Uygun yüksek konsantrasyonlu çözelti özelliklerine sahip antikorların tanımlanması için otomatik ultra seyreltilmiş öz-ilişkilendirme ölçümleri

Özet

Burada, büyük veri setleri oluşturmak ve AI/ML hazır geliştirilebilirlik tahminlerini desteklemek için antikor kolloidal stabilite testinin yüksek verimli adaptasyonunu tanımlıyoruz.

Özet

Antikor mühendisliğindeki temel zorluklardan biri, biyolojiklerin yüksek konsantrasyonlu formülasyon ve uygulama için uygun olmasını sağlamak için kolloidal stabiliteyi değerlendirmek için analitik tarama yöntemlerinin geliştirilmesidir. Yük stabilizasyonlu kendiliğinden etkileşimli nanoparçacık spektroskopisi (CS-SINS), geleneksel affinite-yakalama öz-etkileşimli nanoparçacık spektroskopisi (AC-SINS) olarak modifiye edilmiş bir versiyonu olup, yüksek konsantrasyonlu çözelti davranışını tahmin etmek için sağlam bir kolloidal stabilite değerlendirmesi olarak uyarlanmıştır. Bu yöntem, önemli kaynaklar yatırılmadan önce kolloidal stabilite sorunlarını tespit ederek kritik erken aşama geliştirme kararlarını mümkün kılar, aşağı akım kaybı oranlarını önemli ölçüde azaltır ve aday seçim zaman çizelgelerini hızlandırır. Bu çalışma, testin mevcut keşif iş akışlarına sorunsuz entegre olduğunu ve minimum örnek gereksinimleri nedeniyle tipik erken aşama testlerle paralel olarak yapılabileceğini göstererek, diğer karakterizasyon çabalarından ödün vermeden yüksek konsantrasyonlu davranışı tahmin etmek için değerli veriler sağladığını göstermektedir. Rutin dinamik ışık saçılması (DLS) ölçümlerinin, plazmon rezonans dalga boyundaki kaymanın yanı sıra, burada tanımlanan HTP yönteminin güvenilirliğini artırabileceği gösterilmiştir. Bir arada, DLS ölçümleri ve otomatik analiz programları kullanılarak çapraz doğrulamanın, çeşitli modalitelerde aday antikor tedavilerinin güvenilir şekilde seçilmesini kolaylaştıracağı öngörülmektedir.

Giriş

Terapötik antikorların geliştirilmesi ve formülasyonunda, opalsans ve viskozite, hasta odaklı ticari bir ürün 1,2,3,4,5,6,7,8 geliştirilmesinde önemli önem taşır. Klasik olarak, bu özellikleri yüksek konsantrasyonda doğrudan gözlemlemek için büyük miktarda protein gereklidir; bu da protein erişiminin sınırlı olduğu antikor keşifinin erken aşamalarında optimal kurşun tanımlanmasını etkili bir şekilde engeller. Bu olayların güvenilir şekilde tanımlanması, 1,2,3,4,5,6,7,8 aşağı akışında zayıf yüksek konsantrasyonlu çözelti davranışını azaltmak için geliştirilebilirlik değerlendirmeleri için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, yüksek konsantrasyonda kötü çözelti davranışını öngören yüksek verimli, düşük konsantrasyonlu^{yöntemlere önemli ilgi vardır; bu} yöntemler yüksek konsantrasyonda 9,10,11,12,13,14,15,16 seviyelerinde kötü çözelti davranışını öngörmektedir. Bu yöntemlerden biri olan kD-DLS, yüksek konsantrasyon özelliklerini tahmin etmekte güvenilir olduğu gösterilmiştir ancak erken aşama iş akışlarının düşük protein tüketimi ve yüksek verimlilik gereksinimlerini^{karşılamamaktadır 12,13}.

Son zamanlarda, CS-SINS olarak bilinen ultra düşük tüketimli altın nanoparçacık bazlı bir testin kD-DLS deneylerinin sonuçlarıyla güçlü bir korelasyona sahip olduğu gösterilmiştir ve yüksek konsantrasyonda kötü çözelti^{özelliklerini tahmin etmede makul derecede etkili olduğu gösterilmiştir 16}. Bu özellikler, CS-SINS'i yüksek verimli bir tarama aracı olarak geliştirme için ideal bir aday yapar. CS-SINS testi, aday antikorları Fc bölgeleri aracılığıyla sabitlemek için altın nanopartikül yüzeylerinde immobilize edilmiş bir yakalama antikoru kullanır ve Fab kollarını çözelti etkileşimlere açık bırakır. Bu konfigürasyon, Fab-Fab etkileşimlerinin ölçülen öz-ilişkilendirme sinyaline hakim olduğu anlamına gelir; bu da avantajlıdır çünkü çalışmalar, Fab alanlarının ağırlıklı olarak mAb öz-ilişkilendirme özelliklerine katkıda bulunduğunu gösterir; muhtemelen tamamlayıcılığı belirleyen bölge (CDR) yüzey özellikleri 17,18,19,20,21,22,23. Bu mekanik temel, CS-SINS'i yüksek konsantrasyonlu formülasyonlarla ilgili kolloidal stabilite risklerini tahmin etmek için oldukça uygun kılar. Alternatif HTP yöntemleri, standup monolayer adsorpsiyon kromatografisi (SMAC), genel sabit bir fazla öz-ilişkilendirmeyi taklit eden boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolon tabanlı yaklaşım ve çapraz etkileşim kromatografisi (CIC) dahil olmak üzere kolon hazırlığı ve büyük örnek^{gereksinimleri} 17,24,25,26,27 içerir.

Burada açıklanan yöntem, CS-SINS testinin plaka doğrulu kurulumunu detaylandırır ve laboratuvar otomasyonu ve analiziyle HTP taramasını mümkün kılarak, mevcut yöntemlerin avantajlarını birleştirirken sonuçların güvenilirliğini artırır. Bu çalışma ayrıca, çeşitli örnek türlerinin testteki öz-etkileşimin zenginleşmesi nedeniyle yüksek kaliteli sonuçlar verdiğini göstermekte ve yöntemin protein kaynaklarına karşı bağımsız olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kolloidal özelliklerin proje ekiplerine daha erken iletinin stratejik çok spesifik antikor ilaç^{tasarımını daha da destekleyebileceğini değerlendiriyoruz} 28,29,30,31,32,33,34.

Yüksek konsantrasyonlu çözelti özelliklerinin incelenmesi, genellikle çok spesifik aday seçim kampanyalarında, kurşun seçimi ve mühendislik tamamlandıktan sonra yapılır (Şekil 1A). Bu özelliklerin erken tahmini, birkaç mikrogram örnek gerektiren CS-SINS gibi yöntemlerle mümkün hale gelmiştir; böylece ultra seyreltilmiş ölçümlerle kolloidal stabilite riskleri tahmin^{edilebilir 16}. Aday havuzu büyük olduğunda erken geliştirilebilirlik taramasının (Şekil 1A) tanıtılması ve hem tek spesifik hem de çok spesifik formatlar için paralel veri üretim kampanyaları ilaç keşif sürecini daha iyi^{bilgilendirebilirdi 31,32}. HTP CS-SINS, bağlanma ve fonksiyon belirleme ile paralel olarak mevcut molekül tarama paradigmasına uyum sağlar; böylece mevcut iş akışlarını bozmadan veya engellemeden bilgi paketine ekler. Olumlu kolloidal özelliklere vurgu yaparak lider aday seçimi, Şekil 1B'de gösterildiği gibi seçim ilerlemesini etkileyecektir.

