Method Article

Saccharomyces cerevisiae'de yeni başlayan ve olgun transkriptlerin karşılaştırmalı RNA yapısı analizi

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA ikincil yapısı öncelikle olgun RNA'da yapı araştırma yöntemleriyle gözlemlenmiştir. Ortak transkripsiyonel Yapı İzleme dizileme (CoSTseq), yeni başlayan RNA'da polimeraz pozisyonunu incelemek için kullanılan nükleer akım sürecini yapı araştırması ile birleştirir. CoSTseq, aktif transkripsiyon altında RNA'da ikincil yapının gözlemlenmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkripsiyon sırasında, yeni başlayan RNA RNA polimerazlardan (Pols) çıkarken baz eşleşmeye başlar. Bu baz eşleşmesi, RNA işleme, translasyon ve stabilite düzeyinde gen ifadesini kritik şekilde etkileyen RNA yapılarının oluşmasına olanak tanır. RNA ikincil yapısını incelemek için yerleşik yöntemler olgun transkriptlerle sınırlıdır, katlanma durumları hakkında ise çok az şey bilinmektedir. Ayrıca, nispeten düşük bolluk oranı (%1< ve yeni başlayan RNA'nın geçici yapısı, izolasyonunu ve karakterizasyonunu karmaşıklaştırır. Ortak transkripsiyonel Yapı İzleme (CoSTseq), biotin-NTP ve dimetil sülfat (DMS) problaması ile transkripsiyonel çalışmayı kullanarak yeni başlamış transkriptlerin Pol konumu ve baz eşleşme durumunu aynı anda elde eder. Saccharomyces cerevisiae'de, CoSTseq, üç RNA Pol'dan herhangi biri tarafından transkribe edilen yeni başlayan RNA'ların 3' ucuna yakın dizisini ve yapısal bilgiyi verir. Transkripsiyonel akım sırasında, aktif bölgeye entegre edilen biotin-NTP Pols'u etkili bir şekilde durdurur. Sonrasında DMS ile yapılan tedavi A, C ve U nükleotitlerini eşleştirmemiştir. Sonraki biotin zenginleştirmesi ve şablon anahtarlamalı ters transkriptaz ile cDNA sentezi, eşleştirilmiş uç dizileme ve DMS reaktivitelerinin Pol konumuna bağlı olarak hesaplanmasını mümkün kılar. CoSTseq, DMS probing (DMS-MaPseq) ile yan yana kolayca gerçekleştirilir, böylece katlanmış olgun transkriptin de kaydedilmesi mümkün olur. Burada, paralel CoSTseq ve DMS-MaPseq için transkripsiyonel çalıştırma, kütüphane hazırlığı ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA, RNA moleküllerindeki baz eşleşmesi nedeniyle ikincil ve üçüncül yapılara katlanabilir ve bu yapılar, RNA katlanma1'i yönlendiren şaperon olarak görev yapan proteinler tarafından da etkilenebilir. RNA yapısı oldukça dinamik olabilir; hücresel RNA'lar, termodinamik peyzaj tarafından tanımlanan bir dizi yapıya uyum sağlayarak olası RNA konformasyonlarının topluluklarınıoluşturabilir. Dinamik konformasyonel değişiklikler, gen düzenlemesini ve ifadesinietkileme potansiyeline sahiptir 3,4. Buna karşılık, RNA fonksiyonuyla sıkı bağlantılı olan tRNA'lar, küçük nükleer RNA'lar ve rRNA gibi çok tercih edilen yapıları da benimseyebiliyor. Bu örnekler, güçlü düzenleyici rollere sahip olgun RNA'ları vurgulasa da, ökaryot RNA işleme adımları genellikle transkripsiyonla birlikte gerçekleşir; pre-mRNA splicing, 3' uçlu bölünme ve RNA modifikasyonu dahildir. Benzer şekilde, başka yerlerde tartışıldığı gibi, transkript olgunlaşmadan önce RNA katlanmasıgerçekleşebilir 5.

RNA dizisi ikincil yapıyı kodlayabilse de, doğru belirleme genellikle in vitro veya in vivo deneysel doğrulama gerektirir. DMS-MaPseq (dimetil sülfat mutasyonlu profilleme ve dizileme) gibi yapıya özgü kimyasal modifikasyon tekniklerinin ortaya çıkışı, canlı hücrelerden hücresel RNA ikincil yapısının belirlenmesinin yolunuaçmıştır 6. DMS hücrelere tanıtılır ve özellikle adenozin, sitozin ve daha küçük ölçüde uridinin Watson-Crick baz eşleştirme yüzlerini metiller; bu yüzler yalnızca eşleşmediğinde erişilebilir. DMS tarafından yapılan modifikasyondan sonra, yüksek isabetli ve yüksek işlemci bir ters transkriptaz, örneğin Termostable Grup II Intron Ters Transkriptoaz (TGIRT)7, nihai hazırlanan cDNA kütüphanesinde değiştirilmiş bazları mutasyon olarak yeniden kodlamak için kullanılabilir. Bu mutasyonlar, RNA'nın nükleotid seviyesinde erişilebilirliğini çıkarmak için kullanılabilir. Güçlü bir teknik olmasına rağmen, DMS-MaPseq ve ilgili yöntemler öncelikle zaten tamamen katlanmış olgun RNA'yı incelemekiçin kullanılmıştır 6.

Yeni başlayan RNA düzenlemesi ve işlemesini incelemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Küresel ardıcıl dizileme (GROseq), hücrelerdeki RNA seviyelerinin sabit hal ölçümü mümkün kılan ve böylece transkripsiyon, RNA işleme ve RNA seviyelerini etkileyen bozunma süreçlerinde ortalama olan bilgileri sağlayan RNA-dizisinin sınırlamalarını aşmak için geliştirilmiştir. GROseq, nükleer akım için bromouridin kullandı; burada bir RNA Polimeraz (Pol), onlarca baz8 çözünürlüğüyle yeni başlayan RNA'ya nükleotidler ekleyebilirdi. Hassas koşma dizileme (PROseq), biotin-NTP'ler kullanılarak yeni yaranan RNA Pols'larını baz çift çözünürlükte haritalamak için bu metodoloji üzerine inşa edilmiştir. Burada, Pol'un son tespit edildiği yerde, yeni sentezlenenRNA 9'un 3' ucunda bir biyotinilasyon-NTP eklenir.

