Gelişmiş İmmünofluoresans Analizi için UV ile kürlenebilen reçine kullanarak sentetik biyouyumlu implantların kriyoseksiyonu

Summary

Bu çalışma, implant-doku arayüzünün bütünlüğünü koruyan ve antijen erişimini koruyan UV ile kürlenebilen reçine stabilizasyonu kullanan bir kriyobölümleme protokolü sunar; böylece sentetik polimer implantların güvenilir, yüksek çözünürlüklü immünfloresan analizini mümkün kılar.

Abstract

Sentetik, biyouyumlu implantların histolojik değerlendirmesi, geleneksel doku işleme yöntemleri ile bu malzemelerin fizikokimyasal özellikleri arasındaki uyumsuzluk nedeniyle önemli teknik zorluklar yaratmaktadır. Tam reçine gömülü kullanan mevcut yaklaşımlar, yeterli yapısal koruma sağlar ancak epitopların erişimini ciddi şekilde zayıflatır ve böylece konak bağışıklık yanıtlarının karakterizasyonu için gerekli olan immünohistokimyasal uygulamaları sınırlamaktadır. Buna karşılık, geleneksel parafin gömütme sentetik substratlara zayıf yapışma gösterir ve kapsamlı immünolojik profilleme için antikor seçimini sınırlar. Standart kriyobölümleme protokolleri, antijen korunmasını iyileştirerek immünohistokimyasal uyumluluğu artırır; ancak bu yöntemler genellikle implant içeren örneklerin yapısal bütünlüğünün yetersiz olmasına yol açar ve morfolojik değerlendirme ile kesitleme kalitesinin tehlikeye girmesine yol açar. Bu sınırlamaları gidermek için, kriyobölüm öncesi implant dokusu yapılarının seçici stabilizasyonu için UV ile kürlenebilir reçine içeren yeni bir işlem protokolü geliştirildi. Bu yöntem, mekanik destek sağlamak için fotopolimerize reçine kullanır; epitop erişilebilirliği ve antijenik belirleyiciler genellikle tam reçine polimerizasyonu nedeniyle zarar görür. Protokol, immünoflüoresans değerlendirmesi için optimal kalınlıkta yüksek kaliteli kesitlerin tekrarlanabilir üretilmesini sağlar ve geleneksel reçine gömülü örneklerde antikor nüfuzunu sınırlayan kapsamlı çapraz bağlama olmadan standart dondurulmuş kesitlere kıyasla üstün yapısal koruma sağlar. Bu yaklaşım, sentetik implantların histolojik işlemesi için pratik ve maliyet etkin bir çözüm sunar; biyouyumluluk değerlendirmesi için geliştirilmiş analitik yetenekler sunar ve implant-doku arayüzlerinde lokal bağışıklık yanıtlarının ayrıntılı karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Introduction

İmmünofluoresans mikroskopi, florofor konjuge antikorlar kullanılarak doku mimarisi ve hücre bileşiminin görselleştirilmesini kolaylaştıran rejeneratif tıp araştırmalarında temel bir analitik tekniktir. Bu metodoloji, immünokimyasal tanımanın moleküler özgüllüğünü floresan algısının hassasiyeti ve çok yönlülüğüyle birleştirerek, doku mikro ortamlarında hücresel hedef dağılımlarının ayrıntılı gözlemlenmesini mümkün kılar. İmmünofloresans yaklaşımları hem doğrudan hem de dolaylı etiketleme stratejilerini kapsar; dolaylı immümsülofloresans protokolleri, görünür ve yakın kızılötesi spektrumu kapsayan çeşitli floroforlara konjuge edilen ikincil antikor sistemleri aracılığıyla gelişmiş sinyal yükseltmesi^sağlar. Metodolojinin spektral ayrım yoluyla eşzamanlı çoklu hedef tespit etme yeteneği, heterojen hücresel popülasyonların ve karmaşık doku mikro ortamlarındaki mekansal ilişkilerinin kapsamlı fenotipik karakterizasyonunu kolaylaştırır².

