Yöntem makalesi

Timokinonun Keap-1/Nrf-2 Sinyalizasyonu, Oksidatif Stres ve Sıçanlarda Davranış Üzerindeki Etkisinin Değerlendirilmesi

251 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69924

⸱

13 Mart 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, timokinonun Keap-1/Nrf-2 yolu üzerindeki etkilerinin, oksidatif stres biyobelirteçlerinin ve subkronik deltamethrin maruziyeti olan bir sıçan modelinde davranışsal sonuçların nasıl değerlendirileceğini göstermektedir.

Özet

Pestisit maruziyeti araştırmalarındaki son gelişmeler, antioksidan bazlı koruma stratejilerine olan ilgiyi artırmıştır. Bitki kaynaklı bir biyoaktif bileşik olan Thymoquinone (TQ) çeşitli toksik etkenlere karşı koruyucu etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Bu çalışma, düşük dozlu Deltamethrin (DTM) maruz kalan farelerde TQ'nun oksidatif stres parametreleri, Keap-1/Nrf-2 sinyal yolu ve davranışsal sonuçlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir protokol tanımlar. Burada, 24 yetişkin erkek Wistar Albino sıçan (250 ± 20 g) rastgele dört gruba (n = 6/grup) ayrıldı: kontrol, TQ, DTM ve DTM+TQ. DTM (1,28 mg/kg) ve TQ (10 mg/kg) 30 gün boyunca intragastrik olarak uygulandı. Çalışma boyunca vücut ağırlığı izlendi. 31. günde açık alan testi kullanılarak hareket aktivitesi ve anksiyete benzeri davranışlar değerlendirildi; depresyona benzeyen davranışlar ise 32. gün zorunlu yüzme testi kullanılarak değerlendirildi. Deneysel dönemin sonunda, biyokimyasal, histopatolojik ve moleküler analizler için plazma ve beyin dokuları toplandı. Malondialdehit, toplam nitrik oksit, glutatyon ve sülfüdril grup seviyeleri dahil olmak üzere oksidatif stres belirteçleri plazma ve beyin korteks örneklerinde ölçüldü. Kelch benzeri ECH ile ilişkili protein 1 (Keap-1) ve nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf-2) ifade seviyeleri Western blotting ve immünohistokimya kullanılarak analiz edildi. Bu protokol, pestisit kaynaklı nörotoksisite ve antioksidan bileşiklerin modülatör etkilerini araştırmak için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

Böcek ilaçları, tarımda ve ev ortamlarında zararlıları kontrol etmek için yaygın olarak kullanılır; Ancak, düşük dozlara kronik maruz kalma hem insanlarda hem de hayvanlarda çevresel kirlenmeye ve olumsuz sağlık etkilerine yol açabilir. Özellikle kirlenmiş gıda ve su yoluyla bu tür maruziyetler, nörolojik bozukluklar ve diğer sistemik toksisiteler riskinin artmasıylailişkilendirilmiştir 1.

Piretroidler, organofosforlu insektisidlerin daha sıkı düzenlemeleri ve nispeten düşük memeli toksisitesi nedeniyle büyük ölçüde yerini almıştır. DTM, α-cyano grubu içeren tip II piretroid olup, dünya genelinde en yaygın kullanılan böcek ilaçlarından biridir ve böceklere karşı son derece etkili kabuledilir 2. Buna rağmen, deneysel çalışmalar DTM'ye maruz kalmanın hayvan modellerinde oksidatif stres ve nörotoksisiteye yol açtığınıgöstermiştir 3,4.

DTM, kan-beyin bariyerini kolayca geçen ve voltaj kapılı sodyum kanallarının açılmasını uzatarak nöronal fonksiyonu bozan yüksek lipofilik bir bileşiktir. Bu etki, tekrarlayan nöronal ateşleme, hücre içi sodyum akışının artması ve reaktif oksijen türlerinin artması ile sonuçta oksidatif hasar, iltihap ve davranış değişikliklerine, özellikle hipokampus ve beyin korteks1 gibi hassas bölgelerde yol açar. Pestisit kaynaklı nörotoksisite konusundaki artan endişeler göz önüne alındığında, doğal kaynaklardan türetilen antioksidan bazlı koruyucu stratejilere giderek daha fazla dikkat yönelmiştir. Nigella sativa uçucu yağının önemli biyoaktif bileşeni olan TQ'nun güçlü antioksidan, anti-inflamatuar ve nöroprotektif özelliklere sahip olduğubildirilmiştir 5. Birçok çalışma, kimyasal olarak indüklenen oksidatif stres ve nörodejeneratif süreçlere karşı faydalı etkilerini göstermiştir 5,6,7,8,9.

TQ'nun koruyucu etkilerinin temel mekanizmalarından biri, Keap-1/Nrf-2 sinyal yolunun modülasyonudur. Bu yol, antioksidan ve detoksifikasyon enzimlerinin ekspresyonunu düzenleyerek hücresel redoks homeostazının korunmasında merkezi bir rol oynar. Oksidatif stres koşullarında, Keap-1 aracılı Nrf-2'nin baskılanması gider, böylece Nrf-2 çekirdeğe translokasyon yapar ve antioksidan yanıt elementine bağlı genekspresyonunu aktive eder 9.

DTM'ye maruz kalma moleküler, biyokimyasal, histolojik ve davranışsal seviyelerde değişikliklere yol açtığı için, tek bir analitik yaklaşım nörotoksik etkilerinin tam kapsamını yakalamak için yeterli değildir. Bu nedenle, bu protokol davranışsal değerlendirmeleri, oksidatif stres biyobelirteç analizlerini, histopatolojik değerlendirmeyi ve Keap-1/Nrf-2 yolunun moleküler araştırmalarını birleştirerek, pestisit kaynaklı nörotoksisiteyi ve TQ gibi antioksidan bileşiklerin modülatör etkilerini incelemek için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Bir arada, yukarıda özetlenen kanıtlar, DTM kaynaklı nörotoksisitenin altında yatan mekanizmaları netleştirmek ve potansiyel koruyucu müdahaleleri değerlendirmek için entegre deneysel bir yaklaşıma ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Davranışsal değerlendirmeleri Keap-1/Nrf-2 yolunun biyokimyasal, histopatolojik ve moleküler analizleriyle birleştirerek, mevcut protokol oksidatif stresle ilişkili nöron hasarının çok boyutlu bir değerlendirmesini mümkün kılmaktadır. Bu mekanik çerçeve içindeki deneysel bulguların yorumu, TQ'nun redoks sinyalini nasıl modüle ettiğini, doku hasarını azalttığını ve subkronik DTM maruziyeti bağlamında davranışsal sonuçları nasıl iyileştirdiğini vurgular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kurumsal Hayvan Deneyleri Yerel Etik Komitesi, deneysel protokolü kayıt numarası 68429034/35 altında onayladı. Çalışmanın toplam süresi 32 gündü. Deneylerden önce, hayvanlar standart laboratuvar koşullarına alıştırıldı. Tüm deneysel prosedürler, kurumsal ve uluslararası hayvan etik kurallarına sıkı sıkıya uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan deneysel malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

NOT: Kimyasal ve biyolojik atıklar, kurumun laboratuvar güvenliği ve atık yönetimi yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmiştir. Asitler, bazlar ve organik çözücüler ayrı, etiketlenmiş kaplarda toplanıp kurumsal tehlikeli atık birimine teslim edildi. Biyolojik malzemeler ve kirlenmiş tüketim malzemeleri biyolojik tehlike kaplarında toplandı, sterilize edildi ve nihai bertaraf için uygun kurumsal tesise sevk edildi.

1. Deneysel tasarım

  1. Hayvan Deney Laboratuvarı'ndan 250 ± 20 g ağırlığında 24 yetişkin erkek Wistar Albino sıçan alın. Her fareyi 24 ± 2 °C sıcaklıkta, 12 saat ışık/karanlık döngüsünde kafeslerde ayrı ayrı tutturul, standart fare yemeği ve musluk suyuna imkansız erişim sağlanır.
  2. Hayvanları rastgele dört gruba ayırın (n = 6 her grup başına): Grup 1: Kontrol (C), Grup 2: TQ, Grup 3: DTM, Grup 4: DTM + TQ.
  3. DTM (%98 saflık) mısır yağında çözün ve 30 gün boyunca 1,28 mg/kg dozda intragastrik garaj ile uygulanır.
  4. TQ'yu mısır yağında 10 mg/kg dozda çözün ve 30 gün boyunca intragastrik gaaj ile uygulanın. Tüm ilaç çözeltilerini günlük taze hazırlayın ve toplam 1 mL/kg hacimde uygulayın.
  5. Kombine tedavi grubunda, DTM'den hemen sonra TQ uygulanır. Gavajla ilgili stresi hesaba almak için kontrol grubuna yalnızca mısır yağı verin.
    NOT: DTM dozu, önceki literatürlere dayanarak morbidite oluşturmadan oksidatif stresi indüklemek için seçilmiştir ve yaklaşık LD501 %1'e karşılık gelir.

2. Vücut ağırlığının ölçümü

  1. Çalışmanın 1., 10., 20. ve 30. günlerinde vücut ağırlığını ölçün (Şekil 1).

3. Davranışsal parametreler

  1. Tüm davranış testlerini tutarlılığı sağlamak için standart koşullarda gerçekleştirin. Hem Zorunlu Yüzme Testi (FST) hem de Açık Alan Testi (OFT) ile test cihazının tam görünümünü sağlayan bir üst kamera ile kaydedin. Aydınlatmayı yaklaşık 100–150 lüks arasında tutun. Hareketsizlik, duruş ve nefes almayı korumak için gereken minimum hareketler dışında aktif hareketin olmaması olarak tanımlar. Tüm test alanlarını hayvanlar arasında %70 etanol ile temizleyin, böylece koku etkilerini önleyin.
  2. FST
    1. 32. gün FST yapın ve depresyona benzer davranışları değerlendirin. Hayvanları su ortamına alıştırmak ve yenilikten kaynaklanan stresi en aza indirmek için 5 dakikalık denemeden 24 saat önce 15 dakikalık ön test oturumu yapın. Ön test oturumu sırasında davranışsal puanlama yapma.
    2. Fareleri tek tek silindirik kaplara (çap: 35 cm, yükseklik: 50 cm) yerleştirin; içinde 30 cm su bulunuyor ve 25 ± 1 °C'de 5 dakika boyunca tutulur.
    3. Video kamerası kullanarak yüzme, tırmanma ve hareketsizlik sürelerini kaydedin. Video kayıtlarından saniyeler içinde davranışsal parametrelerinicelikle ölçmek 10.
    4. Davranışları aşağıdaki şekilde tanımlayın:
      Hareketsizlik: Hayvanın aktif hareket etmeden yüzmeye devam ettiğinde hareketsiz olduğunu düşünün; başını suyun üstünde tutmak için sadece minimal hareketler yeterlidir.
      Yüzme: Yüzmeyi, silindir boyunca dört patinin koordineli hareketleriyle aktif yatay hareket olarak tanımlayın.
      Tırmanma: Tırmanışı, hayvanın dikey pozisyonda kalması sırasında, ön patilerin silindir duvarına doğru yukarı doğru güçlü hareketleri olarak tanımlayın.
    5. Hayvan tamamen hareketsiz kalıyorsa, davranışı önceden belirlenmiş kriterlere göre hareketsizlik olarak değerlendirin.
    6. Test oturumu sırasında harici uyarım veya rota düzeltmesi uygulamayın. Hayvanın tüm 5 dakika boyunca özgürce davranmasına izin verin; güvenlik nedenleriyle müdahale gerekmiyorsa (örneğin boğulma riski).
  3. ÇOK
    1. 31. günde OFT yapın ve hareketli aktivite ile anksiyete benzeri davranışlarıdeğerlendirin 11. 90 x 35 cm ölçümlerinde, siyah çizgilerle 24 eşit birime bölünmüş bir arenada 5 dakika boyunca bireysel hareketleri kaydedin.
    2. Grup dağılımı ile kör bir araştırmacının video kayıtlarından aşağıdaki davranışsal parametreleri nicelikle ölçemek:
      Tüm dört pati ile geçiş sayısı (lokomotor aktivite)
      Merkez ve çevresel bölgelerde geçirilen zaman (kaygı benzeri davranışlar)
    3. Bir hayvan tamamen hareketsiz kalırsa, davranışı hareketsiz olarak kaydedin ve o süre için sıfır geçiş atanın.
    4. Test oturumu sırasında dış uyarım, yeniden konumlandırma veya rota düzeltmesi uygulamayın.
    5. Hayvanın 5 dakikalık süre boyunca özgürce davranmasına izin verin, ancak güvenlik nedeniyle müdahale gerekmezse.
    6. Hayvanlar arasında %70 etanol ile arenayı temizleyin, böylece koku işaretleri ortadan kaldırın.

4. Oksidatif stres belirteçlerinin değerlendirilmesi

  1. Tüm işlemleri 32. günde yapın. Sıçanları intramusküler ksilazin (5 mg/kg) ve ketamin (45 mg/kg) ile derin bir anestezi altına alın. Derin anestezi, pedal çekilme refleksinin olmaması ile doğrulan. EDTA kaplı tüplere kalp ponksiyonu yoluyla yaklaşık 3–5 mL kan toplayın.
  2. Derin anestezi altında kansızlaştırma ile tam ötenazi yapın ve doku toplamadan önce ölümü doğrulayın. Santrifüj kan örnekleri 3.000 x g sıcaklığında, 4 °C'de 10–15 dakika boyunca. Buffy tüyünü rahatsız etmeden plazmayı dikkatlice toplayın ve aliquotları −80 °C'de saklayın. Beyni buz üzerinde hızlıca disseksiye. Biyokimyasal analizler için sol beyin yarımküresi ve hipokampusu ayırın ve sıvı azotta (−80 °C depolama) snap-freeze yapın. Sağ beyin yarımküresini histolojik değerlendirme için %10 nötr tamponlu formalin ile sabitleyin.
  3. Plazma Oksidatif Stres Analizleri
    1. Plazma Lipid Peroksidasyonu (TBARS Testi)
      1. Santrifüj plazma örnekleri (3.000 x g, 10 dakika, 4 °C). 0,5 mL plazma ile 1 mL TCA–TBA–HCl reaktifi (%15 trikloroasetik asit (TCA), %0,375 tiobarbiturik asit (TBA), 0,25 N Hidroklorik asit (HCl)) karıştırın. 10 dakika boyunca 1.000 x g ile santrifüj yapın ve süpernatantı cam tüplere aktarın. Yapay oksidasyonu önlemek için %0,02 bütillenmiş hidroksitolüen (BHT) 50 μL ekleyin.
      2. 100 °C'de 15 dakika ısıt, oda sıcaklığına soğut, 10 dakika boyunca 1.000 x g ile santrifüj yapın ve 532 nm10'da süpernatant emilimini ölçin. Beer–Lambert yasası kullanılarak MDA konsantrasyonu hesaplayın
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm ve nmol/mL plazma olarak ifade edilir.
    2. Plazma Tiol (RSH) Seviyeleri
      1. 0,5 mL plazma, %1 Sodyum dodesil sülfat (SDS) ve 2 mM Etilen diamintetraasetik asit (EDTA) içeren Tris-HCl tamponu (100 mM, pH 8,2) ile karıştırın. 25 °C'de 5 dakika kuluçka yapın ve santrifüj yapın (3.000 x g, 10 dakika, 4 °C). Analiz için üst yüzeyi kullanın.
      2. 0,3 mM 5,5′-ditiobis-(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ekleyin ve 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın. 412 nm10'da absorbansı ölç. RSH konsantrasyonlarını ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 kullanarak hesaplayın ve μmol/L plazma olarak ifade edin.
    3. Plazma NOx Seviyeleri (Griess Reaksiyonu)
      1. Plazmayı 0,3 M Sodyum hidroksit (NaOH) ve %5 çinko sülfat (ZnSO₄) ile deproteinize eder. 20.000 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı toplayın.
      2. Nitrat stok çözeltileri (100, 10 ve 1 mmol/L) hazırlayın ve standart bir eğri (1–100 μmol/L) oluşturun. 100 μL süpernatant (kopya kuyular) bir mikroplakaya yüklenin.
      3. 100 μL vanadyum (III) klorür (VCl₃), ardından 50 μL sülfanilamid ve 50 μL N-(1-naftatil) etilenediamin ekleyin. Oda sıcaklığında 30–45 dakika kuluçka yapın ve 540 nm10'da soğurma ölçün. Standart eğriden NOx konsantrasyonlarını belirleyin ve μmol/L plazma olarak ifade edin.
  4. Doku oksidatif stres analizleri
    1. Tüm biyokimyasal analizler için yaklaşık 100 mg sol beyin yarımküre dokusu kullanın.
    2. Doku lipid peroksidasyonu (TBARS Testi)
      1. Dokuyu (1:10 w/v) buz gibi soğuk %10 TCA ile homojenize edin. %0,67 TBA eşit hacim ekleyin ve 100 °C'de 15 dakika ısıtın. Soğutma ve santrifüj (3.000 x g, 10 dakika, 4 °C)10. 535 nm'de süpernatant emilimini ölç. MDA'yı ε = 1.56 × 105 M⁻1 cm⁻1 kullanarak hesaplayın ve nmol/g yaş doku olarak ifade edin.
    3. Doku glutatyon (GSH) seviyeleri
      1. Dokuyu %10 TCA (1:10 w/v) ve santrifüj (3.000 x g, 10 dakika, 4 °C) içinde homojenize edin. 0,5 mL üst üstten 2 mL DTNB çözeltisi (%1 sodyum sitratta 0,4 mg/mL) karıştırın10. 412 nm'de emilme hızını hemen ölçün. GSH hesaplayın ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 ile μmol/g ıslak doku olarak ifade edin.
    4. Doku NOx seviyeleri (Griess Reaksiyonu)
      1. Dokuyu fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) (1:5 w/v) ve santrifüjde (2.000 x g, 5 dakika) homojenleştirin. 0,3 M NaOH ve %5 ZnSO₄ ile süpernatantı deproteinize edin. Santrifüj (3.000 x g, 20 dakika) ve şeffaf üst yüzeyi toplayın.
      2. Nitrat standartları (1–100 μmol/L) hazırlanın. 100 μL süpernatantı çift kuyulara yükleyin. Yukarıda açıklandığı gibi VCl₃ ve Griess reaktiflerini ekleyin. 37 °C'de 45 dakika kuluçka yapın ve 540 nm10'da absorbansı ölçün. Standart eğriden konsantrasyonları belirleyin ve μmol/g dokusu olarak ifade edin.
        DIKKAT: TCA, HCl, NaOH ve organik çözücüler dahil olmak üzere tehlikeli kimyasalları içeren işlemler, sertifikalı kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirildi. Tüm deneyler boyunca laboratuvar önlükleri, kimyasal dirençli eldivenler, koruyucu gözlükler ve gerektiğinde yüz kalkanları gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (PPE) kullanıldı. Tüm kimyasallar kurumsal güvenlik yönergeleri ve ilgili malzeme güvenlik veri formlarına (MSDS) göre ele alındı.

5. Western blot analiziyle Keap-1 ve Nrf-2 Seviyelerinin belirlenmesi

  1. Hipokampal dokuyu 50 mg parçalara ayırın ve 500 μL RIPA tamponu içeren ve proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenen homojenizasyon tüplerine yerleştirin.
  2. Uygun miktarda manyetik boncuk ekleyin ve iki döngü boyunca 1.000 x g seviyesinde homojenizasyon yapın. 14.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Süpernatantı temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve aynı koşullarda tekrar santrifüj yapın. Örnekleri buz üzerinde tutun ve protein konsantrasyonlarını belirleyin.
  4. Protein konsantrasyonlarını üreticinin talimatlarına uygun olarak Protein BR Test Kiti ile bir florometre kullanarak ölçün.
  5. Elektroforez için %10 SDS–PAGE jelleri hazırlayın. Protein konsantrasyonunu 30 μg/μL olarak ayarlayın.
  6. 3:1 oranında 4x Laemmli tamponu ekleyin ve %10 β-merkaptoetanol ekleyin. 95 °C'de 5 dakika ısının, ardından kısa bir süreliğine santrifüj yapın.
  7. Her kanal için 5 μL protein belirteci ve 30 μg protein yükleyin. Jelleri 110 V'da 60–90 dakika çalıştırın.
  8. PVDF membranlarını %100 metanolde 3–5 dakika aktive edin, ardından transferden önce oda sıcaklığında 10 dakika 1× transfer tamponunda dengeleyin.
  9. Transfer tamponu ile ıslak filtre kağıtları ve süngerleri ile transfer sandviçi dikkatlice monte edin ve hava kabarcıklarının tamamen temizlenmesini sağlar. Protein transferi 100 V'da 90 dakika boyunca 4 °C (sabit voltaj) uygulanır.
  10. Membranları %3 sığır serumu albümini (BSA) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca orbital bir sallayıcıda bloklayın. Membranları gece boyunca 4 °C'de %3 BSA (Keap-1 ve Nrf-2, 1:3.000; β-aktin, 1:1.000) ile seyreltilmiş primer antikorlarla kuluçka edin.
  11. Membranları 5 kez 5 dakika boyunca 1 × Tris tamponlu tuzlu send, %0.1 Tween 20 deterjan (TBS-T) ile yıkayın. İkincil antikor (1:15.000) ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kuluçka yapın.
  12. Tarif edildiği gibi zarları yıkayın ve üreticinin talimatlarına göre (kullanımdan hemen önce eşit hacimde reaktif A ve B karıştırılması) geliştirilmiş kemilyüminsans (ECL) alt tabakası (örneğin, luminol bazlı HRP substratı) ile kuluçka yapın. Membran yüzeyini tamamen kaplayacak kadar substrat uygulayın (yaklaşık 1 mL membran başına) ve oda sıcaklığında 1–2 dakika kuluçka yapın.
  13. Kemilyüminesan sinyallerini, kemilyüminesan algılamaya uygun dijital görüntüleme sistemi kullanarak tespit edin (HRP–luminol reaksiyonundan kaynaklanan ışık emisyonu nedeniyle spesifik uyarılma dalga boyu gerekmez). Otomatik pozlama ayarlarıyla görüntü alın ve bantların doymamasını sağlayın. Aynı leke içindeki tüm örnekler için aynı poz parametrelerini koruyun.
  14. Aynı yatırım getirisi seçimi, arka plan çıkarma ve normalizasyon parametreleri altında Görüntü analiz yazılımı kullanarak densitometrik analiz yapın. Keap-1 ve Nrf-2 bant yoğunluklarını ilgili ev proteini β-aktine normalize edin. Normalize edilmiş değerleri istatistiksel analiz için .csv dosyası olarak dışa aktarın.

6. Histopatolojik analiz

  1. Sağ beyin yarımküresini %10 nötr formalin ile 72 saat sabitleyin. Derecelendirilmiş etanol serisi (%70–%100) ile kurutulun, parafine gömülüp 5 μm kesitleyin.
    Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press) adlı eserinde tanımlanan stereotaksik koordinatlara göre hipokampal ve entorinal korteks seviyelerinde koronal beyin kesitleri alın. Anatomik lokalizasyonu doğrulamak ve geliştirmek için etkileşimli fare beyni atlas görüntüleyicisini (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas kullanın.
  2. Parafinli beyin dokusundan standart histolojik prosedürler kullanarak ardışık dört koronal bölüm (5 μm kalınlığında) hazırlayın. Kesitleri geleneksel protokollere göre hematoksilin ve eosin (H&E) ileboyandırın. 12. Tüm slaytları 200× büyütmede ışık mikroskobu altında inceleyin. Histolojik değerlendirmenin gözlemci yanlılığını en aza indirmek için kör bir araştırmacı tarafından yapıldığındanemin olun 13.
    NOT: Bu prosedür, gruplar arasında tutarlı anatomik karşılaştırma sağladı.
  3. Nöronal kayıp, hücresel ödem, nükleer piknoz, inflamatuar infiltrasyon ve damar tıkanıklığını her bölüm başına 10 rastgele alanda yarı nicel olarak değerlendirin.
  4. Her bir parametre için grup başına ortalama puanları hesaplayın. Puanlama kriterleri şu şekildeydi: 0 (hiç yok, <5%), 1 (hafif, <33%), 2 (orta, %33–66) ve 3 (şiddetli, >%66; Tablo 1).

7. Hipokampus ve entorinal kortekste Nrf-2 ve Keap-1 reaktivitesinin immünohistokimyasal analizi

  1. Hipokampus ve entorinal korteksten 5 μm kalınlığında kesitler hazırlayın ve cam slaytlara monte edin.
  2. Bölümleri deparaffize edip yeniden nemlendirin, ardından oda sıcaklığında fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) yıkanır.
  3. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için %3 hidrojen peroksit ile 5 dakika boyunca bölümleri inkübe yapın. PBS ile yıkama bölümleri
  4. Antijen toplama işlemi yaparak slaytları sodyum sitrat tamponunda (pH 6.0) 10–15 dakika ısıtın. Sürgüleri 30 dakika soğut, sonra PBS ile yıkayın.
  5. Bölümleri tekrar %3 hidrojen peroksit ile 15 dakika boyunca inkübe ederek tam peroksidaz inhibisyonunu sağlayın. Bölümleri PBS ile yıkayın.
  6. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için 10 dakika boyunca bir bloklama çözeltisi uygulayın. Bölümleri gece boyunca 4 °C'de Nrf-2 (1:100 seyreltme) ve Keap-1 (1:200 seyreltme) karşı primer antikorlarla kuluçka edin. Kuluçkadan sonra bölümleri PBS ile yıkayın.
  7. Uygun ikincil antikorla bölümleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın. Bölümleri PBS ile yıkayın.
  8. Bölümlere streptavidin-peroksidaz uygulayın ve nemli bir odada oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın (nemli filtre kağıdı içeren kapalı bir kuluçka kutusu kullanarak %95–100 göreli nem korun). Kuluçkadan sonra bölümleri PBS ile yıkayın.
  9. DAB kromojeni uygulayın ve renk gelişimini ışık mikroskobu altında 100× büyütmede izleyin. Tepkiyi durdurun, kaydırakları musluk suyla durulayın.
  10. Bölümleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1:9 seyreltilmiş hematoksilin ile karşı boya yapın. PBS ve damıtılmış suyla iyice durulayın. Bölümleri kalıcı bir montaj ortamı ile monte edin.
  11. Lekeli bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin. Her bölüm başına 16 temsilci alandan ×400 büyütme ile fotomikrograflar yakalayın.
  12. Görüntü analiz yazılımı kullanarak Nrf-2 ve Keap-1 immünoreaktivitesini nicelikle ölçemek. Daha fazla istatistiksel değerlendirme için nicel verilerin kaydedilmesi ve analiz edilmesi.
  13. İmmünohistokimyasal analiz için görüntüleri ImageJ'de açın ve Set Scale aracı ile kalibre edin. Tüm görüntüleri 8 bit gri tonlamaya dönüştürerek yoğunluk ölçümlerini standartlaştırın. Pozitif boyalı alanlar ve bitişik arka plan bölgeleri için ilgi alanlarını (ROI'lar) manuel olarak tanımlayın ve bunları ROI Yöneticisi'nde kaydedin.
  14. Boyama yoğunluğunu tutarlı H-DAB renk dekonvolüsyonuyla niceleştirin ve ardından tüm örneklerde aynı eşik parametreleri uygulanın. Ortalama gri değeri, optik yoğunluk ve pozitif alan yüzdesini ölçün.
  15. Hücre tabanlı analiz için, Watershed aracı ile eşikli görüntüleri segmente alın ve Analyze Particles ile pozitif hücreleri nicelikle ölçün. Tüm veriler istatistiksel analiz için .csv dosyası olarak dışa aktarıldı.

8. İstatistiksel analiz

  1. SPSS sürüm 29.0 kullanarak istatistiksel analizler yapın. Ham verileri Data View sekmesine girin; her satır bireysel bir hayvanı temsil eder ve değişkenler Değişken Görünümü sekmesinde tanımlanmıştır; deneysel grup kategorik değişken olarak kodlanmıştır (Kontrol, TQ, DTM ve DTM+TQ).
  2. Shapiro–Wilk testi kullanılarak veri normalliğini değerlendirin; Analiz > Betimleyici İstatistikleri > Keşfet'i seçerek, Sonuç değişkenlerini Bağımlı Listeye ve Faktör Listesine Grup atayarak ve testlerle Normallik grafiklerini etkinleştirerek değerlendirin. Normal dağılımlı değişkenler için, Analiz > Karşılaştırma Ortalamaları > Tek Yönlü ANOVAyı kullanarak grup karşılaştırmaları yapılabilir; tanımlayıcı istatistikler ve Levene'nin varyansların homojenliği testi Seçenekler altında etkinleştirilmiştir.
  3. Önemli bir ana etki tespit edildiğinde, Tukey'nin post hoc testini Post Hoc menüsünden uygulayarak çift grup farklarını tespit edin. Varyans homojenliğini doğrulamak için Levene'nin test sonuçlarını kullanın (p > 0.05).
  4. Parametrik varsayımları karşılamayan histopatolojik puanlama verileri için, Kruskal–Wallis testi ile Analiz, Ölçüm Dışı Testler > Eski Diyaloglar > K Bağımsız Örnekler > Analizi ve ardından Bağımsız Örnekler ile Bonferroni düzeltmesi ile Dunn'un sonradan yaptığı testi uygulayın.
  5. İstatistiksel çıktılar ve özet tablolar .xls veya .csv dosyaları olarak dışa aktarıldı, sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi ve < 0.05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Vücut ağırlığı ölçümleri
Vücut ağırlığı 1, 10, 20 ve 30. günlerde kaydedildi. C ve TQ gruplarındaki fareler, deneysel dönem boyunca vücut ağırlığında kademeli bir artış gösterdi ve 30. günde bu gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Buna karşılık, DTM'ye maruz kalan farelerde kontrol sınıfına göre vücut ağırlığında önemli bir azalma gösterdi. TQ'nun birlikte uygulanması, DTM ile ilişkili kilo kaybını azalttı. Çalışma döneminde ölüm oranı gözlemlenmedi (Ş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, DTM'ye subkronik ağızdan maruz kalmanın sıçanlarda tutarlı davranışsal, biyokimyasal, moleküler ve histopatolojik değişikliklere yol açtığını ve TQ'nun aynı anda uygulandığında bu etkileri etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Standartlaştırılmış davranışsal testleri oksidatif stres profilleme, Keap-1/Nrf-2 sinyalinin yol düzeyinde analizi ve histopatolojik değerlendirme ile entegre ederek, protokol pestisit kaynaklı nörotoksisite ve antioksidan temelli nörokoruma de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması veya rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma dış bir fon almadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5,5'-Ditiobis (2-nitrobenzoik asit)Termo Bilimci   69-78-3 
Tezgah üstü santrifüj NF048Nü ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, Amerika Birleşik Devletleri7D2C10
BSA çözümü  Proteintech, Amerika Birleşik Devletleri)66201-1-Ig
Bütillenmiş hidroksitolüenSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö r Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
Hematoksilin ve dash; eosin Bio OpticaW01030708
Hidroklorik asitMerck7647-01-0
Image J yazılım programı NIH; Washington, ABD.https://imagej.net/ij/
İmmünohistokimyasal boyama kiti & nbsp;Lab VisionTM UltraVisionTM Büyük Hacmli Tespit Sistemi: anti-polivalentHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Almanyahttps://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
crotomes/histocore-autocut/
Işık mikroskobu Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
N-(1-Naftil)etilen DiaminTermo Bilimci 1465-25-4
Nano Mikroplaka OkuyucuBMG LABTECHSPECTROstar Nano
fosfatla tamponlanmış tuzlu sindirim MerckP4417
Birincil antikorlar Keap-1 ProteintechKat No. 10503-2-AP, 1:200
Birincil antikorlar Nrf-2 ProteintechKatı No. 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR Test Kiti  ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
Sodyum sitratMerck03-04-6132
Sodyum Dodesil SülfatTermo Bilimci 151-21-3
Sodyum hidroksitMerck1310-73-2
Sodyum nitratMerck7631-99-4
Streptavidin Peroksidaz Termo Bilimci SHRP248-B
SülfanilamidTermo Bilimci   63-74-1 
tiyobarbiturik asit Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Trikarballylic asit, %99Termobilimsel Kimyasallar  139360500
Trikloroasetik asitTermobilimsel Kimyasallar76-03-9
Tris-HÇLTermo Bilimci   1185-53-1 
Vanadyum(III) klorürSigma Aldrich7718-98-1
West Pico PLUS Kemimilüminesans Alt Tabaka ve iBright 750 Thermo Fisher Bilimsel sistemihttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1& gad
_campaignid=16224184202& gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-& gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
Çinko sülfat çözeltisiMerck7733-02-0

Kaynaklar

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Timokinon EtkileriDeltametrin MaruziyetiAntioksidan StratejilerDavran sal De erlendirmeA k Alan TestiZorunlu Y zme TestiWestern Blotlamamm nohistokimya

İlgili makaleler