Son zamanlarda, Schärfen ve arkadaşları, S. cerevisiae10'da yeni başlayan transkriptlerin RNA yapısının belirlenmesini sağlamak için biotin akışı ve DMS probing'ini kullanan ve uyarlayan Ortak Transkripsiyonel Yapı İzlemeyi (CoSTseq) geliştirmiş ve kullanmıştır. CoSTseq, aktif transkripsiyon sırasında RNA ikincil yapısının belirlenmesini sağlar; bu protokol, CoSTseq deneyleri sırasında nükleer çalışmanın DMS-probing ile nasıl birleştirildiğini detaylandırır. CoSTseq'in örnek hazırlığı sırasında dikkatli bir şekilde ele alınması ve CoSTseq analizi sırasında veri kalitesine büyük önem verilmesi gerektiği göz önüne alındığında, bu protokol Illumina platformunda eşleştirilmiş uçlu dizileme için uygun kütüphaneler oluşturmak için en iyi uygulamaları detaylandırır. CoSTseq protokolü aynı anda hem yeni hem de olgun RNA'yı sağlar; bu RNA, yeni ve olgun RNA arasında titiz karşılaştırma sağlamak için DMS-MaPseq veri seti olarak analiz edilebilir (Şekil 1). Deneysel olarak, maya kültürlerinin korunması ve nükleer akın ile DMS problaması için gerekli reaktiflere erişim gereklidir; aşağıdaki protokolde detaylandırılmıştır. Yeni başlayan RNA verimi, CoSTseq kütüphane hazırlığı ve veri analizinin başarısı için kritik öneme sahiptir; Bu nedenle, uygun kuluçka makineleri ve büyüme ortamları tarafından oluşturulan büyüme koşulları, yeterli başlangıç materyali sağlamak için kritiktir. Son olarak, CoSTseq verilerinin hesaplamalı analizini yapmak için Yüksek Performanslı Hesaplama (HPC) kümesine erişim idealdir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Aynı biyolojik örnekten birleştirilmiş CoSTseq ve DMS-MaPseq kütüphane hazırlığının genel görünümü. (A) Maya hücre duvarı ve nükleer zarın sarkosil ile permeabilizasyonu, nükleer akan reaksiyon sırasında yeni başlayan RNA'nın 3' ucunda biotin-NTP dahil edilmesini sağlar. (B) DMS, permeabilize hücrede yeni başlayan ve olgun RNA üzerinde eşleşmesiz A ve C kalıntılarını (bazen U) metiller ve toplam RNA fenol/kloroform ekstraksiyonuyla elde edilir. Yeni oluşan RNA, streptavidin ile konjuge manyetik boncuklarla toplam RNA'dan arındırılır; TRIzol ekstraksiyonu, boncuklardan yeni oluşan RNA'yı serbest bırakır. Paralel olarak, poliadenillenmiş mRNA'lar içeren boncuk süpernatantı EtOH çökeltiliği olabilir; bu materyalden mRNA, oligo(dT) boncuk pulldown ile izole edilebilir. Poli A+ mRNA'lar, kütüphane hazırlığından önce parçalanır. (C) Şablon anahtarlamalı ters transkriptaz, yeni veya olgun RNA'dan ayrı ayrı cDNA üretmek için kullanılır, ardından 5' ve 3' adaptörlerin ligasyonu yapılarak N7 UMI ve barkodlar eklenir (CoSTseq detayları için Şekil 2'ye bakınız). DMS-MaPseq ve CoSTseq ters transkripsiyon adımlarının, CoSTseq'te kullanılan biotin-NTP ve DMS-MaPseq'de kullanılan N çıkıntılarına tamamlayıcı çıkıntılara sahip farklı heteroduplex adaptörler kullanacağını unutmayın. Kütüphanedeki yanlılığı sınırlamak için amplifikasyon için minimum PCR döngüleri kullanılır ve adaptör dimerlerini çıkarmak için boyut seçimi uygulanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Başlamadan önce, Tablo 1'de listelenen tüm tamponların hazır olduğundan emin olun. Tüm reaktifler nükleaz içermeyen suda hazırlanmalıdır. Tampon hazırlığı için moleküler biyoloji olmayan kimyasallar/reaktifler kullanılırken tamponların filtre sterilizasyonu önerilir. 1'den 4'e kadar olan bölümler için aşağıdakıları önceden hazırlayın:

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Tam çözünme için yeterli zaman sağlamak amacıyla en az 1 gün önceden %10 sarkosil (v/v) çözeltisi hazırlayın. Homojen çözeltiyi 0,22 μm filtreyle filtre-sterilize edin. Deney günü, %10 sarkosil kullanarak %0,5 sarkosil çözeltisi yapın ve kullanılana kadar buzda bırakın.
  2. Ultrasantrifüjleri 4 °C'ye kadar önceden soğutma. Duman davlumbasında, termomikseri 30 °C'ye ayarlayın ve 2.5x Yapı probing buffer aliquotunu önceden ısıtın. Bu termomikser daha sonra DMS tedavisinde kullanılacaktır.
  3. Duman davlumbasında, bir ısı bloğunu 65 °C'ye ayarlayın ve RNA ekstraksiyonu için reaksiyon başına kloroform olan 650 μL asit fenol ısıtın.
  4. DTT'yi 2,5x transkripsiyon tamponu ile karıştırarak son konsantrasyon 2 mM'e ulaşın. DMS işleminden hemen sonra kullanmak üzere soğutma ve yıkama çözeltilerini taze hazırlayıp önceden soğutun (bkz. Tablo 1).
  5. Aliquot 40 μL %20 SDS'yi maya lizisi için RNA çıkarmadan önce tüplere koymak. 100 mM Çinko Klorür (ZnCl2) çözeltisi hazırlayın ve kullanmadan önce filtre sterilizasyonu yapın.
  6. Tomurcuklanan maya ile karşılaştırıldığında yeni başlayan RNA baz eşleşmesiyle ilgili özel araştırma sorularını yanıtlamak için gerekli olabilecek deleksiyon, tükenme veya knock-in maya suşları oluşturulur. Her zaman uygun bir maya agar plakasında (YPD, dropout veya antibiyotik plakalar) çizgi çizerek suşları taze canlandırın. Deneye başlamadan bir gün önce tek bir koloniden sıvı kültür başlatın. Maya suşlarının büyümesi ve manipülasyonu hakkında daha fazla talimat için lütfen Schärfen ve ark., 2025'e bakınız.

2. CoSTseq için maya hücrelerinin hazırlanması

  1. Ön kültür kurulumu: S. cerevisiae suşunu BY4741 suşunu 50 mL YPAD ortamında hücreler orta log fazına (600 nm = 0.6) ulaşana kadar yetiştirin ve 200 rpm'de sallama ile 30 °C'de. Gerekirse, kültürü OD 0.2-0.3'e seyreldin ve mayanın 0.6 OD'ye ulaşmasına izin verin.
  2. Mayanın hasamı: 2.500 x g sıcaklıkta 1.8 OD (~3 mL) maya kültürünü 3 dakika boyunca önceden soğutulan bir santrifüjde (4 °C) toplayıp spin yapın. Üst yüzeyi bir atık konteynerine atın. Peleti 10 mL soğuk Fosfat-Tamponlu Salin (PBS) yeniden süzülerek yıkamak. Tekrar 2.500 x g ile 4 °C'de 3 dakika boyunca spin yapın. Süpernatantı atın ve maya pelletini buzda tutun.
  3. Maya hücrelerinin permeabilizasyonu: Maya pelletini dikkatlice 10 mL soğuk %0,5 sarkosil içinde yeniden süzüldürün. Hücreleri yeniden süslemek için P1000 pipetörü kullanın ve kabarcık oluşturmaktan kaçının. Geçirimliliği artırmak için 20 dakika buzda kuluçka yapın. Geçirimli maya hücrelerini 400 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de pellet edin. Permeabilize maya hücrelerini 100 μL nükleazsız suya yeniden süspansiyona alın.

NOT: DMS etiketleme hücre duvarı geçirimliliği gerektirmese de, nükleer akım reaksiyonu biotinile nükleotidlerin transkripsiyon bölgesine ulaşması için permeabilizasyonu gerektirir. Bu, hem maya hücre duvarını hem de nükleer zarını geçirimli hale getiren sarkosil tedavisiyle sağlanır. Ayrıca, sarkosil tedavisi, yeni transkripsiyon başlatma olaylarını önleyerek ve Pol II ile kromatin 11,12'den negatif uzatma faktörlerini yerinden çıkararak devam testini kolaylaştırır. Örnekleri nazikçe ele alın ve hücre yırtılmasını önlemek ve biotinin uzamak için başarılı bir şekilde yeni başlayacak transkriptlere katkısını sağlamak için düşük santrifüj hızını (400 x g)koruyun.

