Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü

367 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69916

⸱

20 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 2Research Institute of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3The First Clinical School of Wuhan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, fare stria vascularis'ten birincil marjinal hücrelerin izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz ve koklear yan duvar bozukluklarını incelemek için oksidatif stres ve hücresel yaşlanma için in vitro modeller oluşturulmuştur.

Özet

Stria vascularis, iç kulakta endokoklear potansiyeli (EP) üreten ve sürdüren kilit bir yapıdır ve işlev bozukluğu çeşitli işitme kaybı türleriyle yakından ilişkilidir. Stria vascularis, marjinal hücreler, ara hücreler ve bazal hücrelerden oluşur; bunlar arasında marjinal hücreler EP'nin oluşumu ve korunmasında merkezi bir rol oynar. Bu nedenle, marjinal hücrelerin in vitro primer kültür modeli oluşturulması, stria vascularis'in biyolojik özellikleri ve işitme kaybı ile ilişkili bozukluklardaki rolüyle ilgilenmesi için gereklidir.

Bu çalışmada, neonatal farelerin stria vaskülaris'inden primer marjinal hücreleri başarıyla izole edip kültürledik. Strial dokuları mikrodiseksiyon yoluyla elde edildi, tip II kollajenazla sindirildi ve çoğu fibroblast çıkarılmak için diferansiyel kaplama ile saflaştırıldı; kültürlenen hücreler 7. güne kadar %80'in üzerine birleşti. İmmünoflüoresans boyama, sitokeratin 18 (CK18) ve potasyum voltaj kapılı kanal alt ailesi Q üyesi 1'in (KCNQ1) stabil ekspresyonunu göstererek, marjinal hücrelerin başarılı izolasyonunu, yüksek saflığını ve korunmuş fizyolojik fonksiyonunu doğruladı.

Bu modele dayanarak, in vitro oksidatif stres ve hücresel yaşlanma modelleri sırasıyla hidrojen peroksit (H2O2) ve D-galaktoz kullanılarak oluşturulmuştur. Tedavi edilen hücrelerde, hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyeleri ve yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) pozitifliği önemli ölçüde arttı; bu da birincil marjinal hücrelerin oksidatif stres ve yaşlanma tetikleyici uyaranlara karşı yüksek hassasiyetini gösterdi. Bu çalışma, fare birincil marjinal hücrelerinin kültürü ve modellenmesi için kararlı ve tekrarlanabilir bir sistem kurarak, stria vasküler disfonksiyon ve ilgili mekanizmaların incelenmesi için güvenilir bir in vitro platform sağlamaktadır.

Giriş

İşitsel sistemde, koklea içindeki çeşitli dokular birlikte çalışarak karmaşık ses dalgalarını elektriksel sinyalleredönüştürür 1. Stria vascularis, endolimfin iyon bileşimini düzenler ve Endo-koklear Potansiyeli (EP) oluşturur; böylece koklear homeostazı korur ve iç ile dış saç hücrelerinin normal işlevini sağlar. Üç farklı hücre tipinden oluşur: marjinal hücreler, ara hücreler ve bazal hücreler. Marjinal hücreler, doğrudan endolimfe bakan ve sıkı birleşimlerle kapalı olan polarize epitel monotabakası oluşturur. Marjinal hücrelerin bazolateral zarı, stria vaskülaris içinde sodyum ve potasyum iyonu taşınımını düzenlemede rol alan Na⁺/K⁺-ATPaz ve NKCC1 adlı iki önemli potasyum taşıyıcısı ile zenginleştirilir. Na⁺/K⁺-ATPaz'ın işlevinin doğrudan EP 2,3 ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. KCNQ1/KCNE1 K⁺ kanalları, marjinal hücrelerin apikal zarında yer alır ve EP4'ün oluşumuna katkıda bulunan ek bir K⁺ difüzyon potansiyeli üretir. Marjinal hücreler, birden fazla potasyumla ilişkili proteinle zenginleştirilir ve koklear endolimfte potasyum geri dönüşümünü sağlayan çekirdek hücresel birim olarak hizmet eder. Bu nedenle, marjinal hücreler EP'yi üreten ve sürdürmekten sorumlu kilit hücrelerdir.

