Method Article

Saccharomyces cerevisiae'de yeni başlayan ve olgun transkriptlerin karşılaştırmalı RNA yapısı analizi

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA ikincil yapısı öncelikle olgun RNA'da yapı araştırma yöntemleriyle gözlemlenmiştir. Ortak transkripsiyonel Yapı İzleme dizileme (CoSTseq), yeni başlayan RNA'da polimeraz pozisyonunu incelemek için kullanılan nükleer akım sürecini yapı araştırması ile birleştirir. CoSTseq, aktif transkripsiyon altında RNA'da ikincil yapının gözlemlenmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon sırasında, yeni başlayan RNA RNA polimerazlardan (Pols) çıkarken baz eşleşmeye başlar. Bu baz eşleşmesi, RNA işleme, translasyon ve stabilite düzeyinde gen ifadesini kritik şekilde etkileyen RNA yapılarının oluşmasına olanak tanır. RNA ikincil yapısını incelemek için yerleşik yöntemler olgun transkriptlerle sınırlıdır, katlanma durumları hakkında ise çok az şey bilinmektedir. Ayrıca, nispeten düşük bolluk oranı (%1< ve yeni başlayan RNA'nın geçici yapısı, izolasyonunu ve karakterizasyonunu karmaşıklaştırır. Ortak transkripsiyonel Yapı İzleme (CoSTseq), biotin-NTP ve dimetil sülfat (DMS) problaması ile transkripsiyonel çalışmayı kullanarak yeni başlamış transkriptlerin Pol konumu ve baz eşleşme durumunu aynı anda elde eder. Saccharomyces cerevisiae'de, CoSTseq, üç RNA Pol'dan herhangi biri tarafından transkribe edilen yeni başlayan RNA'ların 3' ucuna yakın dizisini ve yapısal bilgiyi verir. Transkripsiyonel akım sırasında, aktif bölgeye entegre edilen biotin-NTP Pols'u etkili bir şekilde durdurur. Sonrasında DMS ile yapılan tedavi A, C ve U nükleotitlerini eşleştirmemiştir. Sonraki biotin zenginleştirmesi ve şablon anahtarlamalı ters transkriptaz ile cDNA sentezi, eşleştirilmiş uç dizileme ve DMS reaktivitelerinin Pol konumuna bağlı olarak hesaplanmasını mümkün kılar. CoSTseq, DMS probing (DMS-MaPseq) ile yan yana kolayca gerçekleştirilir, böylece katlanmış olgun transkriptin de kaydedilmesi mümkün olur. Burada, paralel CoSTseq ve DMS-MaPseq için transkripsiyonel çalıştırma, kütüphane hazırlığı ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA, RNA moleküllerindeki baz eşleşmesi nedeniyle ikincil ve üçüncül yapılara katlanabilir ve bu yapılar, RNA katlanma1'i yönlendiren şaperon olarak görev yapan proteinler tarafından da etkilenebilir. RNA yapısı oldukça dinamik olabilir; hücresel RNA'lar, termodinamik peyzaj tarafından tanımlanan bir dizi yapıya uyum sağlayarak olası RNA konformasyonlarının topluluklarınıoluşturabilir. Dinamik konformasyonel değişiklikler, gen düzenlemesini ve ifadesinietkileme potansiyeline sahiptir 3,4. Buna karşılık, RNA fonksiyonuyla sıkı bağ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Başlamadan önce, Tablo 1'de listelenen tüm tamponların hazır olduğundan emin olun. Tüm reaktifler nükleaz içermeyen suda hazırlanmalıdır. Tampon hazırlığı için moleküler biyoloji olmayan kimyasallar/reaktifler kullanılırken tamponların filtre sterilizasyonu önerilir. 1'den 4'e kadar olan bölümler için aşağıdakıları önceden hazırlayın:

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Tam çözünme için yeterli zaman sağlamak amacıyla en az 1 gün önceden %10 sarkosil (v/v) çözeltisi hazırlayın. Homojen çözeltiyi 0,22 μm filtreyle filtre-sterilize edin. Deney günü, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölüm, bu protokolte açıklandığı gibi CoSTseq iş akışı ve analizinin uygulanmasıyla elde edilen gerçek sonuçları sunar. İlk olarak, bu bölüm başarılı kütüphane hazırlıklarının dizeleme öncesi ve sonrası kalite değerlendirmesinden sonra beklenen sonuçları açıklar. Dizileme öncesi, araştırmacılar biotin zenginleştirme sonrası RNA varlığını doğrulamak için bir test PCR ve TapeStation analizi kullanabilirler. Bu, CoSTseq kütüphanesi hazırlığı sırasında yeni yaranan RNA'nın başarılı izolas.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA, baz eşleşmesinin daha hızlı kinetiği nedeniyle24,25,26,27 sentez hızına kıyasla ko-transkripsiyonel olarak katlanmaya başlar. Mevcut gelişmekte olan RNA katlanma bilgimiz, prokaryotik RNA'ların tek moleküllü çalışmaları, in vitro probing veya in silico yaklaşımlarından geliyor. Bu protokolde, CoSTseq'in ayrıntılı bir iş akışı sunulur; bu .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, kodlama için Dr. SK Boopathy Jegathambal'a ve özellikle P. Bech'e yardımcı tartışmalar için Neugebauer laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek ister. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM112766 KMN'ye) ve Amerikan Kalp Derneği'nden (908949 LS'ye kadar) bir doktora öncesi bursu tarafından desteklendi. LPS, NIH eğitim hibesi 5T32GM14943803 ile desteklendi. LRAB, Amerikan Kalp Derneği'nden (26POST1569544) bir doktora sonrası burs ile desteklendi. Yale Genomik Analiz Merkezi'nde veri toplama, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından Ödül Numarası 1S10OD03036301A1 kapsamında desteklenmişt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10mM ATPInvitrogen18330019
10mM Biotin-11-CTPJena biyobilimleriNU-831-BIOX
10mM GTPInvitrogen18332015
10mM UTPInvitrogen18333013
10X NEBuffer 1New England BiolabsB7001S7.2.1 adımında kullanıldı
10X Fosfat Tamponlu Tuzlu Çay (PBS)Gibco70011-044
%20 SDSRPI L23100-500
Asit fenol:kloroform AmbionAM9722
Boyut seçimi için AMPure XP boncuklarıBeckman Coulter A638807.5.1 adımında Boyut Seçimi için Kullanılıyor
Bacto PeptoneGibco211677
Bacto Maya EkstraktıGibco212750
BicineSigma AldrichB3876-100G
KloroformSigma Aldrich319988
D-(+)-GLUKOZSigma AldrichG5767-500G
DIFCO AGARBD DIFCO214010
Dimetil SülfatSigma AldrichD186309-5ML
Dynabeads™ MyOne Streptavidin C1 boncuklar Invitrogen650014.1. Bölümde Biotin Pulldown için Kullanılıyor
Dynabeads™ mRNA DIRECT™ Arındırma KitiInvitrogen61011Bölüm 5.1'de Poli A seçimi için kullanılmıştır
EDTA, pH 8, 0.5MSigma Aldrich 03690-100ML
EtanolSigma AldrichE7023-500ML
GlycoBlueInvitrogenAM95164.2.7 ve 5.2.4 adımlarında kullanılan eş çökeltici
Induro®   Ters TranskriptazNew England BiolabsM0681S6.3.1 adımında kullanılan RT enzimi
İzoamil alkolSigma Aldrich W205710-1KG-K
İzopropanolJT-BAKER9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kiti & nbsp;  Roche07958889001PCR reaksiyonları için 7.3.2 ve 7.4.1'de kullanılan yüksek isabetli DNA Pol
Magnezyum klorürSigma AldrichSLCM2154
MinElute PCR Temizleme KitiQiagen280046.3.3 ve 7.2.2 adımlarında DNA temizliği için kullanılmıştır
Mth RNA LigaseNew England BiolabsM2611A
Oligo Clean & KonsantrasyonZymo AraştırmasıD4060DNA Oligo temizliği için 7.1.2. adımda önerildi
Potasyum Asetat Sigma Aldrich236497-500G
Potasyum klorürJT Baker3040-01
Potasyum HidroksitAvantor6984-04-01
RNA Temizliği & Konsantretör-5Zymo AraştırmasıR1014PNK tedavisinden sonra 5.3.2'de kullanılan RNA temizleme kiti
RNaseOUT™ Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörüThermo Fisher Scientific10777019PNK tedavisi sırasında 5.3.1 adımında kullanılan RNaz inhibitörü
SarkosylIBI ScientificIB07080
Sodyum AsetatKaliteli Biyolojik351-035-721
Sodyum KlorürSigma AldrichS5150-1L
Sodyum Hidroksit Macron7708-10
SUPERase· In™ RNaz İnhibörü (20 U/μ L)Thermo Fisher ScientificAM26966.3.1. adımda kullanılan RNaz inhibitörü
T4 Polinükleotid KinazNew England BiolabsM0201S
Termostabil 5' App DNA/RNA LigaseNew England BiolabsM0319L
Tris-HCl, pH 7.4, 1MTermo BilimselJ60202. K2
Triton X-100TEKNOVAT1105
TRIzol™ ReaktifInvitrogen15596-026Bölüm 4.2'deki yeni RNA elülasyonu için; Bölüm 4'te "RNA reaktifi" olarak da adlandırılır
β-merkaptoetanolSigma AldrichM6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles