Method Article

Nötralize Antikor Titrlerini Ölçmek İçin Hepatit E Virüsü Flüoresans Azaltma Nötralizasyon Testi

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit E Virüsü (HEV) için standart bir virüs nötralizasyon testi bulunmamaktadır; bu virüsün sitopatik olmayan pozitif iplikli RNA virüsü vardır. Burada, anti-HEV antikorlarının etkinliğini değerlendirmek için floresan etiketli viral kapsid proteininin nicelendirilmesine dayalı bir floresan azaltma nötrasyonasyon testi (FRNT) tanımlanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüs nötralizasyon testi, ilgili virüse karşı bir antikor veya antikor karışımının nötralizasyon potansiyelini ölçür. Aşı adaylarının ve virüsün karşısında geliştirilen nötralize edici antikorların etkinliğini değerlendirmek için değerli bir tekniktir. Plak azaltma nötralizasyon testi (PRNT), virüsle özgül nötralize edici antikorların titrini değerlendirmek için popüler bir yöntemdir. Ancak, sitopatik olmayan virüslerde PRNT uygulanabilir değildir. Hepatit E virüsü (HEV), Hepeviridae ailesine ait pozitif algılı, tek zincirli bir RNA virüsüdür. Dünya genelinde akut viral hepatitin başlıca nedenidir. Memeli hücre kültüründe sitopatik etki göstermez. Çin'de HEV'e karşı bir aşı mevcuttur. Ancak, HEV'ye karşı aşılar veya terapötik antikorlar dünyanın çoğunda mevcut değildir. Birçok laboratuvar HEV'ye karşı aşı adayları üzerinde çalışıyor. HEV aşılarının etkinliğini ölçmek için bir nötralizasyon testi araştırmacılar için çok faydalı bir araç olacaktır. Burada, anti-HEV antikorlarının %50 nötralizasyon titresini (NT50) tahmin etmek için bir floresans azaltma nötralizasyon testi (FRNT) tanımlıyoruz. Anti-HEV ORF2 nötralize edilmiş veya tavşan IgG nötralize edilmiş HEV, Huh7 hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı ve ardından viral ORF2 proteininin immünofluoresan boyaması yapıldı. Floresan pozitif hücreler ImageJ uygulamasında nicelendirildi ve NT50 2.1 x 103 olarak tahmin edildi. Bu yöntem, aşılanmış fare serumlarında, HEV ile geri alınan bireysel serumlarda ve laboratuvarda üretilen anti-HEV antikorlarda bulunan anti-HEV antikorlarının NT50'sini tahmin etmek için uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit E virüsü (HEV), Hepeviridae ailesi 1,2'ye ait pozitif algılı, tek zincirli bir RNA virüsüdür. Genellikle kendini sınırlayan akut hepatite neden olur, ancak bağışıklık sistemi suprese bireylerde kronik hepatite yol açabilir 3,4. Hamile kadınlar fulminant karaciğer yetmezliği geliştirme riski yüksektir ve ölüm oranı %30'a kadar yükselir. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) 2021 yılında dünya genelinde yaklaşık 19,47 milyon akut hepatit E (AHE) vakası ve HEV nedeniyle 3450 ölüm raporladı

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni Delhi, AIIMS Gastroenteroloji Bölümü'ne kabul edilen HEV enfekte bir hastadan dışkı örneği almak için kurumsal etik komite (IEC) onayı alındı. Çalışmaya katılan hastalardan bilgilendirilmiş onay alındı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Virüs izolasyonu ve nicelendirme

  1. Bilgilendirilmiş onayla, virüsün arındırılması için HEV enfekte bir hastadan dışkı örneği alın.
  2. Dışkı örneğini Dulbecco'nun Fosfat tamponlu tuzlu sonu (DPBS) %10 nihai konsantrasyonda (w/v) ve santrifüjde 7800 x g ile 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huh7 hücrelerinin g1-HEV ile enfekte edilmesi ve virüs karakterizasyonu

G1-HEV, gösterildiği gibi bir dizi adımla dışkı örneğinden izole edildi (Şekil 1A). Temizlenmiş g1-HEV'in genom kopya numarası RT-qPCR ile tahmin edildi, ardından -80 °C olarak depolama yapıldı. Viral enfeksiyon ve çoğalmayı doğrulamak için, Huh7 hücreleri 72 saat boyunca 1.8 × 104 genom kopyası eşdeğeri olan g1-HEV stokuyla enfekt.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT, antikorların nötralize edici potansiyelini tahmin etmek için immünboyama temelli bir yöntemdir. Dengue virüsü (DENV), Şiddetli Akut Respirator Sendromu Koronavirüs-2 (SARS-CoV-2) ve Japon ensefalit virüsü (JEV) dahil olmak üzere birden fazla virüse karşı antikorların NT50 değerlerini tahmin etmek için kullanılmıştır23,24,25. Bu yöntemde, virüs bir test antikoru (veya serum) ile .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, kısmen Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Endüstrisi Araştırma Yardım Konseyi'nden MS, S ve BN'ye verilen bir hibe ile finanse edilmiştir. MS laboratuvarındaki araştırmalar, Translasyonel Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Enstitüsü'nden alınan temel bir hibe ile desteklenmektedir. SA, Hindistan Hükümeti Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından finanse edilen Proje Araştırma Bilimcisi pozisyonu tarafından desteklenmektedir. UB, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı'ndan Kıdemli Araştırma Bursu ile desteklenmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL mikrofüj tüpleriAxygenMCT-150-C
12 delikli hücre kültürü çanakıCorning3512
37 derece kuluçka makinesiTermo Bilimsel50163013
4′,6-diamidino-2-fenilindolAbcamAB104139DAPI
50mL santrifüj tüpüFalcon352070
6 kuyruklu hücre kültürü çanakıCorning 3516
Alexa unu 594 ikincil IgG AntikoruTermo BilimselA-11012
Anti-ORF2 antikorGenscriptNAGenscript tarafından özel olarak sentezlenmiş ve laboratuvarımızda karakterize edilmiştir14
Anti-tavşan IgG antikoruGenscriptNA
Sığır Serum AlbüminiHIMEDIAMB083BSA
Konfokal mikroskopOlympusFV3000
DMEM, yüksek glikozHIMEDIAAL007A
Fetal Sığır SerumuGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband ve katkıda bulunanlar, NIH, ABD)
Normal Keçi SerumuHIMEDIARM-10701
ParaformaldehitHIMEDIAGRN3660PFA
Fosfat Tamponu Tuzlu pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polietilengol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reaktifiMoleküler Araştırma MerkeziTR118
Triton X100SIGMAX100
Tripsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells
Video Coming Soon

Related Articles