3. Nükleer saldırı ve DMS araştırması

NOT: Biotin-NTP ile nükleer akıntı, RNA Pols'larını aktif bölgelerinde durduran sterik engel oluşturur ve yeni yaranan RNA'nın seçici zenginlenmesi için bir biotin sapı sağlar. İstenen çözünürlüğe bağlı olarak, bir nükleer run-on bir, iki veya dört biyotinile ribonükleotid9 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Maliyet verimliliği için, burada tanımlanan iş akışı yalnızca bir biyotinli nükleotit (yani biotin-CTP) kullanır.

  1. Nükleer hazırlık reaksiyonunun kurulması
    1. Yeni eklenen 5 mM DTT ile 2,5x transkripsiyon tamponu çalışma çözeltisi hazırlayın ve 2,5x yapı probing buffer'ı 30 °C'ye kadar önceden ısıtın (bkz. Tablo 1).
    2. Temiz bir 2 mL tüpte, 120 μL 2,5x transkripsiyon tamponu, 3,75 μL 10 mM ATP, 3,75 μL 10 mM GTP, 3,75 μL 10 mM UTP, 7,5 μL 1 mM Bio-CTP, 15 μL %10 sarkosil ekleyin ve hacmi 46,25 μL nukleazsız su ile 200 μL'ye çıkarın.
    3. Tüpe 100 μL hücre ekleyin ve 30 °C'ye ayarlanmış bir termomikserde 2 dakika boyunca 500 rpm'de çalkalayarak kuluçka yapın.
      NOT: Bu adım son derece zaman açısından önemlidir. Güvenilir veri üretmek için örnek sayısını sınırlamaya çalışın. Tutarlılık için örnekler arasında zamanlamayı kaydırmak en iyi uygulamadır.
  2. DMS tedavisi: Kuluçka tamamlandıktan sonra, tüpe aynı anda 200 μL önceden ısıtılmış 2.5x yapı probing tamponu ve 25 μL DMS reaktifi ekleyin. İki darbe ile nazikçe girdabla inkubasyon yapın ve termomikserde 30 °C'de 4 dakika boyunca 500 rpm'de çalkalayarak inkubasyona devam edin. Tutarlı olmak için örnekler arasında 30 saniye aralık bırakın.
    NOT: DMS probing, yüksek zamansal çözünürlükte RNA baz eşleşmedurumuna 14 izin veren ani bir reaksiyondur. Sürekli DMS modifikasyonunu önlemek için, güçlü indirgentici β-merkaptoetanol kullanılarak DMS etiketlemesini hızlıca söndürmek çok önemlidir. Ayrıca, kalan DMS, ekstraksiyonda RNA geri kazanımı engeller. Santrifüjden önce suya doygun izoamil alkol eklenmesi, hücrepelleti 15'teki kalıntı çözünmeyen DMS'yi giderebilir. Bu adım son derece zaman hassasiyetlidir. Güvenilir veri üretmek için sınırlı sayıda örnekle çalışmak şarttır.
    DIKKAT: DMS, hafif soğan benzeri kokusu olan, son derece zehirli, renksiz bir sıvıdır. DMS ile çalışırken aşırı önlemler gereklidir. Doğrudan temas ve/veya buhar soluması, göz, ağız ve solunum yolu nekrozuna ve organlara ciddi hasar verebilir. Koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve uygun eldivenler kullanın. Mümkün olduğunda çift eldiven kullanın ve eldivenleri maruz kaldıktan veya DMS kullandıktan sonra hemen değiştirin. DMS içeren adımları fume hood altında gerçekleştir. DMS bertaraf için özel atık konteynerleri kullanın.
  3. Soğutma ve yıkama
    1. Tablo 1'de belirtildiği gibi önceden durdurma ve yıkama tamponlarını hazırlayın ve kullanıma kadar buzun üzerinde koyun. DMS metilasyonunu 1 mL stop buffer ekleyerek durdurun.
    2. DMS etiketli örnekleri 3.500 x g g'de önceden soğutmalı bir santrifüjde 5 dakika boyunca döndürün. Atıkları uygun bir atık konteynerine atın.
    3. Pellete 1 ml yıkama tamponu ekleyin ve tekrar askıya alın. 3.3.2. adımı tekrarlayın. Hemen RNA çıkarımına geçin. Mayalı pelleti dondurmayın.
  4. Fenol kloroform ekstraksiyonu
    1. DMS etiketli maya 600 μL RNA lizis tamponuna yeniden askıya alın, ardından süspansiyonu %20 SDS içeren 40 μL içeren tüplere aktarın. 65 °C'de 30 saniye kuluçka edin, 950 rpm'de sallayın.
    2. Mayaya 650 μL önceden ısıtılmış asit fenol:kloroform ekleyin ve termomikserde 65 °C'de 2 dakika ısıtmaya devam edin, 950 rpm'de çalkalayın. Örnekleri 5 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.
      NOT: Bu arada, ısı bloğunu veya termomikseri oda sıcaklığına (RT) geçirin.
    3. RT'de 3 dakika boyunca 20.000 x g santrifüj yapın.
    4. Üst katmanı yeni bir tüpe taşıyın ve 650 μL kloroform ekleyin. Kısa bir süreliğine Vortex. Tekrar santrifüj yapın ve üst katmanı 700 μL izopropanol içeren yeni bir tüpte toplayın.
    5. Ters çevirip karıştırın ve -20 °C dondurucuda 30 dakika kuluçka yapın, böylece RNA'nın çökelmesine izin verin. 20.000 x g sıcaklıkta 45 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Üst yüzeyi at. Pelleti 750 μL %75 etanol (EtOH) ile yıkayın.
      NOT: Bu, protokolde duraklama/duraklama noktasıdır. Örnekler gece boyunca -80 °C'de %75 EtOH içinde bırakılabilir.
    6. 20.000 x g ile 3 dakika döndürün ve süpernatantı atın. RNA peletini hava ile kurutup 81 μL nukleazsız suda çözür. 260 nm dalga boyuna ayarlanmış bir spektrofotometre kullanarak RNA verimini nicelikle ölçün. Yukarıdaki resuspensiyondan 1 μL ölçüm için uygulayın. Gerekirse RNA örneğini seyreltin. Bir sonraki adıma geçmek için en az 80 μg toplam RNA bulunmalıdır.
      NOT: Gerekirse, DMS etiketli RNA -80 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.

4. Yeni başlayan RNA (CoSTseq)

NOT: Fenol: kloroform ekstraksiyonundan elde edilen toplam RNA, DMS etiketli olgun RNA'ları ve üç polimerazın tamamından DMS etiketli biyotinillenmiş yeni başlayan RNA'ları içerir. Toplam RNA'dan yeni oluşan RNA'ları arındırmak için aşağıdaki adımlar streptavidin boncuklarını kullanarak biyotinile edilmiş yeni başlayan RNA'yı zenginleştirecektir. Biotinin streptavidin için güçlü eğilimi (Kd = 10-14 - 10-15 M) nedeniyle, streptavidin boncuklarından RNA'yı elüasyon etmek için ardışık iki RNA reaktifi (bkz. Malzeme Tablosu) çıkarılması yapılır. Büyüme koşullarına bağlı olarak maya RNA'sının %1'inden azının yeni başlayanRNA'sı olduğunu unutmayın 16.

  1. Biotin pulldown
    1. Streptavidin manyetik boncuklarının hazırlanması
      1. Kompozisyon için Tablo 1'de gösterildiği gibi ön yıkama tamponu A ve ön yıkama tamponu B'yi hazırlayın. Streptavidin manyetik boncuklarını vorteksleme yoluyla homojenleştirin. 80 μg toplam RNA örneği başına 44 μL homojenize manyetik boncuk elde edin.
        NOT: Hacimi örnek sayısıyla çarparak ölçeklendirin.
      2. Manyetik boncukları manyetik rafa yerleştirin ve depolama çözümünü çıkarın. Manyetik boncukları 1 mL ön yıkama tamponu A'da yeniden askıya alın.
      3. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın. Süpernatantı mıknatısla çıkarıp çıkarın. Yıkamayı tekrarlayın. 1 mL ön yıkama tamponu B ile 1 kez yıka. Süpernatantı manyetize edip çıkarın, ardından hızla bağlama ve yıkama aşamasına geçin.
    2. Ciltleme ve yıkama
      1. Tablo 1'de gösterildiği gibi 2x bağlama tamponu, 1x bağlama tamponu, yüksek tuzlu ve düşük tuzlu yıkama tamponlarını hazırlayın.
      2. Önceden yıkanmış boncukları, orijinal hacmin (88 μL) iki katı (2x bağlama tamponu) ekleyerek yeniden askıya alın. 80 μL boncuk, 80 μL biyotinillenmiş RNA örneği içeren steril 1,5 mL tüplere aktarın.
      3. Boncuk-örnek karışımını oda sıcaklığında bir rotator üzerinde 20 dakika döndürün. Olgun RNA içeren akış aşamasını manyetik aşamaya göre topla (çökeltme aşamasına geçin).
      4. Boncuk-yeni RNA kompleksini 500 μL yüksek tuzlu tampon ile 2 kez durulayın. 500 μL 1x bağlanma ile bir durulama ve ardından 500 μL düşük tuzlu tampon ile bir durulama yapın.
  2. RNA reaktif ekstraksiyonu ile elusiyon
    1. Termomikseri 60 °C'ye kadar önceden ısıtın. 20.000 x g ile 4 °C arasında hız elde edebilen bir santrifüjü soğutun.
    2. Boncuk-yeni RNA kompleksine 300 μL RNA reaktifi (bkz. Materyal Tablosu) ekleyin ve yeniden süzülür. 60 °C'ye ayarlanmış termomikserde 5 dakika kuluçka yapın.
    3. 60 μL kloroform, vorteks ekleyin ve RT'de 3 dakika kuluçka yapın. 14.000 x g ile 5 dakika boyunca önceden soğutulan santrifüjde çevirin.
    4. Üst sulu fazı yeni bir toplama tüpüne (~180 μL) taşın. Organik fazı atın, boncuklar ve kalan sulu fazın geride kalması.
    5. Toplama tüpünde 360 μL sulu faza nihai hacmi elde etmek için ekstraksiyon tekrarlanın.
    6. Toplama tüpüne 360 μL kloroform ekleyin ve kısa süreliğine vorteks ekleyin. Önceden soğutmalı bir santrifüjde 5 dakika boyunca 14.000 x g ile spin yapın.
    7. Üst katmanın yaklaşık 350 μL'sini yeni bir tüpe aktarın. RNA'yı 900 μL mutlak EtOH ve 1 μL ko-çökeltici ekleyerek çökeltin.
    8. Kısa süreliğine girdablar ve 20 dakika boyunca -20 °C'de veya gece boyunca -80 °C sıcaklıkta yağışın oluşmasına izin verin.
    9. Ön soğutmalı santrifüjde, 20.000 x g ile 20 dakika boyunca santrifüj yapılacaktır. Süpernatantı dikkatlice at.
    10. Pelleti 750 μL %75 EtOH ile yıkayın, ardından 20.000 x g ile 5 dakika boyunca bir soğuk santrifüj daha yapın.
    11. Pelleti kurutarak kalan EtOH'u 10 dakika boyunca kurutun. RNA peletini 3.75 μL H2O içinde çöz.
      NOT: Elutlenmiş RNA'nın nokta blotlaması ve ardından streptavidin-HRP konjugatı ile probing yapılması biotin çekilmesini değerlendirmek için en etkili yöntemdir. Ancak bu yaklaşım, örnek materyalin önemli bir kısmını tüketir ve kütüphane hazırlığı için yeterli materyal bırakır.
  3. Üst Yüzeyin Çökeltmesi
    1. Olgun RNA'ları içeren üst yüzeyi 2.5-3 hacim EtOH ekleyerek çökeltin. Yağışın -20 °C'de 1 saat boyunca oluşmasına izin verin.
    2. Ön soğutmalı bir santrifüjde, 20.000 x g hızında 45 dakika boyunca spin yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin.
    3. RNA pelletini %75 EtOH ile 0.5 mL yıkayın. Pelleti kurutup 50 μL nukleazsız suda çöz. Tüpü 65 °C sıcaklıkta bir ısı bloğuna yerleştirerek RNA peletinin çözünmesini artırın.
    4. Sonraki adımlar için spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.

5. Olgun RNA (DMS-MaPseq)

  1. Poli A seçimi
    NOT: Poliadenillenmiş olgun RNA'lar, oligo(dT) boncuk bazlı affinite yakalama yöntemiyle saflaştırılır. Bu protokol, Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit'i kullanmak üzere optimize edilmiştir (bkz. Materyal Tablosu). İlk hazırlık olarak, 1 mL nükleazsız suyu 80 °C'ye kadar elülasyon için önceden ısıtın ve bir ısı bloğunu 70 °C'ye ayarlayın.
    1. Poli A çekilmesi için RNA hazırlanması: 50 μg çökeltilmiş RNA aktarın ve nükleaz içermeyen suyla son hacmi 300 μL'ye getirin. RNA'yı 70 °C'de 2 dakika ısıtarak ikincil yapıları bozup hemen buz üzerine yerleştirin. RNA'yı 300 μL lizis/bağlanma tamponu ve girdabla kısa süreliğine karıştırın.
    2. Manyetik boncukların hazırlanması: Manyetik boncukları en az 30 saniye vorteks ile askıya alın. Her örnek için 100 μL askıda duraklı boncukları steril 1,5 mL bir tüpe aktarın. Depolama tamponunu atmak için manyetisize yapın. Manyetik boncukları eşit hacimde lizis/bağlama tamponu ile durulayın, manyetize edin ve üst yüzeyi atın.
    3. Ciltleme ve yıkama
      1. Önceden yıkanmış 100 μL boncukları hazırlanmış 600 μL örnek RNA'sına ekleyin. Oda sıcaklığında rotator üzerinde 5 dakika boyunca sürekli döndürün.
      2. Boncukları manyetik bir rafa yerleştirerek toplayın ve akış akışını atın. Boncukları 600 μL yıkama tamponu A ile yıkay. Pipet karıştırın.
      3. Boncukları tekrar toplayarak yıkamayı at. Boncukları 300 μL yıkama tamponu B ile yıkayın. Pipet karıştırın.
      4. Boncukları tekrar toplayarak yıkamayı at. Boncukları 90 μL sıcak (80 °C) suyla karıştırın ve 90 μL lizis/bağlama tamponu ekleyerek bağlanmasına izin verin. 5.1.3.1-5.1.3.3 adımını tekrarlayın.
    4. Elusyon: Boncukları 30 μL sıcak (80 °C) nükleaz içermeyen suya yeniden askıya alın. 75 °C ile 80 °C arasında 2 dakika kuluçka yapın. Boncukları hızla manyetik alana maruz bırakın ve eluatı RNase-içermeyen bir tüpe toplayın. Elusyonu tekrarlayın ve elütasyon RNA'yı toplayın.
  2. Parçalanma
    NOT: mRNA'ların parçalanması enzimatik veya kimyasal yöntemlerle sağlanabilir. Burada parçalanma için çinko klorür ve ısı kullanılır. Belirli bir dizi veya yapısal eleman gerektiren enzimlerin aksine, çinko iyonları Lewis asidi gibi 2' oksijeni (bir nükleofil) aktive eder ve fosfodiester omurgasını parçalar. Bu, RNAzincirleri 17 üzerinde 5' OH ve 2',3' döngüsel fosfat esterinin oluşmasına yol açar.
    1. Termocycler'ı blok sıcaklığı 94 °C, kapak sıcaklığı ise 105 °C olarak önceden ısıtın. 54 μL ülütlenmiş mRNA'yı PCR tüpüne yerleştirin.
    2. 6 μL 100 mM Çinkoklorür çözeltisi (son konsantrasyon 10 mM) ekleyin, 2 saniye girdab yapın ve hemen 94 °C'de 55 saniye önceden ısıtılan termosikl üzerinde inkübe yapın.
    3. Kuluçkanın sonunda, parçalanma reaksiyonunu 6,6 μL 0,5 M EDTA (son konsantrasyon 50 mM) ile söndürün, pipet yapın ve karışım için yukarı aşağı indirin ve tüpleri hızla buz üzerine yerleştirin. İçeriği steril 1.5 mL tüplere aktarın.
    4. Parçalanmış mRNA'ların çökelmesine izin verin; 150 μL izopropanol, 15 μL 3 M Sodyum asetat, pH 5.2 ve 1 μL ko-çökeltici eklensin.
    5. 30 dakika boyunca -20 °C'ye yerleştirin. 20.000 x g ile 45 dakika boyunca önceden soğutmalı bir santrifüjde spin yapın. Peleti %75 EtOH ile yıkayın ve 15 μL nukleazsız suda çözün.
  3. PNK tedavisi
    NOT: ZnCl2 ile kimyasal parçalanma, ligasyon17 için uygun olmayan 5' ve 3' uçları oluşturur. Böylece, kimyasal parçalanmadan sonra, RNA'lar Polinükleotid Kinaz (PNK) tedavisine tabi tutulur; bu işlem 5' OH'yu fosforile eder ve 3' fosfat uçlarını defosforile eder; bu uçlar adaptör18'e bağlanabilir.
    1. 1 μL ribonükleaz inhibitörü, 2 μL 10x PNK Buffer ve 2 μL T4 PNK ekleyin. 37 °C'de 60 dakika kuluçka yapın. Reaksiyonu durdurmak için 30 μL nükleaz içermeyen su, 50 μL RNA bağlanma tamponu ve 50 μL EtOH ekleyin.
    2. Kirleticileri çıkarmak ve RNA'yı yoğunlaştırmak için spin-kolon tabanlı RNA arıtma yöntemi kullanın. Bu, ticari olarak mevcut bir kit kullanılarak yapılabilir (RNA Temiz ve Konsantrasyon Kiti, bkz. Malzemeler Tablosu). Kısaca, iki hacim RNA bağlama tamponu ile 1 hacim örnek karıştırın, bu karışımın eşit hacmini %100 EtOH ile karıştırın ve yeni bir toplama tüpü ile spin kolonuna yükleyin. Bu örneği döndürün ve akışı atın. Spin kolonunu 700 μL RNA yıkama tamponu ile ve bir kez 400 μL RNA yıkama tamponu ile yıkayın. Akışı at. Boş kolonu 1 dakika boyunca döndürerek yıkama tamponunun tamamen çıkarılmasını sağlar.
    3. RNA'yı 10 μL sıcak, nükleaz içermeyen suda elüasyon yapın.
      NOT: Tüm santrifüj adımlarını 10.000 - 16.000 x g arasında RT hızında 30 saniye boyunca gerçekleştirin.

6. Şablon değiştirme ters transkripsiyon reaksiyonu

NOT: Biotin pulldown (adım 4.2) ve PNK tedavisi (adım 5.3) sonrası parçalanmış mRNA'lardan oluşan yeni RNA'lar, kütüphane hazırlığı için aşağıdaki adımlara tabi tutulur ( Bkz. Şekil 1 ve Şekil 2). Kısacası, şablon değişiminin gerçekleşebileceği sentetik bir RNA şablonu/DNA primer başlangıç dupleksi (R2 RNA/DNA heterodupleks adaptörü) hazırlanacaktır. Bu heterodupleks, ters transkriptaz (RT) tarafından zincirleri değiştirmek için şablon anahtarlamasını mümkün kılan kısa bir tamamlayıcı dizisi sağlar; bu, RT'nin RNA'dan DNA primerine zincirleri değiştirdiği ve böylece RNA'dan adaptör dizisine sorunsuz cDNA sentezini mümkün kılar. Burada Induro ters transkriptaz kullanılıyor ve bu protokol için test edilmiş ve optimize edilmiştir. Diğer şablon değiştirme ters transkriptazlar istenirse CoSTseq kütüphane hazırlığı için kullanılabilir, ancak kullanıcı tarafından optimize edilmesi gerekir.

  1. DNA/RNA heterodupleks adaptör dizileri
    NOT: DMS-MaPseq örneğinin ters transkripsiyonu için kullanılan DNA/RNA heterodupleks adaptörleri, Xu ve ark.7'de listelenenlerle ve Schärfen ve ark.10 tarafından referans alınanlarla aynıdır.
    1. CoSTseq örneğinin ters transkripsiyonu için kullanılacak DNA/RNA heterodupleks adaptörü için, çıkıntı bölgesinde 'G' harfi bulunan bir adaptör kullanın. Bu, G'nin RNA'nın 3' ucunda biotin-C'yi yakalamasına olanak tanır. Farklı bir biyotinillenmiş NTP kullanıyorsanız, heterodupleks DNA primerini uygun eşleştirici nükleotidin çıkıntı olarak kullanması için düzenleyin ( bkz. Tablo 2).
    2. DMS-MaPseq adaptörü için, parçalanmadan sonra 3' uçunun rastgele olacağı koşuluyla tek bir N çıkıntısı olduğundan emin olun. Aşağıdaki kütüphane hazırlık adımlarının genel bir özeti için Şekil 2'ye bakınız.
  2. Şablon değişimi için DNA/RNA hibritinin hazırlanması: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ve 1 mM EDTA'dan oluşan bir tamponda 1 μM R2 RNA ve R2R DNA primerleri hazırlanır. Astar karışımını 82 °C'de 2 dakika kuluçkalayın, ardından 0,1 °C/s hızla 25 °C'ye kadar soğutun. Karışımı alıp daha sonra kullanmak için dondurun.
  3. Şablon değiştirme ters transkripsiyon
    1. Aşağıdaki reaktifleri ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın: 2 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 1 μM DNA/RNA heterodupleks (CoSTseq örneği için tek G çıkıntısı içeren heterodupleks kullanın; DMS-MaPseq örneği için rastgele N çıkıntı içeren heterodupleks kullanın), 0,5 μL enzim, 0,5 μL RNaz inhibitörü, 3,75 μL RNA örneği (veya 7,75 μL toplam hacme ulaşmak için su ekleyin).
    2. Bu karışımı (dNTP olmadan) RT'de 30 dakika kuluçka edin. Sonra reaksiyona 1,25 μL 10 mM dNTP ekleyin ve termosiklerde şu döngü koşullarını uygulayın: 10 dakika 25 °C, 10 dakika 42 °C, 10 dakika 50 °C, 10 dakika 55 °C, 30 dakika 60 °C, 20 dakika 65 °C, 15 dakika 75 °C.
    3. 1 μL RNase H ekleyin ve 37 °C'de 20 dakika kuluçka yapın. PCR reaksiyonunu kolon tabanlı DNA arıtma yöntemiyle arındırarak kalan primerleri, nükleotitleri ve enzimleri çıkarın. 20 μL'lik son hacimde elyut.

figure-protocol-1
Şekil 2: CoSTseq kütüphane hazırlığının ayrıntılı şematik temsili. Biotinile edilmiş 3' uçlu yeni başlayan RNA, biotin-CTP'ye tamamlayıcı G çıkıntısı içeren bir şablon anahtarlama adaptörü ile kuluçka edilir. Parçalanmış olgun RNA (DMS-MaPseq) için, N-çıkıntılı bir adaptör kullanılır (bkz. Şekil 1). cDNA sentezi, termostabil grup II intron ters transkriptaz (TGIRT) gibi yüksek prosesif bir ters transkriptaz kullanılarak yapılır ve ardından RNA zinciri parçalanmak için RNase H tedavisi uygulanır. Sonrasında, 5' App DNA/RNA ligazası, N7 UMI linker'ının riboz-adenillenmiş 5' ucunu (rApp) tek zincirli cDNA'nın 3' OH'sine bağlar. N7 UMI adaptörü, adaptörler arasında kendiliğinden bağlanmayı önleyen bloklu bir 3′ uç içerir. Son olarak, PCR amplifikasyonu, her numuneye atanmış benzersiz Illumina i5 ve i7 barkodları taşıyan örtüşen bölgeler ve 5′ çıkıntılar içeren primerler kullanılarak gerçekleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

7. 5' Eşleştirilmiş uçlu etiket dizilemesi için nihai cDNA kütüphanelerinin hazırlanması için adaptör ligasyonu

  1. 5' uçlu adaptörün hazırlanması
    1. 5' uçlu adaptörü, RNA ligaza bazlı bir reaksiyon (örneğin, Mth RNA Ligase, Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir) kullanarak şu reaksiyon bileşenleriyle adenilat edilir: 8 μL 10x 5'-DNA adenilasyon reaksiyon tamponu tamponu 8 μL, 1 mM ATP 8 μL, 100 μM R1R DNA (bu, benzersiz moleküler tanımlayıcı veya UMI içeren TruSeq primeridir), 8 μL Mth RNA ligaz, 52 μL nukleazsız su.
      NOT: N7 UMI adaptör tasarımına ilişkin detaylar için Tablo 2 ve Şekil 2'ye bakınız.
    2. Bu reaksiyonu 65 °C'de 1 saat, ardından 85 °C'de 5 dakika kuluçka yapın. Üreticinin talimatlarına göre cDNA'yı izole etmek için EtOH çökeltmesi veya silika membran spin kolon tabanlı DNA temizleme yöntemiyle ürünü arındırmaya devam edin.
    3. EtOH çökeltmesi için, DNA -20 °C (en az 20 dakika) sıcaklıkta, nihai konsantrasyon 0,3 M sodyum asetat (pH 5,2) ve %95%-100 soğuk EtOH ile 2x-2,5x ile çökeltilebilir. EtOH ile çökeltilmiş reaksiyonu maksimum hızda 15 dakika boyunca önceden soğutulmuş (4 °C) santrifüjde santrifüjleyin, peleti %70 EtOH ile yıkayın, tekrar santrifüj yapın ve peleti hava ile kurutun. Pelleti 40 μL nukleazsız suya yeniden süzülebilir (veya spin-kolon kullanıyorsa elüasyon) yapın. Uzun süre -20 °C'de sakla.
  2. 5' adaptör ligasyonu
    1. Tek bir 20 μL reaksiyon hacmi için, 10 μL cDNA'ya aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 2 μL 10x NE Buffer 1, 2 μL 50 mM MnCl2, 2 μL 5' AppDNA/RNA ligaz, 4 μL 10 μM (100 ng/μL) adenillenmiş adaptörden 7.1. adımdan.
    2. Bu reaksiyonu 65 °C'de 1 saat kuluçka, ardından 3 dakika 90 °C'de inkubka edin. Reaksiyonu minElute PCR arıtma kiti ile temizleyin ve son olarak 20 μL nükleazsız su hacminde elülasyon yapın.
  3. Pilot testle cDNA kütüphanelerinin minimal PCR amplifikasyonu
    1. Devam etmeden önce, benzersiz barkodlar içeren 10 μM'lik bir indeks primer stoku hazırlayın. Her benzersiz CoSTseq veya DMS-MaPseq örneğinin sorunsuz bir sonraki analiz için benzersiz bir barkodu olmalıdır. Tablo 2'deki başlangıç dizilerine bakınız. İleri ve geri bireysel barkod içeren primerler 1:1 karışımında birleştirilip barkod premiksi olarak saklanabilir.
    2. 7.2. adımdan 2 μL PCR ürünü kullanılarak, 2.5 μL yüksek isabetli PCR tamponu (örneğin, ticari bir HiFi tampon), 0.375 μL dNTP (10 mM), 0.75 μL barkod premiksi (veya 0.375 μL bireysel i5 ve i7 benzersiz barkodlama primerleri), 0.25 μL yüksek hassasiyetli sıcak başlangıç DNA Polimeraz (örneğin, ticari HiFi sıcak başlatma enzimi) eklenin, 6.625 μL nükleazsız su.
    3. Bu reaksiyonu 95 °C'de kuluçka yapın ve [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] 23 döngü boyunca tekrarlayın, sonunda 72 °C'de 1 dakikalık kuluçka ile sona erin. Optimal döngü sayısını belirlemek için %1 agaroz jeli üzerinde çalışın.
      NOT: Düşük döngü koşullarını test etmek için, alt döngünün sonunda (örneğin 15 veya 16 döngü sonunda) bir örnek hazırlanabilir ve agaroz jelinde cDNA kütüphanesi yaymasının yoğunluğu bir agaroz jel boyunca döngü uzunluğu boyunca karşılaştırılabilir.
  4. Kütüphane amplifikasyonu için son PCR
    1. 7.2. adımdan 18 μL PCR ürünü kullanılarak, KAPA HiFi PCR Kit'inden şu maddeleri ekleyin: 22,5 μL yüksek isabetli PCR Buffer, 3,375 μL dNTP (10 mM), 6,75 μL barkodlama premiksi (veya 3,375 μL bireysel i5 ve i7 benzersiz barkodlama primerleri), 2,25 μL yüksek isabetli sıcak başlangıçlı DNA Polimeraz ve 59,625 μL nükleazsız su.
    2. Bu reaksiyonu 95 °C'de kuluçka yapın ve 7.3. adımda belirlenen döngü sayısı için [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] tekrarlayın. 72 °C'de 1 dakikalık kuluçka ile bitirin.
  5. Boyut seçimi
    1. PCR ürününde paramanyetik boncuk bazlı arıtma (örneğin, AMPure XP veya eşdeğeri) kullanılarak boyut seçimi yapılabilir. Boncukların 1,3 katı hacmi kullanın (örneğin, 50 μL PCR reaksiyonu için 65 μL boncuk bulamaç kullanın) ve homojen olana kadar iyi karıştırın. Boncukların numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tutmasına izin verin.
      NOT: Bu 1:1,3x örnek/boncuk oranı, primer adaptör dimerlerinin çıkarılmasını sağlar ve tutulan DNA parçalarının 150 bp'den küçük ve 800 bp'den büyük olmamasını sağlar.
    2. Boncukları rahatsız etmeden üst yüzeyi çıkarın ve üretici protokolüne göre boncukları %80 EtOH ile yıkamaya başlayın.
    3. Son ürünü 11 μL içinde elüasyon yapın. Kütüphaneleri doğrulamak için 1 μL agararoz jel üzerinde çalıştırın. Son ürünü sıralamaya gönderin.

8. Veri analizi

NOT: Tam CoSTseq paketi ve analiz kodu GitHub'da (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq) mevcuttur ve analiz iş akışı Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu boru hattı, hem CoSTseq hem de DMS-MaPseq dizileme verilerini işlemek üzere tasarlanmıştır. CoSTseq, mevcut CPU çekirdek sayısını optimize ederek analizi kolayca paralelleştiren bir biyoinformatik iş akışı olan Snakemakekullanır 19. İş akışı, çalıştırılacak analizleri belirleyen bir dizi kuraldan oluşan bir Snakefile ile tanımlanır. GitHub paketi kurulduğunda mevcut olan Snakefile'ı değiştirmeye gerek yoktur.

  1. Yapılandırma dosyasını (.yaml dosyası) ham verinin saklandığı yere doğru dosya yolları ile ayarlayın. Bu ayarlarda adaptör dizilerine ve ilgili örnek isimlerine giden bir yol da dahil edilmelidir. Yapılandırma dosyasını, Snakefile'da tanımlanan belirli analizleri çalıştıracak şekilde değiştirin.
  2. Analize başlamak için, fastq.gz formatında ham eşleştirilmiş son okumaları indirin. Hızlandırıcı20 kullanarak adaptör dizilerini kırpmak ve en az 20 Phred puanına sahip okumalar için kalite filtresi süreci. Bu okumaları referans genomuna STAR21 kullanarak BAM dosyaları oluşturmak için hizala.
  3. Ek bir doğrulama olarak, Integrated Genome Viewer (IGV) tarayıcısında CoSTseq analiz boru hattı çalıştırıldıktan sonra oluşturulan BAM dosyalarını görselleştirin. IGV kullanılarak, BAM dosyaları ilgi duyulan genlerin tüm bölümlerinde okumaları gösterecek şekilde kolayca yorumlanabilir olmalı, bu da okumaların yeni başlayan RNA'yı temsil ettiğini gösterir. Beklendiği gibi, olgun RNA okumaları intronik bölgelerde minimum kapsama göstermelidir; çünkü bu okumaların olgun ve muhtemelen verimli şekilde birleştirilmiş transkriptlerden türetilmesi beklenmektedir.
  4. Tahmini tekrarlanan okuma yüzdesi için fastp çıktısını (web tarayıcısında açılabilen .html bir dosya) kullanın. CoSTseq okumalarının çok yüksek şekilde tekrarlanabileceğini ve bu da bir sonraki adımın kritikliğini vurguladığını unutmayın.
  5. UMICollapse22 kullanılarak, aynı UMI'ler ve hizalamalarla okumaları deduplicate ederek çarpıtma okumalarını sağlar; böylece yalnızca benzersiz okumalar korunur ve PCR yanlılığını azaltır. Ortaya çıkan dosyalar, tekrarlanmış okumalardan arındırılmış ve BAM formatında olmalıdır; burada rRNA'ya hizalanan okumalar, rRNA olmayan genlerle ilişkilendirilenlerden ayrılacaktır.
  6. Modüler CoSTseq boru hattının son ana bileşeni için, her nükleotit üzerindeki mutasyon sayılarını ve okuma kapsamını hesaplamak için özel bir Python uygulaması kullanın. Bu uygulamayı tanımlayan fonksiyonlar GitHub'daki kaynak kodda bulunabilir ve Snakefile, bu verileri .pkl formatında depolayan giriş, çıktı, parametreler ve fonksiyonları detaylandırır.
    NOT: CoSTseq analiz boru hattı kullanılarak yapılabilecek birçok başka analiz vardır, ancak parametreler kişiselleştirilmiş analiz ihtiyaçları için optimizasyon gerektirebilir. CoSTseq için uyarlanan değerli bir yöntem, mutasyon oranlarının genom genelinde karşılaştırılmasını sağlayan HDProbepaketidir 10. Kısacası, HDProbe tüm kopyalananlardan veri gerektirir ve mutasyon oranlarındaki önemli farklılıkları kontrol ile karşılaştırarak sistematik olarak kategorize edebilir. Yapılması istenebilecek ek analiz türleri arasında, deneysel DMS reaktivitelerine dayalı yapı tahmini yer alır. Bu, RNAstructurepaketi 23 kullanılarak gerçekleştirilebilir.

figure-protocol-2
Şekil 3: Modüler CoSTseq analiz hattının analiz adımları ve beklenen çıktılar. Analiz adımları, mevcut araçların önerilen kullanımını ve beklenen çıktı dosyaları ve içeriğiyle birlikte kullanıma hazır CoSTseq analiz boru hattını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölüm, bu protokolte açıklandığı gibi CoSTseq iş akışı ve analizinin uygulanmasıyla elde edilen gerçek sonuçları sunar. İlk olarak, bu bölüm başarılı kütüphane hazırlıklarının dizeleme öncesi ve sonrası kalite değerlendirmesinden sonra beklenen sonuçları açıklar. Dizileme öncesi, araştırmacılar biotin zenginleştirme sonrası RNA varlığını doğrulamak için bir test PCR ve TapeStation analizi kullanabilirler. Bu, CoSTseq kütüphanesi hazırlığı sırasında yeni yaranan RNA'nın başarılı izolas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA, baz eşleşmesinin daha hızlı kinetiği nedeniyle24,25,26,27 sentez hızına kıyasla ko-transkripsiyonel olarak katlanmaya başlar. Mevcut gelişmekte olan RNA katlanma bilgimiz, prokaryotik RNA'ların tek moleküllü çalışmaları, in vitro probing veya in silico yaklaşımlarından geliyor. Bu protokolde, CoSTseq'in ayrıntılı bir iş akışı sunulur; bu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, kodlama için Dr. SK Boopathy Jegathambal'a ve özellikle P. Bech'e yardımcı tartışmalar için Neugebauer laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek ister. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM112766 KMN'ye) ve Amerikan Kalp Derneği'nden (908949 LS'ye kadar) bir doktora öncesi bursu tarafından desteklendi. LPS, NIH eğitim hibesi 5T32GM14943803 ile desteklendi. LRAB, Amerikan Kalp Derneği'nden (26POST1569544) bir doktora sonrası burs ile desteklendi. Yale Genomik Analiz Merkezi'nde veri toplama, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından Ödül Numarası 1S10OD03036301A1 kapsamında desteklenmiştir. Bu çalışma yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini mutlaka temsil etmemektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10mM ATPInvitrogen18330019
10mM Biotin-11-CTPJena biyobilimleriNU-831-BIOX
10mM GTPInvitrogen18332015
10mM UTPInvitrogen18333013
10X NEBuffer 1New England BiolabsB7001S7.2.1 adımında kullanıldı
10X Fosfat Tamponlu Tuzlu Çay (PBS)Gibco70011-044
%20 SDSRPI L23100-500
Asit fenol:kloroform AmbionAM9722
Boyut seçimi için AMPure XP boncuklarıBeckman Coulter A638807.5.1 adımında Boyut Seçimi için Kullanılıyor
Bacto PeptoneGibco211677
Bacto Maya EkstraktıGibco212750
BicineSigma AldrichB3876-100G
KloroformSigma Aldrich319988
D-(+)-GLUKOZSigma AldrichG5767-500G
DIFCO AGARBD DIFCO214010
Dimetil SülfatSigma AldrichD186309-5ML
Dynabeads™ MyOne Streptavidin C1 boncuklar Invitrogen650014.1. Bölümde Biotin Pulldown için Kullanılıyor
Dynabeads™ mRNA DIRECT™ Arındırma KitiInvitrogen61011Bölüm 5.1'de Poli A seçimi için kullanılmıştır
EDTA, pH 8, 0.5MSigma Aldrich 03690-100ML
EtanolSigma AldrichE7023-500ML
GlycoBlueInvitrogenAM95164.2.7 ve 5.2.4 adımlarında kullanılan eş çökeltici
Induro®   Ters TranskriptazNew England BiolabsM0681S6.3.1 adımında kullanılan RT enzimi
İzoamil alkolSigma Aldrich W205710-1KG-K
İzopropanolJT-BAKER9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kiti & nbsp;  Roche07958889001PCR reaksiyonları için 7.3.2 ve 7.4.1'de kullanılan yüksek isabetli DNA Pol
Magnezyum klorürSigma AldrichSLCM2154
MinElute PCR Temizleme KitiQiagen280046.3.3 ve 7.2.2 adımlarında DNA temizliği için kullanılmıştır
Mth RNA LigaseNew England BiolabsM2611A
Oligo Clean & KonsantrasyonZymo AraştırmasıD4060DNA Oligo temizliği için 7.1.2. adımda önerildi
Potasyum Asetat Sigma Aldrich236497-500G
Potasyum klorürJT Baker3040-01
Potasyum HidroksitAvantor6984-04-01
RNA Temizliği & Konsantretör-5Zymo AraştırmasıR1014PNK tedavisinden sonra 5.3.2'de kullanılan RNA temizleme kiti
RNaseOUT™ Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörüThermo Fisher Scientific10777019PNK tedavisi sırasında 5.3.1 adımında kullanılan RNaz inhibitörü
SarkosylIBI ScientificIB07080
Sodyum AsetatKaliteli Biyolojik351-035-721
Sodyum KlorürSigma AldrichS5150-1L
Sodyum Hidroksit Macron7708-10
SUPERase· In™ RNaz İnhibörü (20 U/μ L)Thermo Fisher ScientificAM26966.3.1. adımda kullanılan RNaz inhibitörü
T4 Polinükleotid KinazNew England BiolabsM0201S
Termostabil 5' App DNA/RNA LigaseNew England BiolabsM0319L
Tris-HCl, pH 7.4, 1MTermo BilimselJ60202. K2
Triton X-100TEKNOVAT1105
TRIzol™ ReaktifInvitrogen15596-026Bölüm 4.2'deki yeni RNA elülasyonu için; Bölüm 4'te "RNA reaktifi" olarak da adlandırılır
β-merkaptoetanolSigma AldrichM6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural and biophysical dissection of RNA conformational ensembles. Current Opinion in Structural Biology. 88, (2024).
  3. Bose, R., Saleem, I., Mustoe, A. M. Causes, functions, and therapeutic possibilities of RNA secondary structure ensembles and alternative states. Cell Chemical Biology. 31 (1), 17-35 (2024).
  4. Rapakko, J., Scaravilli, M., Änkö, M. L. Interplay between RNA-protein interactions and RNA structures in gene regulation. FEBS Open Bio. , (2025).
  5. Rodgers, M., Woodson, S. A. A roadmap for rRNA folding and assembly during transcription. Trends in biochemical sciences. 46 (11), 889-901 (2021).
  6. Tomezsko, P., Swaminathan, H., Rouskin, S. DMS-MaPseq for Genome-Wide or Targeted RNA Structure Probing In Vitro. Methods in Molecular Biology. 2254, 219-238 (2021).
  7. Xu, H., Douglas, C. W., Lambowitz, A. M. Improved TGIRT-seq methods for comprehensive transcriptome profiling with decreased adapter dimer formation and bias correction. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  8. Lopes, R., Agami, R., Korkmaz, G. GROseq, A Tool for Identification of Transcripts Regulating Gene Expression. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1543, 45-55 (2017).
  9. Mahat, D. B., et al. Base-Pair Resolution Genome-Wide Mapping Of Active RNA polymerases using Precision Nuclear Run-On (PROseq). Nature protocols. 11 (8), 1455-1476 (2016).
  10. Schärfen, L., Vock, I. W., Simon, M. D., Neugebauer, K. M. Rapid folding of nascent RNA regulates eukaryotic RNA biogenesis. Molecular Cell. 85 (8), 1561-1574 (2025).
  11. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Functional steps in transcription initiation and reinitiation from the major late promoter in a HeLa nuclear extract. Journal of Biological Chemistry. 262 (8), 3452-3461 (1987).
  12. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Separation and partial characterization of three functional steps in transcription initiation by human RNA polymerase II. Journal of Biological Chemistry. 260 (13), 8163-8172 (1985).
  13. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), 75-82 (2017).
  14. Tijerina, P., Mohr, S., Russell, R. DMS foot-printing of structured RNAs and RNA-protein complexes. Nature Protocols. 2 (10), 2608-2623 (2007).
  15. Liebig, A., Waldsich, C. W. Probing RNA structure within living cells. Methods in enzymology. 468, 219-238 (2009).
  16. Pelechano, V., Chávez, S., Pérez-Ortín, J. E. A Complete Set of Nascent Transcription Rates for Yeast Genes. PLOS ONE. 5 (11), (2010).
  17. Wery, M., Descrimes, M., Thermes, C., Gautheret, D., Morillon, A. Zinc-mediated RNA fragmentation allows robust transcript reassembly upon whole transcriptome RNA-Seq. Methods. 63 (1), 25-31 (2013).
  18. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. The EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  19. Köster, J., Rahmann, S. Snakemake a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  20. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. fastp: an ultrafast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics (Oxford, England). 34 (17), i884-i890 (2018).
  21. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (1), 15-21 (2013).
  22. Liu, D. Algorithms for efficiently collapsing reads with Unique Molecular Identifiers. PeerJ. 7, (2019).
  23. Spasic, A., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C., Mathews, D. H. Modeling RNA secondary structure folding ensembles using SHAPE mapping data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 314-323 (2018).
  24. Saldi, T., Fong, N., Bentley, D. L. Transcription elongation rate affects nascent histone pre-mRNA folding and 3′ end processing. Genes & Development. 32 (3-4), 297-308 (2018).
  25. Pan, T., Artsimovitch, I., Fang, X., Landick, R., Sosnick, T. R. Folding of a large ribozyme during transcription and the effect of the elongation factor NusA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (17), 9545-9550 (1999).
  26. Heilman-Miller, S. L., Woodson, S. A. Effect of transcription on folding of the Tetrahymena ribozyme. RNA. 9 (6), 722-733 (2003).
  27. Yu, A. M., et al. Computationally reconstructing co-transcriptional RNA folding from experimental data reveals rearrangement of nonnative folding intermediates. Molecular Cell. 81 (4), 870-883 (2021).
  28. Yu, G., et al. Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect. Nature communications. 14 (1), (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles