Method Article

Nötralize Antikor Titrlerini Ölçmek İçin Hepatit E Virüsü Flüoresans Azaltma Nötralizasyon Testi

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit E Virüsü (HEV) için standart bir virüs nötralizasyon testi bulunmamaktadır; bu virüsün sitopatik olmayan pozitif iplikli RNA virüsü vardır. Burada, anti-HEV antikorlarının etkinliğini değerlendirmek için floresan etiketli viral kapsid proteininin nicelendirilmesine dayalı bir floresan azaltma nötrasyonasyon testi (FRNT) tanımlanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüs nötralizasyon testi, ilgili virüse karşı bir antikor veya antikor karışımının nötralizasyon potansiyelini ölçür. Aşı adaylarının ve virüsün karşısında geliştirilen nötralize edici antikorların etkinliğini değerlendirmek için değerli bir tekniktir. Plak azaltma nötralizasyon testi (PRNT), virüsle özgül nötralize edici antikorların titrini değerlendirmek için popüler bir yöntemdir. Ancak, sitopatik olmayan virüslerde PRNT uygulanabilir değildir. Hepatit E virüsü (HEV), Hepeviridae ailesine ait pozitif algılı, tek zincirli bir RNA virüsüdür. Dünya genelinde akut viral hepatitin başlıca nedenidir. Memeli hücre kültüründe sitopatik etki göstermez. Çin'de HEV'e karşı bir aşı mevcuttur. Ancak, HEV'ye karşı aşılar veya terapötik antikorlar dünyanın çoğunda mevcut değildir. Birçok laboratuvar HEV'ye karşı aşı adayları üzerinde çalışıyor. HEV aşılarının etkinliğini ölçmek için bir nötralizasyon testi araştırmacılar için çok faydalı bir araç olacaktır. Burada, anti-HEV antikorlarının %50 nötralizasyon titresini (NT50) tahmin etmek için bir floresans azaltma nötralizasyon testi (FRNT) tanımlıyoruz. Anti-HEV ORF2 nötralize edilmiş veya tavşan IgG nötralize edilmiş HEV, Huh7 hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı ve ardından viral ORF2 proteininin immünofluoresan boyaması yapıldı. Floresan pozitif hücreler ImageJ uygulamasında nicelendirildi ve NT50 2.1 x 103 olarak tahmin edildi. Bu yöntem, aşılanmış fare serumlarında, HEV ile geri alınan bireysel serumlarda ve laboratuvarda üretilen anti-HEV antikorlarda bulunan anti-HEV antikorlarının NT50'sini tahmin etmek için uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatit E virüsü (HEV), Hepeviridae ailesi 1,2'ye ait pozitif algılı, tek zincirli bir RNA virüsüdür. Genellikle kendini sınırlayan akut hepatite neden olur, ancak bağışıklık sistemi suprese bireylerde kronik hepatite yol açabilir 3,4. Hamile kadınlar fulminant karaciğer yetmezliği geliştirme riski yüksektir ve ölüm oranı %30'a kadar yükselir. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) 2021 yılında dünya genelinde yaklaşık 19,47 milyon akut hepatit E (AHE) vakası ve HEV nedeniyle 3450 ölüm raporladı. HEV, gelişmekte olan ülkelerde kötü hijyen nedeniyle öncelikle kirlenmiş gıda ve su yoluyla bulaşırken, gelişmiş ülkelerde sporadik mesleki enfeksiyonlar çiğ veya az pişmiş et tüketimiyle ilişkilidir6. HEV sekiz genotipe ayrılır. Genotip (g) 1- ve g2- HEV yalnızca insanları enfekte eder. g3- ve g4-HEV'de insan, tavşan, domuz, yaban domuzu ve geyik gibi geniş bir konakçı yelpazesi vardır. g5- ve g6-HEV yaban domuzlarını enfekte ederken g7- ve g8-HEV develeri enfekte eder. Orta Doğu'da deve eti ve süt tüketimi yoluyla g7-HEV'in insan yoluyla bulaştığı tek bir vakarapor edilmiştir 7,8. HEV enfeksiyonu genellikle düşük ve orta gelirli ülkelerde yaygındır. Güney ve Güneydoğu Asya, Afrika ve Meksika'nın endemik bölgelerinde, esas olarak g1- ve daha az sıklıkla g2-HEV enfeksiyonu nedeniyle su yoluyla salgın bildirilmiştir. Avrupa ve Doğu Asya'nın gelişmiş ülkelerinde mesleki sporadik enfeksiyon vakaları çoğunlukla g3-HEV 6,7 tarafından oluşmaktadır.

HEV genomu, 5′ ucunda 7-metilguanin kapağı, üç açık okuma çerçevesi (ORF) ve ardından poli-adenillenmiş 3' uç içeren 7,2 kb artı zincirli bir RNA'dır. ORF1, yedi farklı bölgeden oluşan yapısal olmayan poliproteini kodlar: Metiltransferaz (Met), Y-domain, Papain benzeri sistein proteaz (PCP), V-domain, makro-domain (X-domain), Helikaz (Hel) ve RNA-bağımlı RNA polimeraz (RdRp). ORF2, viral kapsid oluşumundan sorumlu kapsid proteinini kodlar. ORF3, viroporin olarak görev yapan ve virüsün çıkışına yardımcı olan birfosfoproteini kodlar. G1-HEV'de ek bir açık okuma çerçevesi olan ORF4 bulunur; bu çerçeve, ORF1 içinde bulunan iç ribozom giriş sitesi benzeri eleman kullanılarak kaptan bağımsız bir mekanizma ile çevrilir. ORF4 ekspresyonu, endoplazmik retikulum stres indükleyen bileşiklerle güçlendirilir. ORF4, g1-HEV replikasyon kompleksimontajı 10'u teşvik etmek için önerilmiştir.

HEV in vitro verimli şekilde çoğalmaz ancak hepatit E hastalarından izole edilen bazı virüs suşları hepatositlerde, akciğer hücre hattında ve kolon epitel hücrehattı 11'de başarılı şekilde yayılmıştır. Ancak, virüsü kültürlenen hücrelerde sağlam bir şekilde yaymak zordur. G1-HEV'in (Sar55 suşu) enfeksîyonel cDNA klonu in vitro çalışmalar için kullanılmıştır, ancak kültürlenmiş hücrelerde g1-HEV suşlarının verimli üretimi ve yayılması henüz sağlanamamıştır. Bazı g3- ve g4-HEV suşları kültürlenmiş hücrelerde daha iyibüyür 12. Buna rağmen, in vitro transkripsiyonlu ve kaplı p6 HEV genomik RNA ile transfekte edilen hücrelerden elde edilen saflaştırılmış virüs, çoklu testler için yeterli değildir. Bunun üzerine, hücre kültüründe üretilen tüm HEV parçacıkları yarı zarflıdır ve bu da enfektifiyetlerini etkiler. Buna karşılık, kirlenmiş gıda ve suda bulunan HEV zarfsızdır ve oldukça bulaşıcıdır. Hasta dışkısında bulunan HEV zümfer değildir ve doğal enfeksiyonun yaygın kaynağıdır. Bu nedenle, hasta dışkısından arındırılmış HEV kullanımı, memeli hücre kültür sisteminde verimli enfeksiyonu sağlar. Önceki çalışmalarımız, hasta dışkı ile arındırılmış g1-HEV'nin insan hepatom hücrelerinde viral replikasyonun niceliklendirilmesinde güvenilirliğini göstermiştir (Huh7). -80 °C'de depolanan saflaştırılmış virüs birkaç yıl boyunca enfektifliğini korur ve viral çoğalma 10,13,14,15 tahmini için birçok bağımsız çalışmada kullanılmıştır. Bu çalışma, hastadan alınan saflaştırılmış g1-HEV kullanılarak bir HEV nötralizasyon testi tasarladı. Virüs, arındırıldı, titerlendi, karakterize edildi ve nötralizasyon testlerinde kullanılmak üzere -80 °C sıcaklıkta aliquotlarda saklandı. HEV sitopatik olmadığı için, geleneksel PRNT yöntemi anti-HEV antikorlarının virüs nötralizasyon potansiyelini tahmin etmek için faydalı değildir. HEV için nötralizasyon testleri geliştirmeye yönelik birkaç girişim olmuştur; bunlar arasında akış sitometrisi tabanlı nötralizasyon testi, hücre süpernatantlarına salgılanan pORF2'yi tespit etmek için antijen ELISA kitli nötralizasyon testi, in vitro ELISA tabanlı bağlanma testi, RT-PCR tabanlı bir test ve floresans tabanlı nötralizasyontesti 16,17,18,19,20 yer alır . ELISA tabanlı bir test, virüsün fonksiyonel nötralizasyonunu değerlendirmek için antikor bağlanmasını dolaylı olarak tespit eder, ancak gerçek enfeksiyonu ölçemez. Akış sitometrisine dayalı yöntem genellikle psödovirüs kullanarak enfekte hücrelerin yüzdesini ölçür. RT-PCR tabanlı nötralize yöntemi FRNT'den daha karmaşıktır; bu nedenle, hata yapma olasılığı daha yüksektir. Öte yandan, burada tarif edilen FRNT yöntemi, yüksek titrli bulaşıcı virüs ve görüntüleme yeteneklerinin varlığıyla sınırlıdır. Buna rağmen, anti-HEV antikorlarının NT50'sini ölçmek için etkili bir yöntemdir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni Delhi, AIIMS Gastroenteroloji Bölümü'ne kabul edilen HEV enfekte bir hastadan dışkı örneği almak için kurumsal etik komite (IEC) onayı alındı. Çalışmaya katılan hastalardan bilgilendirilmiş onay alındı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanların detayları Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Virüs izolasyonu ve nicelendirme

  1. Bilgilendirilmiş onayla, virüsün arındırılması için HEV enfekte bir hastadan dışkı örneği alın.
  2. Dışkı örneğini Dulbecco'nun Fosfat tamponlu tuzlu sonu (DPBS) %10 nihai konsantrasyonda (w/v) ve santrifüjde 7800 x g ile 1 saat boyunca 4 °C'de yeniden askıya alın.
    NOT: HEV dışkı örneğini tutarken eldiven kullanın ve iş sonrası çalışma alanını %70 etanol ile temizleyin (tüm adımları bir Biyogüvenlik dolabında yapın).
  3. Süpernatantı topla ve 0.45 μm filtreden geçir.
  4. 0,4 M NaCl içinde hazırlanan %8 PEG6000 virüs süpernatantına ekleyin ve 0 °C'de 16 saat kuluçka yapın.
  5. Numuneyi 18.000 x g ile 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  6. Süpernatantı çıkarın ve pelleti Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile 40 mL içinde yeniden askıya alın.
  7. Süspansiyonu, 30 kDa membran kartuş kullanarak teğetsel akış filtrasyonu (TFF) ile 5 mL hacme konsantre edin. Biosafety kabini içindeki 0.2 μm filtreden geçirin, aliquotlar yapın ve -80 °C'de saklayın. Bir aliquot kullanarak toplam RNA'yı izole edin ve RT-qPCR yapın.
  8. Viral RNA'nın nicelendirilmesi için bir standart oluşturmak amacıyla pSK-HEV2 plazmidinin birden fazla seyreltilmesi (g1-HEV'in bulaşıcı klonunun cDNA'sını içeren pBluscript vektörü (Genbank ID: AF444002.1)] (1 ng'den 0,000001 ng'e kadar 10x seri seyreltmede DNA/reaksiyon) kullanılabilmektedir.
  9. Grafiği, X ekseninde pSK-HEV2 DNA miktarı ve Y ekseninde karşılık gelen Ct değerleriyle çizin. Standart grafikten viral RNA konsantrasyonunu ekstrapol edin.
  10. Standart grafikten HEV genomik RNA seviyesini niceliklendirin ve virüsün genom kopya sayısını aşağıdaki formülle hesaplayın: Kopya sayısı = ng*(sayı/mol) / bazlar *(ng/g)*(g/mol baz).

2. Huh7 hücrelerinin g1-HEV ile enfekte edilmesi

  1. Huh7 hücreleri içeren bir T75 şişesi alın. Mikroskop altında hücrelerin birleşip sağlıklı olup olmadığını kontrol edin.
  2. Ortamı aspiratör ile çıkarın (biyogüvenlik kabininde tüm adımları yapın). 10 mL DPBS ekleyin, döndürün, ve çıkarın.
  3. 1 mL %0,05 tripsin çözeltisi ekleyin, böylece yüzeye eşit şekilde yayılmasını sağlar.
  4. Hücrelerin %90 ayrılmasına kadar birCO2 kuluçka makinesi içinde 30–60 saniye kuluçka yapın.
  5. 5 mL tam ortam ekleyin, T75'in tüm yüzeyine eşit şekilde yayılmış ve agregalardan arınmış tek-hücreli bir popülasyon oluşturmak için defalarca pipet yapın.
  6. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın, oda sıcaklığında 200 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  7. Kültür ortamını, biyogüvenlik kabinin içindeki konik tüpten aspire edin.
  8. Tüpe 5 mL tam ortam ekleyin ve hücreleri nazik pipetlemeyle eşit bir askıya askıya alın.
  9. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve hücre sayacı slaytına koyun. Hücreleri 4 çeyrekte say, ortalaması/mL hesaplayın.
  10. 2 mL DMEM'de (%10 FBS takviyesi) 6 kuyu için 0,5 x 106 hücre/kuyu tohumu ekin.
  11. Ertesi gün, ortamı çıkarın, 1 mL DPBS ile yıkayın ve 50 μL g1-HEV virüsü (4,5 ×10 4genom kopyasına eşdeğer) 1 mL serumsuz ortamda (SFM) ekleyin.
  12. Hücreleri %5CO2 inkubatörde 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
  13. Hücreleri 500 μL DPBS ile yıkayın, ardından 2 mL tam ortam ekleyin (DMEM, %2 FBS takviyesi).
  14. Hücreleri %5CO2 inkübatörde 37 °C'de 72 saat kuluçka yapın.
  15. Aşağı akış testleri için devam edin.

3. RT-qPCR testi

  1. 6 kuyu tabakasından büyüme ortamını (2.15. adımdan itibaren) çıkarın ve hücreleri 1 mL DPBS ile yıkayın.
  2. Hücreleri lizize etmek için doğrudan 6 kuyu plakaya 1 mL TRI Reaktifi ekleyin. Lizat pipetini birkaç kez yukarı aşağı indirin, ardından 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: TRI reaktifi solulursa, yutulursa veya cildle temas ederse toksiktir. Reaktif kullanırken koruyucu eldiven kullanın ve buharları solup çıkmaktan kaçının. Tercihen kimyasal kapağın içinde kullanın. Tüm plastik eşyalar RNAse içermeyen kalitede olmalıdır.
  3. Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın. 0,2 mL kloroform ekleyin, tüpü güvenli bir şekilde kapatın, ardından 10–15 saniye girdabla (Kloroform tehlikeli ve toksiktir; uygun PPE ile tutulur). 2–3 dakika kuluçka yapın.
  4. Örnekleri 12.000 × 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendirin. Sulu fazı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sulu faza 0,5 mL izopropanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyi karıştırın.
  5. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
  6. 12.000 sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj × 4 ° C'de yapıldı. Üst yüzeyi at.
  7. Pelleti 1 mL %75 etanol ile yeniden askıya alın. 7500 sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj × 4 ° C'de kullanın. Üst yüzeyi at.
  8. RNA pelletini 5–10 dakika boyunca hava kurutma.
  9. Pelleti 50 μL nükleazsız suya (NFW) yeniden süsküye alın, 55 °C'de 10 dakika kuluçka yapın, elle dokunarak karıştırın ve spektrofotometri ile RNA konsantrasyonunu ölçün.
  10. Aşağıdaki primerleri kullanarak TaqMan prob tabanlı tek adımlı RT-qPCR yapın:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV Prob: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGGGGAATCACC [BHQ1]3′; Ribonükleaz P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP Probe: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGCG[BHQ1]3′.
  11. 2−ΔΔCT yöntemiyle g1-HEV RNA'nın göreli niceliklendirmesini hesaplayın.

4. İmmünofloresans testi (IFA)

  1. Huh7 hücrelerini önceki adımlarda anlatıldığı gibi bölün.
  2. Mikroskopi kalitesinde cam kapak parçasını 12 delikli bir plakaya yerleştirin ve 1 mL tam ortamda (%10 FBS takviyesi olan DMEM) 0.2 × 106 hücre/kuyunun tohumu ekin.
  3. Hücreleri, 500 μL SFM içinde saflaştırılmış g1-HEV'nin 1.8 ×10 4 genom kopyasıyla enfekte edin. Hücreleri %5CO2 inkubatörde 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
  4. Hücreleri 500 μL DPBS ile üç kez yıkayın.
  5. 2 mL tam ortam ekleyin (DMEM, %2 FBS takviyesi).
  6. Hücreleri %5CO2 kuluçka makinesinde, 37 °C sıcaklıkta 72 saat kuluçka yapın.
  7. Hücreleri 500 μL DPBS ile üç kez yıkayın, her yıkama arasında oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
  8. Hücrelere 500 μL %4 PFA (Paraformaldehit) ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
    NOT: %4 PFA solulursa zararlıdır, cilt ve göz tahrişe neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna yol açabilir. Güvenlik için, reaktifi kullanırken koruyucu eldiven ve göz koruması takın ve solun buharlarından kaçının.
  9. Hücreleri 500 μL DPBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın ve DPBS'de 30 dakika kuluçka yapın.
  10. Hücrelere 250 μL bloklayıcı çözelti (%5 Normal Keçi Serumu, %0,5 BSA, %0,3 Triton X-100 DPBS) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat kuluçka yapın.
  11. Bloklayıcı çözeltiyi çıkarın, bir kez 500 μL DPBS ile yıkalın ve hücreleri 250 μL birincil antikor (DPBS, %0,3 Triton X-100, %5,5 BSA, %0,5 Normal Keçi Serumu, 1:500 sulandırılmış anti-ORF2 antikoru veya tavşan IgG) ile gece boyunca kuluçka yapın.
  12. Hücreleri 500 μL DPBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın.
  13. Hücreleri ikincil antikorlarla (DPBS, %0,3 Triton X-100, %5 BSA, %0,5 Normal Keçi Serumu, keçi anti-tavşan Alexa fluor 594 antikorunun 1:1000 seyreltilmesi) RT'de 1 saat boyunca kuluçka edin.
  14. Hücreleri DPBS ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıkayın. Cam slayta DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi ile 10 μL Prolong altın antiifade reaktifi ekleyin. Kapak kaplı hücreleri, cam slaytlara DAPI çözeltisine bakacak şekilde monte edin, böylece hava kabarcıklarından kaçının.
  15. Kapak parçasını tırnak boyasıyla kapatın.
  16. 60x hedefli konfokal mikroskopta floresan görüntüler alın.
  17. Floresan sinyal görselleştirme ve alma için mikroskobu ayarlayın.
  18. İlk olarak, sahte hücrelere (enfekte olmayan) karşılık gelen slayttaki çekirdekleri 60x büyütme ile odaklayın. Eşik voltajını ve lazeri arka plan floresans sinyali görünmeyecek şekilde ayarlayın. Kontrol antikor (tavşan IgG) ile boyanmış slaytı kontrol edin ve arka plan floresans sinyalinin görünmediğinden emin olun.
  19. HEV enfekte hücrelerin slaytlarını yukarıdaki parametreleri değiştirmeden görselleştirin. 1028 x 1028 piksel boyutlarında görüntüler elde edin.

5. Floresans Azaltma Nötralizasyon Testi (FRNT)

  1. Virüs nötralizasyonu ve Huh7 hücrelerinin enfekte edilmesi
    1. Huh7 hücrelerini önceki adımlarda anlatıldığı gibi bölün. Örtü tabakasını 12 kuyuyla bir tabakaya yerleştirin ve 1 mL tam ortamda (DMEM + %10 FBS) 0.2 ×10 6 hücre/kuye tohumu ekleyin.
    2. Ertesi gün, SFM'de 25 μg/mL başlangıç antikor konsantrasyonu ile 1:10 5 seyreltme ile 10 kat seri sulandırılma hazırlanır. Sulandırmanın nihai hacmi 100 μL olmalıdır.
    3. Her antikor seyreltmesine arıtılmış g1-HEV'nin eşdeğeri 1,8 x 104 genomik kopya ekleyin.
    4. Antikor ve virüs karışımını %5CO2 kuluçka makinesinde, 37 °C'de 1 saat kuluçka edin.
    5. Huh7 hücrelerini içeren 12 kuyu plakasını (bir önceki gün tohumlanmış) çıkarın ve hücreleri 500 μL DPBS ile yıkayın.
    6. Antikor-virüs karışımını hücrelere ekleyin ve plakayı 37 °C'de %5CO2 kuluçka makinesine 1 saat boyunca yerleştirin.
    7. Hücreleri 500 μL DPBS ile yıkayın.
    8. Hücrelere DMEM + %2 FBS ortamı ekleyin ve plakayı %5CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 72 saat kuluçka yapın.
    9. 4. bölümde belirtildiği gibi (4.7. adımdan itibaren IFA) yapın.
    10. 10x amaç kullanarak 1028 x 1028 piksel boyutunda 5 rastgele alanın floresan görüntülerini elde edin.
    11. Görüntüleri JPEG/TIFF formatında kaydedin. Aşağıda açıklandığı gibi ImageJ analiziyle floresan noktaları nicelikle ölçün.
    12. ImageJ'de görüntüyü analiz etmek için RGB görüntünü 8-bit bir görüntüye dönüştürün. Resme tıklayın > 8-bit > yazın.
    13. Görüntünün eşiğini ayarlayın. Resme tıklayın > > eşiğini ayarlayın. Alt eşik seviyesini 40, üst eşik seviyesini ise 255 olarak seçin.
    14. Saymak için Analiz > Parçacıkları Analiz Et. Sonuçları göster, sonuçları temizle, özetle, kenarlarda hariç tut ve bileşik yatırım getirisi seçeneklerini seç. Yöneticiye ekle, delikleri ekle ve üst üste katman seçeneğini kaldır. Ok'a bastığında floresan leke sayısı görünecek.
  2. NT50'nin tahmini
    1. Her seyreltmenin %'si nötralleşmesini aşağıdaki formülle hesaplayın:
      % Nötralizasyon= 100-[((ORF2-pozitif hücreler seyreltmede)⁄(ORF2-pozitif hücreler virüs kontrolünde)) X 100]
    2. NT50'yi aşağıdaki formülle hesaplayın:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      burada, D1 = %50'nin altında nötralleşme olan seyreltme
      D2 = %50'nin üzerinde nötralleşme olduğu seyreltme
      N1=% 50'nin altında nötrleşme
      N2=% 50'nin üzerinde nötralleşme
    3. Log10 NT50'nin antilogunu formülle hesaplayın:
      NT50= 10log10(NT50)
    4. Tüm alanların (ortalama±SD) grafiğini çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huh7 hücrelerinin g1-HEV ile enfekte edilmesi ve virüs karakterizasyonu

G1-HEV, gösterildiği gibi bir dizi adımla dışkı örneğinden izole edildi (Şekil 1A). Temizlenmiş g1-HEV'in genom kopya numarası RT-qPCR ile tahmin edildi, ardından -80 °C olarak depolama yapıldı. Viral enfeksiyon ve çoğalmayı doğrulamak için, Huh7 hücreleri 72 saat boyunca 1.8 × 104 genom kopyası eşdeğeri olan g1-HEV stokuyla enfekt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT, antikorların nötralize edici potansiyelini tahmin etmek için immünboyama temelli bir yöntemdir. Dengue virüsü (DENV), Şiddetli Akut Respirator Sendromu Koronavirüs-2 (SARS-CoV-2) ve Japon ensefalit virüsü (JEV) dahil olmak üzere birden fazla virüse karşı antikorların NT50 değerlerini tahmin etmek için kullanılmıştır23,24,25. Bu yöntemde, virüs bir test antikoru (veya serum) ile ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, kısmen Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Endüstrisi Araştırma Yardım Konseyi'nden MS, S ve BN'ye verilen bir hibe ile finanse edilmiştir. MS laboratuvarındaki araştırmalar, Translasyonel Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Enstitüsü'nden alınan temel bir hibe ile desteklenmektedir. SA, Hindistan Hükümeti Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından finanse edilen Proje Araştırma Bilimcisi pozisyonu tarafından desteklenmektedir. UB, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bakanlığı'ndan Kıdemli Araştırma Bursu ile desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4',6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNAGenscript tarafından özel sentezlendi ve laboratuvarımızda karakterize edildi14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband ve katkıda bulunanlar, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells

Related Articles