Tek moleküllü FRET testi, bakteriyel sRNA'lar ile mRNA'lar arasında Hfq aracılı tavlamanın nicel analizini sağlar ve böylece etkileşim kinetiği ve stabilitesinin ölçülmesini sağlar. Temsil eden sonuçlar, tohum uzunluğu, Hfq bağlama motifleri ve motif aralığının RNA dupleks oluşumunu nasıl etkilediğini göstermektedir.
Araştırma makalesi
Tohum uzunluğu ve bağlanma motiflerinin Hfq aracılı sRNA-mRNA tavlaması üzerindeki etkisi, tek moleküllü FRET kullanılarak analiz ediliyor
Bu makalede
Özet
Özet
Bakteriyel küçük RNA'lar (sRNA'lar) ile onların mRNA hedefleri arasındaki tavlanmayı yöneten kuralları tanımlamak zordur çünkü bu RNA'lar dizi ve yapı açısından oldukça heterojendir. Bireysel özelliklerin katkısını ayırmak için, tohum gücü, Hfq bağlama motifleri ve aralarındaki mesafe gibi temel belirleyicileri sistematik olarak çeşitlendirdik. Bu özelliklerin sRNA-mRNA çift zamanlı stabilitesi üzerindeki etkileri, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) kullanılarak test edilmiştir; bu yöntem, bireysel RNA moleküllerinin milisaniye zaman ölçeğinde izlenmesini sağlar ve toplu testlerde sıklıkla gizlenen dinamik olaylara erişim sağlar.
Kısa tohum bölgelerinin (4-5 bp) kararsız, kısa ömürlü kompleksler oluşturduğunu, uzun tohumların (8-10 bp) ise stabil çift bölgeler oluşturduğunu gösterdik. Hfq bağlama motiflerinin genişletilmesi veya mRNA'daki bağlanma noktaları arasında bir aralık eklemek, etkileşim ömrünü daha da uzattı ve Hfq aracılı tavlama verimliliğinde motif gücü ve mekansal düzenlemenin önemini vurguladı. Ayrıca, bu yaklaşım, tek molekül çözünürlükte RNA-RNA etkileşim dinamiklerini disseksiye etmek ve RNA şaperon mekanizmalarını incelemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.
Giriş
Bakteriyel gen ekspresyonu, transkripsiyon sonrası düzeyde küçük RNA'lar tarafından kapsamlı şekilde düzenlenir. Bu kısa (genellikle 50-300 nt) RNA'lar, hedefmRNA'lar 1 ile baz eşleşmesiyle hareket eder. Birçok durumda, sRNA'lar ribozom bağlanma bölgelerine annelenerek translasyonu bastırır veya mRNA çürümesini tetikleyerekRNazlar 2,3'ü aboru eder. Bu etkileşimler genetik ve biyokimyasal testlerle kapsamlı şekilde incelenmiş olsa da, mevcut yaklaşımların çoğu düzeni, RNA seviyeleri veya protein çıkışı üzerindeki sabit durum etkilerinden dolaylı olarak düzenleme çıkarır ve bu da temel bağlanma dinamiklerini çözmeyi zorlaştırır.
Verimli hedef düzenlemesi genellikle küçük heksamerik, Sm-benzeri 4,5 proteini olan RNA chaperonu Hfq'yu gerektirir. Hfq, sRNA'larınukleazlar 6'dan koruyarak yarı ömrü uzatır ve hedefmRNA'lar 7,8 ile tavlanmayı teşvik eder. Hfq, bu işlevleri farklı tercihlere sahip üç farklı RNA bağlama yüzeyi aracılığıyla gerçekleştirir: distal yüz, genellikle mRNA'larda bulunan AAN motiflerini tanır, proksimal yüz ise sRNA terminatörlerine özgü U-zengin dizileri bağlar ve kenar RNA omurgaları 9 ile elektrostatik olarak etkileşimegirer. Ancak Hfq, etkileşimde olanRNA'ların toplam havuzundan çok daha düşük miktarda bulunur (10,11). Bu belirgin sınırlamaya rağmen, yeni sentezlenen sRNA'lar hedeflerini hızla bulur ve transkripsiyon12'den sonraki dakikalar içinde düzenlemeyi tetikler. Bu paradoks, RNA-Hfq etkileşimlerinin oldukça dinamik olduğunu, RNA'ların kararlı komplekslerde bağlı kalmak yerine sürekli olarak ilişkilenip ayrıldığınıgösterir 13,14. Bu tür geçici etkileşimlerin güvenilir düzenleme üretmesini anlamak, popülasyon ortalamalarından ziyade bireysel bağlanma olaylarına deneysel erişim gerektirir.