Önerilen erken geliştirilebilirlik tarama iş akışında, kurşun tanımlama, üretim ve hasta erişimi dahil olmak üzere olumlu ilaç özellikleri açısından tam resmi dikkate alır ve böylece sonraki geliştirmeyi kolaylaştırır³⁴. Biyolojik ilaçların yüksek konsantrasyon özellikleri, uygulama yollarını belirleyebilir: hastane ziyareti gerektiren damar içi enjeksiyonlar veya hasta tarafından evde uygulanabilen ancak genellikle yüksek konsantrasyonlu bir ürün gerektiren deri altı^{enjeksiyonlar (35,36}). Düşük öz-ilişkiye sahip gelişebilir mAb'lar genellikle >100 mg/mL ^5,35 olarak formüle edilir. Visko-indirgeceli ajanlar gibi yardımcı maddeler kullanılarak formülasyon optimizasyonu, CMC geliştirme aşamalarında zayıf çözelti özelliklere sahip arzu edilen adaylar için kolloidal stabilite risklerini^aşabilir. Ancak bu, biyofarmasik üretimde sonraki zorluklar getirir ve başarılı ilaç onaylarının zaman çizelgelerini^{uzatır 36}. Viskoziteyi düşüren yardımcı maddeler (tuzlar ve amino asitler gibi) de protein stabilitesini etkileyebilir, daha önce tanımlanmış gelişim profillerini değiştirebilir ve süreci daha da^{karmaşıklaştırabilir 36,37}. Ayrıca, aşırı yardımcı maddeler immünojenlik endişeleri, çeşitli güvenlik endişeleri nedeniyle hasta popülasyonunu sınırlayabilir veya tedavi uyumunu etkileyebilir ve üretim alanında yeni zorluklar^yaratabilir. Starr ve ark. CS-SINS yöntemini ilk kez yayımladı; PLL ve IgG'nin optimal kütle oranını 0.03 olarak tanımladı ve histidin formülasyonlarında mAb öz-ilişkisi için zeta potansiyel ölçümleriyle nanopartikül stabilizasyonunu^{doğruladı 16}. Özellikle, çok fazla PLL eklemek testte aşırı stabilizasyona yol açar ve mAb ile kendi kendine etkileşimin gözlemlenmesini engeller (PLL ile altın nanoparçacık stabilitesinin iyileştirilmesi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir). Histidin formülasyonlarının tuzsuz kullanımı, elektrostatik taramayı en aza indirir (Debye uzunluğunu artırır), bu da moleküller arası etkileşim aralığını genişletir, böylece zayıf öz-ilişkilendirme sinyallerini artırır ve antikorların yakında olduğu yüksek konsantrasyonlu davranışları taklit eder. Genel olarak, düşük iyon şiddetli formülasyonlar, yüksek konsantrasyonlu formülasyonlar için tercih edilir; çünkü kendiselleşme gözlemlenmiyor.

Büyük PLL polimerleri, altın nanopartikül yüzeylerinde daha fazla yakalama mAb'sının işgal edilmesini engeller; bu da plazmonik kayma penceresini daraltır ve sonraki veri analizi için daha gelişmiş bir eğri uyum programı ve analizi gerektirir. Bu çalışma, dahili veritabanlarıyla senkronize olan bir web portalı aracı kullandı. Bu ön maliyetin en büyük avantajı, büyük bir dizi havuzundan veri oluşturma potansiyeli, adayların çeşitliliğini en üst düzeye çıkarmak ve daha pahalı geliştirme aşamalarındaki darboğazları^azaltmaktır 34,35,36. Burada tanımladığımız CS-SINS testi, HTP uyumlu bir yöntem olarak öne çıkmaktadır ve geç evre kolloidal stabilite^{testleri 16} ile iyi ilişkilendirildiği gösterilmiştir. Gelecekteki programlar için çok spesifik derslerin düşünceli tasarımı ve her alanın bireysel katkılarının karmaşık formatlarda anlaşılması amacıyla yapay zeka destekli profilleme^{devam etmektedir} 41,42,43,44. Bu çabalar, antikor tedavileri için meta-analizleri ve kolloidal stabilite özelliklerinin daha ayrıntılı belirlenmesini birlikte etkileyecek ve böylece nihayetinde erken Ar-Ge aşamalarında zaman kazandıracaktır.

Protokol

Şekil 2 , nanoparçacık konjugasyon hazırlığını gösterir, Şekil 3 iş akışını tamamını gösterir, Şekil 4 laboratuvar otomasyon sürecini haritalandırır ve Şekil 5 veri analiz hattının diyagramını içerir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Tamponların hazırlanması

NOT: 1. Hafta (örnek hazırlığı)

1. Histidin (10 mM), pH 6.0 (örnek ve test tamponu) hazırlayın.
   NOT: Bu adımlar 1. günde gerçekleştirilir.
   1. 5 mM L-histidin monohidroklorür monohidrat ve 5 mM L-histidin ultra saf suda çözünür. Hidroklorik asidi damla karıştırarak pH 6.0'a ulaşana kadar ekleyin; kalibre edilmiş pH ölçerle ölçülür.
   2. Çözeltiyi vakumda 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreyle filtreleyin ve filtratı steril bir şişede toplayın.
   3. Kalite kontrol amacıyla iletkenliği ölçmek ve yaklaşık 500 μS/cm okuma sağlamak için gereklidir.
2. Potasyum asetat (20 mM), pH 4.3 (mAb konjugasyon tamponu yakalama) hazırlanır.
   1. Potasyum asetatı ultrasaf suda çözün ve pH'ı buzul asetik asitle 4.3'e ayarlayın.
   2. Çözüm, adımda 1.1.2'de açıklandığı gibi 0.22 μm gözenek boyutunda bir filtre ile vakum filtresi ile sterilize edilsin.
3. Poli-L-lizin hazırlayın.
   1. 5 mg/mL stok çözeltisi ultra saf suda hazırlayın ve −20 °C'de kullanana kadar saklayın.

2. Tüm örneklerin diyalizi (aday mAb'lar)

NOT: Bu adımları 2–5. günlerde yapın.

1. 100 μL veya 300 μL diyalizörleri 10 mM histidinde, pH 6.0 içinde, 5 dakika boyunca önceden bekletin.
2. Tüm örnekleri (50–100 μL) diyaliz kasetlerine aktarın. Kasetleri 10 mM histidin tamponuna batır, pH 6.0 (kutu başına 700 mL), rezervuarlara karıştırma çubukları ekleyin, rezervuarları manyetik karıştırma plakalarına yerleştirin ve 4 °C'de 2 saat 15 dakika kuluçka yapın.
3. Her 2 saat 15 dakikada bir 10 mM histidin (pH 6.0) ile yedi tampon değişimi gerçekleştirin veya örneklerden tuzun tamamen çıkarılmasını sağlamak için dört gecelik tampon değişimi yapın.
4. Örnekleri alın, temiz matris şişelerine aktarın ve CS-SINS testi yapılana kadar 4 °C'de depolayın.
5. Diyaliz sonrası örnek konsantrasyonlarını ölçün ve polidispersite bilgisini kaydedin. Düzeltilmiş konsantrasyonları, 1 mg/mL bir çözelti için 280 nm'deki ham absorbans değerlerini 280 nm'deki emime ile bölerek hesaplayın.
6. Kuyu adresleri ve konsantrasyonları (μg/mL), kontroller dahil olmak üzere sıvı işleyici giriş dosyasını hazırlayın.

3. Yakalama mAb tampon değişimi (Şekil 2, adım 1)

NOT: Bu adımları 2. haftanın 1. gününde (test) gerçekleştirin.

1. 2 mL'lik tuz arındırma kolonlarından depolama tamponunu oda sıcaklığında 1.000 × g ile 2 dakika boyunca santrifüj ederek çıkarın. Gereken her 700 μL yakalama mAb için iki tuz giderme kolonu hazırlanın. Her santrifüj adımından sonra akışı at.
2. Kolonları 1 mL 20 mM potasyum asetat tamponu ile üç kez yıkayın, pH 4.3. Her yıkamada kolonları 1.000 × g sıcaklığında 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
3. Her kolona 700 μL yakalama mAb (keçi anti-insan Fcγ-spesifik antikor) ekleyin ve 1.000 × g üzerinde 2 dakika santrifüj yaparak yeni 15 mL'lik bir tüpe elüfüj yapın.
4. Tuzdan arındırılmış eluatı toplayın, ikinci dengeli tuz giderme kolonuna uygulayın ve 1.000 × g ile 2 dakika daha santrifüj yapın.
5. Tüm elyat edilmiş örnekleri birleştirin.
6. 2.5. Günler, 2.5. adımda tanımlandığı gibi tuzdan arındıktan sonra yakalama mAb çözeltisi konsantrasyonunu ölçün.
7. Yakalama mAb stok çözeltisini 20 mM potasyum asetat tamponuyla 0,8 mg/mL'ye seyreldin ve kullanıma kadar bir kenara alın.

4. Poli-L-lizin çalışma stokunun hazırlanması

1. Poli-L-lizin stok çözeltisinden küçük bir aliquot ile ultrasaf suyla 2,66 mg/mL'ye seyreltin.

5. Altın nanopartiküllerin konsantrasyonu (Şekil 2, adım 2)

1. 20 nm altın nanopartikülleri içeren polipropilen mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak 1 mL tüplerde stok süspansiyondan 1,2 mL aliquot veya 5 mL tüplerde 4,8 mL aliquot hazırlayın. Santrifüj 21.130 × g'de 6 dakika boyunca koyun.
2. Süpernatantlar (~1.1–1.15 mL) pelletleri rahatsız etmeden çıkarır ve ayrı bir konik tüpe aktarılır.
3. Konsantre pelletleri ve kalıntı hacimleri temiz bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Nanopartikül hacmini pipetle belirleyin ve hacmi (1 mL tüp sayısı × 50 μL) veya (5 mL tüp sayısı × 200 μL) olarak ayıran süpernatantla ayarlayın. Örneğin, 1 mL tüplerde 1,2 mL 10 aliquot santrifüjlendikten sonra, konsantre nanopartiküllerin son hacmini 500 μL'ye ayarlayın.

6. Nanopartikül montajı

1. 1,5 μL poli-L-lizin çalışma çözeltisi ile 48,5 μL tampon değişimli yakalama mAb ile iyice karıştırın (Şekil 2, adım 3).
2. 5. adımdan konsantre nanopartikül çözeltisi ile 6.1. adımdan poli-L-lizin/yakalama mAb çözeltisi ile 1:1 karışımı hazırlayın (Şekil 2, 4. adım).
3. Karışımı oda sıcaklığında (23 °C) gece boyunca kuluçka yapın (Şekil 2, adım 5).

7. Sıvı taşıyıcı test plakası kurulumu

NOT: Bu adımları 2. Günde yapın.

1. Analiz için gerekli malzemeleri derleyin; diyaliz edilmiş antikorlar, diyaliz sonrası konsantrasyonları içeren sıvı işleyici giriş dosyası, konjuge altın nanopartikülleri, robotik taşıma uçları, plakalar ve rezervuarlar (Şekil 3, Laboratuvar Otomasyonu, adım 1). Uçları, örnekleri, plakaları ve rezervuarları Şekil 3'te (Laboratuvar Otomasyonu, adım 1) gösterilen düzene göre güverteye önceden yükleyin.
2. Kontrolleri örnek plakasının A12–D12 kuyularına ekle (iki pozitif kontrol ve iki negatif kontrol). Sıvı taşıyıcısı tarafından hazırlanan tampon örneği için H12 kuyusunu boş bırakın.
3. Sıvı taşıyıcı CS-SINS yöntemini açın ve programı başlatın (Şekil 3, Laboratuvar Otomasyonu, adımlar 2–3). İstürün sorulduğunda sıvı işleyici giriş dosyasını yükleyin ve örnek sayısını girin (Şekil 4A). Sonraki iki hesaplama-kontrol penceresini (Şekil 4B,C) gözden geçirin, değerleri onaylayın ve koşuya devam edin.
4. Kontroller dahil örnekleri, 10 mM histidin tamponunda, pH 6.0'da, matris örnek tüplerinden polimeraz zincir reaksiyon plakasına son 100 μL hacimde aktararak 55,5 μg/mL olarak normalize edin (Şekil 4D, adım 1). İlerlemeyi izleyin; tamamlanmış plaka alanlarının gri göründüğünü ve aktif adımların yeşil olarak vurgulandığını not edin (Şekil 4E).
5. Her numunenin 11,1 μg/mL ile 10 mM histidin tamponunda, pH 6,0 ile daha büyük hacimli seyreltme hazırlanır; polimeraz zincir reaksiyon plakasından malzemeyi 200 μL nihai hacimde bir derin kuyuyu bloğuna aktararak (Şekil 4D, adım 2).
6. Sistemin 2. adımdan sonra duraklamasına izin verin. Yönlendirildiğinde, 6.3. adımda hazırlanan konsantre altın nanopartikülleri tüpü ters çevirerek yaklaşık 10 kez yukarı aşağı pipet yaparak karıştırın.
   1. Nanopartikülleri iki polipropilen mikrosantrifüj tüpü arasında eşit şekilde dağıtın ve tüpleri, kapakları açık şekilde, güvertede belirlenen tüp-raf konumuna yerleştirin (Şekil 4D, vurgulanmış "AuNP"). Çalışmaya devam edin ve sıvı işleyicinin ikinci derin kuyu bloğunun her kuyusuna, her kuyuya 20 μL nanopartikül dağıtmasına izin verin, aynı anda iki kuyu (Şekil 4D, adım 3).
7. Sıvı taşıyıcının, 11,1 μg/mL örnekleri içeren derin kuyu blokundan (Şekil 4D, adım 2) ikinci derin kuyu bloğuna 192 μL numune aktarmasına izin verin ve iyice karıştırın. Her örnek için 4× CS-SINS mastermix üretin; böylece 48 μL altın nanopartikül eklendikten sonra 240 μL nihai hacme 10 μg/mL nihai örnek konsantrasyonu elde edilir (Şekil 4D, adım 3). Bu noktada 4 saatlik kuluçka zamanlayıcısını başlatın.
8. Sıvı taşıyıcının kaynak kuyusuna 30 μL dağıtmasına izin verin ve ardından 384 kuyu plakasının her dörtlüğündeki dört kuyudan üçüne 60 μL dağıtarak her örnek için teknik üçlü parçalar oluşturulur (Şekil 4D, adım 4). Kalan 30 μL'yi kaynak plakaya geri gönderin.
9. Akış ilerledikçe sıvı taşıyıcılı güverte düzenini takip edin. Kullanılan uçların ve doldurulmuş örnek kuyruklarının gerçek zamanlı olarak açık renkten koyu griye dönüştüğünü, aktif hareketlerin ise yeşil ile gösterildiğini gözlemleyin (Şekil 4E).
10. Çalışma tamamlandıktan sonra plakayı çıkarın. Plakayı minimal yapışkanlı şeffaf bir plaka mühürle mühürleyin ve toplam 4 saat oda sıcaklığında kuluçka yapın. 3,5 saat saat noktasında, Ek Şekil 2'de gösterilen ayarlarla odayı 20 °C'ye dengelemek için dinamik ışık saçma programını başlatın.
11. Her kuyunun 510 ile 570 nm arasındaki soğurma spektrumunu 1 nm aralıklarla (zirvenin her iki tarafında 30 nm) 4 saat zaman noktasında ölçün.
12. Hemen 4,5 saat zaman noktasında, Ek Şekil 2'de gösterilen ayarlarla, dinamik ışık saçma plakası okuyucusuyla plakayı ölçün.
    NOT: Sınırlı dinamik aralık nedeniyle spektral ölçümler için yüksek performanslı bir plaka okuyucu kullanın. Hızlı okuma fonksiyonunu kullanmayın.

