Yöntem makalesi

Sentetik bir K2P Kanalının Kaydı için Minyatürize Edilmiş Montal–Mueller Planar Lipid Çift Tabakası Sistemi Kullanılarak Tek Kanallı Elektrofizyoloji

3 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69903

⸱

9 Ekim 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Pavia, 2Elements S.r.l.

Bu makalede

Özet

Bu protokol, kararlı tek kanal kayıtları gerçekleştirmek için entegre amplifikasyona sahip minyatürleştirilmiş bir Montal–Mueller düzlemsel lipid çift katman sisteminin kullanımını açıklamaktadır. Yöntem, sistem performansını doğrulamak amacıyla saflaştırılmış sentetik bir K2P kanalının yeniden konstitüe edilmesiyle gösterilmiştir.

Özet

İyon kanallarının düzlemsel lipid çift tabakalara fonksiyonel rekonstitüsyonu, kanal aktivitesinin tek molekül düzeyinde incelenmesi için bir strateji sağlar. Ancak, geleneksel Montal–Mueller çift tabaka sistemleri genellikle hantal deneysel düzenekler, manuel hazne kurulumu ve nispeten büyük kayıt hacimleri gerektirir; bu durum reaktif tüketimini artırır ve uzatılmış kablolama ile harici kafa katları nedeniyle ek elektriksel gürültü kaynaklarına yol açabilir. Burada, azaltılmış reaktif tüketimi ve basitleştirilmiş operasyon ile stabil tek kanal kayıtlarına olanak tanıyan, kompakt bir amplifikatör ile entegre edilmiş minyatürize, kullanıma hazır bir çift tabaka platformu (BLMchipMM) sunuyoruz. Bu protokol, tek kanal elektrofizyoloji ölçümleri gerçekleştirmek için bu sistemin kullanımını açıklamaktadır. Bu sistemi kullanarak, sentetik bir K2P kanalını (ancTREK1) rekonstitüe ettik ve bunu rekonstitüsyon ile tek kanal kaydını doğrulamak için bir prensip kanıtlama test proteini olarak kullandık. Tek kanal kayıtları, Mg2+-içermeyen simetrik K+ çözeltilerinde, TREK1 kanalları için rapor edilenlerle tutarlı iletkenlik değerlerine sahip bir akım-gerilim ilişkisi göstermektedir. Bu K2P-benzeri kanalın başarılı rekonstitüsyonu, sistemin yapay membranlarda tek kanal analizi için faydasını kanıtlamaktadır.

Giriş

Siyah lipid membranlar (BLM'ler) olarak da bilinen yapay lipid çift tabakalı membranlara iyon kanallarının yeniden yapılandırılması, iyon kanallarının tek molekül düzeyinde elektrofizyolojik karakterizasyonunu gerçekleştirmek için kullanılan yerleşik tekniklerden biridir1. BLM'lerin avantajları yapısal özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Nitekim, polar olmayan bir yüzeydeki bir gözenek içinde, iki sıvı çözeltiyi birbirinden ayıran düzlemsel bir lipid çift tabakası (PLB) oluşturulur. Böylece, biyolojik bir membranı taklit ederek, membran lipid kompozisyonu ve elektrolit veya kimyasal bileşik konsantrasyonları dahil olmak üzere yüksek düzeyde kontrollü koşullar altında, her iki taraftan da erişilebilir kalarak iyon kanalı aktivitesinin kaydedilmesine olanak tanır. Bu erişilebilirlik aynı zamanda iyon kanallarının, örneğin miseller bir çözeltiden veya lipozom aracılı füzyon ile doğrudan yerleştirilmesine imkan sağlar2,3.

Tanımlanan ilk yapay membran sistemi, uçucu olmayan bir organik çözücü içinde çözülmüş bir lipid damlasının bir fırça yardımıyla küçük bir açıklığa uygulandığı boyama tekniği4 kullanılarak oluşturulmuştur. Açıklığın her iki yanına sulu bir çözeltinin eklenmesi, bir lipid çift katmanının kendiliğinden oluşmasını sağlar. Ancak bu yöntemin önemli bir dezavantajı, membran özelliklerini etkileyebilecek çözücü kalıntılarının kalmasıdır. Lipid çift katmanları içindeki kalıntı organik çözücü miktarını azaltmak için, "çözücüsüz" BLM'lerin oluşumuna olanak tanıyan katlama yöntemi5 geliştirilmiştir. Bu yaklaşımda, uçucu bir çözücü içindeki lipid çözeltisi su yüzeyine yayılarak iki tek katman oluşturulur ve sulu fazın seviyesi açıklığın üzerinde kademeli olarak yükseltilerek, bu lipid tek katmanlarının açıklık üzerinden katlanıp bir çift katman oluşturması sağlanır. Bununla birlikte, ortaya çıkan BLM çözücüsüz olarak tanımlansa da, başarılı bir çift katman oluşumu için açıklığın uçucu olmayan bir çözücünün ince bir tabakasıyla ön işlemeden geçirilmesi gerekir. Bu deneyler için gereken temel unsur, küçük bir açıklığa (50–250 µm çapında) sahip lipofilik bir septuma sahip iki sulu bölmeden (genellikle cis ve trans olarak adlandırılır) oluşan bir kayıt hücresidir (Şekil 1). Her bir bölmeye gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlar yerleştirilir. Elektrolit çözeltisine daldırıldıklarında bu elektrotlar, lipid çift katmanı ile kayıt cihazı arasında elektrokimyasal bağlantı kurar. Kayıt cihazı, transmembran potansiyelinin hassas kontrolünü ve gömülü por oluşturucu proteinlerden geçen iyonik akımların eş zamanlı ölçümünü sağlayan bir voltaj-clamp amplifikatöründen oluşur.

figure-introduction-1
Şekil 1: Planar lipid çift tabaka (PLB) elektrofizyoloji düzeneğinin şeması. PLB deneyleri için gerekli temel bileşenlerin şeması. Kayıt odası, lipid çift tabakanın oluşturulduğu bir açıklık içeren lipofilik bir septum ile birbirinden ayrılmış iki sulu bölmeden (cis ve trans) oluşur. Her bölmedeki elektrolit çözeltiye gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrotlar daldırılmıştır. Elektrotlardan biri voltaj uyaranları (örneğin sinüs, kare veya üçgen dalga formları) uygular; topraklanan diğer elektrot ise iyonik akımı orantılı bir voltaj sinyaline dönüştüren bir akım-voltaj dönüştürücüye bağlanır. Sinyal yükseltilir, isteğe bağlı olarak filtrelenir, dijitalleştirilir ve gerçek zamanlı izleme ve analiz için kaydedilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

BLM'leri oluşturmak için başka yöntemler de geliştirilmiştir. Bunlar arasında yaygın bir yaklaşım, bir patch-clamp pipetinin ucunda asılı lipid çift tabakaları oluşturmaktan oluşur. Buna göre, tip-dip yöntemi6, pipetin ucunun hava-su arayüzündeki bir lipid tek tabakasına tekrar tekrar daldırılmasıyla, böylece her geçişte tek bir yaprak yakalanarak, ~4 µm çapındaki bir cam mikropipet açıklığında asılı, çözücüsüz bir lipid çift tabakasının oluşmasını sağlar. Patch-clamp tekniği, lipid çift tabakalarda tek kanal ölçümleri için de kullanılmıştır. Örneğin, punch-out yönteminde7, bir kayıt odasındaki açıklık üzerine başlangıçta boyanmış geniş bir membranı yamalamak için 10 ile 80 µm arasında çapta bir cam pipet kullanılır. Alternatif olarak, lipozom-patch yöntemi, çözücüsüz bir BLM olarak önceden oluşturulmuş nano ila mikro boyutlu bir vezikülün kullanımını içerir8,9. Özellikle, hücreye yapışık ve eksize patch modları dahil olmak üzere farklı patch-clamp konfigürasyonları aracılığıyla tek kanal kayıtları için dev unilameller veziküller yaygın olarak kullanılmıştır10,11.

Birden çok çift tabakanın paralel ve otomatik olarak oluşturulması için çeşitli platformlar da ortaya çıkmıştır. Bu yaklaşımlardan biri, sulu damlacıkların bir lipid-solvent karışımına yerleştirildiği damlacık arayüzey çift tabakası (DIB) tekniğidir12. Bu yöntemde, lipid tek tabakaları damlacıkların etrafında kendiliğinden düzenlenir ve iki damlacık temas ettiğinde çift tabaka oluşumu gerçekleşir. Bazı düzeneklerde, membran stabilitesini artırmak için hidrojeller üzerinde DIB'ler oluşturulabilmektedir13. Bir cam pipet ucunda DIB oluşumuna dayanan alternatif bir yaklaşım ise, iki mikropipet kullanılarak bir yağ fazına sulu kabarcıkların verildiği temas kabarcık çift tabakası (CBB) yöntemidir14. DIB yaklaşımında olduğu gibi, lipid kaplı iki kabarcık temas ettirildiğinde kendiliğinden bir lipid çift tabakası oluşur. Bir diğer platform ise, bir ızgara düzeninde yerleştirilmiş, iyi tanımlanmış mikro ila nano ölçekli gözenek dizilerinden oluşan dizili BLM sistemleri ile temsil edilir. Bu sistemlerde, askıda lipid çift tabakaları; ya boyama veya katlama teknikleri kullanılarak manuel olarak ya da lipozom vezikül yırtılması yoluyla15,16,17 veya mikroakışkan kanal yapılarıyla birleştirildiğinde lipid ve tampon çözeltilerinin ardışık enjeksiyonu ile otomatik olarak oluşturulabilir18,19.

Çözücü içermeyen BLM'ler oluşturmak için birçok yöntem geliştirilmiş olsa da, bu çalışmada, yapay bir lipid çift tabakasına gömülmüş membran proteinlerinin tek kanallı davranışını incelemek amacıyla, minyatürize edilmiş ve entegre bir platformda uygulanan katlama yöntemine odaklanıyoruz. Deneyler, iki bileşenden oluşan Elements düzeneği kullanılarak gerçekleştirilmiştir: Elements Nanopore Reader (eNPR amplifikatörü) ve BLMchipMM (Şekil 2A ve Şekil 2B). İlki, eksiksiz ve bağımsız bir ünite oluşturarak çalışma alanını basitleştiren ve ek harici cihazlara olan ihtiyacı ortadan kaldıran kompakt, düşük gürültülü bir voltaj-clamp amplifikatörüdür. BLMchipMM, Montal–Mueller tekniği için tasarlanmış, önceden monte edilmiş ve minyatürize edilmiş bir sistemdir ve deneysel arayüz görevi görür. Bu sistem, amplifikatöre doğrudan bağlantı için elektrot görevi gören Ag/AgCl telleri yerleştirmek üzere tasarlanmış iki soket içeren bir baskı devre kartı (PCB) ile entegre edilmiş şeffaf bir polimetil metakrilat (PMMA) kayıt odasından oluşur. Odanın çekirdek yapısı, iki şeffaf PMMA bileşeni arasında sızdırmaz hale getirilmiş bir poliimid septumdan oluşur. Septum, çift tabaka oluşumunu kolaylaştırmak için kalınlığın 25 µm'ye düşürüldüğü küçük bir merkezi bölge (3,78 mm2) hariç 50 µm kalınlığındadır. Bu daha ince bölgenin merkezinde, lipid çift tabakasının mekanik stabilitesini artıran, lazer delme ile oluşturulmuş konik bir açıklık bulunur20,21. Membran kapasitansının ayarlanmasına olanak tanıyan dört farklı açıklık çapı (50, 75, 100 ve 140 µm) mevcuttur (Tablo 1). Her bir PMMA bileşeni, elektrolit çözeltisini tutmak için poliimid septumun her iki yanında iki akışkan bölme oluşturan 110 µL hacminde C şeklinde bir boşluğa sahiptir. Her bir PMMA bloğunun zıt taraflarına iki eğimli akışkan kanal delinmiştir: kanallardan biri Ag/AgCl elektrodunu yerleştirmek için kullanılırken, diğeri rezervuar içindeki tampon seviyesinin pipetleme yoluyla manuel olarak ayarlanmasına olanak tanır.

figure-introduction-2
Şekil 2: Entegre Elements Nanopore Reader ve BLMchipMM sistemi. (A) BLMchipMM'nin Elements Nanopore Reader (eNPR) amplifikatörünün özel yuvasına yerleştirilmiş halini gösteren fotoğraf. (B) Polimetil metakrilat (PMMA) kayıt odası, mikro boyutlu açıklığı içeren poliimid septum ve Ag/AgCl elektrotlar için soketler ile oda hizalaması için bir yuva içeren baskılı devre kartı (PCB) dahil olmak üzere BLMchipMM bileşenlerinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Delik çapı (µm)5075100140
Delik kalınlığı (µm)25252525
Tipik membran kapasitansı (pF)20–4040–6060–9090–140

Tablo 1: Mevcut BLMchipMM açıklık formatlarının özellikleri. 50, 75, 100 ve 140 µm açıklığa sahip BLMchipMM cihazları için delik çapı, açıklık bölgesindeki septum kalınlığı ve tipik membran kapasitans değerleri. Membran kapasitans değerleri, 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine lipidlerinden oluşturulan çift katmanlar için gösterilmiştir.

Laboratuvarlarda kullanılan kayıt odacıkları tipik olarak ya el yapımı ünitelerdir ya da ticari olarak temin edilebilen cihazlardır. İlk durumda, sistemin inşası çeşitli bileşenlerin birleştirilmesini ve septuma açıklık oluşturmak için güvenilir bir yöntemin geliştirilmesini gerektirir; bu durum birçok laboratuvar için erişilebilirliği kısıtlayabilir. Ticari cihazlar kullanıldığında bile, bunlar genellikle her deney öncesinde birden fazla bileşenin manuel olarak entegre edilmesini gerektirir. Buna karşılık, BLMchipMM önceden monte edilmiştir ve rutin temizleme prosedürleri için deneyler arasında sökülme gerektirmez. Kullanılan çözücülerin cihaz malzemeleriyle uyumlu olması kaydıyla, aynı ünite membran oluşum kalitesinden ödün vermeden yıkanabilir ve birden fazla deney için yeniden kullanılabilir. Bu, kullanıcıya bağlı değişkenliği azaltır ve manuel sızdırmazlık elemanlarıyla ilişkili sızıntı riskini en aza indirir. Harici, değiştirilebilir ve yenilenebilir gümüş tel elektrotların kullanımı, özellikle elektrot tüketimini hızlandıran deneysel koşullar altında, sistemin kullanılabilir ömrünü daha da uzatır.

Dahası, ev yapımı cihazlar genellikle geniş bölme hacimlerine sahiptir ve bu durum deneyler için gereken biyolojik ve kimyasal bileşen miktarını artırır. Buna karşılık, BLMchipMM'nin minyatürize edilmesi, deneysel hacimlerin minimize edilmesine olanak tanıyarak reaktiflerin, proteinlerin ve diğer bileşiklerin tüketimini önemli ölçüde azaltır. Bu durum, özellikle ekspresyonu zor veya düşük verimli membran proteinleriyle çalışırken ya da test bileşiklerinin sentezleme maliyetinin deneylerin genel maliyetini artırdığı durumlarda oldukça avantajlıdır. Önemli bir nokta olarak BLMchipMM, solventi minimize edilmiş çift tabakaların oluşumuna imkan tanır ve her bir yaprağın farklı lipid türlerinden oluşabildiği asimetrik membran konfigürasyonlarını destekleyerek5,22, membran protein fonksiyonlarının kontrollü koşullar altında incelenmesini kolaylaştırır.

Geleneksel olarak akım ölçümleri, genellikle veri toplama için ayrı bir dijitalleştiriciye bağlanmayı ve grafik arayüzler üzerinden kontrolü gerektiren, patch-clamp deneyleri için tasarlanmış amplifikatörler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sistemler sadece hantal ve pahalı olmakla kalmaz, aynı zamanda uzman olmayan kullanıcılar için sıklıkla sezgisel olmayan kurulum prosedürleri içerir. Ek olarak, kayıt odasının boyutu ve kafa katı girişini elektrostatik girişime karşı korumak için genellikle yerleşik korumaya sahip olmayan standart amplifikatörlerin tasarımı nedeniyle, harici bir Faraday kafesi kullanımı sıklıkla gereklidir. Böyle bir kafesin kalitesi ve topraklaması, sistemin gürültü performansını önemli ölçüde etkileyebilir. Kompakt entegre bir amplifikatör ile birlikte kullanıldığında BLMchipMM, harici bileşenlere olan ihtiyacı azaltarak bu konfigürasyonu basitleştirir. Sinyal dijitalleştirmesi cihaz içinde gerçekleşir ve sistem kasası, ortamdaki elektromanyetik girişime karşı duyarlılığı azaltan bir koruma sağlar.

Bu platformun uygulanabilirliğini göstermek için, TREK alt ailesinin bilgisayarla türetilmiş atasal bir üyesi olan K2P benzeri kanal ancTREK1 (Ek Şekil 1), başarılı yeniden yapılandırmayı ve tek kanal kaydını doğrulamak amacıyla test proteini olarak kullanılmıştır. K2P kanalları, dinlenme membran potansiyelini ve hücresel uyarılabilirliği düzenleyen dimerik potasyum sızıntı kanalları oluşturur ve TREK kanalları iyi tanımlanmış bir alt familyayı temsil eder.

Protokol

Bu çalışma insan katılımcıları, insan kaynaklı materyalleri veya hayvan denekleri içermemiştir. Sonuç olarak, kurumsal ve ulusal kılavuzlar uyarınca etik onay gerekmemiştir.

1. Elektrofizyoloji Düzeneklerini Hazırlayın

  1. Enstrüman kalibrasyonu
    ​Sistem fabrikada konfigüre edildiği için resmi bir kalibrasyon gerekli olmasa da, membran oluşumundan önce sistemin düzgün çalıştığını doğrulayın.
    1. Açık devre koşulları altında (yani BLMchipMM takılı değilken) giriş direncini ölçün. Ölçülen direnç ≥1 TΩ olmalı ve bu durum amplifikatör giriş bütünlüğünün uygun olduğunu doğrulamalıdır.
    2. 1 GΩ'luk bir direnç içeren model bir hücre kullanarak sistem yanıtını doğrulayın. Ölçülen direnç, entegre direncin toleransı ile uyumlu olarak ±30% dahilinde 1 GΩ olmalıdır.
    3. Sabit voltajda (0 mV) açık devre koşulları altında taban gürültüsünü ölçün. RMS gürültüsü, 10 kHz örnekleme hızı ve 5 kHz bant genişliğinde ≤300 fA olmalı ve bu durum düşük gürültülü sistem performansını doğrulamalıdır.
  2. Ag/AgCl elektrotların hazırlanması
    1. İlk kullanım için gümüş telleri etanol ve çift distile su ile durulayın.
    2. Daha önce kullanılmış teller için, tel yüzeyindeki eski Ag/AgCl tabakasını, yüzey tekdüze parlak gümüş renkte, temiz bir metalik parlaklıkta ve görünür kalıntı olmaksızın ortaya çıkana kadar ekstra ince kumlu bir zımpara ile temizleyin. Ardından etanol ve çift distile su ile durulayın.
    3. Gümüş tellerin uç kısımlarını, açık gri renk alana kadar, tipik olarak 15–30 dk boyunca %1–5 sodyum hipoklorit (NaOCl) içerisinde bekleterek klorlayın (Şekil 3A). Klorlanmış tellerin kullanım sırasındaki bozulmasını (renk değişimi, taban akımında kayma veya her ikisi şeklinde görülür) zaman içinde izleyin.
      NOT: Klorlama işlemi yaygın ev tipi çamaşır suyu (%1–5 NaOCl) kullanılarak gerçekleştirilebilir.
      UYARI: Telleri tüm uzunlukları boyunca klorlamayın. Uygun elektriksel bağlantıyı sağlamak için PCB yuvasına giren uç kısmı klorlanmamış olarak bırakın.
      ​UYARI: PCB üzerindeki yuvalar 0,5 mm çapındaki gümüş teller için tasarlanmıştır. Diğer çaplar uygun şekilde oturmayabilir veya kararsız bağlantılara neden olabilir.
  3. BLMchipMM'nin monte edilmesi
    1. İki gümüş telin klorlanmamış uç kısımlarını PCB yuvalarına yerleştirin. Doğru konumlandırmak için gerekirse cımbız kullanın (Şekil 3B).
    2. Tellerin klorlanmış uçlarını PMMA bileşeninde delinmiş olan akışkan kanallarına yerleştirin (Şekil 3C).
    3. BLMchipMM'yi dikkatlice döndürün ve PMMA kayıt odasının alt dişini özel yuvasına oturtarak PCB üzerine monte edin (Şekil 3D).
    4. Tellerin konumunu kontrol edin ve akışkan kanallarının sonuna ulaştıklarından emin olun. Gerekirse, uçlar bölmelerin altında görünene kadar telleri hafifçe itin (Şekil 3E).
      ​UYARI: Telleri PMMA bileşenine mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Aşırı bükülme, amplifikatör kapağıyla temasa neden olarak kısa devreye ve sinyal doygunluğuna yol açabilir.
  4. Lipidlerin ve kayıt solüsyonunun hazırlanması
    1. Septum açıklığını ön işlemden geçirmek için %100 n-hekzan içerisinde %1 (v/v) heksadekan solüsyonundan 100 µL hazırlayın. Bu solüsyonu −20°C'de bir haftaya kadar saklayın.
    2. 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) lipidlerini %100 n-pentan içerisinde 15 mg/mL nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde yeniden süspanse edin. Bu solüsyonu −20°C'de 24 saate kadar saklayın.
    3. 3 mL 1 M KCl stok solüsyonu ile 150 µL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid stok solüsyonunu (pH'ı pH metre kullanılarak KOH ile 7,4'e ayarlanmış) karıştırarak elektrolit kayıt solüsyonunu oda sıcaklığında (RT; 20°C–25°C) hazırlayın. Nihai hacmi 15 mL'ye tamamlamak için çift distile su ekleyin. Solüsyonu 4°C'de bir haftaya kadar saklayın (Tablo 2).

figure-protocol-1
Şekil 3: BLMchipMM cihazının montajı. (A) Ag tellerin çamaşır suyunda bekletilerek klorlanması. (B) Ag tellerin PCB soketlerine yerleştirilmesi. (C) Ag tellerin mikroakışkan kanallara konumlandırılması. (D) Kayıt odasının PCB üzerine yerleştirilmesi. (E) Akışkan kanallar içindeki elektrot konumlandırmasının doğrulanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ReaktifFinal konsantrasyonHacim
Çift distile su—15 mL'ye tamamla
Potasyum klorür (KCl) (1 M)200 mM3 mL
HEPES pH 7.4 (KOH) (1 M)10 mM150 µL

Tablo 2: Elektrolit kayıt çözeltisi. Reaktif konsantrasyonları ve hazırlama hacimleri dahil olmak üzere, PLB kayıtları için kullanılan elektrolit çözeltisinin bileşimi. Final hacmi, çift distile su ile 15 mL'ye tamamlanır. Kayıt çözeltisi, kullanımdan önce 0.2 µm şırınga filtresi kullanılarak filtrelenmelidir.

NOT: Kayıt solüsyonunu kullanmadan önce 0.2 µm şırınga filtresinden geçirin. DPhPC lipidleri kuru toz şeklinde veya kloroform içinde çözünmüş olarak temin edilebilir. Oksidasyonu önlemek için her iki formu da −20°C'de, sızdırmaz cam flakonlarda, inert gaz altında saklayın. Kuru tozun açılmadan önce RT'de dengelenmesini sağlayın. Kuru tozdan taze solüsyonlar hazırlayın ve 24 h içinde kullanın. Kloroform stokları kullanılıyorsa, kalıntı kloroform membranı destabilize edebileceği için resüspansiyon öncesinde solventi nitrojen altında tamamen buharlaştırın.

2. Montal–Mueller yöntemiyle PLB oluşturma

Aşağıdaki adımlar, Montal–Mueller tekniği5 olarak da adlandırılan katlama yöntemi kullanılarak yapay membran oluşumunu açıklamaktadır (Şekil 4). Bu yaklaşım, septum açıklığının %1 (v/v) n-hekzan içinde heksadekan içeren ince bir tabaka ile ön işlemden geçirilmesini, hava-su ara yüzeyinde tek tabakalar oluşturmak için bir lipid çözeltisinin biriktirilmesini ve elektrolit çözeltisi seviyesi hazne bölmelerinde sırayla yükseltilirken tek tabakaların açıklık üzerine katlanmasını içerir.

figure-protocol-2
Şekil 4: Montal–Mueller yöntemi kullanılarak PLB'lerin oluşturulması. (A) Açıklığın %1 heksadekan içeren n-hekzan ile ön işlemi ve bölmelerin açıklık seviyesine kadar doldurulması. (B) Hava-su ara yüzeyinde lipid tek tabakaların oluşumu. (C ve D) Her bir bölmedeki tampon seviyesinin ardışık olarak yükseltilmesi, tek tabakaların katlanmasına ve açıklık boyunca çözücü içermeyen bir lipid çift tabakanın oluşmasına yol açar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Membranı oluşturun
    1. Septum açıklığını, bir pipet ucu kullanarak n-hekzan içindeki %1 (v/v) heksadekan çözeltisi ile ön işlemden geçirin. Her tarafa yaklaşık 2 µL uygulayın (Şekil 4A).
    2. Çözücünün 23°C–25°C sıcaklıkta ve %45%–50% bağıl nemde 5 dk boyunca buharlaşmasını bekleyin.
    3. Montajı tamamlanmış BLMchipMM'yi amplifikatöre yerleştirin.
    4. Amplifikatörü bir USB kablosu aracılığıyla bilgisayara bağlayın ve veri toplama yazılımını açın.
    5. Akım aralığını 2 nA olarak ayarlayın ve membran kapasitansı ile direncini izlemek için RC kestirim aracını etkinleştirin.
      NOT: RC kestirim ayarları varsayılan olarak yapılandırılmıştır ancak gerekirse ayarlanabilir.
    6. Her bir bölmeyi, açıklığın alt kenarına kadar 30 ± 2 µL kayıt çözeltisi ile doldurun (Şekil 4A).
      DİKKAT: Kayıt çözeltisinin açıklığı çevreleyen bölgeyi ıslatmasına izin vermeyin.
    7. Her bölmedeki sulu fazın yüzeyine damla damla 2,5 ± 0,1 µL lipid çözeltisi yayın (Şekil 4B).
    8. Çözücünün 2 dk boyunca buharlaşmasını bekleyin.
    9. Bir bölmenin altına yaklaşık 90° açıyla bir pipet ucu yerleştirin ve 80 ± 2 µL kayıt çözeltisi ekleyin. Aynı işlemi ikinci bölme için tekrarlayın (Şekil 4C ve Şekil 4D).
      NOT: Çözücü buharlaşma süreleri 23°C–25°C sıcaklık, durağan hava ve %45%–50% bağıl nem koşulları için geçerlidir.
    10. Faraday kafesi kapağını kapatın ve akım sinyalini izleyin. 200 GΩ üzerindeki membran direnç değerleri, başarılı bir çift tabaka oluşumunu ve iyi bir membran bütünlüğünü gösterir.
      NOT: Başarılı membran oluşumu, genliği membran kapasitansı ile orantılı olan ve sıfır civarında dalgalanan kare dalga şeklinde bir akım sinyali ile belirtilir (Şekil 5A).

figure-protocol-3
Şekil 5: Edinme yazılımı arayüzü kullanılarak membran oluşumunun izlenmesi. (A) Başarılı membran oluşumunu gösteren temsili iz. Üçgen bir voltaj dalga formu (100 mV peak-to-peak, 10 Hz), membran kapasitansı ile orantılı (~45 pF) kare dalga kapasitif akım üretir. (B) Akım sinyalinin doygunluğu ile karakterize edilen, membran oluşumunun olmadığını belirten temsili iz. (C) Apertür açığa çıktığında olduğu gibi, çift katman oluşmadığında sızıntı kapasitansı ile ilişkili kapasitif sinyal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Akım aralığı limitleri arasında geçiş yapan bir sinyal, membran arızasına işaret eder (Şekil 5B).

NOT: RMS gürültüsü membran kapasitansı ile ve dolayısıyla açıklık boyutuyla birlikte artar. Sabit voltaj koşulları (0 mV) altında, 5 kHz örnekleme hızı ve 2.5 kHz bant genişliğinde ölçülen tipik gürültü aralıkları şunlardır: 0.48–2.00 pA (50 µm); 0.74–2.62 pA (75 µm); 1.00–3.52 pA (100 µm); ve 1.59–5.27 pA (140 µm).

NOT: İlk denemeler başarısız olursa, bir bölmedeki tampon seviyesinin düşürülmesi ve yükseltilmesi membran oluşumunu teşvik edebilir.

NOT: Gerektiğinde, çift katman oluşumunu kolaylaştırmak için bir pipet ucu kullanarak açıklığın üzerine ~5 s boyunca bir hava kabarcığı uygulayın.

NOT: Tampon seviyesinin açıklığın altına düşürülmesi veya bir hava kabarcığının oluşması, kaçak kapasitansa karşılık gelen bir sinyal üretebilir (Şekil 5C). Çıktı Şekil 5B'ye benziyorsa, ön işlem etkisiz kalmış olabilir. Ön işlem solüsyonunu ve lipidleri yeniden uygulayın veya cihazı temizleyip prosedürü tekrarlayın.

DİKKAT: Voltaj ofset kompanzasyonunu yalnızca membran yokken gerçekleştirin. Eğer bir membran mevcutsa, kompanzasyondan önce ZAP fonksiyonunu kullanarak membranı yırtın.