İmmünoflüoresans mikroskopisinin teknik yetenekleri, geleneksel protein lokalizasyonunun ötesine geçerek, floresans yoğunluk ölçümleri, kololokalizasyon analizleri ve hücresel fonksiyon ile doku organizasyonunu anlamak için kritik olan mekansal dağılım değerlendirmeleri gibi nicel analitik uygulamaları da^kapsar. İmplant biyouyumluluk araştırmaları bağlamında, immünoflüoresans analizi, yabancı cisim reaksiyonları, iltihap kaskadları ve hücresel ve moleküler düzeyde implant kabulünü veya reddini belirleyen doku entegrasyon süreçleri dahil olmak üzere konak bağışıklık yanıtları hakkında kritik bilgiler^{sunar 4}.

İmmünoflüoresans protokollerinin başarılı uygulanması, morfolojik bütünlüğü koruyan ve floresan sinyalini koruyan ve arka plan otofloresansını en aza indiren doku işleme metodolojilerinin dikkatli değerlendirilmesini gerektirir. Geleneksel gömülü ortam seçimi, doku tipine, sonraki analitik gereksinimlere ve ilgi duyulan spesifik antijenlere bağlıdır. Sentetik malzemeler ve implantlar için, güncel literatürde öncelikle kesitleme işlemleri sırasında yapısal stabiliteyi korumak için tam reçine gömülmesi^{önerilir 5}. Ancak, bu yaklaşım, polimerize reçine blokların kesitlenmesi için özel ultramikrotomlar ve bıçaklar gereksinimi nedeniyle önemli sınırlamalar taşır ve bu da önemli ekipman yatırımı ve teknik uzmanlık gerektirir. Parafin gömülü, kesitleme için yeterli yapısal destek sağlarken, fiksasyon ve işleme sırasında antijenik belirleyicilerde konformasyonel değişiklikler sağlar; bu da proteinleri denatüre edebilen ve epitopları maskeyebilen organik çözücülerle infiltrasyon yoluyla genişlemiş dehidrasyon, kimyasal sertleşme ve işleme sürecinde gerçekleşir. Parafin işleme ayrıca sinyal algılama ve nicel analizi tehlikeye atan içsel otofloresans girişimi de üretir. Bu değişiklikler, antikor erişimini yeniden sağlamak için genellikle ısı kaynaklı epitop toplama (HIER) veya proteolitik kaynaklı epitop alımı (PIER) içeren antijen toplama prosedürlerini^{gerektirir 6}. Bu müdahalelere rağmen, ticari olarak mevcut birçok antikor parafinle gömülü örneklerle uyumsuz kalmaktadır ve zorlu geri alma koşulları floresan sinyal kalitesini daha da zayıflatabilir ve foto ağartma artefaktları ortaya çıkarabilir.

Kriyoseksiyon, immünoflüoresans uygulamaları için alternatif bir işleme metodolojisi sunar. Doku hazırlığı için iki kriyokonserasyon yöntemi kullanılabilir. İlk yaklaşım, taze doku örneklerinin doğrudan sıvı azotla önceden soğutulan izopentan banyosuna batırılarak –20 °C'nin altına sıcaklık elde edilmesini ve ardından sıcaklık kontrollü kesme odalarıyla donatılmış kriyostat mikrotomlarıyla kesimlendirmeyi içerir. İkinci protokol ise paraformaldehit (PFA) veya formalin ile kısa bir fiksasyon dönemi kullanır, ardından dondurmadan önce dereceli sukroz sızması ile kriyokoruma uygulanır. Kriyokoruma süreci, antikor tanıma için gerekli olan doğal protein konformasyonlarını koruyarak doku bütünlüğünü koruyan katı bir matriks oluşturur. Dondurulmuş kesimleme, dokuları neredeyse doğal bir durumda tutar ve minimum kimyasal^{modifikasyonlar yapar 7}, böylece sert antijen toplama prosedürlerine olan ihtiyacı azaltır ve epitop maskelenmesi veya denatürasyonu nedeniyle parafinli dokularla uyumsuz olanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir birincil antikor yelpazesinin kullanılmasını^{sağlar 8}.

Kriyobölümleme işlemi genellikle optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğini kullanır; bu, polivinil alkol ve polietilen glikolden oluşan, kesitleme sırasında yapısal destek sağlarken şeffaf ve floresan algılama sistemleriyle uyumlu kalınca suda çözünür bir göme ortamıdır. OCT gömme, özel analitik gereksinimlere ve doku özelliklerine bağlı olarak 5–15 μm kalınlığında ince, uniform kesitlerin oluşturulmasını^{kolaylaştırır 9}. Donmuş kesitlerde doğal protein konformasyonlarının korunması, nicel immünoflüoresans analizi için gerekli olan optimal sinyal-gürültü oranlarını korurken, parafinli dokularla uyumsuz olanlar da dahil olmak üzere daha geniş birincil antikor yelpazesinin kullanılmasına olanak tanıyan sağlam^{epitopları korur 8}.

Ancak, donmuş doku kesimleme, özellikle doğal biyolojik dokulara kıyasla farklı fizikokimyasal özelliklere sahip sentetik implant malzemeleri işlenirken, benzersiz teknik zorluklar sunar. Dondurma sırasında sentetik polimerler ile biyolojik doku arayüzleri arasındaki farklı termal genişleme, yapısal bütünlüğü tehlikeye atan ve kesitleme artefaktları oluşturan lokal mekanik gerilime yol açabilir¹⁰. Ayrıca, birçok sentetik malzemenin donmuş biyolojik dokulara göre doğal sertliği, kesitleme sırasında bıçak sapmasına neden olabilir; bu da parça kalınlığının düzensiz olmasına ve hem numune hem de kesme ekipmanına zarar vermesine yol açabilir. Bu teknik sınırlamalar, implant içeren örneklerin benzersiz gereksinimlerini karşılayabilen ve immünofluoresans uygulamaları için dondurulmuş kesitlemenin avantajlarını koruyabilen özel işlem protokollerini gerektirir.

Bu sınırlamaları gidermek için, bu çalışma, seçici UV ile kürlenebilir reçine stabilizasyonunu kontrollü kriyost kesitleme parametreleriyle birleştiren ve implant dokusu yapılarının yüksek çözünürlüklü, çok parametreli immünoflüoresans analizini mümkün kılan bir kriyobölümleme protokolü geliştirmiştir.

Protocol

Bu araştırma, Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak A00003765-18-24 onay numarasıyla gerçekleştirilmiştir. Sentetik biyouyumlu implantları içeren tüm işlemler, uygun biyogüvenlik protokollerine uygun olarak steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir.

1. Örnek işleme ve kriyokoruma

NOT: Formalini yalnızca kimyasal bir duman davlumbasarında kullanın ve uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin, çünkü formalin güçlü bir tahrişedici, duyarlayıcı ve kanserojen içeren formaldehit içerir.