Stria vascularis (SV), sensösöral işitme kaybı (SNHL) ile ilişkili birçok hastalığın patogenezinde kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir; bunlar arasında yaşa bağlı işitme kaybı (ARHL), gürültü kaynaklı işitme kaybı (NIHL), kalıtsal işitme kaybı (HHL) ve ilaç kaynaklı işitme kaybı (DIHL) dahildir. Ayrıca, otoimmün iç kulak hastalığı (AIED), otoinflamatuar iç kulak hastalığı (AID) ve Ménière hastalığı (MD) gibi birkaç başka işitme bozukluğu da etiyolojik olarak farklı olsalar da, son çalışmalarda SV'nin altta yatan patojenik mekanizmalarında yer aldığıgösterilmiştir 5,6. Bu nedenle, işitme kaybının patogenezini araştırmak için güvenilir hücresel modeller oluşturmak çok önemlidir. Çalışmalar, azalmış marjinal hücre yoğunluğunun fare ömrü boyunca EP'nin güçlü bir öngörücüsü olduğunu, stria vascularis'in atrofisinin ise ARHL 7,8'de erken karakteristik bir lezyonu temsil ettiğini göstermiştir. Marjinal hücrelerin in vitro kültürü, ARHL'nin patogenezini incelemek ve potansiyel tedavi hedeflerini incelemek için güvenilir bir model sağlayabilir. ARHL'nin ötesinde, son çalışmalar stria vasküler ile diğer işitsel bozukluklar arasında yüksek bir korelasyon ve olası bir altta yatan ilişki ortaya koymuştur; bu da in vitro marjinal hücre modellerinin daha geniş uygulamalara sahipolabileceğini öne sürmektedir 5,9,10.

Bu çalışma, neonattal fare koklealarından stria vascularis'in diseksiyonu ve kültürü için bir protokol tanımlıyor; ardından marjinal hücrelerin diferansiyel kaplama kullanılarak arındırılması ve böylece stria vaskülaris ile ilgili patolojiler üzerine güvenilir bir hücresel model sağlanıyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yenidoğan fare yavrular (P0-3) Biont tarafından sağlandı. Tüm deneysel prosedürler, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayımlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzları'na (NIH Yayını, revize 2011) ve Wuhan Üniversitesi Renmin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış (WDRM202400019) ile uyumluydu.

1. Sterilizasyon ve malzeme hazırlığı

  1. İki çift mikro diseksiyon pensesi, bir çift standart forset, bir çift cerrahi makas ve bir çift mikro diseksiyon makası dahil olmak üzere diseksiyon aletlerini hazırlayın. Tüm aletleri otoklav kullanarak sterilize edin ve 60 °C fırında 4 saat kurutulun.
  2. Üreticinin talimatlarına göre 100 mL epitel hücreli ortam-hayvan (EpiCM-a ortam) hazırlayın. Bazal ortama fetal sığır serumu (FBS), epitel hücre büyüme takviyesi (EpiCGS-a) ve penisilin/streptomisin çözeltisi ekleyerek %2 FBS, %1 EpiCGS-a ve %1 penisillin/streptomisin konsantrasyonları elde edilir.
  3. Stereomikroskop aşamasını ve gövdesini %75 etanol ile dezenfekte edin. Sonra, otoklavlanmış diseksiyon aletlerini ve dezenfekte edilmiş mikroskobu biyolojik bir güvenlik dolabına yerleştirin. Diseksiyon işlemine başlamadan önce tüm ürünleri 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak tam sterilliği garanti edin.

2. İşitsel epitel toplama için diseksiyon ve temporal kemik izolasyonu

  1. Yenidoğan fare yavrularını (P0-3) %4 izofluran anestezisinden sonra ötenaze edin, %75 etanol ile dezenfekte edin ve buz üzerinde kafa kesme işlemi yapın. Gerekirse etik olarak onaylanmış diğer yöntemleri kullanın.
  2. Başı hareketsiz hale getirin, mikro diseksiyon makası ile saç derisini sagital dikiş boyunca açın, saç derisini iki taraflı olarak ayırın ve çıkarın.
  3. Mikro diseksiyon makası kullanarak yenidoğan farenin başını orta hat boyunca ikiye böl. Temporal kemikleri açığa çıkarmak için pensle beyin dokusu alın (Şekil 1A).
  4. Kranial tabandaki çift taraflı temporal kemikleri gözlemleyin, diğer gereksiz kemikleri çıkarın ve kokleayı içeren temporal kemik dokusunu koruyun (Şekil 1B).
  5. Bir temporal kemiği, buz üzerinde taze Hank's Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 35 mm steril bir kaba aktarın.
  6. Diğer temporal kemiği mikroskop altına taşıyın, temporal kemik dokusunu bir çift forseps ile sabitleyin ve başka bir çift kullanarak yüzey kas dokusunu küt şekilde diseksiyon ederek beyaz yarım dairesel ossikül halkası görünür hale getirilir (Şekil 1C). Koklear pozisyon doğrulandıktan sonra, şeffaf koklear doku gözlemlenene kadar aşağıya doğru küt diseksiyon devam edin (Şekil 1D).
    NOT: 2.6-2.7 numaralı adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.
  7. Mikro diseksiyon forsepsleri kullanarak, kokleanın apikal dönüşündeki kemik duvarının küçük bir parçasını dikkatlice çıkarın, forsepsin bir tarafını nazikçe kokleaya yerleştirin ve kemik duvarını membran labirentinden ayırın. Kemik duvarını çıkarın ve membran labirent dokusunu taze Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ile genişletin (Şekil 1E).
  8. Baziler membranı bir çift pensepsle sabitleyin ve stria vaskülarisi başka bir çift forsepsle dikkatlice ayırın. Buz üzerine yerleştirilmiş 1 mL 1mg/mL kollagenaz tip II çözeltisi içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 1F).
  9. Yukarıdaki adımları tekrarlayarak stria vascularis'i diğer taraftan alın.

3. Stria vascularis'in marjinal hücrelerinin elde edilmesi için enzimatik ayrıştırma

  1. Toplanan dokuyu içeren mikrosantrifüj tüpünü 1mg/mL kollagenaz tip II çözeltisinde 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka edin.
    NOT: Kolagenaz tip II çözeltisi, fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla kollagenaz tip II (PBS; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4) seyreltilerek hazırlanmıştır.
  2. Tüpü 300 × g'de 8 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Süpernatantı dikkatlice çıkarın. Sindirimi sonlandırmak için 1 mL kültür ortamı ekleyin, hücreleri yeniden süzülmek için nazikçe tritürle yapın ve tekrar 300 × g ile 8 dakika boyunca santrifüj yapın.
  4. Süpernatantı aspire edin ve 1 mL taze kültür ortamı ekleyin. Tritürle tek hücreli süspansiyon elde edin, süspansiyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve toplam hacmi 10 mL'ye ayarlamak için ek ortam ekleyin.
  5. Hücre süspansiyonunu tekrar tekrar pipetleyerek iyice karıştırın, ardından süspansiyondan 1 mL 6 kuyruklu plakanın her bir kuyusuna aktarın. Hücreleri, %2 FBS, %1 EpiCGS-a ve %1 penisilin/streptomisin çözeltisi takviyesi ile takviye edilmiş 2 mL DMEM'deki hücreleri, %5CO2 kuluçka içinde, 37 °C'de kültürleyin.
  6. Aracı her gün değiştirin ve hücre durumunu izleyin. Marjinal hücrelerin kümelenmiş büyümesi genellikle kaplamadan 2 gün sonra gözlemlenebilir.

4. Marjinal hücrelerin arındırılması

  1. Kültürün 3. gününde, kenar taşı benzeri kenar hücre kümelerini çevreleyen çok sayıda iğne şeklinde fibroblastın ortaya çıkışını gözlemleyin (Şekil 2B).
  2. Yapışma oranlarındaki farklardan yararlanarak, iğne şeklindeki fibroblastları kısmen çıkarmak için nazikçe pipetleyin. 1 mL pipet kullanarak, D-Hanks dengeli tuz çözeltisini dört dörtlüğün her birinde geniş alanlara nazikçe yuyun. Hücre arıtmasını mikroskop altında izleyin ve pipetleme kuvvetini ve yönünü buna göre ayarlayın. Genellikle, geniş alanlı yıkama iki kez yapılır. Her turdan sonra fibroblast yoğunluğunu mikroskobik olarak inceleyin; Bu gözlemlere dayanarak, yoğun nüfuslu fibroblast alanlarına lokal nazik pipetleme uygulanarak kültür tabağı boyunca seyrek ve eşit bir dağılım sağlanır.
    NOT: Fibroblastların uygun yoğunluğu korundu, çünkü tamamen çıkarılması veya aşırı arındırma birincil hücrelerin büyümesini kısıtlayabilir. Marjinal hücreler ile fibroblastlar arasında yaklaşık 2:1 oranının korunmasını öneririz.
  3. Mikroskobik inceleme altında fibroblastlar marjinal hücre kümeleri arasında seyrek dağılım göründüğünde saflaştırmayı durdurun. Üst maddeyi çıkarın ve 2 mL taze kültür ortamı ekleyin, böylece ekim devam eder.