sRNA'lar ile mRNA'lar arasındaki etkileşimler, genellikle uzun ve yüksek yapılandırılmış mRNA'lar içinde eşleşme sitelerini bulmak zorundayan, kusurlu olmayan tamamlayıcı tohum dizileriyle aracılık edilir. Ayrıca, sRNA tohum bölgesi ile mRNA'daki Hfq-bağlanma bölgesi arasındaki mesafeönemli ölçüde 15 farklı olabilir ve bu da tavlama sürecini daha da karmaşıklaştırır. Hfq, hedefteki potansiyel bağlanma noktaları arasında sRNA'ları esnek bir şekilde aktararak bu zorlukların üstesinden gelir ve böylece doğru eşleşme bölgesi16 ile karşılaşma olasılığını artırır. Hfq aracılı eşleşme, yerel mRNA yapılarını da yeniden modelleyebilir, baz çiftli bölgeleri geçici olarak çözebilir ve başka türlü erişilemeyen dizileri ortaya çıkarabilir. Ancak bu tür yeniden yapılanma, üretken olmayan veya başarısız tavlama olaylarına da yol açabilir. Bu geçici etkileşimler bazen eşleşme bölgesi17 yakınında bulunan güçlü Hfq bağlama motifleriyle stabilize edilebilir. Bu esnekliğe rağmen, tüm sRNA-mRNA karşılaşmaları stabil dupleks oluşumu ile sonuçlanmaz ve tavlama verimliliğini belirleyen faktörler hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Özellikle, bireysel dizi belirleyicilerinin bağlanma ömrüne ve karmaşık kararlılığa nicel olarak nasıl katkıda bulunduğu belirsizdir.
Burada, smFRET ile dizi belirleyicilerinin kademeli manipülasyonunu ve tavlama kinetiklerinin doğrudan ölçülmesini mümkün kılan minimal yeniden oluşturulmuş tek moleküllü bir sistem oluşturduk. Bu sistemde, başlangıçta verimsiz tavlanmaya sahip RNA çiftleri tasarladık ve tohum gücü, Hfq bağlama motif gücü ve bu alanlar arasındaki mesafe gibi temel özellikleri sistematik olarak değiştirerek bireysel parametrelerin dupleks stabilitesini nasıl etkilediğini inceledik. Kontrollü in vitro sistemde tanımlanmış dizi özelliklerini izole ederek, bu yaklaşım, ağ karmaşıklığı ve dolaylı düzenleyici etkiler nedeniyle in vivo çözülmesi zor olan sRNA hedefleme kurallarının mekanik olarak diseksiyonunu mümkün kılar.
Protokol
Bu protokol, sRNA-mRNA tavlanmasını izlemek için tek moleküllü FRET testini tanımlar. Model RNA tasarımı, sentezi, slayt pasifasyonu ve işlevselleştirmesi, tek moleküllü görüntüleme ve nicel veri analizi prosedürlerini içerir.
RNA hazırlığı
sRNA ve mRNA dizilerini silico içinde tasarlayın. Her sRNA, bir transkripsiyon terminatörü ile sonlanmalı ve hedef mRNA'ya tamamlayıcı bir tohum dizisi ile U-zengin Hfq bağlama motifi içermelidir. İlgili mRNA, Hfq-bağlanma motifi olarak hizmet eden AAN tekrarlarını ve sRNA tohum bölgesine tamamlayıcı bir dizi içermelidir. Hfq bağlanmasının dışındaki diziler, istenmeyen Hfq etkileşimlerini önlemek için AAN motifleri ve U-zengin traktatlardan kaçınarak rastgele yapılır. Görüntüleme sırasında yüzeyde immobilizasyonu sağlamak için mRNA'nın 3' ucuna bir tether-complementer dizisi eklenin. RNAstructure ile web sunucusu veya yerelolarak 18 kullanılarak tether-complementary dizisini hariç RNA ikincil yapılarını tahmin edin. Web tabanlı analiz için, FASTA dizilerini RNAstructure Web Server'a (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) yükleyin ve İkincil Bir Yapıyı Tahmin Edin. Varsayılan parametreleri kullanın (sıcaklık 37 °C, katlanma kısıtlamaları yok). Hesaplamadan sonra, yapı diyagramını ve katlanma olasılığını inceleyin. Bölgeler, tohum veya Hfq bağlama motifindeki nukleotidler baz eşleşme olasılıklarını >%60 tahmin ettiyse, tıkanmış olarak sınıflandırıldı. Bu eşiği aşan diziler yeniden tasarlandı.
Üreticinin protokolünü izleyerek DNA polimeraz kullanarak üst üste binen oligonukleotidleri genişleterek in vitro transkripsiyon için DNA şablonlarını hazırlayın. Primer konsantrasyonu her biri 3 μM idi. Termocycler programı, üreticinin önerdiği gibi kullanıldı, ancak amplifikasyon döngülerinin sayısı 8'e indirildi ve bu da primerleri uzatmak için yeterliydi.
RNA'yı 37 °C'de 3 saat boyunca transkribe edin, ardından 1× transkripsiyon tamponu (80 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM spermidin, 10 mM NaCl) ile T7 RNA polimerazı ile 1 mM, 40 mM DTT ve 30 mM MgCl2 takviye edilerek bir gece boyunca transkribe edin. Reaksiyonu durdurun, EDTA'yı 30 mM'lik nihai konsantrasyona ekleyin. RNA çökeltmesi için, 1/10 hacimde 3 M NaOAc (pH 5,4) ve ardından 2,5-3 hacim %≥99 etanol ekleyin. İyice karıştırın ve -80 °C'de 1 saat kuluçka yapın. Pellet RNA'sı santrifüjle ≥20.000 × g ile 4 °C'de 35 dakika sürer. Üst yüzeyi çıkarın, pelleti %70 etanol ile yıkayın ve kısa bir süre hava ile kurutun. RNA pelletini 20 μL 8 M ürede çözüp 90 °C'de 2 dakika ısıtın. RNA'yı %8 M üre içeren %8 poliakrilamid jellerde saflaştırın. İlgi bantlarını çıkarıp RNA'yı gece boyunca elusiyon tamponunda (0.3 M sodyum asetat, pH 5.4, 1 mM EDTA) elüasyon yapın. RNA'yı etanol çökeltmesiyle geri kazanın (DNA çökeltmesi için talimatları izleyin) ve pelleti nükleaz içermeyen suda çözebilirsiniz.
Flüoresan etiketleme için RNA'ları hazırlamak için, tarif edildiği gibi in vitro transkripsiyon gerçekleştirin; reaksiyonu 32 mM GMP ile takviye ederek 5' monofosfat taşıyan transkriptler oluşturulur. RNA'yı 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimidhidroklorür 19 (EDC) ve imidazol ile işleyerek 5' ucunda bir amin grubu oluşturuldu. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, sRNA'yı karbonat-bikarbonat tamponunda (pH 8.5) Alexa Fluor 555 veya Cy3 NHS ester ile inkübe edin. Modifiye RNA'yı kromatografi spin sütunlarıyla arındırın, etanol ile çökeltin ve pelleti nükleazsız suda çözün. Etiketleme verimliliğini spektrofotometrik olarak belirleyin; 260 nm ve boyaya özgü absorpsiyon maksimumunda Nanodrop veya eşdeğer spektrofotometre kullanılarak ölçülür. RNA ve boya konsantrasyonlarını Beer-Lambert yasası ve florofor üreticisi tarafından sağlanan ilgili yok olma katsayıları kullanılarak hesaplayın. Etiketleme verimliliği, boyanın RNA ile molyar oranı olarak tanımlanır ve rutin olarak %100'e yaklaşıyordu. Etiketlenmiş RNA'lar -20 °C sıcaklıkta depolanabilir.
3′-biotin kısmı ve 5′-amino C6 linker taşıyan DNA oligonukleotidleri sırası. Yukarıda açıklandığı gibi etanol ve sodyum asetat kullanarak DNA'yı çökeltin. Amin grubunu, üreticinin talimatlarına göre karbonat-bikarbonat tamponu (pH 8.5) içinde Cy5 NHS ester ile etiketleyin. Yukarıda tarif edildiği gibi etiketlenmiş DNA konsantrasyonunu spektrofotometrik olarak belirleyin. Etiketlenmiş DNA'lar -20 °C'de depolanabilir.
Hfq arındırma
Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq:::cat-sacB hücreleri, Hfq ekspresyon plazmidi pET21b-EcHfq taşıyan ve E. coli hfq geninin IPTG-indüklenebilir bir promotor tarafından eksprese edildiği bir şekilde yetiştirilir. Hfq, bir yakınlık etiketi olmadan ifade edilir; doğal protein, Ni2+ afinite kromatografisi ile arındırmaya olanak tanıyacak kadar yüzeye maruz kalan histidin kalıntıları içerir. Hücreleri, 1 L LB-Miller ortamında 37 °C'de 100 μg/mL ampisilin ile OD600 ile 0.6 sıcaklıkta yetiştirin. Hfq ifadesini IPTG ile 1 mM nihai konsantrasyona ekleyerek indük edin ve 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın. Hücreleri 5.000 × g ile 10 dakika boyunca santrifüjle hasat edin, ardından pelleti 50 mL lizis tamponu içinde (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, Dikkat: 2-merkaptoetanol zehirlidir, duman başlığında tutulur) tekrar askıya alın. Hücreleri %50 görev döngüsü ayarıyla buz üzerinde sonikasyon yoluyla liz yapın. Darbeler arasında buz üzerinde 1 dakikalık soğutma aralıklarıyla üç adet 40 saniyelik darbe uygulayın. Lizat 27.000 × g ile 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Süpernatantı 85 °C'de 45 dakika ısıtın, ardından aynı koşullarda tekrar santrifüj yapın. Ortaya çıkan süpernatantı RNase A (30 μg/mL) ve DNase I (5 U/mL) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca nazikçe çalkalayarak muamele edin, ardından 0,45 μm filtreyle filtrelenin. Açıklanmış lizatı NiSO4 ile önceden yüklenmiş bir affinite kromatografi kolonuna uygulayın. Kolonu tampon ile yıkayın (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NH4Cl, 0.5 mM 2-merkaptoetanol). Aynı tampon kullanarak proteini 10 mM'den 1 M'e doğrusal imidazol gradyan konsantrasyonu ile elüasyon yapın. Hfq içeren fraksiyonları bir toplayın ve HB tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, %10 gliserol) ile dengelenmiş HiLoad 16/600 Superdex 200 boyut hariç kromatografi kolonuna yükleyin. Kolonu üreticinin talimatlarına göre çalıştırın. Hfq saflaştırmasının temsil eden SDS-PAGE analizi Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. Gerekirse arıtılmış proteini santrifüj filtrelerle (3 kDa MWCO) konsantre edin. Saflaştırılmış Hfq aliquotları -80 °C'de saklanabilir.
Tek moleküllü deneyler
Kuvars slaytlarının pasivasyonu20
Her uzun kenarın yakınında beş paralel delik (0,8 mm çapında) deldirilmiş kuvars slaytları hazırlayın. Kuvars sürgü ve örtü örtülerini Hellendahl boyama kavanozuna (sürgü tutucusuna) yerleştirin ve asetonla 20 dakika sonikasyon yapın (Dikkat: aseton yanıcı ve uçucudur; buhar davlumbazında çalışın). Temizlik adımını metanol kullanarak tekrarlayın (Dikkat: metanol zehirli ve yanıcıdır; buhar davlumbazında kullanın). Slaytları iyice suyla durulayın ve 1 M KOH ile 1 saat sonikasyon yapın (Dikkat: KOH aşındırıcıdır, eldiven ve göz koruyucu kullanın). Slaytları suyla durulayın, ardından sırayla aseton ve metanolde 20 dakika sonikasyon yapın. 5 M KOH ile KOH temizliğini 1 saat boyunca tekrarlayın, ardından iyice suyla durulama yapın (Dikkat: Konsantre KOH ile uygun koruyucu ekipmanla tutun). Kaydırakları hava ile kurut. Hellendahl boyama kavanozlarından temiz bir set hazırlayın ve onları heksan ile durulayın (Dikkat: heksan çok yanıcıdır; duman kapasonu içinde tutun), ardından hava kurumasına izin verin. Sürgüleri sürgü tutucuya yerleştirin ve sürgüleri iki kez heksanla durulayın. Sürgü tutucuya 75 mL heksan ekleyin ve dikkatlice 50 μL diklorodimetilsilan (DMDCS) heksan yüzeyinin altına enjekte edin (NOT: DMDCS'yi havaya maruz bırakmaktan kaçının). Kaydırakları hafif sallayarak 1,5 saat kuluçka edin. Slaytları heksanda 1 dakika boyunca durulayın ve sonikle yapın, ardından kalan DMDCS'yi çıkarmak için bu adımı üç kez tekrarlayın. Sürgüleri hava ile kurutup 50 mL'lik tüplerde (örneğin Falcon veya konik tüpler) vakum ile sızdırdırın. Hazırlanan slaytlar, daha fazla kullanıma kadar −20 °C'de saklanabilir.
Akış kanallarının montajı ve işlevselleştirilmesi
Basit bir akış kanalı, kuvars sürgü, cam kapak kaçığı, çift taraflı bant, pipet uçları ve epoksi kullanılarak monte edilebilir. Kuvars sürgüsündeki deliklerin arasına ince çift taraflı bant şeritleri uygulayın ve kapak parçasını üstüne yerleştirin. Uzun kenarları epoksi ile kapatın. Bir pipet ucundan (hem dar ucu hem de daha geniş yaka) yaklaşık 5 mm segmentler kesilip birini çıkış olarak hizmet etmek üzere bir deliğe yerleştirin, diğerini ise paralel bir deliğe yerleştirerek giriş rezervuarı oluşturun. İkisini de epoksi ile sabitleyin. Giriş rezervuarı, enjeksiyondan önce sızıntı olmadan sıvı tutmalı. Kanaldan çözümler çekmek için, 1 mL bir şırıngadan çıkan boru çıkışa bağlayın.
Kanalları yüzeyi işlevselleştirmek için aşağıdaki reaktiflerle sıralı olarak ön işlemlendirin: biyotinillenmiş BSA (0,2 mg/mL) 5 dakika, Tween-20 (%0,2) 10 dakika ve NötrAvidin (0,1 mg/mL) 1 dakika boyunca. Her bir çözeltinin yaklaşık 100 μL bir kanal için yeterli olması yeterlidir. Giriş rezervuarındaki sıvıdan daha fazla sıvı çekmekten kaçının, çünkü bu kanala hava girer ve baloncuklar oluşturur. Kanalın kurumasını önlemek için adımlar arasında rezervuarda küçük bir hacim çözelti bırakın. Her adım arasında 1× TNK tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) ile iyice durulayın. Bu tedavi, RNA immobilizasyonu için bir biotin-NötrAvidin yüzeyi oluşturur.
40 nM mRNA'yı 20 nM biyotinillenmiş Cy5 etiketli DNA tether ile karıştırarak immobilizasyondan hemen önce mRNA-tether duplekleri hazırlayın. Karışımı 75 °C'de 1× TNK tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) 5 dakika boyunca denatüre edilir, ardından 37 °C'de 15 dakika boyunca yeniden pişirilir ve 20 °C'de dengelenir.
Numuneyi görüntüleme tamponunda 50 kat seyreldin (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkrom-2-karboksilik asit, %0,01 oktaetilen glikol monododesil eter, %0,8 glikoz, 2 U/mL RNase inhibitörü) ve mRNA'ları immobilize etmek için akış kanalına enjekte edin. 1 dakika kuluçka yapın, ardından foto ağartmayı azaltmak için oksijen temizleyici sistemi (165 U/mL glukoz oksidaz ve 2170 U/mL katalaza) ile desteklenen görüntüleme tamponuyla yıkayın.
Bileşenleri 1:1 oranında karıştırarak sRNA-Hfq komplekslerini 1× TNK tamponunda son 250 nM konsantrasyona karıştırın ve oda sıcaklığında 5-15 dakika kuluçka yapın. Kompleksleri, oksijen toplama sistemini içeren görüntüleme tamponunda 50 kat seyreldin ve görüntülemeden hemen önce akış kanalına enjekte edin.
