Yöntem makalesi

İnsan Derisindeki Lenfatik Damarların ve Lenfödem Sırasında Yapısal Değişikliklerinin Üç Boyutlu Görselleştirmesi

DOI:

10.3791/69972

⸱

13 Şubat 2026

 ,  ,  ,  , 
1MIRAI Technology Institute, Shiseido Co., Ltd., 2Department of Plastic, Reconstructive, and Aesthetic Surgery, Chiba University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insan derisindeki lenfatik damar yapısının üç boyutlu görselleştirilmesi, üç farklı doku temizleme tekniği uygulandıktan sonra konfokal veya ışık tabakası mikroskopisi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemlerin immünohistokimyasal boyama ile birleşmesi, lenfödemin ilerlemesi sırasında lenfatik damarlarda fonksiyonel değişikliklere dair içgörü sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilt lenfatik damarları, kapillyarlar ve toplayıcı damarlardan oluşan, atık uzaklaştırma ve bağışıklık tepkilerinde önemli rollere sahiptir ve doku homeostazının korunması için gereklidir. Ancak, insan derisi, epidermis, dermis ve deri altı yağ gibi üç katmanıyla birlikte yoğun bir ekstrahücre matriks içerir; bu nedenle lenfatik ağları üç boyutta görselleştirmek zordur. Bu sınırlamayı gidermek için, bu makale, insan derisi lenfatiklerinin doku temizleme reaktifleri ile konfokal veya ışık tabakası mikroskopisi kombinasyonuyla üç boyutlu görselleştirmesi için her biri ilgi duyulan belirli moleküllere ve deneysel hedeflere özel olarak uyarlanmış üç farklı yöntem tanıtmaktadır. İmmöhistokimya yoluyla lenfatik endotel hücrelerindeki adherens bağlantı moleküllerini hedefleyerek, özellikle kapiller bağlantıların karakteristik düğmeden fermuara benzeri yeniden yapılanmasına, ikincil lenfödem hastalarından elde edilen cilt dokularında belirgin fonksiyonel etkileri olan yapısal değişiklikler değerlendirildi. Bu üç boyutlu görselleştirme tekniği, geleneksel histolojik doku kesiti analiziyle fark edilemeyen damar yapılarını ortaya koyar, böylece lenfatik damar yapısı ve fonksiyonunun anlaşılmasını artırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lenfatik damarların işlevine, kanser metastazındaki köklü rolüne rağmen, deri homeostazını korumadaki rollerinin tanınmasından sonraartan ilgi vardır 1,2. Lenfatik damarlar, yapısal olarak kapiller ve toplama damarlara ayrılır ve her biri kendine özgü özelliklere sahiptir. Lenfatik kapillyarlar, lenfatik endotel hücrelerinden oluşan tek katmanlı bir yapıdan oluşur ve interstisiel sıvı, atık ürünler ve bağışıklık hücreleri için ilk toplama noktaları olarak hizmet verir. Buna karşılık, toplayan lenfatik damarlar iki katmanlı bir yapıya sahiptir ve lenfatik endotel tabakasını çevreleyen düz kas hücreleri, kapiler ağ tarafından toplanan lenf sıvısının merkezi dolaşıma aktiftaşınmasını sağlar 3. Fare modelleri, özellikle bronşiyal lenfatik damarların yapısal özelliklerini aydınlatmak için kullanılmış ve iltihap hastalıklarının yapısal yeniden yapılanmaya nasıl yol açtığınıortaya koymuştur 4. Önceki çalışmalar, ultraviyole kaynaklı iltihapın lenfatik kapilyarların anormal genişlemesine yol açtığını ve bunun sıvı toplama fonksiyonlarını zayıflattığını göstermiştir. Bu işlevsizliğin altında yatan moleküler mekanizmalar tanımlandı ve özellikle artan VEGF-A ekspresyonunun ve azalan VEGF-C ekspresyonunun bu yapısal değişiklikleri tetiklediğigösterildi 5,6,7.

Üç boyutlu görselleştirme teknikleri, fare modellerinde lenfatik ağın anlaşılmasınıönemli ölçüde ilerletmiş olsa da, insan lenfatik damarlarının benzer yapısal analizi hâlâ zorlu olmuştur. Bu analitik boşluk, insan dokularıyla çalışmanın zorluklarından, sınırlı örnek bulunabilirliğinden ve kapsamlı üç boyutlu görüntülemenin sağlanmasında ortaya çıkan teknik sorunlardan kaynaklanmaktadır. Özellikle, epidermis, dermis ve deri altı yağdan oluşan üç katmanlı bir yapıya sahip olan ve dış çevreye karşı bir bariyer görevi gören deri, diğer yumuşak organlara göre daha büyük zorluklar teşkilatıyor. Ayrıca, insan derisi, fare modellerine kıyasla daha yüksek doku kalınlığı gibi belirgin analitik zorluklar sunar ve derin görüntüleme nüfuzunu engeller. Ayrıca, özellikle kollajen olmak üzere bol miktarda ekstraselüler matriks bileşenleri ve yaşa bağlı yapısal değişiklikler, farelerde lenfatik görüntülemeyi devrim niteliğinde değiştiren yeni doku temizleme tekniklerinin etkinliğini azaltan optik engelleroluşturur 10.

Çeşitli doku temizleme ajanları daha önce insan derisi kapilyarlarını görselleştirmek için test edilmiş ve doku uyumluluklarınıgöstermiştir 11. Bu çalışmanın ardından, doku temizleme reaktifleri insan derisi lenfatik damarlarını üç boyutta görselleştirmek için başarıylakullanılmıştır 12. Lenfatik endotel hücrelerinin adheren birleşimlerine odaklanarak, lenfödemin ilerlemesiyle ilişkili lenfatik damarlarda yapısal değişiklikler tespitedildi 13. Bu makalenin amacı, insan derisi lenfatik damarlarının üç boyutlu görselleştirme prosedürlerini, konfokal mikroskopi ve ışık tabakası mikroskopisi kombinasyonları ile belirli araştırma hedeflerine göre uyarlanmış immünohistokimyasal boyama yöntemlerini ayrıntılı olarak anlatmaktır. Bu çalışmada, yalnızca eksizyon gününde düzeltilmiş ve donma-çözülme döngülerinden geçmemiş taze insan cilt dokularına odaklansak da, bu teknikler sadece hastalık ve yaşlanma sırasında lenfatik damarların yapısal değişikliklerini değil, aynı zamanda ilgili fonksiyonel değişiklikleri de incelemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan denek deri örnekleri Chiba Üniversitesi Hastanesi'nden (Chiba, Japonya) alındı. İnsan deneklerle ilgili tüm prosedürler Chiba Üniversitesi Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu ve Shiseido Küresel İnovasyon Merkezi tarafından onaylanmış ve tüm denekler yazılı bilgilendirilmiş onay vermiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. İnsan derisi örneklerinin ön tedavisi

  1. Alındığında çıkarılan örneklerin deri altı dokusu alın.
    NOT: Deri eksizyonu ile alma arasındaki aralık yaklaşık h idi. Nakil sırasında doku DMEM'e daldırıldı ve buz paketlerinde tutuldu.
  2. Örnekleri, epidermis ve dermisi ayırmak için epidermal tarafı aşağı 60 °C'lik sıcak plakaya 45 saniye boyunca yerleştirin.
  3. Örnekleri hemen buz gibi PBS'ye daldırın.
  4. Epidermis ve dermisi cımbızla ayırın.
  5. Dermal bölgeleri %4 paraformaldehit ile 4°C'de 16 saat boyunca sabitleyin ve ardından kullanımdan önce PBS ile yıkayın.
    NOT: Fiksasyondan sonra örnekler PBS'de 4 °C'de saklandı ve immünboyama adımları aylar içinde başlatıldı.
    DİKKAAT PFA çözeltisi toksiktir. Tüm hazırlık ve kullanım uygun kişisel koruyucu ekipman takılırken duman kapantısında yapılmalıdır.

2. Tüm montajlı immünboyama ile temizleyici reaktiflerin birleşimi

  1. iDISCO tekniği
    1. Örnekleri yaklaşık 5 mm × 5 mm × 5 mm boyutlarında kesin.
    2. Örnekleri, PBS'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında, 24 °C'de 16 saat boyunca 50 rpm ile geçirimli bir yörünge sallayıcısında PBS'de %5 Triton X-100 ve %2,5 Tween 20 içine aktarın.
    3. Örnekleri PBS ile 24 °C'de 1 saat boyunca yıkayın ve işlemi üç kez tekrarlayın.
    4. Örnekleri, 72 saat boyunca 24 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında taze hazırlanmış bloklama tamponu A'ya (%1 BSA, %0,1 Tween 20, %0,03 sodyum azid) daldırın.
    5. Örnekleri, podoplanine karşı birincil antikor (1:100) ile bloklayıcı tampon A'da, 37 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca kuluçka edin.
    6. Örnekleri yıkama tamponu A ile (PBS'de %0,1 Tween-20) 24 °C'de 1 saat boyunca yıkayın ve işlemi üç kez tekrarlayın. Daha sonra örnekleri yıkama tamponu A'da, 4 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca tutun.
    7. Örnekleri, fare IgG'ye karşı ikincil antikorla, Alexa Fluor 647 (1:1000) ile konjuge edilmiş bir bloklayıcı tampon A'da, 37 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca inkubasyon yapın.
    8. 1.6. adımı tekrarlayın.
    9. Örnekleri %50 MeOH ile 24 °C'de 3 saat kuluçka yapın.
    10. Örnekleri %70 MeOH ile 24 °C'de 3 saat kuluçka yapın.
    11. Örnekleri %100 MeOH ile 24 °C'de 16 saat kuluçka yapın.
    12. Örnekleri 24 °C'de diklorometan ile 15 dakika kuluçka edin, işlemi iki kez tekrarlayın.
    13. Örnekleri dibenzil eter ile 24 °C'de 16 saat boyunca temizleyin.
      NOT: Eğer doku bu noktada şeffaf olmamışsa, beklemek için önemli bir iyileşme olmaz.
    14. Örneklerin görüntülerini ışık tabakası mikroskobu ile yakalayın.
      NOT: EC Plan-Neofluar 5×/0.16 objektif içeren bir Lightsheet kullanın; aydınlatmayı (uyarım) 63 nm'de, tespiti 648 nm'de ayarlayın; 5.8 μm adım boyutuna sahip bir Z-yığını elde edin.
      DIKKAT: Metanol, diklorometan ve dibenzil eter tehlikelidir. Tüm hazırlık ve kullanım uygun kişisel koruyucu ekipman takılırken duman kapantısında yapılmalıdır.
  2. Rapiclear 1.52 reaktifi
    1. Örnekleri yaklaşık 5 mm × 5 mm × 2 mm boyutlarında kırpın.
    2. Numuneleri, permeabilizasyon için 16 saat boyunca 24 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında PBS'de %2 Triton-X 100 ölçüsüne aktarın.
    3. Örnekleri, 16 saat boyunca 4 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış yörünge sallayıcısında yeni hazırlanmış bloklama tamponu B'ye (%5 eşek serumu ve %1 Triton-X 100) daldırın.
    4. Örnekleri, podoplanin ve VE-kadherine karşı birincil antikorlarla (her ikisi de 1:100 oranında) bloklama tamponu B'de, 4 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca inkubasyon yapın.
    5. Numuneleri yıkama tamponu B ile (%3 NaCl ve %0,2 Triton-X 100 PBS) 24 °C'de 1 saat boyunca yıkayın ve işlemi üç kez tekrarlayın. Sonra, örnekleri yıkama tamponu B'de, 4 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 16 saat boyunca tutun.
    6. Örnekleri PBS ile 24 °C'de 1 saat boyunca yıkayın.
    7. Örnekleri, fare IgG ve tavşan IgG'ye karşı ikincil antikorlarla inkübe edilir; bu antikorlar sırasıyla Alexa Fluor 647 ve 568 ile (her ikisi de 1:1000 hızında) konjuge edilir; blok buffer B'yi 4 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir orbital sallayıcıda 16 saat boyunca bloke edilir.
    8. 1.5. adımı tekrarlayın. ve 1.6.
    9. Örnekleri en az 5 kat Rapiclear 1.52 örnek hacmiyle 24 °C'de 16 saat boyunca temizleyin.
      NOT: Dokunun periferik bölgelerinin açılması 1 saatten kısa sürede gözlemlendi.
    10. Temizlenmiş örnekleri, taze Rapiclear 1.52 reaktifiyle bir kapak üzerine yerleştirilmiş polidimetilsiloksan jel odasına yerleştirin.
    11. Örnekleri konfokal mikroskopla görüntüleyin.
      NOT: Plan-Apochromat 10×/0.45 M27 objektif konfokal mikroskop kullanın; uyarımı 633 nm ve 561 nm, tespit aralıkları 641-754 nm ve 566-628 nm olarak ayarlayın; GaAsP dedektörü ile; 3.15 μm adım boyutuna sahip bir Z-yığını elde edin.
  3. KÜBIK teknik
    1. Örnekleri yaklaşık 5 mm × 5 mm × 3 mm boyutlarında kesin.
    2. Numuneleri delipidasyon için ön tedavi amacıyla 24 °C'de %50 CUBIC-L ile 24 saat boyunca daldırın.
    3. Numuneleri, delipidasyon için 7 gün boyunca 37 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında %100 CUBIC-L içine aktarın.
    4. Örnekleri PBS ile oda sıcaklığında 24 saat yıkayın.
    5. Örnekleri, 72 saat boyunca 24 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış yörünge sallayıcısında yeni hazırlanmış bloklama tamponu A'ya daldırın.
    6. Örnekleri, VE-kadherin, podoplanin ve CD31'e karşı birincil antikor (sırasıyla 1:100, 1:100 ve 1:200) ile inkubasyon yapın; bloklama tamponu A'da, yörünge sallayıcısında 37 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca.
    7. Numuneleri yıkama tamponu A ile 24 °C'de 1 saat boyunca yıkayın. Süreci üç kez tekrarlayın, ardından örnekleri yıkama tamponu A'da, 4 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca tutun.
    8. Örnekleri, fare IgG, tavşan IgG ve koyun IgG'sine karşı ikincil antikorlarla inkübe edin; bunlar sırasıyla Alexa Fluor 647, 568 ve 488 ile konjuge edilmiştir (hepsi 1:1000 hızında), bloklama tamponu A'da, 37 °C'de 50 rpm'ye ayarlanmış bir yörünge sallayıcısında 72 saat boyunca kullanılır.
    9. 3.7. adımı tekrarlayın.
    10. Örnekleri %50 CUBIC-R+(M) ile 24 °C'de 16 saat boyunca önceden temizleyin.
    11. Örnekleri %100 CUBIC-R+(M) ile 24 °C'de 16 saat boyunca temizleyin.
      NOT: Eğer doku bu noktada şeffaf olmamışsa, beklemek için önemli bir iyileşme olmaz.
    12. Örnekleri konfokal mikroskopla görüntüleyin.
      NOT: Plan-Apochromat 20×/0.8 M27 objektif içeren konfokal mikroskop kullanın; uyarımı 633 nm, 561 nm ve 488 nm olarak ayarlayın, GaAsP dedektörüyle 641-754 nm, 566-628 nm ve 479-550 nm tespit aralığına ayarlayın; 0.78 μm adım boyutuna sahip bir Z-yığını elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epidermisli ve epidermissiz temizlenmiş insan derisi dokusunun ışık geçirimliliğindeki fark
Şekil 1, epidermisi olan ve olmayan insan derisi örneklerinin Rapiclear 1.52 reaktifi ile permeabilizasyon ve temizlenme sonrası temsil eden fotoğraflarını göstermektedir. Epidermal çıkarma, etkili bir ışık emici olan melanini ortadan kaldırarak doku şeffaflığını artırır; bu, örneklerin altındaki siyah çizginin daha fazla görünürlüğüyle doğrulanır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyolojik dokularda lenfatik ağların üç boyutlu görselleştirilmesi, yapısal özelliklerini, fizyolojik işlevlerini ve patolojik değişiklikleri anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, insan cilt dokusu için optimize edilmiş üç farklı doku temizleme yöntemi sunar ve her biri belirli gözlemsel amaçlara göre uyarlanmıştır.

Epidermal çıkarma, melaninin ortadan kaldırılmasında kritik bir adım olarak kabul edilir; bu da doku şeffaflığını azaltır ve histolojik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.T., E.G., N.I. ve K.K., Shiseido Co., Ltd.'nin çalışanlarıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-CD31 antikorR& D SistemleriAF8061:200'de seyrelme
Anti-Podoplanin antikorDakoM36191:100'de seyrelme
Anti-VE-kadherin antikoruHücre Sinyal Teknolojisi#25001:100'de seyrelme
CUBIC-LTokyo Kimya EndüstrisiT3740
KÜBIK-R+(M)Tokyo Kimya EndüstrisiT3741
DMEM, düşük glikoz, piruvatThermo Fisher SCIENTIFIC11885084
Eşek Anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 647Thermo Fisher SCIENTIFICA-315711:1000'de seyrelme
Eşek Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 568Thermo Fisher SCIENTIFICA100421:1000'de seyrelme
Eşek Anti-Koyun IgG (H+L) Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher SCIENTIFICA-110151:1000'de seyrelme
Rapiclear 1.52Sunjin LaboratuvarıRC152001
ZEISS Lightsheet Z.1 MikroskobuCarl Zeiss
ZEISS LSM 880 Konfokal Lazer Tarama MikroskobuCarl Zeiss

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Skobe, M., Detmar, M. Structure, function, and molecular control of the skin lymphatic system. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 14-19 (2000).
  2. Yang, Y., Wang, X., Wang, P. Signaling mechanisms underlying lymphatic vessel dysfunction in skin aging and possible anti-aging strategies. Biogerontology. 24 (5), 727-740 (2023).
  3. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The Lymphatic Vasculature in the 21st Century: Novel Functional Roles in Homeostasis and Disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  4. Baluk, P., McDonald, D. M. Imaging Lymphatics in Mouse Lungs. Methods Mol Biol. 1846, 161-180 (2018).
  5. Kajiya, K., Hirakawa, S., Detmar, M. Vascular endothelial growth factor-A mediates ultraviolet B-induced impairment of lymphatic vessel function. Am J Pathol. 169 (4), 1496-1503 (2006).
  6. Kajiya, K., Detmar, M. An important role of lymphatic vessels in the control of UVB-induced edema formation and inflammation. J Invest Dermatol. 126 (4), 919-921 (2006).
  7. Sawane, M., Kidoya, H., Muramatsu, F., Takakura, N., Kajiya, K. Apelin attenuates UVB-induced edema and inflammation by promoting vessel function. Am J Pathol. 179 (6), 2691-2697 (2011).
  8. Kirschnick, N., et al. Rapid methods for the evaluation of fluorescent reporters in tissue clearing and the segmentation of large vascular structures. iScience. 24 (6), 102650(2021).
  9. Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. 33 (2), 181-199 (2017).
  10. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  11. Kajiya, K., Bise, R., Commerford, C., Sato, I., Yamashita, T., Detmar, M. Light-sheet microscopy reveals site-specific 3D patterns of the cutaneous vasculature and pronounced rarefication in aged skin. J Dermatol Sci. 92 (1), 3-5 (2018).
  12. Sawane, M., et al. Apelin provides an alternative function to estrogen in regulating lymphatic vascular integrity. J Dermatol Sci. 111 (3), 124-127 (2023).
  13. Itai, N., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic zippering in skin associated with the progression of lymphedema. J Invest Dermatol. 144 (3), 659-668.e7 (2024).
  14. Breiteneder-Geleff, S., et al. Podoplanin-a specific marker for lymphatic endothelium expressed in angiosarcoma. Verh Dtsch Ges Pathol. 83, 270-275 (1999).
  15. Suami, H., Scaglioni, M. F. Anatomy of the lymphatic system and the lymphosome concept with reference to lymphedema. Semin Plast Surg. 32 (1), 5-11 (2018).
  16. Avraham, T., et al. Fibrosis is a key inhibitor of lymphatic regeneration. Plast Reconstr Surg. 124 (2), 438-450 (2009).
  17. Giannotta, M., Trani, M., Dejana, E. VE-cadherin and endothelial adherens junctions: active guardians of vascular integrity. Dev Cell. 26 (5), 441-454 (2013).
  18. Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31): cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
  19. Bhutto, I. A., et al. Visualization of choroidal vasculature in pigmented mouse eyes from experimental models of AMD. Exp Eye Res. 238, 109741(2024).
  20. Cichoń, M. A., Elbe-Bürger, A. Epidermal/Dermal separation techniques and analysis of cell populations in human skin sheets. J Invest Dermatol. 143 (1), 11-17.e8 (2023).
  21. Takahashi, K., et al. An analysis modality for vascular structures combining tissue-clearing technology and topological data analysis. Nat Commun. 13 (1), 5239(2022).
  22. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  23. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  24. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  25. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
  26. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  27. Johnson, L. A., et al. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. J Biol Chem. 282 (46), 33671-33680 (2007).
  28. Pechtimaldjian, L., et al. Skin-iDISCO+: An optimized tissue-clearing and labeling protocol for morphometric analysis of human cutaneous vasculature. STAR Protoc. 6 (1), 103524(2024).
  29. Hägerling, R., et al. VIPAR, a quantitative approach to 3D histopathology applied to lymphatic malformations. JCI Insight. 2 (16), e93424(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lymphatic VesselsHuman SkinThree Dimensional VisualizationLymphedemaTissue ClearingConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyImmunohistochemistryCapillary JunctionsLymphatic Endothelial Cells

İlgili makaleler