NOT: Deneyler standart bir laboratuvar tezgahında gerçekleştirilebilir; ancak gerekirse titreşim önleyici bir masa kullanılabilir.

3. BLMchipMM'yi Temizleyin

  1. Kayıt odasını PCB'den çıkarın.
  2. Her iki bölmeyi ve akışkan kanallarını %100 izopropil alkol (IPA) ile yıkayın.
    UYARI: IPA'ya maruz kalma süresinin 1 dk'yı geçmemesine dikkat edin.
    UYARI: Aseton veya %100 etanol kullanmayın; bu çözücüler odanın sızdırmazlık malzemesine zarar verebilir.
    NOT: Kullanmadan önce ek çözücülerin PMMA ile uyumluluğunu doğrulayın.
  3. Çift distile su ile iyice durulayın.
  4. Görünür su damlacıkları kalmayana kadar, kayıt odasını hafif bir basınçlı hava akımı kullanarak tamamen kurulayın.
    NOT: Herhangi bir kalıntı yağlı film bulunmadığından emin olmak için odayı ışıklı bir büyüteç altında inceleyin. Gerektiğinde temizleme ve kurutma işlemini tekrarlayın.
    NOT: Yeni bir deneye başlamadan önce odanın tamamen temiz ve kuru olduğundan emin olun.

4. Sentetik İyon Kanalının (ancTREK1) Ekspresyonu ve Saflaştırılması

  1. Ekspresyon konstrüktünün hazırlanması
    Aşağıdaki adımlar klonlama stratejilerini, Freestyle-293F hücrelerinde heterolog ekspresyonu ve ancTREK1 proteininin saflaştırılmasını açıklamaktadır.
    ​PCR amplifikasyonu, restriksiyon enzimi sindirimi, ligasyon ve kimyasal olarak kompetan Escherichia coli hücrelerine transformasyon kullanarak ekspresyon vektörünü oluşturun23,24. Floresan tabanlı tespite25,26 ve öncelikle nikel-nitrilotriasetik asit (Ni2⁺-NTA reçinesi)27,28,29 ve ardından anti-GFP nanobody reçinesi30,31,32 kullanılarak gerçekleştirilen iki aşamalı afinite saflaştırmasına olanak tanıyan, C-terminal GFP etiketi ve His₈ etiketi içeren bir memeli vektörü kullanarak ancTREK1 dizisini (Ek Şekil 1) eksprese edin.
  2. ancTREK1 DNA'sının PCR ile amplifikasyonu
    1. Steril çift distile su kullanarak PCR primerlerini ve DNA şablonunu sırasıyla 10 µM ve ~20 ng/µL nihai konsantrasyonlara seyreltin.
    2. Tüm reaktifleri buz üzerinde çözdürün.
    3. 10 µL 5× tampon, her birinden 2,5 µL 10 µM primer, 2 µL DNA şablonu, 1 µL 10 mM dNTP, 0,5 µL high-fidelity DNA polimeraz ve hacmi tamamlamak için steril çift distile su içeren 50 µL'lik bir PCR reaksiyonu hazırlayın (Tablo 3). Nazikçe karıştırın ve kısa süreli santrifüjleyin.
    4. PCR işlemini şu koşullarda gerçekleştirin: 98°C'de 3 dk başlangıç denatürasyonu; 98°C'de 30 sn, 68°C'de 30 sn ve 72°C'de 30 sn'lik 30 döngü; 72°C'de 3 dk nihai uzama (Tablo 4).
    5. PCR ürününü 1× TAE tamponu içeren %1 (w/v) agaroz jelde 60 V'ta 90 dk boyunca yürütün ve doğru bandı kesin.
      ​NOT: PCR ürünlerini jel ekstraksiyon yöntemiyle saflaştırın, DNA konsantrasyonunu 260 nm'de ölçün ve gerekirse saflaştırılmış PCR ürünlerini −20°C'de saklayın.
  3. Restriksiyon sindiriminin gerçekleştirilmesi
    1. Ayrı tüplerde 2 µg PCR ürünü ve 2 µg plazmit DNA içeren sindirim reaksiyonları hazırlayın. 5 µL 10× tampon, 0,5 µL EcoRI ve 0,5 µL NotI restriksiyon enzimleri ekleyin ve çift distile su ile 50 µL'ye tamamlayın (Tablo 5).
    2. Nazikçe karıştırın ve 37°C'de 3 saat inkübe edin.
    3. Enzimleri 65°C'de 20 dk ısıtarak inaktive edin.
    4. Vektör sindirimine 1 µL alkalin fosfataz ekleyin ve 37°C'de 1 saat inkübe edin.
    5. Sindirilen ürünleri %1'lik agaroz jelde yürütün ve istenen bantları ekstrakte edin.
      ​NOT: DNA fragmanlarını uygun saflaştırma yöntemleri kullanarak saflaştırın ve gerekirse saflaştırılmış DNA'yı −20°C'de saklayın.
  4. Ligasyon ve transformasyonun gerçekleştirilmesi
    1. Vektör ve insert (3:1 molar oran), 2 µL 10× ligaz tamponu ve 1 µL ligaz enzimi içeren 20 µL'lik bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın (Tablo 6).
    2. Oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
    3. Kimyasal olarak kompetan E. coli hücrelerini buz üzerinde çözdürün.
    4. 50 µL hücreye 5 µL ligasyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde 20 dk inkübe edin.
    5. 42°C'de 1 dk ısı şoku uygulayın, ardından 2 dk boyunca buza geri döndürün.
    6. 450 µL LB besiyeri ekleyin ve 37°C'de çalkalamalı olarak 1 saat inkübe edin.
    7. 3.000 × g'de 1 dk santrifüjleyin ve pellet'i 50 µL içerisinde resüspande edin.
    8. Selektif agara ekim yapın ve 37°C'de gece boyunca inkübe edin.
      ​NOT: Başarılı klonlamayı sekanslama ile doğrulayın.
  5. HEK293F hücrelerinin transfeksiyonu
    1. 250 mL 293F hücresini serumsuz süspansiyon besiyerinde 0,5 × 106 hücre/mL yoğunluğunda ekim yapın ve %6 CO₂ ile 37°C'de inkübe edin.
    2. 3 mL'lik nihai hacimde düşük serumlu besiyeri içerisinde 250 µg DNA hazırlayın.
    3. Su içerisinde 1 mg/mL konsantrasyonda 750 µg polietilenimin (PEI) hazırlayın, pH'ı NaOH ile 6,9–7,1'e ayarlayın, çözeltiyi steril filtreleyin ve nihai hacmi düşük serumlu besiyeri ile 3 mL'ye tamamlayın.
    4. DNA ve PEI çözeltilerini birleştirin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dk inkübe edin.
    5. Karışımı hücrelere damla damla ekleyin.
    6. 4 saat sonra nihai konsantrasyonu 10 mM olacak şekilde sodyum bütirat ekleyin.
    7. 48 saat sonra hücreleri 500 × g'de 15 dk santrifüjleyerek hasat edin.
    8. Hücre pelletlerini −80°C'de saklayın.
  6. Membran proteinlerinin solubilize edilmesi
    1. 100 mL HEK293 kültüründen elde edilen hücre pelletlerini buz üzerinde çözdürün.
    2. Hücre pelletini 1:10 (w/v) oranında lizis tamponu içerisinde resüspande edin (Tablo 7).
      %1 n-dodesil-β-D-maltosid (DDM) ve %0,1 kolesteril hemisüksinat (CHS) nihai konsantrasyonlarında deterjan ekleyin.
    3. 4°C'de 2 saat rotasyonla inkübe edin.
    4. 4°C'de 100.000 × g'de 1 saat santrifüjleyin.
    5. Süpernatantı toplayın.
      DİKKAT: Tüm adımları önceden soğutulmuş tamponlar kullanarak 4°C'de gerçekleştirin.
  7. IMAC saflaştırmasının gerçekleştirilmesi
    1. Bir gravite kolonuna 500 µL Ni2⁺-NTA reçinesi paketleyin.
    2. Reçineyi iki kolon hacmi (CV) dengeleme tamponu ile dengeleyin (Tablo 8).
    3. Numuneyi yükleyin ve 10 rpm'de nazik karıştırma ile 4°C'de 3 saat inkübe edin.
    4. Kolonu dikey konuma getirin ve akıştan geçen sıvıyı (flowthrough) gravite akışıyla toplayın.
    5. Reçineyi 30 mM imidazol içeren 10 CV yıkama tamponu ile yıkayın.
    6. Proteini 300 mM imidazol içeren 10 CV elüsyon tamponu ile elüye edin.
      NOT: Fraksiyonları SDS-PAGE ile analiz edin (Şekil 6). Akıştan geçen ve yıkama fraksiyonlarını analiz için saklayın. Gerekirse proteini gece boyunca 4°C'de saklayın
  8. Anti-GFP saflaştırmasının gerçekleştirilmesi
    1. Bir gravite kolonuna 1 mL anti-GFP reçinesi paketleyin.
    2. Reçineyi 2 CV Tampon 1 ile dengeleyin (Tablo 9). IMAC elüatını yükleyin ve 10 rpm'de nazik karıştırma ile 4°C'de 3 saat inkübe edin.
    3. Kolonu dikey konuma getirin ve akıştan geçen sıvıyı gravite akışıyla toplayın.
    4. Reçineyi sırasıyla 10 CV Tampon 1, 10 CV Tampon 2 ve 10 CV Tampon 1 ile yıkayın.
    5. HRV-3C proteazı, 1:50 proteaz:protein oranında 2 mL Tampon 1 içerisinde seyreltin.
    6. HRV-3C proteaz ile desteklenmiş Tampon 1'i reçineye ekleyin, nazikçe karıştırın ve dikey statik konumda 4°C'de gece boyunca inkübe edin.
    7. Kesilmiş proteini elüsyon fraksiyonunda toplayın.
    8. Numuneyi, 50 kDa kesme sınırına sahip bir santrifüj konsantratörü kullanarak 3.000 × g ve 4°C'de yaklaşık 500 µL nihai hacme ulaşana kadar konsantre edin.
      NOT: Fraksiyonları SDS-PAGE ile analiz edin (Şekil 7). Agregasyonu önlemek için konsantrasyon sırasında proteini periyodik olarak resüspande edin. Saflaştırılmış proteini şok dondurma sonrası −80°C'de saklayın. 100 mL kültürden yaklaşık 60 µg protein elde edilebilir.

figure-protocol-4
Şekil 6: İmmobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) ile ancTREK1 saflaştırması. Floresan deteksiyon ile IMAC elüsyon fraksiyonlarının sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) analizi. Şerit M: moleküler ağırlık belirteci. Şerit a: yeşil floresan protein (GFP) etiketli ancTREK1'i (sarı ok) gösteren IMAC elüsyon fraksiyonu. Otoklivaj sonucu oluşan serbest GFP (*eGFP) ile belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-5
Şekil 7: anti-GFP nanobody afinite kromatografisi ile ancTREK1 saflaştırılması. Coomassie Blue ile boyanmış elüye fraksiyonların SDS-PAGE analizi. Şerit M: moleküler ağırlık belirteci. Şerit a: 3C proteaz varlığını gösteren anti-GFP elüsyon fraksiyonu. Şerit b: konsantrasyon sonrası saflaştırılmış ancTREK1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktif50 µL reaksiyon için hacimFinal konsantrasyonu
Çift distile su50 µL'ye tamamla—
5× PhusionTM GC tamponu10 µL1×
dNTP'ler (her biri 10 mM)1 µLher biri 200 µM
İleri primer (10 µM)2.5 µL0.5 µM
Geri primer (10 µM)2.5 µL0.5 µM
Kalıp DNA (20 ng/µL)2 µL0.8 ng/µL
PhusionTM High-Fidelity DNA polimeraz0.5 µL0.02 U/µL

Tablo 3: ancTREK1 amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaksiyon kurulumu. Yüksek sadakatli (high-fidelity) bir DNA polimeraz sistemi kullanılarak ancTREK1 DNA dizisinin PCR amplifikasyonu için kullanılan reaktif bileşimi, hacimler ve final konsantrasyonlar.

AdımSıcaklıkZamanDöngüler
Başlangıç denatürasyonu98°C3 dk1
Denatürasyon98°C30 sn30
Tavlama68°C30 sn30
Uzatma72°C30 sn30
Final uzatma72°C3 dk1
Bekletin12°CBekletin—

Tablo 4: ancTREK1 amplifikasyonu için PCR döngü koşulları. Denatürasyon, bağlanma, uzama ve final uzama adımlarını içeren, ancTREK1 DNA dizisinin amplifikasyonu için kullanılan termal döngü parametreleri.

Bileşenİnsert sindirimi (50 µL)Vektör sindirimi ve defosforilasyon (50 µL)
çift distile su₂Oİçin 50 µLİçin 50 µL
10× ANZA Kırmızı Tampon Çözelti5 µL5 µL
DNAancTREK1 PCR ürünü (2 µg)pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 vektör DNA'sı (2 µg)
Anza™ EcoRI0.5 µL0.5 µL
Anza™ NotI0.5 µL0.5 µL
Anza™ Alkalen Fosfataz—1 µL

Tablo 5: ancTREK1 klonlaması için insert ve vektörün restriksiyon enzimi ile sindirimi. EcoRI ve NotI enzimleri kullanılarak ancTREK1 PCR ürünü ve ekspresyon vektörünün restriksiyon sindirimi için reaksiyon koşulları. Vektör sindirimi, kendi kendine ligasyonu önlemek için alkalin fosfataz kullanılarak yapılan ek bir defosforilasyon adımını içerir.

BileşenMiktar (20 µL reaksiyon)
çift distile su₂OŞunlara: 20 µL
10× T4 DNA Ligaz Tamponu2 µL
ancTREK1 insert DNA'sı (843 bp)10 ng
pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 vektör DNA'sı (7673 bp)30 ng
T4 DNA Ligaz1 µL

Tablo 6: ancTREK1 klonlaması için vektör–insert ligasyon koşulları. T4 DNA ligaz kullanılarak ancTREK1 insertinin pEG BacMam ekspresyon vektörüne 1:3 molar oranında ligasyonu için reaksiyon karışımı.

BileşenSon konsantrasyonMiktar (5 mL'ye kadar)
çift distile su₂O—5 mL'ye
KCl (1 M)200 mM1 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM100 µL
MgCl₂₂ (100 mM)1 mM50 µL
PMSF proteaz inhibitörü (100 mM)1 mM50 µL
Leupeptin proteaz inhibitörü (1 mg/mL)1 µg/mL5 µL
Aprotinin proteaz inhibitörü (1 mg/mL)1 µg/mL5 µL
Pepstatin A proteaz inhibitörü (1 mg/mL)1 µg/mL5 µL
DNaz I (50 mg/mL)25 µg/mL2.5 µL
n-Dodesil-β-D-maltoside (DDM, %10)1%500 µL
Kolesteril hemisuksinat (CHS, %2)0.10%250 µL

Tablo 7: Membran protein ekstraksiyonu için liziz tamponu bileşimi. Tuzlar, tamponlama ajanları, proteaz inhibitörleri, nükleaz ve deterjanlar dahil olmak üzere membran proteinlerinin solubilizasyonu için kullanılan liziz tamponu formülasyonu. Not: Tamponlar kullanım öncesinde taze olarak hazırlanmalıdır.

Dengeleme tamponu (toplam 10 mL hacim)
BileşenFinal konsantrasyonMiktar
çift distile H2O₂O—10 mL'ye
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodesil-β-D-maltosid (DDM, %10)0.05%50 µL
Kolesteril hemisüksinat (CHS, %2)0.01%50 µL
Yıkama tamponu (toplam hacim 10 mL)
BileşenFinal konsantrasyonMiktar
çift distile su₂O—10 mL'ye
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodesil-β-D-maltozid (DDM, %10)0.05%50 µL
Kolesteril hemisüksinat (CHS, %2)0.01%50 µL
İmidazol pH 8 (5 M)30 mM60 µL
Elüsyon tamponu (toplam 10 mL hacim)
BileşenFinal konsantrasyonMiktar
çift distile su₂O—10 mL'ye
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodesil-β-D-maltosit (DDM, %10)0.05%50 µL
Kolesteril hemisüksinat (CHS, %2)0.01%50 µL
İmidazol pH 8 (5 M)300 mM600 µL

Tablo 8: ancTREK1 saflaştırması için IMAC tampon bileşimleri. ancTREK1'in immobilize metal iyonu afinite kromatografisi saflaştırması için kullanılan dengeleme, yıkama ve elüsyon tamponu formülasyonları. Not: çözeltiler 4°C'de altı aya kadar saklanabilir.

Tampon 1 (toplam hacim 10 mL)
BileşenSon konsantrasyonMiktar
çift distile su₂O—10 mL'ye
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodesil-β-D-maltoside (DDM, %10)0.05%50 µL
Kolesteril hemisüksinat (CHS, %2)0.01%50 µL
Tampon 2 (toplam hacim 10 mL)
BileşenFinal konsantrasyonMiktar
çift distile su₂O—10 mL'ye
KCl (1 M)500 mM5 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodesil-β-D-maltosit (DDM, %10)0.05%50 µL
Kolesteril hemisüksinat (CHS, %2)0.01%50 µL

Tablo 9: anti-GFP nanobody afinite kromatografisi için tampon bileşimleri. anti-GFP nanobody afinite kromatografisi kullanılarak ancTREK1 saflaştırmasında kullanılan tampon formülasyonları. Not: çözeltiler 4°C'de altı aya kadar saklanabilir.

5. İyon Kanalı Aktivitesini Kaydedin

  1. Membran kalitesini değerlendirin
    1. Faraday kafesi kapağını kapatın.
    2. Membran kapasitansını değerlendirmek için üçgen bir voltaj dalga formu (100 mV, 10 Hz) uygulayın.
    3. Membran direncini değerlendirmek için voltaj basamakları (±200 mV'a kadar ±20 mV'lik artışlar) uygulayın.
    4. Akım ve gürültü değerlerini izleyin.
      ​NOT: Aksi gerekmediği sürece 5 kHz örnekleme hızı ve 2.5 kHz alçak geçiren filtreleme kullanın.
  2. ancTREK1 aktivitesini kaydedin
    1. ancTREK1 proteinini kayıt çözeltisi içinde ~2 µg/mL olacak şekilde seyreltin.
      NOT: Seyreltme sırasında, kayıt çözeltisindeki nihai seyreltmeden önce deterjan konsantrasyonunu kritik misel konsantrasyonunun (CMC) üzerinde tutmak için gerektiğinde Tampon 1 içinde ara seyreltmeler yapın.
    2. Seyreltilmiş protein çözeltisinden 1 µL'yi septum açıklığının yanındaki cis haznesine ekleyin.
      NOT: Membran potansiyeli Vcis − Vtrans olarak tanımlanmıştır. Kanal oryantasyonu bu çalışmada doğrudan belirlenmemiştir; bu nedenle kayıtlar, atanmış membran yönünden ziyade uygulanan voltaj polaritesine göre tanımlanmıştır.
    3. ±120 mV'a kadar ±20 mV'lik artışlarla voltaj basamakları uygulayın.
    4. Kanal yerleşme olaylarını izleyin.
      NOT: Kanal yerleşmesi, kapalı ve açık durumlar arasındaki belirgin akım geçişleri ile belirtilir. Yerleşme gerçekleşmezse daha fazla protein ekleyin veya membranı yeniden oluşturun. Birden fazla kanal yerleşirse membranı yırtın ve protein konsantrasyonunu azaltın.

Sonuçlar

PLB membranların akım-gerilim (I–V) karakteristikleri

Çift katmanlı membranların doğal hidrofobik yapısı, onları yüklü türlere karşı geçirimsiz kılar. Ancak, harici bir elektrik alanının uygulanması, nanometre boyutunda geçici gözeneklerin oluşumunu tetikleyebilir ve böylece membran geçirgenliğini ve iletkenliğini etkileyebilir33. 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine lipidlerinden oluşturulan yapay çift katmanların kalitesini değerlendirmek için, eklenmiş proteinlerin yokluğunda membran kapasitansı, direnci ve I-V özellikleri incelenmiştir. ±20 ile ±200 mV arasında (±20 mV artışlarla) bir dizi voltaj basamağı uygulanmış ve ortaya çıkan transmembran akımları kaydedilmiştir. Veriler 5 kHz hızında örneklenmiş ve 2,5 kHz'de düşük geçiren filtreleme işlemine tabi tutulmuştur.

Membran kapasitansı (Cm) ve membran direnci (Rm), çift katman kalitesini değerlendirmek için temel parametreleri temsil eder. PLB, membranın bir dirençle paralel bir kapasitör gibi davrandığı eşdeğer bir direnç-kapasitör (RC) devresi ile tanımlanabilir34. Kapasitif bileşen membranın yük depolama yeteneğini yansıtırken, dirençli bileşen iyon geçirgenliğini yansıtır. Üçgen bir voltaj dalga formunun uygulanması, aşağıdaki formüle göre membran kapasitansı ile orantılı olan kare şeklinde bir kapasitif akım yanıtı oluşturur:

figure-results-1    (1)

Burada, Cm membran kapasitansı, V uygulanan voltaj ve t zamandır. Membran oluşumunu takiben, çift tabakanın kademeli olarak incelmesi nedeniyle kapasitans değerleri zamanla artabilir35. Membran bir paralel plakalı kapasitör olarak düşünüldüğünde, kapasitans, membran alanı ve kalınlığı ile şu şekilde ilişkilidir:

figure-results-2    (2)

Burada, εlipids lipid çekirdeğinin dielektrik sabitini (~2), ε0 boşluğun geçirgenliğini, A membran alanını ve d ise membran kalınlığını temsil eder36,37.

Membran direnci, Ohm kanunu kullanılarak belirlendi33:

figure-results-3    (3)

Burada, V uygulanan voltajı ve Rm membran direncini temsil eder. İyon kanallarının yokluğunda, membran akımı 0 pA civarında kalır ve bu durum giga-ohm (GΩ) aralığındaki direnç değerlerine karşılık gelir33.

75 ve 100 µm açıklıklı BLMchipMM cihazları için I–V ilişkisi, 0 ve ±200 mV arasında lineer (ohmik) davranış sergilemiştir. Verilerin lineer uyarlaması, 75 µm açıklık için 847 ± 16 GΩ (n = 6) (Şekil 8A, daireler) ve 100 µm açıklık için 980 ± 32 GΩ (n = 7) (Şekil 8A, kareler) membran direnci değerleri vermiştir. Akım izinin 3 s'lik bölümleri üzerinden ölçülen RMS gürültü değerleri, 100 µm açıklık için 3.1 ± 2 pA (n = 7) ve 75 µm açıklık için 2.6 ± 0.1 pA (n = 6) olarak belirlenmiştir. Membran stabilitesi, toplam 1 h süresince yaklaşık 2 dk aralıklarla direnç ölçülerek değerlendirilmiştir (Şekil 8B). İyi oluşmuş membranlar istikrarlı bir şekilde 1 h'den fazla süreyle stabil kalmış olup, bu süre çoğu elektrofizyolojik deney için yeterlidir. Membranlar genellikle ±200 mV'ye kadar uygulanan potansiyelleri instabilite belirtisi göstermeden tolere etmiş, ancak bireysel biyokatmana bağlı olarak ±220 ve ±300 mV arasında kırılmalar meydana gelmiştir. Kapasitans değerleri 75 µm açıklıklar için 40 ile 60 pF, 100 µm açıklıklar için 60 ile 90 pF arasında olan ve 100 mV'de ≤0.5 pA akım değerlerine sahip membranlar, protein yerleşimi için uygun kabul edilmiştir.

figure-results-4
Şekil 8: PLB'lerin elektriksel karakterizasyonu. (A) 75 µm ve 100 µm açıklıklarda oluşturulan çift katmanların ±200 mV arasında lineer (ohmik) davranış sergileyen akım-gerilim (I–V) ilişkileri. Lineer regresyon sonucunda membran direnç değerleri sırasıyla 847 ± 16 GΩ (n = 6) ve 980 ± 32 GΩ (n = 7) olarak bulunmuştur. (B) Membran stabilitesi, direncin 1 saat boyunca 2 dakikalık aralıklarla izlenmesiyle değerlendirilmiştir. Membranlar ±200 mV'ye kadar stabil kalmakta ve ±220 ile ±300 mV arasındaki gerilimlerde yırtılmaktadır. Veriler, ortalama ± ortalama standart hata (SEM) olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ancTREK1 tek kanal davranışının başlangıç karakterizasyonu

Sentetik ancTREK1 saflaştırıldı ve PLB'lere yeniden konfigüre edildi; tek kanal aktivitesi, −120 ile 120 mV arasında 20 mV'luk artışlarla uygulanan voltaj basamak protokolleri kullanılarak izlendi. Tek kanal kayıtları (Şekil 9A ve Şekil 9B), K2P kanallarının karakteristik titreme (flickering) davranışını ortaya çıkardı38. 80 mV'da ortalama akım genliği 13,02 ± 0,78 pA (n = 5) iken, −80 mV'da akım genliği −18,72 ± 0,25 pA'ya (n = 5) yükseldi (Şekil 9C). Elde edilen I–V ilişkisi, Mg2+-içermeyen simetrik 200 mM potasyum koşulları altında hem pozitif hem de negatif potansiyellerde ölçülebilir tek kanal akımları gösterdi (Şekil 9D). Akım genlikleri, 5 kHz'de elde edilen ve 2,5 kHz'de düşük geçiren filtreyle süzülen kayıtların tüm nokta histogramlarından tahmin edildiği için, bu I–V ilişkisi kapsamlı bir biyofiziksel karakterizasyondan ziyade tanımlayıcı bir prensip kanıtı olarak sunulmuştur.

figure-results-5
Şekil 9: Sentetik ancTREK1'in tek kanallı aktivitesi. (A ve B) Sırasıyla 80 mV ve −80 mV'de kaydedilen temsili tek kanallı akım izleri. Kesikli çizgiler kapalı kanal seviyesini göstermektedir. (C) Pozitif (sol) ve negatif (sağ) potansiyeller için tüm nokta genlik histogramları. (D) Divalent katyonlar olmaksızın, simetrik 200 mM potasyum (K+) koşulları altında ancTREK1'in I–V ilişkisi. Eğri dördüncü dereceden bir polinom kullanılarak uydurulmuştur ve iletkenlik değerleri ±80 mV'deki eğimden türetilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ancTREK1, memeli TREK1 kanallarıyla karşılaştırıldığında genişletilmiş N- ve C-terminal bölgelerden yoksun olsa da, yeniden yapılandırma sonrası fonksiyonel olarak aktif kalmıştır. Yüksek ve düşük iletkenlik modları sergileyen (pozitif potansiyellerde sırasıyla 132 ± 5 pS ve 41 ± 5 pS) memeli TREK1'in39 aksine, ancTREK1 yalnızca büyük iletkenlik modunu sergilemiştir. Pozitif potansiyellerdeki tek kanal iletkenliği 112.8 ± 10.8 pS (80 mV, n = 5) olarak ölçülmüş olup, bu değer TREK kanalları için rapor edilen değerlerle (simetrik potasyum koşulları altında 85–130 pS) uyumludur38,39,40,41. Negatif potansiyellerde iletkenlik, daha önce rapor edilen TREK1 davranışı ile uyumlu olarak 205.6 ± 2.05 pS'ye (−80 mV, n = 5) yükselmiştir39. Özellikle ancTREK1, eksize yama konfigürasyonları kullanılarak elde edilen TREK1 ölçümlerine kıyasla daha yüksek bir normalize edilmiş açık olma olasılığı (NPo) sergilemiştir42. NPo–voltaj ilişkisi, pozitif potansiyellerde artan kanal aktivitesi göstererek 80 mV'de 0.78 ± 0.02'ye (n = 5) ulaşmıştır. Buna karşılık, NPo negatif potansiyellerde azalmış; −80 mV'de 0.53 ± 0.04 ve −120 mV'de 0.28 ± 0.03 değerleri almıştır (Şekil 10).

figure-results-6
Şekil 10: ancTREK1 tek kanal aktivitesinin voltaj bağımlılığı analizi. Membran potansiyelinin bir fonksiyonu olarak normalize edilmiş açık olma olasılığı (NPo) (solda) ve 80 mV ile −80 mV'daki NPo karşılaştırması (sağda); pozitif potansiyellerde artan kanal açılmasını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1. Sentetik atasal iki gözenekli domain potasyum (K2P) kanalının (ancTREK1) amino asit dizilimi. Elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan ancTREK1'in tam uzunluktaki amino asit dizilimi. Dizilim; UniProt ve NCBI veritabanlarından toplanan ortolog dizileri içeren, korunmuş gözenek motiflerine göre filtrelenmiş, hizalanmış ve maksimum olabilirlik filogenetiği kullanılarak analiz edilmiş küratörlü bir TREK/TRAAK ailesi veri setinden atasal dizi çıkarımı ile yeniden oluşturulmuştur.Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışma

Bu çalışmada, sentetik bir K2P kanalının elektrofizyolojik özelliklerini tek molekül düzeyinde değerlendirmek için PLB tekniğini kullandık. Bilimsel literatürde tanımlanan çeşitli düzlemsel lipid modelleri arasından, iki sulu bölmeyi ayıran dikey polar olmayan bir yüzeye delinmiş 50 ile 140 µm arasında çapa sahip bir açıklık üzerine boyanan BLM'lerin oluşturulmasına odaklandık. Bu konfigürasyon, lipid membran hazırlığı ve elektrolit bileşimi (örneğin, iyonik güç ve pH) dahil olmak üzere deneysel parametreler üzerinde kontrol sağlarken hücre membranı ortamının simüle edilmesine olanak tanır3. BLM'leri, iki sulu çözeltinin hava-su ara yüzeyine önceden yayılmış iki lipid tek tabakasının, su seviyesinin yükseltilmesiyle açıklık üzerinde birleşerek membranın kendiliğinden toplandığı Montal-Mueller (katlama) yöntemini5 kullanarak yeniden oluşturduk.

Burada sunulan membran oluşum protokolü oldukça sezgiseldir; ancak, birkaç kritik adım deneysel başarıyı güçlü bir şekilde etkilemektedir. BLMchipMM ile amplifikatör arasında uygun elektriksel bağlantıyı sağlamak için, PCB soketlerine yerleştirilen Ag/AgCl tel uçlarının klorlanmasından kaçınmak esastır. BLMchipMM montajı sırasında tellerin yanlış konumlandırılması, amplifikatör kasasıyla temasa yol açarak kısa devrelere ve sinyal doygunluğuna neden olabilir. Açıklık ön işlem prosedürü bir diğer kritik faktördür: ön işlem solüsyonunun uygulanması sırasında aşırı kuvvet uygulanması poliimid septuma zarar verebilirken, elektrolit solüsyonunun yanlış kullanımı —özellikle açıklık bölgesinin ıslatılması— membran oluşumunu bozabilir. Ayrıca, tekrarlanabilirlik için BLMchipMM kayıt odasının dikkatlice temizlenmesi esastır. %100 izopropil alkol kullanımı, ardından iyice durulama ve tamamen kurutma işlemi, kalıntıların sonraki deneylere müdahale etmemesini sağlar.

Protokol üzerinde çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Çamaşır suyu ile emdirme yoluyla klorlama pratik ve yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olsa da, elektrokaplama gibi alternatif yöntemler de uygulanabilir43. Benzer şekilde, ön işlem ve lipid hazırlama süreçlerinde varyasyonlar yapılabilir. Standart ön işlem çözeltileri tipik olarak uçucu hidrokarbon çözücüler içinde çözülmüş uzun zincirli alkanlardan oluşur36; n-hekzan içinde %1 heksadekan çözeltisi yaygın olarak kullanılsa da diğer çözücüler de uygun olabilir. Lipid kompozisyonu da deneysel gereksinimlere bağlı olarak uyarlanabilir. DPhPC lipidleri optimal membran stabilitesi sağlarken, doğal veya sentetik kompozisyonlar dahil olmak üzere alternatif lipid karışımları da kullanılabilir36. Katlama yöntemiyle oluşturulan dikey lipid çift katmanlarının temel bir avantajı, her bir yaprağın farklı lipid türlerinden oluştuğu asimetrik membranlar oluşturabilme yeteneğidir5,22; bu özellik, membran protein fonksiyonunu etkilediği bilinmektedir.

Membran oluşumundaki sorunların giderilmesi genellikle sulu faz seviyelerinin ayarlanmasını içerir. Membran oluşumu başlangıçta gerçekleşmezse, bir bölmedeki tampon seviyesinin tekrarlanan şekilde düşürülmesi ve yükseltilmesi çift katman montajını kolaylaştırabilir. Başarısız olunması durumunda, açıklığın üzerine bir hava kabarcığı uygulamak lipid yeniden dağılımını ve membran oluşumunu teşvik edebilir. Devam eden başarısızlıklar genellikle ön işlem veya kontaminasyonla ilgili sorunlara işaret eder; bu durumda kayıt odasının temizlenmesi ve deneyin yeniden başlatılması önerilir.

Bu düzeneğin temel bileşenleri eNPR 100 kHz kompakt amplifikatör ve BLMchipMM'den oluşmaktadır. Amplifikatör, kasa yapısı kendi başına etkili bir elektromanyetik kalkan sağladığından, harici Faraday kafesleri dahil olmak üzere ek harici cihaz ihtiyacını ortadan kaldıran kompakt, düşük gürültülü bir voltaj klempleme sistemidir. BLMchipMM, amplifikatöre doğrudan bağlantı için bir PCB ile entegre edilmiş, önceden monte edilmiş, minyatürleştirilmiş bir kayıt odasıdır. Bu sistem, yapay membranın oluşturulduğu, konik uçlu lazer delikli bir açıklığa sahip poliimid bir septum ile ayrılmış iki C şeklinde bölmeden oluşur. Yaklaşık 110 µL bölme hacimlerine sahip olan sistemin düşük boyutları, reaktif tüketimini önemli ölçüde azaltır ve iç kapasitansı düşürerek sinyal kalitesini artırır. Ayrıca cihaz, uygun temizleme prosedürleri uygulandığında sökülmeden defalarca yeniden kullanılabilir, bu da değişkenliği azaltarak deneysel tekrarlanabilirliği artırır.

Bu avantajlara rağmen, bazı sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır. Mevcut düzenek; sıcaklık, basınç veya perfüzyon kontrolü için entegre modüller içermemektedir. İntrinsik membran geriliminin TREK144,45,46 gibi mekanosensitif kanalları etkilediği bildirilmiştir; ancak mevcut düzenek membran geriliminin kontrollü manipülasyonunu içermemektedir ve burada herhangi bir mekanistik sonuç çıkarılmamıştır. Genel olarak bu platform, yapay membranlarda iyon kanalı aktivitesinin kaydedilmesi için sağlam ve erişilebilir bir sistem sunmaktadır. Bu çalışmada, TREK alt ailesinin bilgisayarlı ortamda türetilmiş bir atasal kanalı olan sentetik K2P kanalı ancTREK1'i inceledik. Kaydedilen veriler, PLB'lere rekonstitüe edilen saflaştırılmış ancTREK1'in, bildirilen TREK1 benzeri iletkenlik özellikleri ile tutarlı tek kanal davranışı sergilediğini göstermektedir. Mg2+-içermeyen simetrik 200 mM potasyum koşulları altında kanal, 80 mV'ta yaklaşık 13 pA ve −80 mV'ta −19 pA genlik değerleri ile ölçülebilir I–V ilişkisi sergilemektedir. Ayrıca ancTREK1, TREK1 kanallarında gözlemlenen karakteristik yüksek iletkenlik modunu sergilemekte olup, negatif potansiyellerde (~205,6 pS) pozitif potansiyellere (~112,8 pS) kıyasla daha yüksek iletkenliğe sahiptir. Özellikle ancTREK1, eksize patch konfigürasyonlarındaki42 gözlemlerden farklı olarak, pozitif potansiyellerde artmış NPo (80 mV'ta 0,78) ve negatif potansiyellerde azalmış NPo (−80 mV'ta 0,53 ve −120 mV'ta 0,28) göstermektedir. Bu bulgular, sistemin rekonstitüe membran proteinlerinin prensip kanıtlama (proof-of-principle) tek kanal kayıtları için kullanımını desteklemektedir.

Açıklamalar

F.T. Elements S.r.l.'nin CEO'su, A.P. ise şirket çalışanıdır. Diğer tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmektedir.

Teşekkürler

Hücre transfeksiyon prosedürüne yardımcı olduğu için Sofia Diletta Guzzeloni'ye teşekkür ederiz. Elements çalışanları Dr. Leon Juarez ve Dr. Michelangelo Paci'ye minnettarız. Bu çalışma; İtalya Pavia Üniversitesi Moleküler Tıp Bölümü'nün Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027) girişimi, Cariplo Vakfı (#2019-1809) ve M.L.'ye yönelik PNRR Araştırma Programı CN00000013 “National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing” tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)Avanti Polar Lipids850356PYapay lipid çift tabakalarının oluşturulması
2-Propanol (≥99.5%)Honeywell24137-5LBLMchipMM cihazının temizlenmesi
AgarozFisher BioReagentsBP160-500Agaroz jellerin hazırlanması
Agaroz jel yatay elektroforez sistemiBTLabSystemsBT102DNA fragmanlarının ayrılması
AmpisilinFisher BioReagentsBP1760-25Transforme edilmiş bakterilerin seçimi
Anti-GFP nanobody Sepharose reçinesi (ev yapımı)——GFP etiketli proteinlerin afinite saflaştırılması
Anza Alkalin FosfatazInvitrogenIVGN2208Vektör defosforilasyonu
Anza EcoRIInvitrogenIVGN0116Restriksiyon sindirimi
Anza NotIInvitrogenIVGN0014Restriksiyon sindirimi
Anza Red Buffer (10×)InvitrogenIVGN2008Restriksiyon sindirim tamponu
Aprotinin proteaz inhibitörüFisher Scientific15996008Protein degradasyonunun önlenmesi
Masaüstü santrifüjEppendorfEP5420000164Hücre çöktürme ve numune hazırlama
BLMchipMMElements s.r.l.—Planar lipid çift tabakalarının oluşturulması
Kolesteril hemisuksinat (CHS)AnatraceCH210Membran proteinlerinin stabilizasyonu
Coomassie Brilliant BlueSigma-Aldrich1125530025Protein boyama
Sıradan ev tipi çamaşır suyu——Ag tellerin klorlanması
DNaz ISigma-Aldrich11284932001Lizat viskozitesinin azaltılması
Çift distile su——Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması
Etanol (saf, 99.9%)Girelli Alcool s.r.l.—Ag/AgCl tellerin temizlenmesi
Etidyum bromürSigma-Aldrich1116080030DNA boyama
Ekstra ince kumlu zımpara kağıdı——Tellerden Ag/AgCl kaplamanın uzaklaştırılması
eNPR 100 kHz amplifikatörElements s.r.l.—Elektrofizyolojik kayıtlar
Agarozdan DNA ekstraksiyonu için Gel-Out kitiA&A Biotechnology023-250DNA saflaştırma
GeneRuler 1 kb DNA merdiveniThermo Fisher ScientificSM0311DNA boyut referansı
FreeStyle™ 293-FThermo Fisher ScientificR79007ancTREK1 protein ekspresyonu
HEPES (≥99.5%)Sigma-AldrichH3375-500GTamponlama ajanı
Heksadekan (≥99%)Sigma-AldrichH6703-100MLAçıklık ön işlemi
Heksan (≥99%)Sigma-Aldrich139386-100MLLipid çözücü
Ev yapımı 5× DNA yükleme boyası——DNA numune hazırlama
Ev yapımı 6× Laemmli SDS tamponu (indirgeyici)——Protein numune hazırlama
Ev yapımı boya giderme çözeltisi——SDS-PAGE jellerinin boyasının giderilmesi
Ev yapımı HRV-3C proteaz——Füzyon proteinlerin kesilmesi
Ev yapımı SDS-PAGE yürütme tamponu (10×)——SDS-PAGE elektroforez tamponu
İmidazolAlfa AesarA10221His etiketli proteinlerin elüsyonu
Seri içi (in-batch) saflaştırma kolonları——Protein saflaştırma iş akışları
Innova44 çalkalamalı inkübatörNew Brunswick InnovaM1282Hücre kültürü büyümesi
KClHoneywell31248-1KGElektrolit ve tampon hazırlama
LB besiyeri (Lennox)Condalab1231Bakteriyel kültür
Leupeptin proteaz inhibitörüThermo Scientific78435Protein degradasyonunun önlenmesi
Magnezyum klorür hekzahidratAcros Organics447700010Tampon bileşeni
Nanodrop spektrofotometreDeNovixDS-11DNA ve protein kantifikasyonu
n-Dodesil-β-D-maltosit (DDM)NeoBiotechNB-19-0056-25GMembran proteini solubilizasyonu
Ni Sepharose High Performance ReçinesiCytiva17526801IMAC saflaştırma
Dizüstü bilgisayar——Cihaz kontrolü ve veri toplama
Optima LE-80K ultrasantrifüjBeckman365668Membran fraksiyonu izolasyonu
Pentan (≥99%)Sigma-Aldrich236705-100MLLipid çözücü
Pepstatin A proteaz inhibitörüThermo Scientific78436Protein degradasyonunun önlenmesi
Phusion GC Tamponu (5×)Thermo Fisher ScientificF519PCR tamponu
Phusion Yüksek Sadakatli DNA PolimerazThermo Fisher ScientificF530SPCR amplifikasyonu
PMSF proteaz inhibitörüThermo Scientific36978Lizis sırasında protein koruması
Polietilenimin (PEI)Clinisciences24765-100Transfeksiyon ajanı
ProteinEle hazır dökülmüş Tris-glisin jel (4–20%)TransGen BiotechDG101-01-V2Protein ayrımı
SDS-PAGE jel elektroforez sistemiBio-Rad1658002FCProtein elektroforezi
Sodyum bütiratFisher ScientificA11079Protein ekspresyonu artırıcı
T4 DNA ligazThermo Fisher ScientificEL0011DNA ligasyonu
T4 DNA ligaz tamponu (10×)Thermo Fisher ScientificB69Ligasyon tamponu
Termal döngüleyici (Mastercycler Nexus)Eppendorf6331000025PCR amplifikasyonu
Tris bazSigma-AldrichT1503-1KGTampon hazırlama
Lesitin ve polisorbate 80 içeren Tripton SOYA agarHiMediaM449-5KGBakteriyel ekim
İki adet Ag telElements s.r.l.—Elektrofizyoloji için elektrotlar
Ultra-spin konsantratör (50 kDa kesme sınırı)Merck AmiconUFC8050Protein konsantrasyonu
pEG BacMam ekspresyon vektörüAddgene160687Protein ekspresyonu
USB kablosu——Amplifikatör ve bilgisayar arasındaki bağlantı

Kaynaklar

  1. Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr Protoc Pharmacol. 11 (1), (2000).
  2. Polak, A., Mulej, B., Kramar, P. System for measuring planar lipid bilayer properties. J Membr Biol. 245 (10), 625-632 (2012).
  3. Zakharian, E. Recording of ion channel activity in planar lipid bilayer experiments. Methods Mol Biol. 998, 109-118 (2013).
  4. Mueller, P., Rudin, D., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
  5. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  6. Coronado, R., Latorre, R. Phospholipid bilayers made from monolayers on patch-clamp pipettes. Biophys J. 43 (2), 231-236 (1983).
  7. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophys J. 41 (2), 119-133 (1983).
  8. Tank, D. W., Miller, C., Webb, W. W. Isolated-patch recording from liposomes containing functionally reconstituted chloride channels from Torpedo electroplax. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7749-7753 (1982).
  9. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Lett. 224 (1), 172-176 (1987).
  10. Varnier, A., et al. A simple method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. J Membr Biol. 233, 85-92 (2010).
  11. Garten, M., et al. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Anal Chem. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. J Am Chem Soc. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  14. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact bubble bilayers with flush drainage. Sci Rep. 5, 9110 (2015).
  15. Han, X., et al. Nanopore arrays for stable and functional free-standing lipid bilayers. Adv Mater. 19 (24), 4466-4470 (2007).
  16. Miyata, R., et al. Parallel recordings of transmembrane hERG channel currents based on solvent-free lipid bilayer microarray. Micromachines. 12 (1), 98 (2021).
  17. Kresak, S., Hianik, T., Naumann, R. L. C. Giga-seal solvent-free bilayer lipid membranes: from single nanopores to nanopore arrays. Soft Matter. 5 (20), 4021 (2009).
  18. Suzuki, H., Pioufle, B. L., Takeuchi, S. Ninety-six-well planar lipid bilayer chip for ion channel recording fabricated by hybrid stereolithography. Biomed Microdevices. 11, 17-22 (2009).
  19. Zagnoni, M., Sandison, M. E., Morgan, H. Microfluidic array platform for simultaneous lipid bilayer membrane formation. Biosens Bioelectron. 24 (5), 1235-1240 (2009).
  20. Baker, C. A., Bright, L. K., Aspinwall, C. A. Photolithographic fabrication of microapertures with well-defined, three-dimensional geometries for suspended lipid membrane studies. Anal Chem. 85 (19), 9078-9086 (2013).
  21. Tadaki, D., et al. Mechanically stable solvent-free lipid bilayers in nano- and micro-tapered apertures for reconstitution of cell-free synthesized hERG channels. Sci Rep. 7 (1), 17736 (2017).
  22. Collins, M. D., Keller, S. L. Tuning lipid mixtures to induce or suppress domain formation across leaflets of unsupported asymmetric bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 124-128 (2008).
  23. Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W., Helling, R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (11), 3240-3244 (1973).
  24. Hoseini, S., Sauer, M. G. Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering. J Biol Eng. 9 (1), 2 (2015).
  25. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  26. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  27. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  28. Hochuli, E., Dobeli, H., Schacher, A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr A. 411, 177-184 (1987).
  29. Hochuli, E., et al. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Biotechnology (N Y). 6 (11), 1321-1325 (1988).
  30. Kirchhofer, A., et al. Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 17 (1), 133-138 (2010).
  31. Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
  32. Lee, H., Lolicato, M., Arrigoni, C., Minor, D. L. Production of K2P2.1 (TREK-1) for structural studies. Methods Enzymol. 653, 151-188 (2021).
  33. Kramar, P., Miklavcic, D., Kotulska, M., Lebar, A. M. Voltage- and current-clamp methods for determination of planar lipid bilayer properties. Adv Planar Lipid Bilayers Liposomes. 11, 29-69 (2010).
  34. Golowasch, J., Nadim, F. Capacitance, membrane. Encyclopedia of Computational Neuroscience. , (2014).
  35. Niles, W. D., Levis, R. A., Cohen, F. S. Planar bilayer membranes made from phospholipid monolayers form by a thinning process. Biophys J. 53 (3), 327-335 (1988).
  36. Gutsmann, T., et al. Protein reconstitution into freestanding planar lipid membranes for electrophysiological characterization. Nat Protoc. 10 (1), 188-198 (2015).
  37. White, S. H. A study of lipid bilayer membrane stability using precise measurements of specific capacitance. Biophys J. 10 (12), 1127-1148 (1970).
  38. Bockenhauer, D., Zilberberg, N., Goldstein, S. A. N. KCNK2: reversible conversion of a hippocampal potassium leak into a voltage-dependent channel. Nat Neurosci. 4 (5), 486-491 (2001).
  39. Li, X. T., et al. The stretch-activated potassium channel TREK-1 in rat cardiac ventricular muscle. Cardiovasc Res. 69 (1), 86-97 (2006).
  40. Honoré, E., Maingret, F., Lazdunski, M., Patel, A. J. An intracellular proton sensor commands lipid- and mechano-gating of the K+ channel TREK-1. EMBO J. 21 (12), 2968-2976 (2002).
  41. Patel, A. J., et al. A mammalian two pore domain mechano-gated S-like K+ channel. EMBO J. 17 (15), 4283-4290 (1998).
  42. Maingret, F., Honore, E., Lazdunski, M., Patel, A. J. Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K+ channel. Biochem Biophys Res Commun. 292 (2), 339-346 (2002).
  43. Lemtiri-Chlieh, F., Ali, R. Characterization of heterologously expressed transporter genes by patch- and voltage-clamp methods: application to cyclic nucleotide-dependent responses. Methods Mol Biol. 1016, 67-93 (2013).
  44. Opsahl, L. R., Webb, W. W. Lipid-glass adhesion in giga-sealed patch-clamped membranes. Biophys J. 66 (1), 75-79 (1994).
  45. Perez-Mitta, G., MacKinnon, R. Freestanding lipid bilayer tensiometer for the study of mechanosensitive ion channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (12), e2221541120 (2023).
  46. Sorum, B., et al. Tension activation of mechanosensitive two-pore domain K+ channels TRAAK, TREK-1, and TREK-2. Nat Commun. 15 (1), 3142 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Montal-Mueller Sistemiİyon Kanalı RekonstitüsyonuBilayer PlatformuTek Kanal KaydıYapay MembranlarAkım-Gerilim İlişkisiKanal Aktivitesi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.