1. Doku entegre biyouyumlu sentetik implant örneklerini, %10 nötr tamponlu formalin ile gece boyunca 4°C'de doku hacmine göre en az 10 hacim fiksatif kullanarak sabitleyin; böylece tam dalış ve yeterli penetrasyon sağlanır. Bu sınırlı fiksasyon döneminin amacı, doku morfolojisini koruyarak minimum çapraz bağlama sağlamaktır. (Protokolde kullanılan malzemeler için Materyal Tablosu'na bakınız.)
2. Örnekler, 4°C sıcaklıkta hafif çalkalama ile gece kuluçka için fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) hazırlanmış %15 sakaroz çözeltisine aktarın. Doku çökmesiyle kanıtlandığı gibi tam sakroz infiltrasyonunu sağla.
3. Örnekleri PBS'de %30 sakaroz çözeltisine aktarın ve ikinci gece kuluçka için 4°C. Doku kap dibine batarak tam dengeyi doğrulayın, bu da yeterli sukroz infiltrasyonu ve su yer değiştirmesini gösterir.
4. %30 sükroz çözeltisi ve OCT bileşiğinden oluşan 1:1 hacimsel oran hazırlayın. Örnekleri bu geçiş ortamında 4°C'de 2 saat kuluçka altına alın, ardından dokunun eşit şekilde opak görünümüyle tam denge sağlanması için 1 saat %100 OCT'ye aktarılır.
5. Örnekleri taze OCT bileşiğiyle doldurulmuş standart kriyokalıplara dikkatlice yerleştirin, böylece kesitleme düzlemleri için optimal yönelim sağlanır. İmplant-doku arayüzü ile sonraki işlemler için erişile. Hava kabarcıklarını önceden soğutulan forsepslerle ortadan kaldırın.
6. Doldurulmuş kriyokalıpları hemen kuru buz platformuna yerleştirerek sıcaklık gradyanı oluşturularak alttan yukarıya doğru hızlı buz kristali oluşumunu teşvik edin. Tam katılaşana kadar 10–15 dakika boyunca izleyin; donmuş OCT bileşiğinin karakteristik opak beyaz görünümüyle doğrulanacaktır. Donmuş blokları –80°C sıcaklıkta depoya veya doğrudan kriyostat odasına aktararak hemen kesitleyin.

2. Kriyostat kurulumu ve ilk kesitleme

1. Kriyostat sıcaklık kontrollü odayı –15° C'de tutun. Entegre dijital izleme kullanarak sıcaklığı doğrulayın ve örnek tanıtımından önce gece boyunca denge edin.
2. Yeni tek kullanımlık bıçaklar takın. Birleşik sentetik-biyolojik malzeme kesitleri için bıç açısını üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın.
3. İstenen kesit kalınlığı (50–100 μm) kontrol panelinde Kalınlık ayarı seçilerek, ok tuşlarıyla ayarlanarak ve Set tuşuna basarak parametre doğrulanarak kriyostata programlanır.
4. Gömülü numuneden geçerek implant-doku arayüzüne karşılık gelen önceden belirlenmiş derinliğe ulaşın. UV-reçine uygulaması için optimal düzlemi belirlemek için ilerleyen kesit yüzeyini izleyin; doku opaklığı ve ilk implant-çevre maruziyetinde ince değişikliklerle karakterize edilir ve bu özellikler ardışık kesimlerde tutarlı şekilde görünür kalırsa derinlik doğrulanır.
   NOT: Kritik arayüze ulaşır ulaşmaz kesitleme işlemi durdurularak hedef bölgenin ötesine ilerlemeyi önleyin.

3. UV ile kürlenebilir reçine uygulaması

NOT: UV ile kürlenebilen reçineyi uygun PPE takarak iyi havalandırılan bir alanda kullanın ve gözlerinizi ve cildi LED-UV kürleyici ışıktan koruyun. Bu reçineler, cilt ve göz reaksiyonlarına yol açabilen tahriş ediciler içerir ve LED-UV maruziyeti, UV kaynaklı göz yaralanmasına yol açabilir.

1. Parafilm makas kullanılarak implant çevresini 2–3 mm aşan boyutlarda kesin. Koruyucu kağıt arkadan steril penslerle dikkatlice ayırın.
2. 5–10 μL UV ile kürlenebilir reçineyi açık parafilm yüzeyine dağıtın (Şekil 1A). Reçine hacmi, kademeli hacimlerin dağıtıldığı ön test uygulamaları yapılarak optimize edilir ve ortaya çıkan yayılım, numune yüzeyinin yüzeyinin eşit kapsamı sağlanır; aşırı reçine birikimi ve bu kesitleri engellemeye engel olur.
3. Reçine yüklü parafilmin üzerine hemen koruyucu kağıt arkasını değiştirin. İnce, uniform reçine tabakası elde etmek için 2 inç uzunluğunda poliüretan dikiş rulosu (2 inç) uygulanır; tutarlı basınç ile paralel geçirir, ardından dik geçirerek ince, uniform reçine tabakası elde edilir (Şekil 1B).
4. Koruyucu kağıt tabakasını dikkatlice çıkarın, böylece eşit şekilde dağılmış reçine filmi ortaya çıkarın. Reçine-parafilmi doğrudan açık implant yüzeyinin üzerine yerleştirerek implant-doku arayüzüyle hassas hizalanmayı sağlayacak (Şekil 1C).
5. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak ve reçine ile sentetik ve biyolojik yüzeyler arasında yakın temas sağlamak için implant merkezinden dışa doğru poliüretan dikiş rulosu uygulayın (Şekil 1D).
6. Konum, 405 nm dalga boyunda, UV LED ışık kaynağı, implant yüzeyine doğrudan 2–3 cm mesafede. Tam polimerizasyonu sağlamak için 90 saniye boyunca açığa çıkarın, reçine sertliği ve yapışkan olmayan özelliklerin dokunsal değerlendirmesiyle doğrulanmış (Şekil 1E). Rezin kürleme işlemi sırasında operatörü zararlı UV maruziyetinden korumak için UV fotopolimerizasyonundan önce kriyostat odasının penceresine UV koruyucu örtü yerleştirin.

4. Bölüm kurtarma ve kaydırma hazırlığı

1. Reçine-doku arayüzünün mekanik bozulmasını önlemek için parafilmi tek bir sürekli hareketle çıkarın. Tam reçine yapışması, kriyost aydınlatması altında açık yüzeyin uniform reçine kaplaması, doku kenarında kaldırma eksikliği ve görünür parafilm kalıntısının olmaması açısından incelenerek doğrulanır.
2. Kalibre edilmiş mikrotom ilerleme mekanizmasıyla önceden belirlenmiş 8 μm kalınlıkta örnekler kesitlenir. Her bölümü tutarlı kalınlık ve artefakt (sıkışma, yırtılma, eksik kesitleme) açısından izleyin. Kıvrımı önlemek için anti-roll plakasını optimal şekilde konumlandırın (Şekil 1F).
   NOT: Hidrofilik, pozitif yüklü yapışkan cam slaytlar, zorlu örneklerin üstün tutulmasını sağladıkları için kullanılır; bu da kesit transferi ve sonraki işleme sırasında yapışmayı artırır. Bölüm transferinden önce etiket slaytları tek tek ekleyin.
3. Sürgülü yapıştırıcı yüzeyi konumlandırın; böylece bölüm kenarında ilk temas sağlanır ve ardından tüm alanda ilerleyen temas sağlanır. UV ile kürlenmiş reçine yüzeyinin sürgüye yapışmasını sağlarken, doku yüzeyi yukarıda korunarak immünoflüoresans için (Şekil 1G).
4. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için bölüm sürgü montajına hafifçe basın. Kriyost aydınlatması altında doğru yönü doğrulayın, sağlam implant-doku arayüzünü doğrulayın.

5. Depolama ve koruma

1. İşleme gerektiren uygulamalar için 72 saat içinde tamamlanmış slaytları –20°C sıcaklıkta önceden etiketlenmiş depolama kutularına yerleştirin.
2. Bir haftayı aşan koruma süreleri için – 80°C koşullarını kullanın.

6. İmmünoflüoresans boyama protokolü

NOT: Pepsini, cilt ve solunum solunum tahriş edici olduğu için uygun PPE ile kullanın.

1. Slaytları depodan alıp oda sıcaklığı dengesi için 15–20 dakika boyunca nem odalarına aktarın.
2. Üç ardışık 2 dakikalık PBS yıkama döngüsü yapın.
3. Antijen alımı:
   1. Isı kaynaklı epitop geri alma (HIER) yöntemi: Mikrodalga güvenli kaplarda 1x hedef geri alma çözeltisi ile kaydırmaları yatay konumlandırır. Mikrodalga (1000 watt çıkış) yüksek güçte, 15 dakika boyunca, ardından oda sıcaklığına soğutma.
   2. Proteolitikle indüklenen epitop geri alma (PIER) yöntemi: Her bölüm başına 100–150 μL kullanıma hazır pepsin çözeltisi uygulanır. Geçici plastik kapak örtüleriyle örtün ve nemli bir odada 37°C'de 10 dakika kuluçka yapın.
4. Üç ardışık PBS yıkama döngüsü (her biri 2 dakika) gerçekleştirin.
5. PBS içinde %0,1 saponin ve %2,5 normal keçi serumu içeren 1 mL blok çözeltisi uygulayın. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 30 dakika kuluçka yapın.
6. Üç ardışık PBS yıkama döngüsü (her biri 2 dakika) gerçekleştirin.
7. 100 μL primer antikor çözeltileri optimize edilmiş konsantrasyonlarda uygulanır:
   1. Anti-Kolajen IV tavşan poliklonal, 1:100 seyreltmede.
   2. Anti-Laminin tavşan poliklonal, 1:500 seyreltmede.
   3. Anti-F4/80 tavşan monoklonal antikoru 1:500 seyreltmede.
8. Geçici plastik kapak kapaklarıyla örtün ve nemli odalarda 4°C sıcaklıkta gece boyunca kuluçka yapın.
9. Üç PBS yıkama döngüsü (her biri 2 dakika) gerçekleştirin.
10. 10 μg/mL konsantrasyonda ikincil antikorlar uygulan.
    1. Eşek Anti-Tavşan IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. Keçi Anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488
11. Oda sıcaklığında, karanlık koşullarda 60 dakika kuluçka yapın.
12. Isteğe bağlı buğday tohumu agglutinin (WGA) boyama:
    1. WGA-Alexa Fluor 647'yi 5 μg/mL PBS ile %2,5 normal keçi serumu ile uygulayın.
    2. Örtüyün ve 37°C'de 30 dakika kuluçka yapın. Üç ardışık 2 dakikalık PBS yıkama döngüsü yapın.
13. Her bölüm için nükleer karşı boya ile 80 μL sert ayarlı montaj ortamı uygulayın.
14. Hava kabarcıklarını önlemek için kapak camını örtün.
15. Sürgülerin oda sıcaklığında 2 saat karanlıkta yatay şekilde kürlenmesine izin verin.
16. Görüntüleme kalitesi için 4°C'de bir haftaya kadar saklanın.

7. Flüoresans mikroskopisi ve görüntü alımı

1. Üretici filtre setleriyle ters floresans mikroskobu ile görüntüleme yapılabilir: 360/460 nm uyarılma/emisyon, 470/525 nm uyarılma/emisyon, 545/605 nm uyarılma/emisyon, 620/700 nm uyarılma/emisyon.
2. Görüntüler, mikroskop yazılımının Filtre menüsünden her floresan kanalı seçilerek yakalanır. Pozlama optimizasyonundan önce, her kanal için doğru taban düzeltmesini sağlamak amacıyla Siyah Dengeyi Ayarlayın seçeneği seçilerek siyah denge prosedürü uygulanır. Pozlama parametreleri daha sonra Görüntü Yakalama penceresi açılır, Canlı mod etkinleştirilir ve Pozlama ile Işık Yoğunluğu kontrollerinin ayarlanmasıyla optimize edilir; böylece piksel doygunluğu olmadan yüksek sinyal-gürültü oranı elde edilir. Doygunluk, yazılımın Histogram ekranı ve Highlight Saturated Pixels aracı kullanılarak izlenir. Her kanal, görüntü alınmadan önce bağımsız olarak ayarlanır.
3. Üreticinin bitişik alanlar arasında %10 örtüşmesiyle otomatik karo edinimi gerçekleştirin. Satın alma dizisi boyunca otomatik odak ayarını sürdürün.

Results

Bölüm kalite değerlendirmesi ve optimizasyonu
UV-reçine stabilizasyonu ve 8 μm kalınlığında kesitlemeden sonra, parçalar yapışkan slaytlara toplanır ve kalite kontrolü için değerlendirilir. Yüksek kaliteli kesitler, önemli çatlaklar veya çatlama artefaktları olmadan, sürekli doku mimarisi ve korunmuş implant-doku arayüzü ile sağlam morfolojiyi gösterir (Şekil 2A). Reçine stabilize edilmiş implant yüzeyinden kırılma veya doku ayrılması gib...

Discussion

Bu UV ile kürlenebilir reçine stabilizasyon yöntemi, standart dondurulmuş kesitleme teknikleriyle işlenmesi zor olan sentetik materyaller içeren OCT gömülü doku örneklerinin kriyobölümlenmesi için alternatif bir yaklaşım sunar. Yüklemeli sürgüler, doku bağlayıcı bantlar ve diğer yapışkan destekler gibi çeşitli yapışkan seçenekler mevcut olsa da, bu ürünler sürgü yapışması sağlar ve kesme sırasında implant-doku arayüzünde gereken mekanik takviyeyi sağlamaz. Ayrıca, kriyobölümleme sırasınd...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5W Gooseneck Ultraviyole Işık 395&ntir; Reçine kürleme için 405 nm	Amazon	UPC ‎ 603335835561
Antikor - Anti-F4/80 (Monoklonal)	Abcam	ab300421	1:500
Antikor - Kolajen IV (Poliklonal)	Abcam	AB6586	1:100
Antikor - Eşek Anti-Tavşan IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
Antikor - Keçi Anti-Tavşan IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
Antikor - Laminin (Poliklonal)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Biyouyumlu materyal #1
BioMed Dayanıklı	Formlabs	FLBMDU01	Biyouyumlu malzeme #2
%10 Formalin tamponlu	Kardinal Sağlık	C4320-101
BZ-X Filtresi Cy5	Keyence	OP-87766	Filtre Seti
BZ-X Filtresi DAPI	Keyence	OP-87762	Filtre Seti
BZ-X Filtresi GFP	Keyence	OP-87763	Filtre Seti
BZ-X Filtresi TRITC	Keyence	OP-87764	Filtre Seti
BZ-X800 Analizör yazılımı	Keyence	BZ-X800	Entegre Yazılım
Fisherbrand Premium Coverglass  50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Form4B 3D Yazıcı	FormLabs	F4B-Yazıcı
Form4 Reçine Tankı	Formlabs	RT-F4-01
Keçi Serumu	Gibco	16210064
HM525 NX Kriyostat	Epredia	956641EC
Ev Mikrodalga Fırını	Panasonic	NN-S766BA	1000 watt çıkış
IHC-Tek Plastik Kapak Kapakları 24 mm x 60 mm	IHC Dünya	IW-2601	Geçici örtü slip
JDiction Düşük Viskoziteli UV Reçine	Amazon	6974143904430	Yüksek otofloresans
Keyence BZ-X800	Keyence	BZ-X800
Reçine UV Reçine Clear Hard Type	Amazon	ALR00038	Yüksek otofloresans
Reçine Clear UV Reçine Yüksek Viskoziteli Tip	Amazon	ALR00048
Matsunami MAS Mikro Kaydırmalı Cam Slaytlar	Yeni Gelen Tedarik	SUMAS1190	Yapıştırıcı Sürgü
Medpor Cerrahi İmplantı	Stryker	8662	Biyouyumlu materyal #3
Mr. Reçine UV Reçine Kristal Berrak	Amazon	B08FRF9QTB	Yüksek otofloresans
MX35 Ultra Mikrotom Bıçağı	Epredia	3053835
Parafilm M Laboratuvar Filmi	Parafilm	P7543-1EA
Pepsin	Sigma	R2283-15ML
Fosfatla tamponlu tuzlu pH 7.4	Sigma	P3813
Plan Apo λ 40X	Keyence	BZ-PA40	Objektif Lens
Plan Apo λ 4X	Keyence	BZ-PA04	Objektif Lens
Poliyuretan Dikiş Silindiri	Amazon	682698799567
ProLong Cam Antifade Mountant ve NucBlue Boyalı	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Karşı Leke
Saponin	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Steril Silikon Kaplama	Bentec	PR72034-51N
Hedef Alım Çözümü, Sitrat pH6	Çevik	S236984-2
Tissue-Tek O.C.T Bileşiği	Sakura	4583
Buğday Tohumu Agglutinin AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL