Transkriptom Dizileme Aterosklerotik Plaklarda Patojenik Kemokin Merkezini Belirledi

Özet

Bu çalışma, aterosklerotik plaklarla (AP) ilişkili inflamatuar faktörlerin temel mekanizmalarını RNA dizileme kullanılarak analiz etmeyi amaçlamaktadır. Sonuçlar, AP'de CCL3, CCL4 ve CXCL1 temel inflamatuar merkez genlerini tespit etti. Bu kemokinler, M0 makrofaj birikimini teşvik ederken koruyucu bağışıklık hücrelerini baskılayarak aterosklerozu tetikleyebilir ve potansiyel terapötik hedefleri ortaya çıkarabilir.

Özet

Aterosklerotik plak (AP), endotel hücreleri ve düz kas hücrelerinin arter duvarında hasar oluşmasından sonra ortaya çıkan inflamatuar bir fibroz doku proliferatif hastalık türüdür ve farklı derecelerde kardiyovasküler ve beyin damar kan akışı tıkanıklığına yol açabilir. Ancak, iltihabı hedefleyen etkili terapötik yaklaşımlar bugüne kadar büyük ölçüde başarısız olmuştur ve bu da ek içgörülerin hâlâ gerekli olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, AP'de inflamatuar faktörle ilişkili transkriptomik değişiklikleri RNA dizileme (RNA-seq) kullanılarak analiz etmeyi amaçladı. RNA-seq AP hastalarından (n = 11) ve kontrol bireylerinden (n = 3) alınan örneklerde gerçekleştirildi. Metascape kullanılarak farklı şekilde eksprese edilen genler (DEG) tanımlandı, ardından R yazılımında clusterProfiler paketiyle KEGG yol zenginleştirme analizi, CIBERSORT ile bağışıklık infiltrasyon analizi ve STRING veritabanı kullanılarak protein-protein etkileşimi (PPI) ağı yapıldı. PPI ağı içindeki hub genleri CytoHubba eklentisi kullanılarak tanımlandı. AP grubunda toplam 3713 DEG, bunların 2097'si yukarı regülasyonlu ve 1616 aşağıya regüle edilmiş gen bulunuyordu. Sonuçlar, DEG'lerin esas olarak bağışıklık ve iltihapla ilgili yollarla zenginleştiğini gösterdi. Üç iltihapla ilişkili faktör olan CCL3, CCL4 ve CXCL1, AP'nin patolojik sürecinde ana merkez genler olarak değerlendirildi. İmmün infiltrasyon analizi, AP'de belirgin bir mikro ortam ortaya koydu; bu mikro ortam M0 makrofajlarında önemli artışla birlikte CD8⁺ T hücreleri, aktive NK hücreleri ve AP içindeki dinlenme mast hücrelerinde azalma ile karakterize edildi. Sonuç olarak, bu prosedürel bulgular CCL3, CCL4 ve CXCL1'in farklı ifadelerini ve bunların AP'de değişen bağışıklık hücresi bileşimiyle ilişkisini tanımlarak, üç kemokini daha ileri mekanik araştırma için potansiyel aday olarak öne çıkarıyor.

Giriş

Kardiyovasküler hastalıklar (ÜDV) dünya genelinde insan sağlığı için ciddi bir tehdit^{oluşturmaktadır 1}. Küresel nüfus yaşlanma eğilimi yoğunlaştıkça, YÖĞR vakası da^{artmaktadır 2}. Bunlar arasında, aterosklerotik plak (AP),^{CVD 3'ün} başlıca nedenlerinden biridir. AP, damar intimasında kademeli olarak lipidlerin birikimi ve plakların oluşmasıyla karakterize edilen kronik bir inflamatuar^{hastalıktır 4}. AP, kardiyovasküler ve beyin damar olaylarının yaygın temelidir ve esas olarak büyük ve orta büyüklükteki arterleri içerir; bu da iskemi ve yaralanmaya yol açar; kardiyovasküler ve beyin damar hastalıklarına ve ölüme neden olan önemli bir^{faktördür 5}. Erken evrelerde belirgin semptomların olmaması nedeniyle, AP teşhis edildiğinde genellikle ileri ilerler ve bu da yüksek ölüm^{oranına yol açar 6}. AP tedavisi, düşük fiziksel aktivite, hareketsiz davranış, sigara içmek, ruh sağlığı sorunları⁷ ve yüksek yağlı diyet nedeniyle obezite ve tip 2 diyabet gibi değiştirilebilir faktörler ile genler, yaş ve cinsiyet gibi değiştirilemeyen faktörler^{gibi risk faktörlerine odaklanır.} Son çalışmalar, metabolik sendrom, homosisteinemi, hiperüriksemi ve pankreas direncinin ateroskleroz ^9,10'un oluşumu ve gelişimi için önemli risk faktörleri olduğunu ortaya koymuştur.

AP'nin patogeneziyle ilgili teoriler esas olarak lipid infiltrasyonu, iltihaplanma, oksidatif stres yanıtı, enfeksiyon ve genetik ile çevresel faktörler arasındaki etkileşim^{teorilerini içerir 11,12}. Bunlar arasında, iltihap ve oksidatif stres, AP'nin temel patogenezi olarak kabul edilir ve AP^13'ün oluşmasından gelişimine ve bozulmasına kadar tüm süreçlere katılır. AP kararsız plakının ani hasarı, trombosit aktivasyonu ve tromboz, miyokard enfarktüsü ve hemorajik inme¹⁴ için önemli patogenezlerdir. Sürekli araştırmalarla, AP'nin sadece lipid değil, aynı zamanda birçok iltihap hücresi de içerdiği^{bulunmuştur 15}. Sigara içme, hipertansiyon, lipid bozuklukları, hiperinsülinimemi, hiperglisemi, yüksek ürik asit ve diğer zararlı uyarıncılar, beyaz kan ve endotel hücrelerinin çözünür yapışma moleküllerini ve çeşitli sitokinleri sürekli olarak salgılamalarını ve monositlerin damar endotel hücrelerine yapışmasını teşvik eder. Biriken kemokinler, monositlerin subendotel boşluğuna göç etmesine ve makrofajlara ayrılmasına yol açar; makrofajlar da doku içindeki kolesterol açısından zengin oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoproteini (LDL) fagositoz olarak şekillendirerek köpük hücrelerine dönüşür ve lipid çizgilerinin oluşumunu^başlatır16. AS'nin erken patolojik hasarı, yani lipid çizgileri, esas olarak makrofajlar ve tipik bir inflamatuar lezyon olan T lenfositten^{oluşur 17}. Bu nedenle, çeşitli inflamatuar hücreler ve ürünleri AP^18'in başlangıcı ve ilerlemesinde rol oynar. Ancak, AP'nin iltihap durumu karmaşıktır ve bilinen ve potansiyel olarak bilinmeyen birçok faktörü içerir. Geleneksel aday-gen yaklaşımları, bu tüm inflamatuar etkenler spektrumunu yakalamakta başarısız olabilir.

Bu sınırlamayı gidermek için, tarafsız yüksek verimliliğe sahip bir transkriptomik yöntem olan RNA-dizileme (RNA-dizi) kullandık. Bu yaklaşım, ana moleküler sürücülerin önceden tanımlanmadığı hipotez üreten çalışmalar için özellikle uygundur. Aday gen veya mikroarray tabanlı yöntemlerin aksine, RNA-seq daha geniş bir dinamik aralık, daha yüksek hassasiyet ve önceden prob tasarımı olmadan yeni transkriptleri tespit etme yeteneği^{sunar 19,20}. Bu özellikler, moleküler temelin tam olarak tanımlanmadığı durumlarda AP'de iltihap ile ilgili imzaların keşfedilmesi için özellikle uygun hale gelir.

Bu çalışmada, AP ile ilişkili inflamatuar faktörlerin temel mekanizmalarını analiz etmek için RNA-seq gerçekleştirildi. Farklı algoritmalar kullanan biyoinformatik araçlar kullanılarak bir dizi DEG'i taramak yapıldı. Daha sonra, zenginleştirme analizi (WGCNA, KEGG yolu, mcode, GSEA, hub gen analizi) ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi yapıldı. Bu çalışmanın sonuçları, iltihaplanma kaynaklı AP'nin altında yatan moleküler patolojik mekanizmanın daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmakta ve yeni biyobelirteçlerin aramasında önemli bir rol oynamaktadır.

Protokol

Bu çalışma, Liaocheng Halk Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış (Onay numarası: 2023014) ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uymuştur. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alındı. Bilgilendirilmiş onay formları tüm hastalar veya aileleri tarafından imzalandı.

Hastalar ve örnekler

Bu çalışma, Ocak 2023'ten Aralık 2023'e kadar Çin'in Shandong Eyaleti'ndeki Liaocheng Halk Hastanesi Damar Beyin Cerrahisi Bölümü'nde karotis endarterektomi geçiren ağır karotis arter stenozu olan 11 hastayı retrospektif olarak analiz etti. Bu hastalar AP grubu olarak kaydedildi. Karotis arter stenozu teşhisi, CTA veya serebral anjiyografi gibi görüntüleme verilerine dayanıyordu. AP grubu için dahil etme kriterleri şunlardı: (1) 50 ile 80 yaş arasında; (2) bilgisayarlı tomografi anjiyografi/dijital çıkarma anjiyografi intrakraniyal iç karotis arter stenozu doğrulanmış ≥%70; (3) başlangıç öncesi değiştirilmiş Rankin Skalası puanı ≤ 1; (4) hastadan veya yasal temsilcisinden alınan bilgilendirilmiş onay. Dışlama kriterleri şunlardı: (1) inflamatuar veya bağışıklık hastalıkları; (2) psikiyatrik bozuklukların varlığı; (3) kötü huylu tümörlerin varlığı; (4) hamilelik, emzirme veya çocuk sahibi potansiyel. Yaş eşleşmesi Aynı hastanede aynı dönemde organ bağışı geçiren ağır travmatik beyin hasarı olan hastalar kontrol grubu olarak seçildi (NA; Normal Kontrol, n = 3). İki gruptaki denekler, karıştırıcı faktörleri ortadan kaldırmak için yaş, cinsiyet ve vücut kitle indeksi açısından eşleştirildi. Kontrol grubu için dahil etme kriterleri şunlardı: (1) 50 ile 80 yaş arasında; (2) koroner arter hastalığı, karotis arter stenozu veya diğer sistemik damar hastalıkları öyküsü olmaması; (3) hastanın yasal temsilcisinden alınan bilgilendirilmiş onay. Karotis arter intima ve plak örnekleri AP grubundan karotis endarterektomi sırasında alındı, organ bağışı sonrası kontrol grubundan ise aort intima örnekleri alındı. Damar ve plak dokuları, sonraki testler için sıvı azot tanklarında depolandı. AP hastalarının başlangıç özellikleri Tablo 1'de gösterilmiştir.

Numune hazırlama

Toplam RNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatlarına uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak ekstraksiyon yapılmıştır. RNA konsantrasyonu ve saflığı, Nanodrop ND-2000 spektrofotometresi kullanılarak 260 nm ve 280 nm (A260/A280 oranı 1.8 ile 2.0 arasında) değerlendirildi. RNA bütünlüğü, 100 V'da %2 agaroz jel elektroforezi kullanılarak 30 dakika boyunca değerlendirildi. RNA bütünlüğü değerleri (RIN'ler) Agilent 2100 biyoanalizörü kullanılarak alındı (RIN ≥ 7.0 örnekleri aşağı akış analizi için kullanıldı). Tüm örnek işleme ve RNA çıkarma prosedürleri, aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Atık TRIzol reaktifi, kurumsal tehlikeli kimyasal atık yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmiştir.

RNA dizilemesi

Toplam RNA DNase I ile işlendikten sonra, mRNA Oligo D (T) manyetik boncukları kullanılarak zenginleştirildi ve ardından 94 °C'de 5 dakika boyunca kısa parçalara ayrıldı. Ortaya çıkan mRNA parçaları şablon olarak kullanıldı, primer olarak rastgele oligonukleotid kullanıldı. Birinci zincir cDNA, M-MuLV ters transkriptaz sistemi ile 42 °C'de 50 dakika boyunca sentezlendi, ardından RNA zincirlerinin RNase H aracılı bozunması yapıldı. İkinci iplik sentezi, DNA polimeraz I sistemi içindeki dNTP'ler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çift zincirli cDNA arıtıldı, uçları onarıldı ve adaptör ligasyonu kolaylaştırmak için "A" çıkıntısı ile kuyruğu yapıldı. AMPure XP boncukları, 250-300 bp cDNA parçalarını seçmek için kullanıldı ve ardından PCR ile amplifikasyon yapıldı. Daha sonra, güçlendirilmiş ürünler son kütüphane oluşturmak için saflaştırıldı. Kütüphane dizileme işlemi Illumina HiSeq platformunda, eşleştirilmiş uçlu 150 bp okuma uzunluğuyla gerçekleştirilmiştir. Veri kalite kontrolü (QC) için, adaptör dizilerini veya düşük kaliteli bazları içeren ham veriler kendi içi scriptlerle filtrelendi. Cihazdan kaynaklanabilecek dizileme hataları nedeniyle, veri kalitesi dizileme hata oranlarının dağılımı analiz edilerek değerlendirildi (hata oranı %1< kabul edilebilir olarak kabul edildi). Ayrıca, genel içerik dağıtımı da belirlendi. Tüm dizileme prosedürleri aksi belirtilmedikçe ortam sıcaklığında gerçekleştirilmiştir. Tehlikeli kimyasallar içeren reaktifler (örneğin, DNaz I tamponları) kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmiştir.

QC eşikleri ve sorun giderme

Yalnızca RIN ≥ 7.0 ve 250–300 bp parça boyutuna sahip kütüphaneler kullanıldı. Q30 ile %98'lik bir numune başına en az 14 milyon ham okuma ≥ gerekiyordu. Düşük kütüphane verimi PCR döngülerinin 18'e çıkarılmasıyla çözüldü, ancak tekrarlanan oranları %15'in altında tutmak için 15 döngü tercih edildi.

DEG'lerin Taraması

Farklı örnekler arasında gen ifade seviyelerinin dağılımını değerlendirdik. Deneysel güvenilirlik ve örnek seçiminin uygunluğu doğrulanmak için gen ifade seviyelerinin örnekler arası korelasyonu kullanıldı. Gruplar arası farkları ve grup içi tekrarlanabilirliği değerlendirmek için ana bileşen analizi (PCA) uygulandı. DEG'ler Metascape çevrimiçi veritabanı (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1) kullanılarak tanımlandı. DEG'ler, |log₂(katlama değişimi) | > 1 ve p.-değeri < 0.05 ve bunlar istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Tüm biyoinformatik analizler, aksi belirtilmedikçe varsayılan parametreler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ara tekrarlanabilirlik kontrol noktası olarak, örneklerin grup olarak kümelendiğini doğrulamak için PCA grafikleri oluşturuldu.

Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizi

KEGG (http://www.genome.jp/) analizi, biyolojik düzenleyici yolların keşfi için gen fonksiyonunu değerlendirmeye yönelik sistematik bir yaklaşımdır. Bu makale ilk olarak org.Hs.eg'den (sürüm 3.12.0) diferansiyel genin resmi sembol dönüşüm gen kimliğini elde etti. KEGG yol analizi, R yazılımında (sürüm 4.2.0) clusterProfiler paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. P . < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Ara bir sonuç, karşılık gelen gen sayıları ve ayarlanmış p-değerlerle zenginleştirilmiş yolların sıralanmış listesinin oluşturulmasıydı.

PPI ağ analizi

PPI ağı ve ekran anahtarı genini oluşturmak için STRING veritabanı (sürüm 11.0, https://string-db.org/) kullanıldı. Yalnızca 0.9'un üzerindeki bileşik skoruna sahip etkileşimler istatistiksel olarak anlamlı olarak korundu. Ağ, moleküler etkileşim ağlarını incelemek için tasarlanmış açık kaynaklı biyoinformatik araç olan Cytoscape (sürüm 3.10.1) kullanılarak görselleştirildi ve analiz edildi. PPI ağı içindeki hub genleri CytoHubba eklentisi (sürüm 0.1) kullanılarak tanımlandı.

Hub geni

En iyi 20 anahtar gen CytoHubba Plugin tarafından seçildi. Kırmızı, genin yüksek seviyelerini gösterir. Metascape online veritabanı (sürüm 3.5, http://metascape.org/gp/index) tarafından merkez genlerinin biyoinformatik analizi, daha önce 20 hub genini analiz etmek için. Gen zenginleşmesi aşağıdaki ontoloji sınıflarında tanımlanmıştır: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Genomdaki tüm genler zenginleştirme arka planı olarak hizmet eder. < 0,05, minimum sayı 3 ve zenginleştirme faktörü 1,5 > olan maddeler tarandı.

İstatistiksel analiz yöntemi

Verileri analiz etmek için SPSS 25.0 istatistiksel yazılımı kullanıldı. Sayım verileri sıklık veya yüzde olarak ifade edildi ve gruplar arasındaki karşılaştırma Chi-kare testiyle test edildi. Ölçüm verileri, normal dağılımın ortalama ± standart sapmasıyla tutarlıydı ve gruplar arasında karşılaştırma için T-testi kullanıldı. s. < 0.05 önemli bir fark olarak değerlendirildi.

Sonuçlar

Aterosklerotik plaklardaki diferansiyel genlerin RNA-seq veri analizi

Kütüphane hazırlığı için yalnızca RIN ≥ 7.0 içeren örnekler kullanıldı. Tüm 14 örnek (11 AP, 3 kontrol) bu eşiği geçti. Tüm örnekler tek bir partide sıralandı; bu nedenle, toplu etki ayarlamasına gerek yoktu. Örnek başına ortalama 16,8 milyon ham okuma üretildi; Kaliteli filtreleme sonrası, 16,5 milyon temiz okuma (%98) korundu ve %91'i insan referans genomuna (HG38) benzersiz şekilde eşlendi. DEG'in analizi, ateroskleroz plakları olan hastalarda sağlıklı kontrol cihazlarına kıyasla 2097 yukarı regülasyonlu ve 1616 aşağı regülasyonlu gen (|log2FC| >1, P <0.05) olduğunu gösterdi (Şekil 1A). En üst 20 yukarı regülasyon ve aşağı regulasyona edilmiş diferensiyel olarak eksprese edilen genlerin ısı haritası Şekil 1B'de gösterilmiştir. Transkriptom RNA dizileme örnek korelasyonlarını ortaya koydu (Şekil 1C). Ortak ekspresyonlu gen modülleri ile fenotipler arasındaki korelasyon WGCNA tarafından analiz edildi (Şekil 1D). PCA analizi, NA grubu ile AP grubu arasında anlamlı bir fark olduğunu gösterdi (P .< 0.05) (Şekil 1E).

Diferansiyel genlerin KEGG zenginleştirme analizi

R yazılımındaki clusterProfiler paketi kullanılarak (sürüm 4.2.0) KEGG yol zenginleştirme analizi, hastalık grubundaki yukarı regülasyonlu ve aşağıya regulasyonlu farklısal ekspresyon genler üzerinde ayrı ayrı gerçekleştirilmiştir (Şekil 2A,B). Sonuçlar, bu genlerin hematopoietik hücre soyu, romatoid artrit, odak yapışma, integrin sinyal izlemesi ve kemokin sinyal yolu gibi bağışıklık ve iltihapla ilişkili yollarda anlamlı şekilde zenginleştiğini gösterdi.

GSEA analizi

GSEA analizi, deneysel gruptaki çekirdek genlerin ağırlıklı olarak üst kısımda zenginleştiğini ve yukarı regülasyon eğilimi gösterdiğini gösterdi (Şekil 3A). Kontrol grubundaki çekirdek genler ağırlıklı olarak alt kısımda zenginleşmiş ve bu da düşüş eğilimi göstermiştir (Şekil 3B). Özetle, inflamatuar genler deneysel grupta (ASA) yukarı regülasyonlu, kontrol grubunda (NA) ise aşağı regülasyonlu oldu.

PPI Ağları analizi

STRING veritabanı (sürüm 11.0) kullanılarak analiz edilen PPI ağında, aynı küme kimliğini paylaşan düğümler genellikle birbirine yakın konumlandırılır. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, bu kümelenme, ilgili genlerin esas olarak hücre aktivasyonu, inflamatuar yanıt ve hücre aktivasyonu düzenlemesinde rol aldığını ortaya koymuştur. Şekil 4B , daha fazla gen içeren kümelerin daha anlamlı p.-değerleri sergilediği p-değerlerle renklendirilen aynı ağı göstermiştir.

Hub genlerinin tanımlanması ve bağışıklık hücre infiltrasyon analizi

DEG'ler, esas olarak asetilkolin reseptörleriyle ilgili olan mcode analizi ve analiz sonuçları için seçilmiştir (Şekil 5 ve Tablo 2). Cytoscape'deki CytoHubba eklentisi kullanılarak yapılan hub gen analizi, çoğu bağışıklık ve iltihaplanma ile ilişkili olan en iyi 20 hub genini belirledi (Şekil 6A, sol panel). En üst 10 hub geni CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 ve CCR5'ten oluşuyordu (Şekil 6A, sağ panel). Hub genlerinin olink inflamatuar panel 92 genleriyle kesişimi, CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 ve CCL4 dahil olmak üzere 5 yaygın gen ortaya çıkardı (Şekil 6B). CIBERSORT analizi, hastalık grubu ile sağlıklı kontroller arasında bağışıklık hücresi infiltrasyonunda önemli farklılıklar ortaya koydu. Kontrol grubuna kıyasla, hastalık grubunda M0 makrofajlarının oranı anlamlı daha yüksek (p < 0.05) görüldü (Şekil 6C). Buna karşılık, CD8 T hücrelerinin, aktive NK hücrelerinin ve çoğu dinlenme hücresinin oranları hastalık grubunda anlamlı derecede düşüktü (hepsi için s. < 0.05) (Şekil 6C).

Hub genlerinin fonksiyonel analizi

Metascape veritabanı kullanarak Hub geninin biyolojik işlevini daha da analiz ettik ve bu genlerin esas olarak sitokin aracılı sinyal yolu ile kalsiyum aracılı sinyal yoluyla ilişkili olduğunu ortaya koyduk (Şekil 7A ve Tablo 3). Hücre Tipi İmzaları daha sonra hub geninin transkripsiyonel düzenleyici faktörlerini zenginleştirmek için kullanıldı ve hub genlerinin esas olarak gao büyük bağırsak 24W C11 paneth benzeri hücre, gelişmekte olan kalp C8 makrofagi ve manno orta beyin nörotipleri hmgl ile ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 7B). DisGeNET veritabanı hastalık zenginleştirme analizi, hub genlerinin cilt lezyonu, epstein-barr virüsü enfeksiyonları ve kene-bome ensefalitiyle ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 7C). PaGenBase veritabanı doku karakteristik zenginleştirme analizi, hub genlerinin ağırlıklı olarak dalak, kan ve akciğerde zenginleştiğini gösterdi (Şekil 7D). Ayrıca, TRRUST veritabanı analizi, RELA ve NFKB1'in hub genlerini düzenleyen ana transkripsiyon faktörleri olduğunu ortaya koydu (Şekil 7E).

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

İşlenen sayım matrisi ek dosyalar olarak sağlanır (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Diğer tüm veriler makalede tam olarak sunulmaktadır. Ham dizileme verileri, makul talep üzerine ilgili yazardan temin edilebilir.

Şekil 1: DEGs analizi. (A) Sağlıklı plaklar ve aterosklerotik plaklar, diferansiyel gen volkan haritası, yukarı regülasyonlu 2097, aşağı regülasyonlu 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0.05). (B) En üst 20 yukarı ve aşağı regülasyona edilmiş farklı olarak ifade edilen genlerin ısı haritası. (C) Örnek korelasyon analizi. (D) Birlikte ekspreslenen gen modülleri ile fenotipler arasındaki korelasyon WGCNA tarafından analiz edilmiştir. (E) PCA analizi (NA grubu AP grubundan anlamlı şekilde farklıydı). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: KEGG analizi. KEGG yol zenginleştirme analizi, hastalık grubundaki yukarı regülasyonlu (A) ve aşağı regülasyonlu (B) genler üzerinde ayrı ayrı yapıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: GSEA analizi. (A) GSEA analizi, deneysel gruptaki çekirdek genlerin ağırlıklı olarak en üstte zenginleştiğini ve yukarı regülasyon eğilimi gösterdiğini gösterdi. (B) Kontrol grubunda, çekirdek genler ağırlıklı olarak alt kısımda zenginleşmiş ve düşüş eğilimi göstermiştir. Sonuç olarak, inflamatuar genler deneysel grupta (AP) yukarı, kontrol grubunda (NA) ise aşağı regülasyonlu oldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: PPI ağ diyagramı. (A) Küme ID'ye göre renklendirilir, aynı küme ID'yi paylaşan düğümler genellikle birbirine yakın olur. (B) Daha fazla gen içeren öğelerin daha anlamlı P-değerlerine sahip olduğu P-değerlerle boyama. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: DEG'lerin mcode analizi. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Hub gen analizi. (A) Cytoscape'teki CytoHubba eklentisi aracılığıyla dereceler hesaplama yöntemiyle elde edilen ilk 20 hub geni (sol panel) ve en iyi 10 hub geni (sağ panel) ve başlıca bağışıklık ile ilişkili olanlar. (B) Hub genleri ile olink inflamatuar panel 92 genlerinin kesişimi 5 kesişim genini tespit etti. (C) CIBERSORT algoritması, AP ve NA grupları arasında 22 bağışıklık hücresi alt kümesinin infiltrasyon bolluğunu karşılaştırmak için kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Hub genlerinin biyoinformatik analizi. (A) Metascape veritabanı kullanılarak hub genlerinin fonksiyonel açıklaması. (B) Hücre Tipi İmzalarına dayalı hub genleriyle ilişkili transkripsiyonel düzenleyicilerin zenginleştirme analizi. (C) DisGeNET veritabanı ile yapılan hub genlerinin hastalık zenginleştirme analizi. (D) PaGenBase veritabanı aracılığıyla tanımlanan hub genlerinin dokuya özgü ifade kalıpları. (E) TRRUST veritabanı kullanılarak analiz edilen merkez genlerin transkripsiyonel düzenleyici ağı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

MCODE	GIT	Tanım	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Yüksek kalsiyum geçirimli nikotinik asetilkolin reseptörleri	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Presinaptik nikotinik asetilkolin reseptörleri	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Yüksek kalsiyum geçirgen postsinaptik nikotinik asetilkolin reseptörleri	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Tandem gözenek alanı potasyum kanalları	-10.3
MCODE_2	GIT:0030322	Zar potansiyelinin stabilizasyonu	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Faz 4 - dinlenme zarı potansiyeli	-9.7

Tablo 1: AP hastalarının başlangıç özellikleri

MCODE	GIT	Tanım	Log10(P)
MCODE_1	GIT:0030322	Yüksek kalsiyum geçirimli nikotinik asetilkolin reseptörleri	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Presinaptik nikotinik asetilkolin reseptörleri	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Yüksek kalsiyum geçirgen postsinaptik nikotinik asetilkolin reseptörleri	-16.7

Tablo 2: DEG'lerin MCODE zenginleştirme analizi.

MCODE	GIT	Tanım	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Yüksek kalsiyum geçirimli nikotinik asetilkolin reseptörleri	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Presinaptik nikotinik asetilkolin reseptörleri	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Yüksek kalsiyum geçirgen postsinaptik nikotinik asetilkolin reseptörleri	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Tandem gözenek alanı potasyum kanalları	-10.3
MCODE_2	GIT:0030322	Zar potansiyelinin stabilizasyonu	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Faz 4 - dinlenme zarı potansiyeli	-9.7

Tablo 3: Hub geninin MCODE zenginleştirme analizi.

Ek Dosya 1: Kontrol (n=3) Gen ifadesi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Hastalar (n=10) Çekirdek tablo geni.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

AP üzerine yapılan araştırmaların sürekli derinleşmesiyle, AP'de sürekli yeni sitokinler tespit edilmektedir ve iltihap, AS ^21,22'nin oluşumu ve gelişiminde önemli bir faktör haline gelmiştir. Albümin aktivasyonu, endotel hücreleri ile vasküler intimal matriks arasındaki bağlantıyı koparabilir ve endotel hücrelerinin damar intimasından ayrılmasını teşvik edebilir. İndüklenmiş damar intimal^{yaralanması 23,24}. İltihaplanma, LDL-C'nin oksidatif modifikasyonunu tetikler ve modifiye edilmiş LDL-C ise arterin intimasında iltihap sürecine yol açar ve böylece AP^{oluşumunu hızlandırır.} Kararsız plaklar zamanla yırtılabilir ve iç ve dış nedenlerle ACS'ye yol^{açabilir 26}. Plak yırtılması sırasında, makrofajlar, damar düz kas hücreleri (VSMC) ve lenfositler, lökosit interlökin-1 (IL-1), IL-6, damarlararası yapışma faktörü-1 ve hücrelerarası adezyon faktörü-1 gibi inflamatuar faktörler salgılar. Aynı zamanda, monositler ve granülositler üzerindeki bir reseptör olan lökosit integrininin (CD11b/CD18) ekspresyonu^27,28 olarak artar. Ancak, AP'nin oluşumuna yol açan iltihapın moleküler mekanizması daha fazla araştırılmamalıdır.

İltihaplanma nedeniyle oluşan AP'nin oluşması ve gelişimi, çok faktörlü etki, çok gen değişikliği ve çok evreli hastalıkların karmaşık bir sürecidir ve özellikle birçok genin anormal ifadesiyle yakından ilişkilidir. Bu çalışmada, RNA-Seq ve biyoinformatik analizler, sağlıklı kontrol dokuları ile AP arasında DEG'lerin volkan grafikinde 2097 yukarı regülasyonlu ve 1616 aşağı regülasyona sahip gen gösterildiğini ortaya koydu. DEG'lerin daha fazla KEGG zenginleştirme analizi, DEG'lerin esas olarak bağışıklık ve iltihapla ilgili yollarda zenginleştiğini göstermiştir. Hub gen analizi, CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 ve CCR5'ten oluşan en iyi 10 hub genini belirledi. Hub genlerinin olink inflamatuar panel 92 genleriyle kesişimi, CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 ve CCL4 dahil olmak üzere 5 yaygın gen ortaya çıkardı. Bu sonuçlar, iltihapla ilgili faktörler CCL3, CCL4 ve CXCL1'in AP'nin patolojik sürecinde kritik bir rol oynayabileceğini göstermektedir. İmpün sızma analizi, M0 makrofajlarında önemli artış ile CD8⁺ T hücreleri, aktive NK hücreleri ve plaklar içindeki dinlenme mast hücrelerinde azalma ile karakterize edilen belirgin bir mikro ortam ortaya koymuştur.

M0 makrofajları, oksitlenmiş LDL'yi kolayca içselleştirip köpük hücrelere ayrılabilen ve erken aterogenez^29'da belirgin bir olay olan belirlenmemiş bir havuzdur. Hastalık grubunda gözlemlenen M0 makrofajlarının yüksek oranı, bu öncül hücrelerin plak mikroortamında birikimine işaret eder. CCL4, öncelikle aktive makrofajlar ve T hücreleri tarafından üretilir ve NFκB sinyal yolu aracılığıyla makrofaj aktivasyonunu sürdüren, yapışma moleküllerinin ekspresyonunu teşvik eden ve matriks metalloproteinaz-2 ile -9'u indükleyen kalıcı bir uyarı olarak hizmet verir; böylece M0 makrofajlarının pro-aterojenik bir duruma geçişini kolaylaştırır ve plak stabilitesini^{doğrudan tehlikeye düşürür 30}. CD8⁺ T hücrelerinin azalmış oranı, ateroprotektif T hücresi alt kümelerinin CCL3 aracılı baskılanmasını yansıtabilir. Komissarov ve ark., insan aterosklerotik plaklarına T hücresi göçünün ağırlıklı olarak CCR5-CCL3 ekseni³¹ üzerinden gerçekleştiğini göstermiştir. Ayrıca, Döring ve ^ark.32 , CCL17'nin CCR8 üzerinden sinyal göndererek CCL3 ekspresyonunu tetiklediği ve bunun da düzenleyici T hücresi farklılaşmasını bastırdığı kanonik olmayan bir yol keşfetmiştir; CD4⁺ T hücrelerinde CCL3'ün genetik ablasyonu FoxP3⁺ Treg sayısını artırdı ve aterosklerozu sınırladı, CCL3 uygulaması ise hastalığı kötüleştirdi ve Treg farklılaşmasını engelledi. Bu değişim, muhtemelen ateroprotektif CD8⁺ düzenleyici T hücrelerini azaltırken, patojenik efektör T hücrelerini teşvik eder ve analizimizde gözlemlenen CD8⁺ T hücre oranında net azalmaya yol açar. Aktive NK hücrelerindeki ve dinlenme mast hücrelerindeki azalmalar, muhtemelen bu popülasyonların mutlak kaybı değil, aktivasyon durumundaki değişiklikleri yansıtıyor. Bonaccorsi ve ^ark.33 , semptomatik karotis plakların NK hücre infiltrasyonu ve IFN-γ üretiminin arttığını ve bunun NK hücre aktivasyonunu klinik plak kararsızlığı ile doğrudan ilişkilendirdiğini bildirdi. Mast hücreler için, Wezel ve ^ark.34 , aktive mast hücrelerden, özellikle CXCL1'den salınan kemokinlerin, CXCL1/CXCR2 ekseni üzerinden nötrofil katılımını tetiklediğini, böylece devam eden inflamatuar yanıtı şiddetlendirdiğini ve plak ilerlemesini ve destabilizasyonunu teşvik ettiğini göstermiştir. Dolayısıyla, aktive edilmiş NK hücrelerinin ve dinlenme halindeki mast hücrelerin azalmış oranı, gerçek sayısal bir azalma değil, inflamatuar plak ortamında aktivasyon, degranülasyon veya tükenmelerini yansıtır.

Bu çalışmanın birkaç sınırlaması vardır. Birincisi, bu çalışma yalnızca transkriptom dizileme üzerine kuruludur ve küçük örneklem büyüklüğüyle sınırlıdır. Sınırlı örneklem boyutunun ötesinde, RNA-seq protokolünün birkaç teknik sınırlaması da belirtilmelidir. Toplu RNA-seq hücresel heterojenliği maskeler; CCL3, CCL4 ve CXCL1'in hücre tipine özgü ifadesini çözmek için tek hücreli yaklaşımlar gereklidir. Hesaplamalı bağışıklık dekonvolüsyonu (CIBERSORT) yalnızca tahminler sağlar, doğrudan ölçüm değil. RNA bolluğu her zaman protein seviyeleriyle korelasyon göstermez; Ortogonal doğrulama gereklidir. Gelecekteki çalışmalar, tek hücreli transkriptomikler, daha büyük ve bağımsız kohortlar, ortogonal protein doğrulaması kullanarak bu sınırlamaları ele almalıdır.

Sonuç olarak, mevcut bulgular inflamatuar faktörlerin AP'nin patofizyolojik sürecindeki önemli rolünü vurgulamıştır. Ayrıca, M0 makrofaj birikimini teşvik eden, koruyucu T-hücre alt setlerini baskılayan ve NK hücreleri ile mast hücrelerin aktivasyon durumlarını değiştirerek aterosklerozu tetikleyen koordineli kemokin ağı oluşturabilen CCL3, CCL4 ve CXCL1 merkez genlerini tespit ettik. Genel olarak, bu bulgular üç kemokinin plak bağışıklık mikroçevresinin kritik düzenleyicileri ve potansiyel terapötik hedefleri olduğunu vurgulamaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
TRIzol	Invitrogen	15596026CN	RNA çıkarımı
Nanodrop ND-2000 spektrofotometresi	Thermo Fisher Scientific	ND2000	RNA konsantrasyonu tespiti
Agilent 2100 biyoanalizörü	Çevik	G2939BA	RNA kalite kontrolü
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Transkriptom dizileme
Oligo D (T) manyetik boncuklar	New England Biolabs	S1550S	RNA zenginleştirme