5. İmmünofluoresans boyama

  1. Arındırma sonrası ikinci günde, hücre morfolojisini mikroskop altında inceleyin. Yeterli hücre kümesi oluşumu ve uygun yoğunluk gözlemlendiğinde, aspirasyon kültür ortamı ile hücreleri fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS, pH 7.4) ile üç kez yıkayın.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin. Fiksatif çözeltiyi çıkardıktan sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5 dakika).
  3. Hücreleri %0,5 Triton X-100 ile 15 dakika boyunca permeabilize edin. Çözeltiyi çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5 dakika).
  4. Oda sıcaklığında %10 keçi serumu içeren PBS ile blok hücreleri 30 dakika boyunca kullanın.
  5. Hücreleri, tavşan anti-fare CK18 monoklonal antikoru (%3 keçi serumu içeren PBS içinde 1:300 seyreltilmiş şekilde) veya KCNQ1 Antikoru (G-8) (%3 keçi serumu içeren PBS ile 1:100 seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
  6. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her yıkamada 10 dakika). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca karşılık gelen ikincil antikor (%3 keçi serumu içeren PBS içinde 1:300 seyreltilmiş hallandırılmış) kuluçka için.
  7. İkincil antikoru çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her yıkamada 10 dakika).
  8. DAPI içeren antiifade montaj ortamından 1-2 damla slaytlara uygulayın, kapak klaytlarını monte edin ve örnekleri konfokal lazer tarama sistemi ile inceleyin.
    NOT: Yıkama adımları hariç, antikorlar dahil tüm kuluçka çözeltileri hücreleri tamamen kaplayacak hacimde eklenmiştir.

6. H2O2 işlemi ve ROS boyama

  1. 7 günlük kültür sonrası, marjinal hücreler birleşen bir monotabaka oluşturduğunda, 1 mMH 2O2 ile tedavi edilerek oksidatif stresi indükler. 1 mM çalışma çözeltisini, %30 H2O2 stok çözeltiyi 1:10000 oranında epitel hücre ortamında seyreltirerek hazırlayın. Deneysel grupları bu çalışma çözeltisiyle kuluçkalayın, kontrol gruplarını ise sadece epitel hücre ortamıyla tedavi edin.
  2. 16 saatlik tedavinin ardından, ortamı dikkatlice çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Üreticinin protokolüne göre Reaktif Oksijen Türleri Analiz Kiti kullanarak marjinal hücrelerdeki hücre içi ROS seviyelerini değerlendirin.
  3. Kültür ortamını çıkarın, ardından hücrelere seyreltilmiş MitoTracker Red CMXRos (mitokondri seçici boya) ve DCFH-DA ekleyin ve 37 °C'de hücre kültüründeki kuluçkada 30 dakika kuluçka yapın.
  4. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her biri 5 dakika), kapak kapaklarını monte edin ve örnekleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile gözlemleyin.

7. D-galaktoz tedavisi ve SA-β-gal boyama

  1. 7 günlük kültür sonrası, marjinal hücreler birleşen bir monotabaka oluşturduğunda, D-galaktoz tozu EpiCM-bir ortamda çözünerek 40 mg/mL D-gal çalışma çözeltisi hazırlandı. Deneysel grupları bu çözeltiyle (6 kuyruklu bir plakanın kuyu başına 2 mL, 48 saat, 37 °C'de) kuluçka olarak hücrelerin yaşlanmasını tetiklemek, aynı hacimde sadece Epi ortamına sahip kontrol gruplarını tedavi etmek.
  2. 48 saatlik tedaviden sonra, ortamı dikkatlice çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Üreticinin talimatlarına göre SA-β-gal boyama kiti kullanarak marjinal hücrelerde hücresel yaşlanmayı değerlendirin.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca fiksatif çözeltiyle sabitleyin. Fiksanti çıkardıktan sonra, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın (her yıkamada 5 dakika).
  4. Hücreleri, %5 X-Gal (6 kuyululu plakanın her kuyu başına 1 mL) içeren SA-β-gal boyama çalışma çözeltisiyle gece boyunca 37 °C'de,CO2 içermeyen nemlendirilmiş bir kuluçka içinde.
  5. Mikroskop kullanarak parlak alan aydınlatması altında SA-β-gal boyama görüntülerini yakalayın.

8. İstatistiksel analiz

  1. H₂O₂ ile tedavi edilen ve kontrol grupları arasında ROS boyamanın ortalama immünoflüoresans yoğunluğu açısından karşılaştırmalar için, D-galaktaz ile kontrol grupları arasında SA-β-gal-pozitif hücrelerin oranı açısından karşılaştırmalar için, normallik ve log-normallik değerlendirmelerinden sonra t-testleri uygulanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kültürlenen hücrelerin büyüme ve morfolojik özellikleri
Bu protokolü kullanarak, fare kokleasından izole edilen marjinal hücrelerin birincil kültürlerini başarıyla kurduk. Kültürün 2. gününde ışık mikroskobisinde hücrelerin substrata yapışıp kümelenmiş koloniler oluşmaya başladığını ortaya koydu (Şekil 2Aa). 3. gün hücreleri arındırdık (Şekil 2B). Sonraki günlerdeki gözlemler, birincil marjinal hücrelerin üst...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Onlarca yıldır işitme kaybı üzerine yapılan araştırmalar öncelikle duyusal saç hücrelerinin ve bunların spiral ganglion nöronlarla sinaptik bağlantılarının rolüneodaklanmıştır 11. Tüy hücresi hasarı, yenilenmesi ve ototoksik ilaçların etkilerinin araştırılmasında vazgeçilmez rol oynamış in vitro kültür modelleri oluşturmak ve optimize etmek için çok sayıda yayımlanmış çalışmayapılmıştır 12,13. Anc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın ticari veya finansal çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Wuhan Üniversitesi Renmin Hastanesi (Wuhan, Çin) Otolaringoloji-Baş ve Boyun Cerrahisi Bölümü ve Wuhan Üniversitesi Renmin Hastanesi (Wuhan, Çin) Otolaringoloji-Baş ve Boyun Cerrahisi Araştırma Enstitüsü'ne cömert destekleri ve teşvikleri için teşekkürlerimizi sunuyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Sağlık Hizmetleri Merkezi İnşaat ve Kuluçka Vakfı (ZX0000000037), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81700916, 82301294), Hubei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2017CFB242) ve Hubei Eyaleti Sağlık Komisyonu Bilimsel Araştırma Projesi (WJ2017Q005) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Santrifüj TüpüServicebioEP-1501-JKültür için kullanım
35 mm Hücre Kültürü ÇanakıNEST706001Diseksiyon için kullanım
%4 ParaformaldehitServicebioG1101İmmünoffloresan boyama
6-kuyu PlakasıServicebioCCP-6HKültür için kullanım
Alexa Fluor 488-Konjuge Keçi Anti-Tavşan AntikoruProteintechSA00013-2İmmünoffloresan boyama
DAPI ile Antifade Montaj OrtamıAbsinabs9235İmmünoffloresan boyama
Hücre Sayma Kiti-8BeyotimeC0037Hücre sayımı için kullanım
Kollagenaz Tip IIBiosharpBS164Kültür için kullanım
Konfokal Lazer Tarama SistemiOlympus FV1200İmmünoffloresan boyama
DCFH-DAInvitrogenC2938ROS boyama
D-galSolarbioD8310Hücre modelleme için kullanım
EpiCM-A OrtamıSciencell4131Kültür için kullanım
İnce forsepsRWDF11020-11Diseksiyon için kullanım
Keçi SerumuBeyotimeC0265İmmünoffloresan boyama
H2O2MkbioMM0707Hücre modelleme için kullanım
Hank'in Dengeli Tuz Çözümü (HBSS)BiosharpBL561AKültür için kullanım
İzofluranRWDR510-22-10Diseksiyon için kullanım
KCNQ1 Antikor (G-8)Santa CruzSC-365186İmmünoffloresan boyama
MikroskopOlympus SZX7-1063Diseksiyon için kullanım
MikroskopOlympus IX71İmmünofluoresans boyama sonuçlarını gözlemlemek için kullanılır
MitoTracker Red CMXRosInvitrogenM7512ROS boyama
Yenidoğan Fare Yavru Yavrular (P0-P3)BIONT tarafından sağlanmıştır
PBSServicebioG4202İmmünoffloresan boyama
Tavşan Anti-Fare CK18 Monoklonal AntikorProteintech10830-1-APİmmünoffloresan boyama
Senescence β-Galactosidase Boyama KitiBeyotimeC0602Yaşlanma boyama
Triton X-100Sigma-AldrichX100İmmünoffloresan boyama

Kaynaklar

  1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
  2. Bovee, S., et al. The stria vascularis: Renewed attention on a key player in age-related hearing loss. Int J Mol Sci. 25 (10), 5391(2024).
  3. Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Lateral wall Na,K-ATPase and endocochlear potentials decline with age in quiet-reared gerbils. Hear Res. 61 (1-2), 35-46 (1992).
  4. Hibino, H., et al. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Arch. 459 (4), 521-533 (2010).
  5. Johns, J. D., et al. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hear Res. 428, 108682(2023).
  6. Yu, W., et al. Role of the stria vascularis in the pathogenesis of sensorineural hearing loss: A narrative review. Front Neurosci. 15, 774585(2021).
  7. Ohlemiller, K. K., et al. Cellular correlates of age-related endocochlear potential reduction in a mouse model. Hear Res. 220 (1-2), 10-26 (2006).
  8. Mahendrasingam, S., et al. Relative time course of degeneration of different cochlear structures in the CD/1 mouse model of accelerated aging. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (4), 437-453 (2011).
  9. Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
  10. Ohlemiller, K. K., et al. The endocochlear potential as an indicator of reticular lamina integrity after noise exposure in mice. Hear Res. 361, 138-151 (2018).
  11. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
  12. Levano, S., et al. Whole neonatal cochlear explants as an in vitro model. J Vis Exp. (197), e65160(2023).
  13. Wu, K. Y., et al. Isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice. J Vis Exp. (199), e65687(2023).
  14. Schmiedt, R. A., et al. Effects of furosemide applied chronically to the round window: A model of metabolic presbyacusis. J Neurosci. 22 (21), 9643-9650 (2002).
  15. Kurata, N., et al. Histopathologic evaluation of vascular findings in the cochlea in patients with presbycusis. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (2), 173-178 (2016).
  16. Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Med. 2, 30(2004).
  17. Ding, L., Wang, J. miR-106a facilitates the sensorineural hearing loss induced by oxidative stress by targeting connexin-43. Bioengineered. 13 (6), 14080-14093 (2022).
  18. Wan, H., et al. PARP1 inhibition prevents oxidative stress in age-related hearing loss via PAR-Ca(2+)-AIF axis in cochlear strial marginal cells. Free Radic Biol Med. 220, 222-235 (2024).
  19. Zhang, Y., et al. Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells. Mol Neurobiol. 53 (9), 5971-5984 (2016).
  20. Fetoni, A. R., et al. Pathogenesis of presbycusis in animal models: A review. Exp Gerontol. 46 (6), 413-425 (2011).
  21. Marie, A., et al. Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as a model of age-related hearing loss. Neurosci Lett. 656, 138-143 (2017).
  22. Li, W., et al. Rodent models in sensorineural hearing loss research: A comprehensive review. Life Sci. 358, 123156(2024).
  23. Bommakanti, K., et al. Cochlear histopathology in human genetic hearing loss: State of the science and future prospects. Hear Res. 382, 107785(2019).
  24. Nicolson, T. Navigating hereditary hearing loss: Pathology of the inner ear. Front Cell Neurosci. 15, 660812(2021).
  25. Liu, W., et al. Applications and challenges of CRISPR-Cas gene-editing to disease treatment in clinics. Precis Clin Med. 4 (3), 179-191 (2021).
  26. Guo, D., et al. Establishment methods and research progress of livestock and poultry immortalized cell lines: A review. Front Vet Sci. 9, 956357(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Marjinal Hücre İzolasyonuPrimer Hücre KültürüNeonatal Fare İç KulağıMikrodiseksiyon TekniğiKollagenaz SindirimiDiferansiyel Ekimİmmünofloresan BoyamaOksidatif Stres ModeliHücresel Senesans
Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.