8. Veri analizi (Şekil 5, Veri işleme şeması)

1. Ham dosyaları spektrofotometre platformundan dışa aktarın ve erişilebilir bir sürücü klasörüne kaydedin.
2. İç sunucuya bağlı betik web portalına erişin. Gerekli CS-SINS giriş parametrelerini girin, bunlar arasında: (1) Başlangıç dalga boyu; (2) Ham sonuç dosyasının dizin konumu; (3) Plaka seti ve aday tanımlayıcılar; (4) Pozitif ve negatif kontrol kuyu normalizasyonu ele alır; (5) Yöntem kurulumu adı ("Manual" veya "Sıvı işleyici"); (6) Spektral tarama ve dinamik ışık saçma ölçümleri için kullanılan cihazlar; (7) Elektronik laboratuvar defteri (ELN) tanımlayıcısı; (8) Satın alma tarihi.
3. Parametreleri web portalına gönderin ve raw results dizininin bir alt klasöründe üç Excel dosyasının oluşturulduğunu doğrulayın.
4. Web portalı tarafından yürütülen eğri uyum betiği kullanılarak λmax değerleri hesaplayın.
5. Spektral tarama ve dinamik ışık saçma ölçümleri için replikat değerleri, normalleştirilmiş sonuçlar ve temsil grafikleri içeren iki çıktı dosyasını inceleyin.
6. Üçüncü çıktı dosyasını, analiz meta verileri ve normalleştirilmiş sonuçları içeren dosyayı kullanarak veritabanı kullanıcı arayüzünde toplu laboratuvar sonuçları oluşturulur. Gruba özgü gereksinimlere göre raporlama niteliklerini tanımlayın ve sonuçları veritabanına yükleyerek şirket genelinde erişim sağlanabilir.

Sonuçlar

Şekil 6 sonuçları gösterir, Ek Şekil 3A temsil eden ham ve saflaştırılmış örnekten CS-SINS puan örneğini gösterir, Ek Şekil 3B farklı günlerde kuyudan kuyuya sinyal değişkenliğini gösterir, Ek Şekil 4 plaka doğrulama sürecinin sonuçlarını içerir ve Ek Şekil 5 her iki CS-SINS okuması için normalizasyon hesaplamasını tanımlar.

Önemli olarak, diyaliz sonrası en az 55 μg/mL konsantrasyonlarla 10 mM Histidin, pH 6.0 ölçüsünde analiz uygulanabilirliği sağlandı; çünkü bu minimum stok konsantrasyonu (örnek başına en az 6 μg) ve yeni alt tanımlayıcılar oluşturuldu. Toplamda, 70 saflaştırılmış örnek ve 20 ham ifade örneği vardı; her biri farklı geliştirilebilirlik kontrol noktalarında (kurşun optimizasyon aşamasında arıtılmış ve Şekil 1A'da vurgulanan kurşun tanımlama aşamasından 1 veya 2 adımlı saflaştırılmış ham madde) örnek türlerini temsil ediyordu. Ham materyal, tamamen otomatik memeli ifade sistemi olan Protein İfadesi ve Arındırma Platformu (PEPP; GNF, San Diego, CA, ABD). Kontroller ticari malzemeden türetildi ve daha önce maksimum veya minimum viskozite, kD-DLS ve CS-SINS değerlerine sahip olduğu doğrulanmıştı. Yeni aliquotlar -80°C sıcaklıkta saklanır ve her test için yeni bir aliquot kullanılır.

Şekil 6A,B, örnek türüne göre ortalama spektral ve DLS puanlarını gösterir ve bar grafikler hata çubuklarını (standart sapma) ve eşleşen renk kodlarını gösterir. Normalizasyon, örnek ile negatif kontrol değerleri arasındaki farkı (lambda max'ı spektral kayma veya Z-ortalaması, hidrodinamik çapı nm cinsinden) kontroller arasındaki farka bölerek script ile hesaplanır (Ek Şekil 5). Şekil 6C, spektral skorları DLS puanlarına karşı çizer ve analitik yaklaşımlar arasında net bir korelasyon gösterir. Tablo 1, tanımlayıcıları, kuyu adreslerini, örnek türü, spektral skorları ve DLS puanlarını referans olarak standart sapmalarıyla birlikte listeler. Monospesifik IgG için kolloidal stabilite riski (spektral veya DLS ölçümü ne olursa olsun) normalize edilmiş 0.35'in üzerinde bir değerdir (Şekil 6A,B'de yeşil noktalı çizgi ile gösterilmiştir, 6/70 (çoğaltılmış kontroller hariç) saflaştırılmış örnekler yüksek riskli puan alırken, saflaştırılmış materyal için 64/70 düşük puan aldı. Önemli olarak, çok spesifik formatlar için sınırın daha yüksek eğilimde olmasını bekleriz. Kaba ifade örneklerinde 2/20 yüksek puan alırken, 18/20 düşük puan aldı. Burada test edilen saflaştırılmış malzemelerden, bir alt kümenin ebeveyn partilerinin ham ekspresyonu da incelendi ve benzer sonuçlar verdi (Ek Şekil 3A'da gösterilmiştir), bu da bağımsız partilerden aday proteinlerin ölçeklendirilmesiyle (arıtma) sırasında testin temsil edici niteliğini gösterdi. Örneklem boyutlarını sınırlamalarına rağmen, standart hatanın ham PEPP örneklerinde saflaştırılmış örneklerden daha yüksek eğilim gösterebileceği belirtilmektedir. CS-SINS uygulamanın sonraki aşamalarında faydası, analizler için daha fazla protein gerektiren testlerle, örneğin viskozite ve kD-DLS ölçümleriyle ortogonal değerlendirmelerin yapılmasını sağlarken, erken geliştirilebilirlik ekranlarında CS-SINS uygulanmasının faydası ise kolloidal stabilite risklerini önleyici olarak ele alır ve nihai lider aday havuzunu etkileyebilir (Şekil 1B). Yüksek hataya sahip sınır adayları, aşağı akış testleriyle yüksek veya düşük riskli olarak doğrulanabilir.

Tespit edilen plazmonik kaymaların küçük doğası nedeniyle, teste güven kazandırmak için alternatif bir okuma tanımlandı; bu da dinamik aralığı genişletir; bu da özellikle yüksek kaliteli plaka okuyucu yokken küçük değişiklikleri tespit etmek için faydalı olabilir. DLS okuması, nanopartikül kümelenmesi ile nanopartiküllerin spektral özelliklerine olan bağımlılık arasında ayrım yapar; ancak her iki tanımlayıcı da benzer standart hata aralıklarına sahiptir ve ölçümlerine göre küçüktür. Görünüşe göre aykırı değerlere daha yatkın örnekler daha yüksek hataya sahip (veya "multimodal" olup DLS ile sonuç bildirmeyecek), ancak testin çalışma aralığındaki CS-SINS değerleri düşük hata dağılımlarına sahiptir. DLS değerleri spektral skor değerleriyle karşılaştırıldığında, hata dağılımı ham örneklerden alınan DLS sonuçları için spektral puanlara göre daha sıkıdır; ancak bu sadece DLS puanı olarak sınır sınırının altına düşen ama spektral puan olarak değil, sadece bir aday için fark yarattı. Laboratuvarlarda farklı aletler varsa bu faydalı olabilir.

Veri işlemenin ve yöntemin güvenilirliğini özellikle ele almak için, yukarıdaki veri setindeki pozitif ve negatif kontroller için tarama süreleri uçtan uca değiştirildi; ayrıca 384 kuyu plakasının başında ve sonunda ara referans noktası olarak hizmet veren çoklu orta ve düşük kontrol kullanıldı. Ek Şekil 4 , nihai plaka doğrulamasının sonuçlarını gösterir; başta yerleştirilen örnekler ile plakanın sonunda karşılaştırıldığında çoğunlukla önemsiz farklı değerler (Ek Şekil 4A,B) ve her iki okuma değeri arasında yüksek korelasyon (Ek Şekil 4C) gösterilir. Son olarak, Şekil 6'daki spektral tarama ve DLS veri setinden elde edilen kontroller için Z-faktörü ve %CV hesaplandı. Kontroller için oluşturulan ve burada sunulan verilerden, spektral tarama okumasının Z-faktörü 0,648 olarak belirlendi; pozitif kontrol için %0,019 CV, negatif kontrol için %0,012 CV oldu. DLS okuması için 0,998 Z-faktörü hesaplandı; pozitif kontrol için %0,025 CV, negatif kontrol için %0,021 CV oldu. Genel olarak, bu testteki örnek değerleri arasındaki Spearman korelasyon katsayısı (Şekil 6C) 0.829 olarak güçlü şekilde pozitif olarak hesaplandı. Bu değerler, her iki ölçüm türü için sağlam hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlar ve şaşırtıcı olmayan şekilde, yeni, avantajlı DLS tespit stratejisi Z-faktörünü optimize eder, ancak spektral tarama güvenilir sonuçların kaydedilmesi için yeterli bir ayrım bandı sağlar (Z > 0.5). DLS puanının CS-SINS iş akışı içinde eşzamanlı olarak toplanan ortogonal bir okuma olduğunu ve ek örnek hazırlığı gerektirmediğini belirtmek önemlidir. Ham DLS puanlarındaki değer farkı daha büyük bir Z-faktörünü oluşturur, ancak "puanlar" ham değerlerden normalize edildikleri için aynı şekilde yorumlanır. Ayrıca, DLS ölçümleri nanopartikül kümelerinin üç boyutlu boyutlarını plazmonik kayma ve spektral bilgiden gelen dolaylı yakınlık göstergelerine karşı yakalıyor; bu da CS-SINS analiz dinamiği anlayışımızı güçlendirebilir. HTP testinin plaka tabanlı ve zaman açısından kritik doğasını göz önünde bulundurarak, bu yöntemlerle testin güvenilirliğini artırmayı hedefledik.

Şekil 1: Geliştirilebilirlik paradigması ve CS-SINS veri toplama. (A) Bir keşif kampanyasından aday seçimine kadar tipik iş akışı bu diyagramda çok spesifik antikorlar için gösterilmiştir. Keşif süreci, tek spesifik adayların taramaya başlamasını sağlar, ardından çeşitli veri paketlerinden inceleyerek ilgi çekici tek spesifik adayları daraltır ve çoklu türsel formatlarda birleştirilir. Veri paketleri, en iyi aday geliştirilene kadar lider adayları daraltmak için tekrar edilir veya genişletilir. Mevcut çalışma akışında küçük bir molekül paneli seçildiğinde (mor kutular) daha düşük verimlilik testleri yapılır. HTP CS-SIN'ler yolun her aşamasında gerçekleştirilebilir, değerli veriler eklenir ve seçim sürecini iyileştirir. (B) En iyi 6 aday için kolloidal özelliklerin varsayımsal sonucu 2 olası yol için gösterilmiştir: düşük verimlilikli testlerle lider aday seçimi ve HTP CS-SINS ile lider aday seçimi. Olumsuz çözüm davranışına sahip adaylar parıltıyla temsil edilir. İlk senaryoda, keşif ekranlarından elde edilen optimal bağlanma özelliklerine göre lider adayların yarısı yüksek konsantrasyonda zayıf davranış sergiler. İkinci senaryoda, CS-SINS verileri erken keşif taramalarında bağlanma verileriyle paralel olarak değerlendirildiği için, orta derecede zayıf kolloidal stabiliteye sahip sadece 1 aday dahil edilmiştir. İkinci senaryoda, potansiyel adayların çeşitliliği birinci senaryoya göre daha fazladır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SINS testi iş akışı. Altın nanopartikül hazırlanması ve konjugasyonu: (1) Yakalanan mAb tampon olarak 20 mM potasyum asetat (pH 4.3) ile değiştirilir ve 0.8 mg/mL'ye seyreltirilir. (2) Altın nanopartiküller stoktan yoğunlaştırılır. (3) Poli-lizin tampon değişimli yakalama mAb ile karıştırılır. (4) Altın nanopartikülleri poli-lizin ve yakalayıcı mAb ile kuluçka geçirilir ve iyice karıştırılır. (5) CS-SINS kompleksinin oda sıcaklığında gece kuluçkası. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Laboratuvar Otomasyonu iş akışı. Laboratuvar Otomasyonu iş akışı: (1) Sıvı işleme yöntemi için malzemeler ve örnekler derlenir. 10 mM Histidin, pH 6 içinde diyaliz edilmiş örnekler, matris tüplerinde veya 96 kuyu levhalarında toplanır. Örnek konsantrasyonları sıvı işleyici giriş dosyasına biçimlendirilir. MAb'ı yakalamak için konjuge edilmiş CS-SINS karmaşık altın nanopartikülleri, robotik sıvı işleme uçları ve plastik eşyalar sıvı işleme testi kurulumu için hazırlanarak toplanır. (2) Test plakası sıvı taşıyıcıda hazırlanır ve oda sıcaklığında 4 saat kuluçka altına alınır. 3) 4 saat işaretinde, 25 dakika süren örnek kuyulardan spektral taramalar (okuma 1) toplanır; 4.5 saat işaretinden sonra, dinamik ışık saçılması (okuma 2), her bir daha uniform kuyu popülasyonu hakkında boyut bilgisi toplar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sıvı işleyici programı ve plaka kurulumu. (A) Program başladığında ve sistem başlattıktan sonra, belirlenmiş kuyu adresleri ve örnek konsantrasyonları içeren giriş dosyasını seçmek için ayrı bir pencere/prompt açılır. Her seferinde örnek sayısı belirtilmelidir, ancak 200 μL hacmi (384 kuyu plaka damgalamadan önceki karışık reaktiflerin son hacmi) aynı kalır. (B) (A)'daki önceki pencereden devam etmesine tıklandıktan sonra, bu ikinci pencere soldaki giriş dosyasından ve sağdaki değerlerden gelen yorumları doğrulamak için görünecektir. (C) (B)'den yorumlar doğrulandıktan sonra, bu üçüncü pencere bir diyalog kutusu ile birlikte belirir ve bu diyalog kutusu normalizasyon için örnek konsantrasyonu için matematiği iki kez kontrol eder (100 μL hacm) son derin kuyu plakasına (200 μL hacm). (D) Bu düzen, sıvı işleyici yazılım modülünün Metod Düzenleyici görünümünden gelir. Solda 300 μL standart uçlar yüklenirken, sahnenin ortasında 1 kutu 50 μL ve 3 kutu 300 μL ince uçlar yüklenir; bunlar sıvı taşıma robotlarıyla uyumludur. Önde bir tampon çukuru, 10 mM Histidin, pH 6 (örneklerin diyalizlendiği tampon) ile yüklenir. Gold nanopartikülleri eşit şekilde 2 mikrosantrifüj tüpüne bölünür ve sağdaki tüp rafının arkasına kapalı açılmadan yüklenir. Örnek tüpleriyle birlikte matris plakası, taşıyıcının arkasında 10. sütunda yüklenir. Örneklerden sonra normalizasyon plakası (1), 11,1 μg/mL numune içeren derin kuyulu plaka (2), birleşik örnek ve nanopartiküllerin 200 μL derinliğindeki kuyusu plakası (3) ve 384 kuyu formatlı plaka (4) gösterilmiştir. (E) Sıvı işleyici güverte düzeni, uçların alınmasını ve örnek dağıtımını gerçek zamanlı olarak gösterir ve her adım ilerledikçe kuyuları işaretler. Burada, tüm örnekler (3^. sütunda taşıyıcının arkasındaki 96 kuyu görüntüsü) gri olarak boyanmıştır ve ardından gelen normalizasyon plakası da kaynak matris plakalarından normalizasyon plakasına eklenmiş örneklerin olduğunu gösterir. Yeşilde, tampon çukurdan aspire edilip karıştırırken normalizasyon plakasının ilk sütununa dağıttıktan sonra 8 kanallı başlık gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Veri işleme şeması. Veri işleme şeması: (1) Ham veri dosyaları dahili bir sunucuya gönderilir. (2) Veri dosyaları, spektral taramaların eğrisini ince ayarlamak için özelleştirilmiş bir script tarafından okunur ve işlenir, CS-SINS çoğaltmaları için lambda max'i hesaplanır ve çoklu modal popülasyonları DLS ile inceler. (3) Veriler kopyalar tarafından gruplandırılır, ardından ortalamaya alınır ve belirlenmiş kontrollere normalleştirilir; Sonuçları bağlamak için veritabanı portalındaki eşleşen plaka haritaları kaynak olarak sağlanır. (4) Tüm veriler, veritabanına yüklenmeye hazır bir şablon halinde organize edilir ve ELN raporlaması için grafikler otomatik olarak oluşturulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Okuma 1 ve okuma 2'den temsil edilen veriler. (A) Normalize edilmiş spektral kayma puanları, PPB ID ile saflaştırılmış, kaba ifade örnekleri ve kontrol örnekleri için dikey noktalı çizgiyle ayrıldığı durumlarda, örnek türleri arasında hata çubuğu dağılımını belirlemek için bir çubuk grafik grafik grafikinde çizildi. Katı kırmızı çizgi, testin üst sınırını gösterir; bu da pozitif kontrole karşılık gelirken, yeşil noktalı çizgi CS-SINS için düşük riskli molekül profilinin kesme değerini gösterir. (B) Normalize edilmiş DLS puanları, PPB ID ile saflaştırılmış, kaba ifade örnekleri ve kontrol örnekleri için işaretlenmiş ve noktalı çizgi ile ayrılmış halde, örnek türleri arasında hata çubuğu dağılımını belirlemek için bir çubuk grafik grafikinde çizildi. Bazı değerler eksiktir (örneğin, DLS çıktısından gelen multimodal taramalar nedeniyle (A)'da ortalamanın üzerinde bir puan olan açık mavi 2^. değer gibi, scripting yazılım web portalı bunun geçersiz olduğunu belirlemiştir). Katı kırmızı çizgi, testin üst sınırını gösterir; bu da pozitif kontrole karşılık gelirken, yeşil noktalı çizgi CS-SINS için düşük riskli molekül profilinin kesme değerini gösterir. (C) Spektral kayma ve DLS değerleri için ortalanmış, normalize edilmiş puanlar, gösterildiği gibi bir korelasyon nokta grafikiyle karşılaştırıldı (spektral kayma puanları Y eksenine, DLS puanları ise X ekseni karşılığında). Renk kodu yalnızca DLS puanlarıyla koordine edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Antikor örneklerinin kolloidal stabilite puanları CS-SINS ile belirlendi. Tablo, örnek tanımlayıcıları, kuyu adreslerini, örnek sınıflandırmalarını, normalize spektral skorları ve CS-SINS testinden elde edilen dinamik ışık saçılması (DLS) skorlarını özetler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: PLL, CS-SINS için 10 mM His tamponunda (pH 6) AuNP'nin stabilitesini geliştirmiştir. Bu şekil, PLL kaplı CS-SINS kompleksine bağlı negatif kontrol mAb ve sadece tampon kontrolüne bağlı negatif kontrol mAb ile yakın örtülen örtülü mAb nanopartiküllerinin ise tamamen farklı aralıklarda zirvelere sahip olması nedeniyle yalnızca negatif kontrol mAb veya tampon ile örtülü olarak gösterilir. Mavi renkle gösterilen, 10 mM ile inkubasyon yapılan konjuge AuNP için (4-saat zaman noktasında 1 nm aralıklarla alınan) kademeli spektral taramalar gösterilmiştir. Onun tamponu, poli-l-lizin ön-inkubasyonu olmadığında negatif kontrol (PPB-117487) ile inkübe edilmiş konjuge boncuklarla örtülüdür. Kırmızı renkte, 10 mM ile inkübe edilmiş konjuge AuNP için 4-saat zaman noktasında 1 nm aralıklarla alınan artan spektral taramalar gösterilmektedir. Onun tamponu poli-l-lizin öncesi kuluçkasından sonra negatif kontrol (PPB-117487) ile inkubasyon yapılmış konjuge boncuklarla örtülüdür. PLL varlığında her iki negatif kontrol için hesaplanan lambda max'ları birbirine yakındır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: DLS plaka okuyucu için DLS ayarları ve kuyu plakası seçimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: PEPP ile Saflaştırılmış Aşağı Akışta İfade edilen ABS'den CS-SINS puanları. (A) Normalize edilmiş spektral kayma puanları, PEPP örnekleri için kuyu ve plaka kimliği ile (örneğin, A1PL1 = levha 1'den A1 kuyusu) Ab64'ü ifade ederek ve normalize edilmiş spektral kayma veya DLS puanlarından dikey noktalı çizgi ile ayrılarak arıtılmış Ab64 sonrası akışta, örnek tipleri arasında hata bar dağılımını (standart sapma) belirlemek için bir çubuk grafik grafik çiziği ile ayrılmıştır. Yeşil noktalı çizgi, CS-SINS için düşük riskli molekül profilinin kesme değerini gösterir. (B) (A)'da yapılan tüm deneylerde tüm örnekler için toplam AUC ve plaka üzerindeki dağılım burada çizilmiştir (ilgili deneyler için renk kodlu). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Kontrollerin uçtan uca 384 kuyu plaka doğrulaması. (A) 384 kuyu levhasının başlangıç sütunlarındaki örnekler için ortalamanın normalleştirilmiş spektral skorları kırmızı renkte gösterilirken, 384 kuyu plakasının sonunda taranan tekrarlanan değerler kireç yeşili renkte gösterilir. Tekrarlanan değerler yan yana bulunur; pozitif kontrol (PPB ID'sinin yanında artı işaretiyle gösterilir) negatif kontrol (PPB ID'nin yanında eksi işaretiyle gösterilir) kadar değişir. Sıvı işleyici programı tarafından hazırlanan (örnek giriş isteğinden bağımsız) tampon kontrolünün değeri, kontrollü bir desen olarak gösterilir. (B) 384 kuyu plakasının başlangıç sütunlarındaki örnekler için ortalanmış, normalize edilmiş DLS puanları kırmızı renkte gösterilirken, 384 kuyu plakasının sonunda taranan tekrarlanan değerler kireç yeşili renkte gösterilir. Tekrarlanan değerler yan yana bulunur; pozitif kontrol (PPB ID'sinin yanında artı işaretiyle gösterilir) negatif kontrol (PPB ID'nin yanında eksi işaretiyle gösterilir) kadar değişir. DLS okuması için tampon kontrol değeri yoktur (çok modal okumalar nedeniyle). (C) Ortalamalanmış, normalize spektral skorlar, 384 kuyu levhasının başlangıç sütunlarından 384 kuyu plakasının sonuna kadar olan örnekler için DLS puanlarıyla karşılaştırılır. Veri noktalarının renk kodlaması, doğrudan ortalama, normalize spektral tarama puanlarına karşılık gelir. DLS okuması için tampon kontrol değeri olmadığından (çok modal okumalar nedeniyle), bu grafikte yalnızca iki okumadan yalnızca 6 kontrol karşılaştırılır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: Kullanıcılar ile günler arasında evrensel raporlama ve referans yapılmasını sağlamak için spektral skorların veya DLS puanlarının normalizasyonu için hesaplamalar. Pozitif kontrol değerleri 1 değerine ayarlanırken, negatif kontroller 0 değerine ayarlanır ve yüksek puanlar kötü kolloidal davranışla ilişkilendirilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, orijinal CS-SINS^{yöntemi 16'dan} birkaç temel değişikliği temsil eder. Önemli olarak, optimize edilmiş PLL:IgG oranı ve histidin tamponu orijinal^{çalışma 16'dan} korundu. En dikkat çekici olanı, testin sıvı işleme robotik platformuna uyarlanarak HTP işlemini mümkün kılmasını sağladı (1 günde 352 örnek ile ~20 örnekle karşılaştırıldığında), böylece uygulamalı çalışma süresi azaltıldı ve otomatik sıvı işleme sayesinde tekrarlanabilirliği artırdı. Robotik sistemi, 384-kuyu plaka gibi yeni formatlara damgalama ve çeşitli laboratuvar eşyaları türleri dahil olmak üzere plaka tabanlı formatlarla uyumludur. Programlar bağımsız çalışabilir ve uçtan uca iş akışı, örnek sınırlayıcı bir ortamda gelişmiş tekrarlanabilirlikle yüksek hacimli bir okuma sağlar. DLS ölçümleri ayrıca, spektral kaymaya daha optimal bir Z-faktörü ile spektral kaymaya ortogonal bir okuma olarak dahil edilmiştir (0.998 v.648), bu özellikle sınırda spektral skorlara veya yüksek standart sapmalara sahip örnekler için değerlidir ve plazmon kaymasının yorumlanmasını yalnızca plaka okuyucu çıkışından elde edilen dinamik aralığı artırmak için tanımlar. Yüksek seviyeli çok modlu plaka okuyucuları olmayan laboratuvarların CS-SINS performansını güvenilir şekilde gerçekleştirmek için DLS kullanabileceği önerilmektedir. 384 kuyruklu bir plaka boyunca zamana bağlı olası değişkenliği ele almak için, plakanın hem başına hem de sonuna kontroller yerleştirilerek kapsamlı plaka doğrulaması yapıldı (Ek Şekil 4) ve minimum tarama süresi etkileri doğrulandı. Ayrıca, ham PEPP örneklerinin saflaştırılmış materyalle karşılaştırılabilir sonuçlar verdiği gösterilmiştir (Şekil 6, Ek Şekil 3A), bu da yöntemin daha önce rapor edilmemiş ve saflaştırılmış proteinin bulunmadığı daha önceki keşif aşamalarına uygulanabilirliğini genişletmiştir. Ek Şekil 3'teki veriler, kaynaklar arasında örnekleme güvenilirliğini gösterirken, verilerin farklı veri setlerinden toplanıp normalleştirildiği için günlük olarak minimum test değişkenliğini de gösterir. Daha spesifik olarak, Ek Şekil 3B, ilgili deney plakalarından tüm kuyular için eğri altındaki toplam alanı (Ek Şekil 3A'daki aynı deneydeki plakaya eşdeğer renk kodlanmış) göstererek, aynı deney içinde ve farklı günlerde, farklı boncuk hazırlıklarıyla beklenen ancak minimal değişkenliği göstermektedir. Erken keşif aşamasında, kD-DLS ve sütun tabanlı yaklaşımlar (SMAC, CIC) gibi yöntemler, daha yüksek örnek tüketimi gereksinimleri ve ham malzemenin işlenmeyememesi^{nedeniyle uygulanabilir değildir} 12,13,24,25,25,26,27; CS-SINS, bu aşamada yalnızca 6 μg ile kolloidal stabilite taramasını benzersiz şekilde mümkün kılmaktadır; bu örnek tek adımda saflaştırılabilir. Son olarak, eğri uyum beti, küçük lambda maksimum kaymalarının ince ayarlanmasını sağlamak ve dosya işleme ile dahili veri tabanlarına otomatik raporlama sağlanacak şekilde güncellendi.

Yaygın sorun giderme senaryoları şunlardır: (1) spektral veya DLS puanlarında yüksek standart sapmalar, genellikle nanopartiküllerin eksik karıştırılmasını (adım 7.6) veya örnek toplamayı gösterir - bu durumlarda, diyaliz sonrası bütünlüğü sağlamak için DLS tarafından diyalizlenen örneklere karşı kalite kontrol yapılması ve standart okuma olarak spektral skorların varsayılan olarak kullanılması önerilir; (2) çok modlu DLS dağılımı veya başarısız DLS ölçümleri, genellikle önceden var olan örnek toplama veya toz kirliliği nedeniyle - diyaliz öncesi 0,22 μm filtrelerle filtreleme bunu azaltabilir; (3) spektral ve DLS puanları arasındaki tutarsızlıklar, genellikle çarpık DLS ölçümlerine atfedilir (muhtemelen yüksek polidispersiteden dolayı, bu da spektral puana göre normal-yüksek aralığında görünür); (4) tutarsız pozitif kontrol değerleri, genellikle yanlış nanopartikül depolama veya bozuk yakalama mAb'den kaynaklanır; her test için -80 °C'de depolanmış yeni aliquotlar kullanılmalıdır (4 °C'de birkaç günden fazla saklanmamalıdır).

Testin bazı sınırlamaları arasında, örneklerin iyice diyaalizlenmesi ve konjuge nanopartiküllerin testten bir gün önce yarı manuel olarak hazırlanması için zaman gerekliliği yer alır; Ancak, diyaliz süresi örneklem kümesi büyüklüğünden bağımsız olarak eşdeğerdir. Uç tıkanma riskleriyle ilgili olarak, sıvı taşıma uçları aspirasyon sırasında basınç değişimlerini izler ve çalışma sırasında ilgili hatalar ortaya çıkar. Yöntem geliştirme aşamasında, beklenen hacimlerin script tarafından hesaplandığından emin olmak için log dosyalarını (ve hizmet sonrası devam etmesini kontrol ettik). Aliciting fonksiyonları yoğun boncuk preparatları için test edilmiştir ve sorun öngörülmez. Testin zaman hassasiyetini, değerlendirmenin Fab-baskın doğasını ve viskozite ile opalescence gibi kolloidal davranışları doğrudan ölçmeden bir vekil test olarak rolünü kabul ediyoruz. Ancak bu uyarlama, ilaç keşfi sürecinin erken aşamalarında daha büyük veri setlerinin verimli bir şekilde karakterize edilmesini sağlar ve daha önce hiç yok olan yerde güçlü bir tarama aracı olarak hizmet verir.

Bu protokoldeki birkaç kritik adım, tekrarlanabilir sonuçlar için dikkatli bir dikkat gerektirir. İlk olarak, tampon hazırlığı sırasında hassas pH ayarlaması (1.1.1 ve 1.2.1. adımlar) gereklidir; çünkü ±0.1 pH biriminin üzerindeki sapmalar nanopartikül kararlılığını ve antikor yakalama verimliliğini etkileyebilir. Yakalama antikor hazırlığında kullanılan düşük pH tampon, optimal konjugasyonu sağlar ve belirtilen tampon koşulları, yük stabilizasyonu ve geniş antikor uyumluluğu için optimize edilmiştir (genellikle formülasyon bağlamında). 10 mM histidin pH 6.0 tamponu, protein kararlılığını korurken optimal elektrostatik etkileşimler sağlar. İkinci olarak, tam tuz giderilme ile kapsamlı diyaliz (adım 2.3) çok önemlidir; Eksik diyaliz, nanopartikül montajı sırasında elektrostatik etkileşimlere müdahale edebilir. Üçüncü olarak, altın nanoparçacık konsantrasyon adımı (protokol adımları 5.1–5.3) peleti rahatsız etmemek için dikkatlice yapılmalıdır; çünkü tutarsız nanopartikül konsantrasyonları analiz hassasiyetini doğrudan etkiler. Dördüncüsü, PLL:yakalama mAb oranı 0.03 (adım 4.1) maksimum yüzey kapsamı için optimize edilmiştir ve daha önce belirlendiği gibi yeterli plazmonik kayma penceresini^{korurken bu durum 16'da} gerçekleşir. Sıvı işleme dinamiklerine açısından, sıvı algılama uçları normalizasyon ve plaka karıştırma işlemlerini gerçekleştirmek için kullanılmıştır; ta ki bu nanopartiküller çözümde güvenilir şekilde ölçülmez (ve dolayısıyla dağıtım hacimleri standart miktarlara ayarlanır). Yukarı akışta sıvı algılama, plaka hizasının yanlış olması veya eksik örneklerle ilgili sorunların operatör tarafından işaretlenmesine olanak tanırken, 384 kuyu damgalaması adımı Z-hizalanma sorunlarını tespit eder. Son olarak, 4-saat kuluçka zamanlamasına sıkı sıkıya bağlı (protokol adımları 7.10–7.12) ve plakayı baştan sona tutarlı şekilde okumak (eksik bir plaka olursa olsun) kritik öneme sahiptir; çünkü plazmonik kayma ve nanoparçacık kümelenmesi zamana bağlı olgulardır; gecikmeler veya erken okumalar yanlış CS-SINS puanlarına yol açabilirken, tam plakayı okumak HTP formatında günler arası puanların tutarlılığını sağlar.

Çok spesifik antikorların kolloidal stabilitesi giderek daha fazla araştırıldıkça, CS-SINS gibi HTP biyofiziksel testleri tarafından sağlanan büyük veri setleri, molekül stabilitesi üzerindeki kombinatoryal etkileri daha iyi anlamak için AI/ML modellerini besleme potansiyeline sahiptir. Çalışmalar, dizi çeşitliliği arttıkça, AI/ML sonuçlarının doğruluğunu artırmak için daha büyük veri setlerine olan ihtiyacın arttığını^{göstermiştir} 41,42,43. Monospesifikler için özellikler ve moleküler tanımlayıcılar, kimyasal bozulma yükleri gibi nitelikler için dizilere veya motiflere özgü dikkate alınmaya kıyasla tüm molekül yük dağılımı ve dengesi dikkate alındığında bispesifik veya trispesifiklere dönüştürüldüğünde^{değişebilir} 17,18,19,20,21,22 . Özellikle, tahmin edilen elektrostatik yamalar, hidrofobiklik ve çözücüye erişilebilen yüzey alanı gibi yapısal özellikler, diziye özgü özelliklerden bağımsız olarak toplama ve kararlılık tahminlerini geliştirebilir ve bu da birkaç küçük veri setinin tahmin hazırlığı^{ile uyumlu olmasını sağlar} 17,18,19,20,21,22 . CS-SINS puanının bir molekülün biyofiziksel profilinin temsil eden zirvesine referans olarak basitliği, testi AI/ML modellerinin eğitimi için uygun kılar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL İletken Uçlar, 300 μL İletken Uçlar, 300 µL İnce İletken Uçlar)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tüpleri Snap Kapaklı (5.0 mL, Mikrotüp)	Eppendorf	30119401
Falcon Konik Santrifüj Tüpleri (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Keçi anti-insan Fcγ-spesifik antikoru	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Altın nanopartiküller (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-kuyu μClear Taban Polistiren Mikroplakaları – (SS & DLS tahlili plakaları)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Derin Kuyu Konik Taban 2 mL Depolama Plakası – (mastermix ve reaktif karıştırma plakaları)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plakaları normalizasyon (96-Kuyu, düşük profil, ince duvar, kenarlıklı, beyaz/şeffaf HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidin hidroklorür tampon örneği (10 mM, pH = 6.0, örnek ve tahlil tamponu)	Sigma	H8125; H6034	Ultra saf suda 5 mM son konsantrasyonunu hazırlayın, pH'ı 6.0'a ayarlayın, ultra saf su ile son hacmi ayarlayın ve 0.22 μm filtre ile süzün
Matrix ScrewTop Tüpler örnek (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 veya MD300 Xpress Mini Diyalizer (Xpress Mikro Diyalizer, Scienova, 6-8 kDa, 96 adet derin kuyu plakasında (12 kartuş), sızdırmazlık tabakası) ve diyalizi rezervuarı/kutusu (düşük hacimli diyalizi kasetleri)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Mikrosantrifüj tüpleri saf polipropilen (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Tek Kullanımlık Polipropilen Robotik Rezervuarlar – (tampon oluğu)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
PES Membranlı Nalgene Hızlı Akış Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lizin, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Ultra saf suda 5 mg/mL stok çözeltisi hazırlayın
Pozitif ve negatif Kontroller (10 mM Histidin'e 1 mg/mL diyaliz edilmiş, pH 6)	İç üretimli ticari antikorlar	N/A	~2 nm spektral kayma ve 250-300 nm DLS boyutu pozitif kontrol için; ihmal edilebilir spektral kayma ve tampon tek kontrolüne karşılaştırılabilir DLS boyutu
Potasyum asetat tamponu yakalama (20 mM, pH = 4.3, mAb konjugasyon tamponu)	Fisher Scientific	P171-500	Ultra saf suda 10 mM reaktif son konsantrasyonunu hazırlayın, asetik asit ile pH'ı 4.3'e ayarlayın, ultra saf su ile son hacmi ayarlayın ve 0.22 μm filtre ile süzün
Zeba tuzsuz kolonu (2 mL, 5 mL veya 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893