Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Semi-ligation, ferrik klorür ve trombin kombinasyonuyla kurulan şiddetli beyin venöz sinüs trombozunun yeni fare modeli

327 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69961

⸱

13 Şubat 2026

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

Bu makalede

Özet

Yarı ligasyon ile demir klorür ve trombin ile birleştirilen şiddetli beyin venöz sinüs trombozu (CVST) için yeni fare modeli, insanlarda şiddetli CVST'nin patofizyolojik mekanizmasını daha etkili taklit edebilir.

Özet

Beyin venöz sinüs trombozu (CVST), özellikle hamile kadınlar olmak üzere genç bireyleri etkileyen belirgin bir inme türüdür. CVST hastalarının yaklaşık %60'ında venöz serebral enfarkt veya kanama gelişir; bu durum şiddetli CVST olarak tanımlanır. Şu anda, hayvan modellerinde CVST'yi indüklemek için hem yurt içi hem de uluslararası çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Ancak bu modeller, şiddetli CVST'nin altında yatan patofizyolojik mekanizmaları tam olarak kopyalamamakta ve bu durum üzerine temel araştırmaları sınırlamaktadır. Şiddetli CVST'nin yeni bir fare modeli, yarı ligasyon ve ferrik klorür ve trombin kombinasyonuyla oluşturulabilir. Yarı ligasyon, Perfüzyon Benekli Görüntüleyici (PSI) kullanılarak superior sagittal sinüsün (SSS) ligasyonundan önce ve sonra ilgilenilen bölgedeki beyin kan akışı (ROI) ölçülerek gerçekleştirildi. SSS'nin yarı ligasyonu, venöz sinüs içinde kan stazisini indüke eder. SSS yüzeyine ferik klorürün topikal uygulanması endotel hasarına yol açarken, trombinin sinüse doğrudan enjeksiyonu lokal hiperkoagulasyon durumu oluşturur. Bu yaklaşım, tromboz oluşumunun üç temel bileşenini etkili bir şekilde taklit eder: stazis, endotel hasarı ve hiperkoagulabilite. Ortaya çıkan model, aynı anda birden fazla venöz sinüsü içeren önemli bir trombotik yük sergiler. İndüklenen tromb en az 1 hafta stabil kalır. 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama, bu modelin tutarlı olarak 7 güne kadar süren büyük alanlı venöz beyin enfarktüsünü üretebildiğini göstermektedir. Bu model, önceki modellerin elde edemediği bir yeteneğe sahip olan sıçanlarda epileptik nöbetleri bile tetikleyebiliyor. Kan-beyin bariyerinin bozulması, Evans mavisi (EB) boyama ile gözlemlendi. Bu nedenle, yarı ligasyon ile ferrik klorür ve trombin uygulaması ile oluşturulan şiddetli CVST modeli, insanlarda şiddetli CVST'nin patofizyolojik ilerlemesini daha doğru şekilde tekrarlayarak stabilite ve güvenilirlik gösterir.

Giriş

Beyin venöz sinüs trombozu (CVST), arteriyel inmeden farklı olan farklı bir serebrovasküler bozukluk türüdür. Genç bireylerde 1,2, özellikle hamilekadınlarda daha sık görülür 3 ve son yıllarda sıkça artmaktadır. Avustralya'da yapılan bir epidemiyolojik çalışma, yıllık CVST vakasının her milyon kişiye 13,0 ila 15,7 vaka arasında değiştiğinigöstermektedir 4. Amerika Birleşik Devletleri'nde CVST görülürlüğü yaşla birlikte yükseliş eğilimi göstermektedir. Buna rağmen, kadınlarda en yüksek başlangıç yaşı erkeklere göre dahadüşüktür 5. 2021 ile 2023 yılları arasında, Amerika Birleşik Devletleri'nde acil servislere giden her milyon hastada 43'e CVST6 teşhisi kondu. Klinik ortamlarda, çoklu sinüs trombozu en sık gözlemlenen formdur ve tüm vakaların yaklaşık %57,14'ünü oluşturur. Bunu üst sagital sinüs (SSS; %16,19), transvers sinüs (%11,43) ve sigmoid sinüs (%8,57) dahil etme izler. Ana klinik belirtiler arasında baş ağrısı yer alır; bu durum epilepsi ile birlikte olabilir, bilinç bozuklukları ve fokal nörolojik semptomlar 7,8,9. Ancak, bu tezahürler spesifik değildir. CVST hastalarının yaklaşık %60'ında beyin venöz enfarktı veya kanama gelişir ve bu durum şiddetli CVST10,11 olarak sınıflandırılır. CVST tedavisi antikoagülasyon tedavisi ve cerrahi müdahaleyi içerse de, şiddetli CVST'nin ölüm oranı %34,2 kadar yüksektir.9. Bu yüksek ölüm, şiddetli CVST'nin altındaki patofizyolojik mekanizmaların henüz tam olarak anlaşılmamış olmasına bağlanabilir. Bu nedenle, şiddetli CVST'nin uygun bir hayvan modeli, patogenezi, patofizyolojik ilerlemesi ve potansiyel terapötik stratejilerini araştırmak için temel bir deneyselaraçtır 12.

Şu anda, CVST hayvan modellerinin indüksiyonu yöntemleri genellikle şu türlere ayrılabilir: kalıcı ligasyon13,14, kimyasal indüksiyon 15,16,17, girişimselyaklaşımlar 18,19, kendi yapımı greftlerinimplantasyonu 20,21,22 ve bipolar elektrokoagülasyon 23,24. Önceki hayvan modellerinde indüklenen trombus kısa süreliydi ve aynı anda çoklu venöz sinüs trombi ile büyük alanlı venöz beyin enfarktüsü indükteyi yapamadı. Bu nedenle, birden fazla venöz sinüsü aynı anda içeren ciddi bir CVST modelinin geliştirilmesi acil bir öncelik haline geldi. Yarı ligasyon yöntemi, ferrik klorür ve trombin ile birleşerek şiddetli CVST'nin yeni bir fare modelini oluşturabilir. Ayrıca, yeni şiddetli CVST modeli, şiddetli CVST'nin insan patofizyolojik sürecini üç ana unsur üzerinden daha doğru simüle etmektedir: venöz sinüs trombus yükü, venöz beyin enfarktüsü ve kan-beyin bariyerinin bozulması. Bu model, şiddetli CVST için patofizyolojik mekanizmalar ve tedavi stratejileri üzerine yapılan araştırmalara uygulanabilir. Bu yeni fare modeli, gelecekte şiddetli CVST'nin patofizyolojik mekanizmasını araştırmak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneysel protokol, Pekin, Çin'deki Capital Medical University Hayvan Deneyleri ve Deneysel Hayvan Refahı Komitesi (AEEI-2020-119) tarafından onaylandı ve kurumun Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi yönetmeliklerine uygun olarak yürütüldü.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Ortalama vücut ağırlığı 300 ± 10 g olan sağlıklı yetişkin Sprague-Dawley (SD) erkek fareleri deneysel gruba veya sahte operasyon grubuna rastgele atanır. Tüm hayvanlar, yiyecek ve suya erişim ile 12 saatlik dönüşümlü bir ışık/karanlık döngüyle tutuldu.

2. PSI'nin uygulanması

  1. Modelleme süreci boyunca sıçanların SSS'sinde beyin kan akışındaki (CBF) değişiklikleri sürekli izlemek için PSI kullanın. SSS içinde ilgi alanı (ROI) olarak sabit bir dairesel alan seçin. Ameliyat sırasında ROI'nin CBF değişikliklerini izleyerek, yarı ligasyonun tamamlanmasını ve tromb indüksiyonunun başarısını belirleyin.

3. Şiddetli CVST sıçan modelinin oluşturulması

  1. Fareleri anestezi maskesi aracılığıyla %70 azot oksit ve %30 oksijen içeren gaz karışımıyla %5 enfluran kullanarak anestezi yapın. Cerrahi işlem boyunca enfluran konsantrasyonunu %1-2 aralığında tutun. Anestezi altındaki fareleri yatağa yatan pozisyona yerleştirin, başları orta hatta sabit olacak şekilde stereotaksik çerçeve kullanarak. Ameliyat boyunca vücut sıcaklığını 37 ± 0,5 °C arasında tutun ve termostatik ısıtma pediyle kullanın.
  2. Farenin kafatası bölgesinin orta hattı boyunca 1,5 cm boyuna bir kesi yapın. Deri altı dokusunu diseksiyona geçirerek alttaki kafatasını ortaya çıkarın.
  3. Mikroskobik görselleştirme altında, bregma ile lambda arasında yüksek hızlı diş matkapı kullanarak boyuna bir kraniyal pencere (10 x 4 mm) oluşturun. SSS ve iki taraflı beyin korteksi açığa çıkarırken dura mater'in bütünlüğünü koruyun. Kranial delme işlemi sırasında, dura mater ve kortekste termal hasarı önlemek için sondaj ucunu normal tuzlu suyla sürekli soğutun.
  4. SSS'ye maruz kaldıktan sonra, SSS'deki yatırım getirisi CBF'sini PSI kullanarak değerlendirin ve ilgili verileri kaydedin. SSS'yi rostral ve kaudal olarak 8-0 ile yarı ligate yapın Poliamid dikişleri mikroskobik gözlem altında.
    NOT: SSS bağlanırken, kuvvet orta olmalı ve aşırı olmamalıdır. Aksi takdirde, yarı ligasyon etkisi elde edilemez. Ligasyon ideal olarak tek bir sürekli prosedürle yapılmalıdır. Tekrarlayan ligasyon denemeleri, SSS'nin delinmesine yol açabilir ve böylece model üretiminin başarısını zayıflatabilir.
  5. PSI'yi kullanarak SSS'nin ligasyonlu segmentinde bulunan yatırım getirisi için CBF'yi değerlendirin ve CBF'nin yarı ligasyon öncesinde bunun yaklaşık %50'sine düştüğünü doğrulayın. Sonuçları sistematik olarak kaydedin.
  6. Işık korumalı koşullarda, 7 mm uzunluğunda 3-0 ipek ipliği %40 ferrik klorüre batırın ve SSS ligasyon bölgesinin yüzeyini 5 dakika boyunca kaplayın. İpek iplik çıkarıldıktan sonra tarlayı normal salinle yıkayın.
  7. 0.1 mL trombin solüsyesini (500 U/mL) mikroenjektör kullanarak ligated segmentin sinüs boşluğuna 1 dakika içinde enjekte edin. Enjeksiyonu ardışık iki kez daha tekrarlayın, toplam trombin dozu 150 U. Epidural boşluğa yapılan trombin reflü kötü tromboza yol açmadı.
    1. SSS'ye trombin enjeksiyonunu kolaylaştırmak için, yerleştirmeden önce mikroenjektör iğnesini nazikçe bükebilirsiniz. Bu ayar, delme sırasında iğnenin açısının daha iyi kontrol edilmesini sağlar ve SSS'den istemeden geçilmesini önlemeye yardımcı olur.
  8. Trombin enjeksiyonundan sonra PSI kullanarak ROI'nin CBF'sini yeniden değerlendirin. Sonuçların, yarı ligasyon sonrası CBF'de belirgin bir azalma olduğunu doğruladığından emin olun; bu da trombozun başarılı indüktörlüğünü gösterir. Daha fazla analiz için verileri sistematik olarak kaydedin.
  9. Kemik penceresini kemik mumu ile kapatın, ardından kesiyi dikin. Cerrahi işlemden sonra, ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için her fareye deri altı olarak ketoprofen (5 mg/kg) uygulanır.
  10. Sahte ameliyat grubunda, kraniotomi sadece yapılabilir, ek cerrahi müdahaleler yapılmaz.

4. Venöz sinüs trombozu yükü ve beyin enfarktüsü

  1. Venöz sinüs trombozunun yükünü üç zaman noktasında değerlendirin: model oluşumundan 1 gün, 2 gün ve 7 gün sonra. Fareleri feda edin ve farklı zaman noktalarında normal salinle kalp perfüzyonu yapın.
  2. Venöz sinüs tromboz saktımının boyutunu görsel olarak değerlendirmek için kraniotomi yapın. Trombusy izole edin ve nicel analizlere tabi tutulun. Beyin dokusunu kesin ve 2 mm kalınlığında koronal dilimlere ayırın.
  3. Dilimleri %2 TTC çözeltisine batırın ve boyama kolaylaştırmak için 37 °C su banyosunda 20 dakika kuluçka yapın. Bunun ardından, beyin venöz enfarktüsü görsel olarak değerlendirilir ve sonraki istatistiksel analiz için ImageJ yazılımı kullanılarak enfarkt hacmini niceliklendirir.
    İnfarkt hacmi = infarkt alanı mm kare x kalınlık [2 mm]

5. Kan-beyin bariyerinin (BBB) geçirgenliğinin bozulması

  1. Ameliyattan sonraki ikinci gün, hem model grubundan hem de sahte operasyon grubundan rastgele fareler seçilir ve kuyruk damarından %2 Evans mavisi (EB) intravenöz enjeksiyon uygulanır.
  2. Enjeksiyonun başarılı uygulamasından 2 saat sonra, fareleri ötenanize edin ve sol ventrikül üzerinden fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) perfüze yapın. Beyin dokularını toplayıp EB penetrasyonunun boyutunu değerlendirmek için 2 mm kalınlığında dilimlere ayırın.

6. İstatistiksel analiz

  1. SPSS 17.0 yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. Ölçüm verilerini ortalama ± standart sapma olarak sunun. Grup karşılaştırmaları için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) veya bağımsız örneklem t-testi kullanın.
  2. Aynı grup içinde birden fazla zaman noktasında ölçülen sürekli değişkenlerin analizi için, zaman noktaları arasında gruplar arası farkları değerlendirmek amacıyla tekrarlanan ölçüm ANOVA kullanılır. 0,05'in altında olan p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Modelleme süreci
Şekil 1A, farenin SSS'sini okla gösterilmiştir. SSS'nin rostral ve kaudal kısımları yarı ligasyonlu (Şekil 1B), ardından ligasyonlu bölgelerin yüzeyine ferrik klorürle ıslatılmış iplik uygulandı (Şekil 1C). Trombin, daha sonra bağlanmış segmentlere enjekte edilip trombozu indüklemiştir. Okla gösterilen, trombinin enjekte edildiği alan kararmıştır (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yarı ligasyon ile demir klorür ve trombin ile birleştirilen yeni bir şiddetli CVST fare modeli, sadece kan stazini ve endotel hasarını simüle etmekle kalmaz, aynı zamanda kanın hiperkoagulasyon halini de simüle eder; yani tromboz oluşumunun üç elementinisimüle eder 25. Daha da heyecan verici olan, bu yöntemle geliştirilen fare modelinin epileptik nöbet gösterebilmesidir. Epileptik nöbetler, CVST hastalarında belirgin bir klinik tezahürdür ve vakaların yaklaşık %12...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Capital Medical University Kritik Beyin Hastalıkları Enstitüsü'ne teknik desteği için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No.7182064) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2,3,5-triphenyltetrazolium klorürSigma-Aldrich
%40 demir klorür ve nbsp;Tianjin Zhiyuan Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd., Çin
Evans blue Sigma-Aldrich
Isıtma pedleri Harvard Apparatus Holliston, MA, ABD50-7061-F, 
Yüksek hızlı diş matkapı Saeshin, Busan, Güney KoreStrong-207B
Lazer benekli ölçer PeriCam PSI Sistemi, İsveç
MikroskopCarl Zeiss, Inc., Berlin, Almanya
Poliamid dikişi Ningbo Chenghe Mikro Cihaz Fabrikası, Çin
Stereotaksik çerçeveDavid Kopf Enstrümanları, Tujunga, Kaliforniya, ABD
TrombinChang Chun Lei Yunshang İlaç Şirketi, Ltd., Çin

Kaynaklar

  1. Silvis, S. M., de Sousa, D. A., Ferro, J. M., Coutinho, J. M. Cerebral venous thrombosis. Nat Rev Neurol. 13 (9), 555-565 (2017).
  2. Ferro, J. M., Aguiar de Sousa, D. Cerebral venous thrombosis: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 19 (10), 74(2019).
  3. Kashkoush, A. I., et al. Cerebral venous sinus thrombosis in pregnancy and puerperium: A pooled, systematic review. J Clin Neurosci. 39 (5), 9-15 (2017).
  4. Devasagayam, R., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis Incidence Is Higher Than Previously Thought: A Retrospective Population-Based Study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  5. Payne, A. B., et al. Epidemiology of cerebral venous sinus thrombosis and cerebral venous sinus thrombosis with thrombocytopenia in the United States, 2018 and 2019. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12682(2022).
  6. Ruderman, A., Hogan, A., Epley, C., Courtney, D. M., Milman, B. Epidemiology of Cerebral Venous Sinus Thrombosis: 2021-2023. Cureus. 17 (10), e93654(2025).
  7. Singh, R. J., Saini, J., Varadharajan, S., Kulkarni, G. B., Veerendrakumar, M. Headache in cerebral venous sinus thrombosis revisited: exploring the role of vascular congestion and cortical vein thrombosis. Cephalalgia. 38 (3), 503-510 (2018).
  8. Mahale, R., et al. Acute seizures in cerebral venous sinus thrombosis: what predicts it. Epilepsy Res. 123 (7), 1-5 (2016).
  9. Luo, Y., Tian, X., Wang, X. Diagnosis and treatment of cerebral venous thrombosis: a review. Front Aging Neurosci. 30 (1), 102(2018).
  10. Kowoll, C. M., et al. Severe cerebral venous and sinus thrombosis: Clinical course, imaging correlates, and prognosis. Neurocritical care. 25 (3), 392-399 (2016).
  11. Stam, J., Majoie, C. B. L. M., van Delden, O. M., van Lienden, K. P., Reekers, J. A. Endovascular thrombectomy and thrombolysis for severe cerebral sinus thrombosis: A prospective study. Stroke. 39 (5), 1487-1490 (2008).
  12. Yenigün, M., Jünemann, M., Gerriets, T., Stolz, E. Sinus thrombosis: do animal models really cover the clinical syndrome. Ann Transl Med. 3 (10), 138(2015).
  13. Frerichs, K. U., et al. Cerebral sinus and venous thrombosis in rats induces long-term deficits in brain function and morphology--evidence for a cytotoxic genesis. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (2), 289-300 (1994).
  14. Li, G., et al. A new thrombosis model of the superior sagittal sinus involving cortical veins. World Neurosurg. 82 (1/2), 169-174 (2014).
  15. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  16. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306 (10), 39-49 (2015).
  17. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neurosci Lett. 662 (1), 205-212 (2018).
  18. Wang, J., et al. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats. Brain Res. 1181 (11), 118-124 (2007).
  19. Wang, J., et al. Development of a new model of transvenous thrombosis in the pig superior sagittal sinus using thrombin injection and balloon occlusion. J Neuroradiol. 37 (2), 109-115 (2010).
  20. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. J Neurosci Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  21. Bourrienne, M. C., et al. A Novel Mouse Model for Cerebral Venous Sinus Thrombosis. Transl Stroke Res. 12 (6), 1055-1066 (2021).
  22. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  23. Sakaki, T., Kakizaki, T., Takeshima, T., Miyamoto, K., Tsujimoto, S. Importance of prevention of intravenous thrombosis and preservation of the venous collateral flow in bridging vein injury during surgery: an experimental study. Surg Neurol. 44 (2), 158-162 (1995).
  24. Cokluk, C., Aydin, K., Yemisci, M., Colakoglu, S., Kaplan, S. Cortical anastomotic veins occlusion in the rat including the assessment of cerebral swelling. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 203-210 (2006).
  25. Kyrle, P. A., Eichinger, S. Deep vein thrombosis. Lancet. 365, 1163-1174 (2005).
  26. Lindgren, E., et al. Acute symptomatic seizures in cerebral venous thrombosis. Neurology. 95 (12), e1706-e1715 (2020).
  27. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  28. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  29. Duan, J., et al. Identifying Biomarkers Associated with Venous Infarction in Acute/Subacute Cerebral Venous Thrombosis. Aging Dis. 12 (1), 93-101 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

A r CVSTTrombin EnjeksiyonuS perior Sagital Sin sVen z Serebral Enfarkt sKan Beyin BariyeriTTC Boyama

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.