Method Article

Dopamine Karşı Daha İyi Seçicilik İçin Serotonin Duyarlı SSDN-SWCNT Nanosensörünün Makine Öğrenimi Destekli Raman Spektral Analizi

DOI:

10.3791/69925

⸱

May 15th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Convergence Engineering, Pusan National University, 2BB21+, Department of Chemistry, Pukyong National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, ssDNA sarılmış SWCNT nanosensörünün Raman spektral analizini tanımlar; bu da bir makine öğrenimi modeli yardımıyla dopamine karşı serotoninin seçici ölçümünün iyileştirilmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) nöromodülasyonda kritik roller oynarken, mevcut tespit yöntemleri 5-HT'nin gerçek zamanlı algılanmasını yüksek hassasiyet ve seçicilikle sağlamakta zorlanmaktadır. Daha önce, 5-HT'yi hassas şekilde tespit eden, ssDNA ile sarılmış tek duvarlı karbon nanotüpten oluşan yakın kızılötesi serotonin nanosensörü (nIRHT) geliştirmiştik. Ancak, nIRHT'nin floresans yanıtı 5HT ile dopamin (DA) arasında ayrım yapamaz, bu da pratik uygulamalarını sınırlar. Bu çalışmada, Raman spektroskopisi ve makine öğrenimi bu seçicilik zorluğunu aşmaktadır. G-bandı spektral özellikleri, 5HT ile DA arasında nIRHT'ye bağlanma ile DA arasında belirgin imzalar ortaya koydu; DA, daha fazla G-bandı baskılanmasına neden oldu. Analit spesifik spektral değişiklikleri izole etmek için diferansiyel Raman (ΔRaman) kullandık ve sınıflandırma için üç makine öğrenimi modeli eğittik. ΔRaman ile rastgele orman modeli, ham Raman spektrumları kullanan modelleri önemli ölçüde geride bırakarak %95,8 doğrulukla optimal performans elde etti. Bu yaklaşım, asetilkolin, GABA ve glutamata karşı önemsiz yanıtlarla gelişmiş spesifiklik gösterdi ve fizyolojik uygulamalar için uygun 0,1 μM bir tespit sınırı elde etti. Bu Raman tabanlı yaklaşım, seçici olmayan nIRHT floresan sensörü, tek duvarlı karbon nanotüp (SWCNT) tabanlı moleküler algılamada seçicilik sorunlarını aşarak sağlam nörotransmitter ayırt etmeye yeten bir platforma dönüştürür.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT), ruh hali, biliş, uyku ve iştahı düzenleyen kritik bir nörotransmitterdir ve depresyon, anksiyete ve diğer nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkili işlev bozukluğuile ilişkilidir 1. Biyolojik sistemlerde serotonin dinamiklerinin gerçek zamanlı izlenmesi, sinaptik iletimin milisaniyelik zaman ölçeği ve sinir dokusunun karmaşık kimyasal ortamı nedeniyle hâlâzordur. Nörotransmitter tespit teknolojilerindeki önemli ilerlemelere rağmen, serotonin için hem yüksek hassasiyet hem de moleküler seçiciliğe ulaşmak önemli analitik zorluklar teşkil etmeye devam etmektedir.

Mevcut serotonin tespit yöntemleri, geleneksel analitik tekniklerden yeni nanosensör platformlarına kadar uzanıyor. Elektrokimyasal tespitli yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC-ED) altın standart olmaya devam eder ve mükemmel tekrarlanabilirlikle 0.056 nM tespitsınırlarına ulaşır 3. Ancak, HPLC kapsamlı örnek hazırlama ve 15-30 dakikalık analiz süreleri gerektirir, bu da gerçek zamanlı izlemeyi engeller. Hızlı taramalı döngüsel voltametri (FSCV), karbon fiber mikroelektrotlarda saniye altı zamansal çözünürlük sağlar, ancak elektrot kirlenmesi ve yapısal olarak benzer nörotransmitterler arasında sınırlı seçiciliksorunu vardır 5,6. iSeroSnFR7 ve GRAB-5HT8 dahil olmak üzere genetik olarak kodlanmış floresan sensörlerdeki son gelişmeler, olağanüstü hassasiyet ve dinamik aralık sağlarken, hedef dokuların genetik modifikasyonunu gerektirerek klinik translasyonu sınırlamaktadır.

Tek duvarlı karbon nanotüp (SWCNT) optik sensörler, etiketsiz nörotransmitter tespiti için umut vadeden platformlarolarak ortaya çıkmıştır9. DNA fonksiyonel SWCNT'ler, analiz bağlanmasında yakın kızılötesi (nIR) floresans modülasyonu gösterir ve doku-şeffaf pencerede (900-1400 nm) tespit yapılmasını sağlar10,11. Landry'nin grubu, nIRHT sensörünü ligandların sistematik evrimi yoluyla üstel zenginleştirme (SELEC) ile geliştirdi; ~1010 benzersiz ssDNA dizisini taramak ve serotonin tepkili yapılarıtanımlamak için 12. Bu sensör, serotonin bağlandığında %200 floresans artışı ile mikromolyar hassasiyet sağlar ve dopamin veya serotonin oksidasyonundan bağımsız olarak çalışır. Oksidatif girişimi dışlamak için, önceki çalışmamız bu nörotransmitter çözümlerinin kararlılığını doğruladı; UV-Vis ve NMR analizleri, saf 5HT12'ye kıyasla oksidatif değişiklikler veya yeni zirve oluşumları göstermemiştir. Ayrıca, sistemde kullanılan kısa kuluçka süresi ve nötr pH koşulları, önemli kinon oluşumunu önlemek için tasarlanmıştır. Benzer şekilde, Strano grubu korona fazı moleküler tanıma (CoPhMoRe) öncüsü olmuş ve (GT)₁₅ sarılmış SWCNT'lerin dopamini 11 nMkonsantrasyonlarında 13 tespit ettiğini göstermiştir. Grubumuz yakın zamanda makine öğrenimi rehberli optimizasyon yoluyla bu alanı geliştirdi ve sistematik olarak mutasyona uğramış dizilerin yüksek verimli taraması sayesinde 2,5 kat hassasiyet artışı eldeetti 14.

Bu gelişmelere rağmen, serotonin ve dopamin arasındaki yetersiz seçicilikte temel bir sınırlama devam etmektedir. Her iki nörotransmitter de aromatik halkalar ve etilamin zincirleri içerir ve sadece tek bir hidroksil grubu15 fark eder. Mevcut floresans tabanlı SWCNT sensörleri genellikle 5:1'in altında seçicilik oranlarına ulaşır; bu da sinaptik ortamlarda birlikte salınan nörotransmitterleri ayırt etmek için yetersizdir16. Bu seçicilik zorluğu, serotonin ve dopaminin genellikle ödül ve motivasyonu yöneten beyin bölgelerinde birlikte lokalize olması nedeniyle özelliklekritiktir.

Raman spektroskopisi, SWCNT-analizkompleksi 18'in titreşim modu analiziyle tamamlayıcı kimyasal bilgi sunar. SWCNT'lerin G-bandı (~1580 cm⁻1) moleküler adsorpsiyon ve elektronik doping hassasiyetli frekanslara sahip G⁺ ve G⁻bileşenlerine ayrılır 19. Daha önceki bir çalışma, SWCNT üzerindeki kovalent olmayan yüzeyaktif maddelerin G-bandıbölgesi 20'de belirgin Raman spektral değişiklikleri indüklediğini göstermiştir.

Bu çalışmada, serotonin ve dopamin arasında gelişmiş seçicilik sağlamak için nIRHT sensörünün makine öğrenimi destekli Raman spektral analizini gösteriyoruz. 0.01 ile 100 μM arasında konsantrasyona bağlı Raman yanıtlarını sistematik olarak karakterize ettik ve her nörotransmitter için ayrı spektral parmak izleri ortaya çıktı. Üç makine öğrenimi modeli—konvolüsyon sinir ağı (CNN), destek vektör makinesi (SVM) ve rastgele orman (RF) — spektral veri setlerinde analit kimliğini sınıflandırmak için eğitildi. Kritik olarak, analit spesifik özellikleri izole etmek için temel sinyalleri çıkaran diferansiyel Raman işlemesini başlatıyoruz. DR işleme ile optimize edilmiş RF modeli, moleküler ayrımcılıkta önemli bir ilerlemeyi temsil eden %95,8 sınıflandırma doğruluğuna ulaşır. Bu çok modlu yaklaşım, nIR floresans hassasiyetini Raman kimyasal özgüllüğüyle birleştirerek karmaşık biyolojik ortamlarda gerçek zamanlı, seçici serotonin izlemeye yol sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ssDNA fonksiyonel SWCNT nIRHT nanosensör üretimi

  1. 1 mg tek duvarlı karbon nanotüpler (SWCNT), 100 μL 1 mM E6#9 ssDNA ve 900 μL 1x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) 1,5 mL bir tüpte birleştirin.
    DIKKAT: Kuru SWCNT tozu potansiyel bir solunma tehlikesidir. Tozu sertifikalı kimyasal bir duman kaputu içinde tutun ve maske ile eldiven dahil uygun kişisel koruyucu ekipman takın.
  2. Karışımı banyo sonikatörü ile 5 dakika boyunca dağıtın. Karışımı, %50 genlikte 30 mm genlikte bir uçlu sonikatör ile buz banyosunda 30 dakika boyunca sonikleştirin.
  3. Soniklenmiş çözeltiyi 21.500 x g hassasiyetinde 1 saat santrifüjle ederek dağılmasız SWCNT'ler çökeldi. 850 μL süpernatantı dikkatlice toplayıp yeni bir tüpe aktarın.
  4. Toplanan SWCNT süspansiyonunun 632 nm dalga boyunda emilimini ölçin. Konsantrasyonu, SWCNT yok olma katsayısı 0.036 (mg/L)⁻1 cm⁻1 kullanılarak hesaplayın. Son nIRHT sensör çözümünü 4 °C'de daha fazla kullanana kadar sakla.

2. Raman spektrum ölçümü

  1. 10 mg/L nIRHT dispersyonu 90 μL 96 kuyu tabakasına yükleyin. Sensörün Raman spektrumunu bir PBS tamponunda 532 nm lazer uyarıma kaynağı kullanarak ölçün. Bu kaydedilmiş spektrumu temel olarak belirleyin.
    DIKKAT: Canlı biyolojik örnekler araştırılırken lazer gücünü 10 mW ve dalga boyunu 532nm olarak sıkı bir şekilde korumak çok önemlidir. Daha yüksek lazer güçleri ciddi fototoksisiteye neden olabilir ve hücre yaşamını tehlikeye atabilir. Bu protokolde kullanılan 10 mW gücünde 532 nm lazer, canlı hücre analizi için güvenli ve yıkıcı olmadığı iyi şekilde kanıtlanmıştır; hassasorganeller 21 ve primer nöronlarınelektrofizyolojik aktivitesi 22 korunur ve sağlam Raman sinyal alımını sağlar.
  2. Her 90 μL sensör çözeltisi (10mg/L) ile 10 μL analit çözeltisi ile artışla 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50 ve 100 μM nihai konsantrasyonlara ulaşın. Analit eklendikten sonra yeterli kuluçka için 5 dakika bekleyin.
  3. İnküçlenmiş örneklerin Raman spektrumlarını ölçün. Her konsantrasyon için örnekleri üçlü olarak hazırlayın ve tekrarlanabilirliği sağlamak için 2.1'den 2.2'ye kadar olan adımları tekrarlayın.

3. Makine öğrenimi tabanlı veri analizi

  1. Veri setini, 77 dopamin (DA) yanıtı, 76 serotonin (5HT) yanıtı ve 47 kontrol (PBS) grup yanıtından oluşan toplam 208 Raman spektrumundan oluşturun.
  2. Spektral verinin G bandı bölgesinde arka plan çıkarımı gerçekleştirin. G+ bant zirvesine göre arka plandan çıkarılan verileri normalleştirin.
  3. Normalize spektrumlarda gürültüyü azaltmak için bir medyan filtre uygulayın. Spektral değişiklikleri (ΔRaman) her analitle tedavi edilen spektrumdan normalize kontrol spektrumunu çıkararak izole edin.
  4. 5HT, DA veya kontrol üçlü sınıflandırması için bir Konvolüsyon Sinir Ağı (CNN), Rastgele Orman (RF) ve Destek Vektör Makinesi (SVM) modeli geliştirin.
  5. Tüm veri setini 6:2:2 oranında eğitim, doğrulama ve test setlerine ayırın.
  6. CNN mimarisini, ReLU aktivasyon fonksiyonu ve maksimum 2 havuzlama boyutu kullanılarak üç 1D konvolüsyon katmanı ile yapılandırın; ardından iki tam bağlı katman ekleyin.
  7. SVM'yi doğrusal olmayan sınıflandırma için Radyal Temel Fonksiyonu (RBF) çekirdeği kullanarak yapılandırın.
  8. RF modelini varsayılan hiperparametrelerle yapılandırın.
  9. Oluşturulmuş modelleri 5 katlı çapraz doğrulama ile eğitin. İstatistiksel dayanıklılığı sağlamak için tüm 5 katlama boyunca ortalama performans metriklerini hesaplayın.
  10. Son analiz için doğrulama verilerinde en yüksek doğruluk verdiği modeli seçin.
  11. Seçilen modeli test setinde değerlendirerek genelleme yeteneğini doğrulayın.
  12. Dolaylı tespit sınırını (LOD) 0.1 μM konsantrasyon eşiğinin altına düşen eğitim kümesinden veri sıralı olarak hariç tutarak belirleyin.
  13. Eğitilen modeli, kriterlerin altındaki konsantrasyonlar da dahil olmak üzere tüm konsantrasyon aralığında test ederek nihai LOD belirlenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce SELEC metodolojisiyle geliştirilen E6#9 ssDNA fonksiyonel SWCNT nanosensörü (nIRHT), 5HT bağlanmasıyla geri dönebilir nIR floresans artışı göstererek gerçek zamanlı 5HT görüntüleme in vitro ve exvivo 12 yapılmasını mümkün kılar. E6#9 dizisi (5'-CCCCCCAGCACCAGACAGCACACTCCCCCCCC-3') SWCNT'lerin etrafına dolanarak 5HT için bağlanma noktaları oluşturur. Ancak bu sensör özgüllükten yoksundur: hem 5-HT hem de DA benzer yoğunluk artışına yol a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Raman spektroskopik analizi, geleneksel floresan yanıtıyla elde edilemeyen nIRHT sensörünün özgüllüğünde önemli bir artış sağladı. DA'nın G⁻ bandında (1570 cm-1) daha belirgin bir baskılanma indüklediğini gözlemledik, 5HT ile karşılaştırıldığında. Bu diferansiyel imzalar muhtemelen SWCNT yüzeyindeki değişken moleküler yönelimler ve bağlanma geometrilerinden kaynaklanır. Özellikle, DA'nın katekol kısmı muhtemelen SWCNT yüzeyiyle daha güçlü π-π etkileşimleri oluşturur ve bu da G...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Pusan Ulusal Üniversitesi'nden alınan 2 yıllık bir araştırma bursu ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HiPCo raw  Nanointegris
iDus1.7 InGaAsANDORDU490A-1,9
RamantouchNano Foton
Vibra Hücresi 130SONICS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60, 355-366 (2009).
  2. Dankoski, E. C., Wightman, R. M. Monitoring serotonin signaling on a subsecond time scale. Front Integr Neurosci. 7, 44(2013).
  3. Zhang, X., et al. Highly sensitive assay for serotonin in microdialysates using capillary HPLC with electrochemical detection. J Chromatogr B. 844, 112-118 (2006).
  4. Huang, F., et al. Simultaneous quantification of seven hippocampal neurotransmitters in depression mice by LC–MS/MS. J Neurosci Meth. 229, 8-14 (2014).
  5. Saylor, A., et al. In vivo hippocampal serotonin dynamics in male and female mice: Determining effects of acute escitalopram using fast scan cyclic voltammetry. Front Neurosci. 13, 362(2019).
  6. Mendoza, A., Asrat, T., Liu, F., Wonnenberg, P., Zestos, A. G. Carbon Nanotube Farm Microelectrodes Promote High Temporal Measurements of Serotonin Using Fast Scan Cyclic Voltammetry. Sensors. 20, 1173(2020).
  7. Unger, E. K., et al. Directed evolution of a selective and sensitive serotonin sensor via machine learning. Cell. 183, 1986-2002 (2020).
  8. Wan, J., et al. A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics. Nat Neurosci. 24, 746-752 (2021).
  9. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136, 713-724 (2014).
  10. Gong, H., Peng, R., Liu, Z. Carbon nanotubes for biomedical imaging: The recent advances. Adv Drug Deliv Rev. 65, 1951-1963 (2013).
  11. Yaari, Z., et al. Carbon Nanotubes in Biomedicine: Properties, Methods, and Instrumentation. Handbook Carbon Nanomater. 11, 1-62 (2024).
  12. Jeong, S., et al. High-throughput evolution of near-infrared serotonin nanosensors. Sci Adv. 5, eaay3771(2019).
  13. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat Nanotechnol. 8, 959-968 (2013).
  14. Lee, D., et al. Systematic selection of high-affinity ssDNA sequences to carbon nanotubes. Adv Sci. 11, 2308915(2024).
  15. Manciu, F. S., et al. Simultaneous Detection of Dopamine and Serotonin—A Comparative Experimental and Theoretical Study of Neurotransmitter Interactions. Biosensors. 9, 3(2019).
  16. An, S., et al. Directed Evolution of Near-Infrared Serotonin Nanosensors with Machine Learning-Based Screening. Nanomaterials. 14 (3), 247(2024).
  17. Boi, L., et al. Serotonergic and dopaminergic neurons in the dorsal raphe are differentially altered in a mouse model for parkinsonism. eLife. 12, RP90278(2024).
  18. Dresselhaus, M. S., et al. Raman spectroscopy of carbon nanotubes. Phys Rep. 409, 47-99 (2005).
  19. Jorio, A., et al. G-band resonant Raman study of 62 isolated single-wall carbon nanotubes. Phys Rev B. 65, 155412(2002).
  20. Moore, V. C., et al. Individually suspended single-walled carbon nanotubes in various surfactants. Nano Lett. 3, 1379-1382 (2003).
  21. Pieczara, A., Arellano Reyes, R. A., Keyes, T. E., Dawiec, P., Baranska, M. New highly sensitive and specific Raman probe for live cell imaging of mitochondrial function. ACS Sens. 9 (2), 995-1003 (2024).
  22. Tentellino, C., et al. Electrode- and label-free assessment of electrophysiological firing rates through cytochrome c monitoring via Raman spectroscopy. ACS Sens. 10 (2), 1228-1236 (2025).
  23. Jorio, A., et al. Raman spectroscopy of carbon nanotubes. Phys Rep. 409, 47-87 (2005).
  24. Gravely, M., et al. Aggregation Reduces Subcellular Localization and Cytotoxicity of Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Appl Mater Interfaces. 14, 19168-19177 (2022).
  25. Miyaura, K., et al. Extended-conjugation ?-electron systems in carbon nanotubes. Sci Rep. 8, 8098(2018).
  26. Krasley, A. T., Chakraborty, S., Vuković, L., Beyene, A. G. Molecular Determinants of Optical Modulation in ssDNA–Carbon Nanotube Biosensors. ACS Nano. 19 (8), 7804-7820 (2025).
  27. Chakraborty, S., Krasley, A. T., Smith, C. H., Beyene, A. G., Vuković, L. Machine Learning Prediction of Analyte-Induced Fluorescence Perturbations in DNA-Functionalized Carbon Nanotubes. Nano Lett. 26 (2), 787-794 (2026).
  28. Gianni, M., Pasqualetti, M. Wiring and volume transmission: An overview of the dual modality for serotonin neurotransmission. ACS Chem Neurosci. 14 (23), 4030-4040 (2023).
  29. Mayer, S., Saxena, P., Crayen, M. A., Treue, S. Establishing in vivo brain microdialysis for comparing concentrations of a variety of cortical neurotransmitters in the awake rhesus macaque between different cognitive states. J Neurosci Meth. 415, 110361(2025).
  30. Bunin, M. A., Wightman, R. M. Quantitative Evaluation of 5-Hydroxytryptamine (Serotonin) Neuronal Release and Uptake: An Investigation of Extrasynaptic Transmission. J Neurosci. 18, 4854-4860 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Raman Spectral AnalysisMachine LearningSerotonin NanosensorDopamine SelectivitySingle Walled Carbon NanotubessDNA SWCNTNeurotransmitter DiscriminationRandom Forest ModelG Band SpectroscopyMolecular Sensing

Related Articles