Tek moleküllü veri toplama
EMCCD kamerayı ve lazerleri açarak prizma tabanlı toplam iç yansıtma floresansı (TIRF) mikroskobu kurun. Hazırlanmış kaydırı, montajlı akış kanallarıyla mikroskop aşamasına monte edin ve prizmayı üstüne yerleştirin. Veri almak için Tek Yazılım (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) kullanın. Yazılımda, Otomatik Ölçeklendirme seçeneğini seçerek arka plan seviyesini belirleyin ve elde edilen değeri Arka plan alanına kopyalayın. Kare hızını 100 ms olarak ayarlayın. Alexa Fluor 555 veya Cy3'ü 532 nm lazer ile ve Cy5'i 633 nm lazer ile heyecanlandırın. Her iki kanaldan emisyonları aynı anda 60× suya batma hedefiyle toplayın. Her film için, görüş alanında Cy5 etiketli mRNA'ları lokalize etmek amacıyla on kare 633 nm uyarımla başlayın. 532 nm uyarımla 5 dakika kayda devam edin. Cy5 fotobeyazlamasını doğrulamak için 1 saniyelik 633 nm uyarımla alın. Bu, analiz için kullanılabilecek .pma film dosyasını üretecektir.
Tek moleküllü veri analizi
Donör-alıcı kanal haritalaması yapmak ve floresans yoğunluk yörüngelerini çıkarmak için özel IDL scriptleri kullanarak ham .pma dosyalarını analiz edin. İlk olarak, 532 nm veya 633 nm lazerle uyarıldıktan sonra hem donör hem de alıcı kanallarda tespit edilebilen çok renkli floresan boncuklar kullanarak bir kalibrasyon filmi kaydedin. Bu kalibrasyon videosunu kullanarak donör ve alıcı kanallarını hizalayan bir haritalama dosyası oluşturun. Ortaya çıkan eşleme dosyasını tüm deneysel kayıtlara uygulayarak karşılık gelen donör-alıcı çiftlerini belirleyin, floresan noktaları tespit edin ve yoğunluk zaman izlerini aşağı akış FRET analizi için dışa çıkarın. Detaylı, adım adım talimatlar script (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) ile birlikte sunulur.
MATLAB'da yoğunluk izlerini s_tr_E.m betikiyle işleyin. Scripti başlatın ve .traces ile .pks dosyalarını içeren dizine, ardından dosya indeksi ve zaman çözünürlüğüne girin. Nokta tanımlaması için kullanılan çerçeve penceresini seçin. Script daha sonra her tek nokta için donör ve alıcı yoğunluklarını gösterir. Moleküller arasında klavye komutlarıyla (b geri dönmek için, g belirli bir moleküle atlamak için) kullanın. Donör ve akseptör tabanlarını (k) tanımlayın ve gerektiğinde grafiklere tıklayarak sızıntıyı (l) düzeltin. Kabul edilen izleri zaman, bağışçı ve alıcı yoğunluklarını içeren .dat dosyaları olarak tek tek s tuşuna basarak kaydet. Dışa aktarılan dosyaları aşağı akış nicel analizi için kullanın.
Bireysel smFRET izlerini analiz etmek ve bağlama olaylarını nicelendirmek için peak-finder programını kullanarak bekleme süresi analizi ve FRET durum dağılımları dahil. Programı başlatın ve Dosya menüsünü kullanarak dışa aktarılan .dat iz dosyalarını içeren klasörü açın. MATLAB betiği kullanılarak önceden belirlenen bağış değerleri ve donör-kabul ediciye kaçak değerleri ayarlanır. Sonra, tüm görsel olarak doğrulanmış bağlama olaylarının seçilen değerlerin üzerinde olmasını sağlamak için yoğunluk eşiklerini otomatik zirve algısını yönlendirecek şekilde ayarlayın. Gürültü bir olayın birden fazla zirveye bölünmesine neden olursa, dahili birleştirme fonksiyonunu kullanarak manuel olarak birleştirin. Kaydet'e tıklayarak tespit edilen olayları başlangıç zamanı, bitiş zamanı ve her olay için ortalama FRET verimliliğini içeren .csv dosya olarak dışa aktarabilirsiniz. Çıktı dosyaları zirve dizinine kaydedilirken, her olay için çerçeve çözünürlüklü FRET değerleri zirve perde dizinine yazılır. FRET verimliliği, alıcı floresans yoğunluğunun donör ve alıcı şiddetlerinin toplamına bölünmesiyle hesaplanır; arka plan ve alıcı sızıntısı için düzeltilmiş değerler kullanılır. Cy5 fotobeyazlatma için izleri manuel olarak inceleyin; bu, FRET verimliliğinde ani düşüş ve Cy3 yoğunluğunun artmasıyla tanımlanır. Foto ağartma gerçekleştiğinde, Cy3 floresansı tespit edilebilir kaldığı sürece bağlanmanın devam ettiğini varsayın ve karşılık gelen .csv dosyalarını düzenleyerek tepe sürelerini düzeltin.
Pik perde dosyalarından çerçeve çözünürlüklü FRET verimlilik değerlerini GraphPad Prism'e aktarın. Frekans Dağılımı fonksiyonunu kullanarak FRET histogramları üretin ve dağılımları Gauss modelleriyle eşleştirerek baskın FRET popülasyonunu belirleyin.
Bireysel bağlanma olayları için dwell sürelerini dissosiyasyon zaman noktalarından çıkararak bir tablo kullanarak belirleyin. Her deneysel tekrar için geçici olayların (<10 s) kısmını hesaplayın. İstatistiksel analizler GraphPad Prism'de gerçekleştirildi. İki durum arasındaki karşılaştırmalar eşleşmemiş t-testleri kullanılarak değerlendirildi ve üç veya daha fazla durum arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ile Tukey'nin post-hoc testi kullanılarak analiz edildi.
Sonuçlar
Tohum uzunluğu, sRNA-mRNA eşleşmesinin dinamik rejimini belirler
Hfq aracılı tavlamanın dizis özelliklerinin nasıl yönettiğini test etmek için minimal tek moleküllü bir test oluşturduk. Model RNA'lar, daha önce tanımlanmış Hfq-bağımlı sRNA-mRNA çiftleri 16,17 mimarileri takip ederek tasarlanmış ve mRNA'da adenozin açısından zengin Hfq bağlama motifi ve sRNA'da üridin açısından zengin bir kenar bağlanma bölgesi taşıyordu (Şekil 1A). sRNA, 5ʹ ucunda Alexa Fluor 555 (donör) ve mRNA-DNA tonu Cy5 (alıcı) ile etiketlendi; bu da FRET ile baz eşleşmesi nedeniyle oluşan yakınlığın tespitini mümkün kılmıştır.
Tohum tamamlayıcılığını 4, 5, 8'den 10 bp'ye kadar değiştirmek, belirgin dinamik davranışlar ortaya çıkardı. 4 bp tohumda etkileşimler ağırlıklı olarak geçiciydi ve heterojen FRET verimlilikleri gösterdi; bu da eksik baz eşleşmesini düşündürüyor (Şekil 1B-D). Buna karşılık, 8 bp ve 10 bp tohumlar genellikle gözlem penceresi boyunca devam eden stabil dupleksler verdi (Şekil 1C). Bu etkileşimler, RNA'lar arasında tam baz eşleşmesiyle tutarlı olan beklenen yüksek FRET durumunu (EFRET ≈ 0.79-0.80, Şekil 1D) üretti. 5 bp'lik bir tohum, kısa ömürlü ama iyi tanımlanmış bağlanma olayları üretti (E FRET ≈ 0.66), böylece RNA dizisinde sonraki değişiklikler için uygulanabilir bir dinamik aralık sağladı (Şekil 1B-D). Bu nedenle, tüm sonraki testler için 5-bp tamamlayıcılık kullandık.
Daha güçlü Hfq bağlama motifleri, sRNA-mRNA kompleksinin kararlılığını artırır
Sonrasında Hfq bağlanma gücünün sabit 5-bp tamamlayıcılıkta bağlanma ömrünü nasıl modüle ettiğini sorduk. mRNA motifinin AAN4'ten AAN6'ya genişletilmesi, kararlı komplekslerin oluşma olasılığını önemli ölçüde artırdı (p < 0.001). Ortalama yaşam süreleri 7,5 saniyeden 18 saniyeye yükseldi ve 10 saniye < istikrarsız olayların oranı %80 ± %2'den %2,9 ± 68,3'e düştü (Şekil 2A-C).
Daha sonra Hfq bağlama motifinin sRNA üzerindeki etkisini test ettik. UUAUUUUUUU'dan CUUC'a (sRNA-SR, "kısa kenar") kenar bağlanma sitesinin kısaltılması son derece kararsız etkileşimler yarattı (AAN4 ile ortalama ömür süresi 1,9 saniye) ve bu bağlamda mRNA motifinin güçlendirilmesi yalnızca mütevazı bir etki sağladı (AAN6 ile ortalama 3,0 saniye, anlamlı değil, Şekil 2B,C). Böylece, her iki partner de üretilen kompleksin stabilitesine katkıda bulunur, ancak zayıf sRNA-Hfq temasları daha güçlü bir mRNA motifinden elde edilen kazanımları sınırlar.
mRNA'daki Hfq ve tohum siteleri arasındaki bir aralık, daha uzun ömürlü kompleksleri teşvik eder
Hfq, kenar yüzeyini kullanarak optimal sRNA eşleşmesitesi 16'nın aramasını kolaylaştırırken AAN bölgesine bağlı kalabilir. Bu özellik, mRNA'daki iki bağlanma bölgesi arasındaki ek boşlukların etkileşim kararlılığını etkileyebileceğini göstermiştir.
Bunu test etmek için, Hfq- ve sRNA bağlanma noktaları (N15) arasında 15 nt-lik tek zincirli bir aralık ekledik. Bu değişiklik, stabil tavlama olaylarının ömrünü 7,5 saniyeden (AAN4) 47 saniyeye (AAN4-N15) (p < 0,01) anlamlı şekilde artırdı (Şekil 3A,B). 10 saniyeden kısa süren bağlanma olaylarının yüzdesi de %80 ± %2'den %44 ± %6'ya düşmüştür (Şekil 3C). Bu veriler, bağlama modülleri arasındaki ek esnekliğin, tavlama ara maddelerini stabilize edebileceğini ve daha uzun ömürlü dupleksleri teşvik edebileceğini göstermektedir.
VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:
Bu çalışmanın bulgularını destekleyen tüm veriler, tek moleküllü FRET yörüngeleri, işlenmiş veri setleri ve analiz betikleri dahil olmak üzere Mendeley Veri deposunda şu adresten halka açık erişilebilir: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Şekil 1: Bağlanma verimliliği üzerindeki sRNA-mRNA tamamlayıcılığının etkisi. (A) sRNA-mRNA tavlaması için smFRET testi. Alexa Fluor 555 etiketli sRNA ile immobilize edilmiş mRNA-Cy5-DNA bağlama kompleksi arasındaki baz eşleşmesi, yüksek bir FRET sinyali üretir. Model mRNA'lar, Hfq-bağlanma bölgesi (AAC)4 (mavi) ve sRNA-bağlanma bölgesi (S5, kırmızı) içerir; ardından beş nükleotid ve RNA-DNA hibrit bölgesi gelir. sRNA'lar, kenar bağlama bölgesi (turuncu) içerir. (B-D) içindeki paneller deneysel koşullara (tohum uzunluğu) göre gruplandırılır. (B) Tek bir mRNA molekülündeki temsilci sRNA bağlanma olayı. Alexa Fluor 555 etiketli sRNA (donör, yeşil) ve Cy5-DNA tether'in (alıcı, kırmızı) floresans yoğunluk izleri gösterilmiştir. Cy5, kaydın ilk ve son on karesinde doğrudan heyecanlandı. (C) sRNA-Hfq ile bağlı 50 temsilci mRNA molekülünü gösteren rastrgramlar. Her yatay çubuk, tek bir sRNA-mRNA etkileşimini temsil eder. (D) 4 bp (N = 416 mRNA), 5 bp (N = 513 mRNA), 8 bp (N = 191 mRNA) veya 10 bp (N = 105 mRNA) tamamlayıcı bölgeler içeren mRNA'lar ile sRNA'lar arasındaki etkileşimler için FRET verimliliğinin histogramları. FRET verimlilikleri, bireysel bağlanma olayları için başlangıç ve sızıntı düzeltilmiş donör ve akseptör yoğunluklarından 0.1 saniyelik aralıklarla hesaplandı. Gauss uyumları (mavi) baskın FRET popülasyonunu göstermekte gösterilmiştir ve E_FRET değerleri hesaplamak için kullanılmamıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hfq-bağlanma motif uzunluğunun sRNA-mRNA etkileşimleri üzerindeki etkisi. Tüm varyantlarda baz eşleşme bölgesi 5 bp uzunluğundadır. (A) sRNA-Hfq kompleksleriyle bağlanmış 50 temsilci mRNA'yı gösteren rastrgramlar. Her yatay çubuk tek bir etkileşimi temsil eder. Yukarıdaki çizgi diyagramlar, mRNA'daki (AAC) tekrarların sayısındaki değişikliklerle ve sRNA'daki rim-bağlama bölgesinin uzunluğundaki değişikliklerle ilgili RNA tasarımlarını gösterir (SR = "kısa kenar"). Şekil 1A'daki gibi renklendirme. (B) sRNA-mRNA bağlanma ömür sürelerinin saçılma grafikleri. Her nokta tek bir bağlama olayını temsil eder. Ortalama yaşam süreleri (kırmızı yatay çizgi): mRNA-AAN4 + sRNA için 7,5 saniye (N = 188 mRNA), mRNA-AAN6 + sRNA için 18 saniye (N = 142 mRNA), mRNA-AAN4 + sRNA-SR için 1,9 saniye (N = 85 mRNA), mRNA-AAN6 + sRNA-SR için 3 saniye (N = 149 mRNA). (C) 10 saniyeden kısa bağlama olaylarının yüzdesini gösteren çubuk grafik. Hata çubukları, iki bağımsız veri setinden standart sapmayı temsil eder. Tek yönlü ANOVA tarafından Tukey'nin post-hoc testi ile istatistiksel analiz, çoklu karşılaştırmalar için. p < 0.001, ****p < 0.0001; NS, önemli değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hfq- ve sRNA bağlanma noktaları arasındaki aralık uzunluğunun sRNA-mRNA etkileşimleri üzerindeki etkisi. Tüm varyantlarda baz eşleşme bölgesi 5 bp uzunluğundadır. (A) sRNA-Hfq kompleksiyle bağlanmış 50 temsilci mRNA'yı gösteren rastrgramlar. Her yatay çubuk tek bir bağlama olayını temsil eder. Yukarıdaki çizgi film diyagramları, ilgili RNA tasarımını göstermektedir. N15 = rastgele dizinin 15 nt aralıklı. Şekil 1A'daki gibi renklendirme. (B) sRNA-mRNA bağlanma ömür sürelerinin saçılma grafikleri. Her nokta tek bir bağlama olayını temsil eder. Ortalama ömür süreleri (kırmızı yatay çizgi): mRNA-AAN4 + sRNA için 7,5 saniye (N = 188 mRNA) ve mRNA-AAN4-N15 + sRNA için 47 saniye (N = 289 mRNA). (C) 10 saniyeden kısa bağlama olaylarının yüzdesini gösteren çubuk grafik. Hata çubukları, iki bağımsız veri setinden standart sapmayı temsil eder. Eşleşmemiş t-testi ile istatistiksel analiz. **p < 0.01. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: E. coli Hfq'nun Arındırılması. Hfq ifadesi ve arındırmanın SDS-PAGE analizi. (Üst) Ni2+ affinite (HiTrap) kolonunda arıtma sırasında toplanan örnekler, indüksiyondan önce, indüksiyon sonrası, pellet, lizat, yük, akış, yıkama fraksiyonları ve elutlanmış tepe fraksiyonlar dahil. (Altta) HiLoad 16/600 Superdex 200 sütununda boyut dışlama kromatografisinden sonra pik fraksiyonların SDS-PAGE'si. Hfq'nun monomerik (~11 kDa) ve heksamerik (~66 kDa) formları belirtilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu çalışma, belirli RNA dizisi özelliklerinin Hfq aracılı sRNA-mRNA tavlanmasının verimliliğini nasıl belirlediğini inceleyen minimal tek moleküllü bir analiz oluşturur. Tohum uzunluğunu, Hfq bağlama motif gücünü ve bağlanma modülleri arasındaki mesafeyi değiştirerek, her parametrin tek molekül çözünürlükte dupleks stabilitesine nasıl katkı sağladığını doğrudan niceleştirdik. Popülasyon ortalaması etkilerini bildiren topluluk ölçümlerinin aksine, bu yaklaşım bireysel bağlanma ve ayrışma olaylarını doğrudan çözerek kinetik heterojenlik ve geçici etkileşimlerin ölçülmesini sağlar. Sonuçlarımız gösteriyor ki, kısa tohumlu bölgeler bile geçici olarak etkileşime girebilirken, uzun tohumlar uzun ömürlü stabil dupleksler üretir. Bu bulgular, bakteriyel sRNA'lardaki doğal tohum bölgelerinin genellikle 6-12 nükleotid arasında yer aldığını ve nadiren tam tamamlayıcı dupleksler oluşturduğunu gösteren önceki in vivo ve toplulukverileriyle tutarlıdır 21,22,23.
Ayrıca hem mRNA hem de sRNA Hfq-bağlanma motiflerinin dupleks stabilitesini güçlü şekilde etkilediğini bulduk. AAN motifinin mRNA'da uzatılması, bağlanma ömrünü uzatırken, sRNA kenar bağlanma bölgesinin kısaltılması onları belirgin şekilde destabilize etti. Bu, Hfq'nun distal yüzünün adenozin açısından zengin mRNA motiflerini sabitlediği ve kenarın üridin açısından zengin sRNA'ları kullanarak tamamlayıcı bölgelerin verimli hizalanmasını desteklediği bir işbirlikçimodeli destekler 9,17. Genetik veya raporlayıcı tabanlı testlerin aksine, genellikle sadece üretken düzenleyici sonuçları tespit ederken, bu sistem bağlanma kararlılığını aşağı akış etkilerinden nicel olarak ayırır ve bireysel dizi özelliklerinin fiziksel etkileşim ömrünü nasıl modüle ettiğinin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır. Güçlü rim-bağlanma motifi özellikle sRNA-mRNA eşleşmesi için yapısal yeniden düzenlemeler gerektiğinde önemlidir; çünkü Hfq17'de RNA tutumunu artırır. Kenarın ayrıca sRNA-Hfqkompleksleri 16 tarafından mRNA'ların lateral taramasını teşvik ettiği düşünülmektedir; bu özellik, hedef siteler Hfq bağlanma bölgesinden uzak olduğunda özellikle önemli olabilir. Bağlanma noktaları arasında 15 nt-lik bir aralık elde ettiğimiz sonuçlar bu görüşü desteklemekte; tohum ile Hfq motifi arasındaki ek esnekliğin, iplik değişimi sırasında sterik kısıtlamaları azaltarak eşleşme kararlılığını artırdığını gösteriyor.
Doğal sistemlerin ötesinde, sonuçlar sentetik veya mühendislik yoluyla yapılmış sRNA'ların tasarımıyla da ilgilidir. Mevcut tasarım stratejilerinin çoğu, bir tohum bölgesini veya genel bir iskeletioptimize etmeye odaklanır 23,24,25, ancak verilerimiz Hfq bağlama motifi ile hedef bölge arasındaki mesafe gibi ek belirleyicileri vurgulamaktadır. Dizi özellikleri kontrollü ve modüler bir şekilde tanıtıldığından, test tasarım kurallarını test etmek için sistematik bir deneysel çerçeve sağlar. Bu ilke, geliştirilmiş düzenleyici verimlilikle yapay sRNA'ların gelecekteki inşasını yönlendirebilir.
Bu yaklaşım, RNA-RNA etkileşimlerinin nicel ve tekrarlanabilir analizini mümkün kılsa da, sınırlamaları da vardır. Test, tamamen tamamlayıcı bölgeleri incelerken, çoğu fizyolojik sRNA-mRNA etkileşimi tanıma ve düzenlemeyi etkileyebilecek uyumsuzluklar ve çıkıntılar içerir. Yöntem, sRNA-mRNA bağlanma ömrünü ölçür ancak doğrudan öfke inhibisyonu veya mRNA bozunması gibi aşağı akış düzenleyici sonuçları ele almaz. Bu testin gelecekteki uyarlamaları, uyumsuz tohum bölgeleri, değişken GC içeriği veya ribozomlar ve degradozomlar dahil ederek bu faktörlerin bağlanma kinetiklerini nasıl şekillendirdiğini sistematik olarak inceleyebilir.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Tek moleküllü enstrümantasyona erişimi kolaylaştırdığı için Prof. Sarah Woodson'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi (2022/46/E/NZ1/00462 tarihinden EMM'ye) ve EMBO Kurulum Hibesi (IG 5730-2024 EMM'ye) tarafından finanse edilmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m filtresi | Millipore | HABG04700 | |
| 5 mL Hi-Trap kolonu | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Aseton | Merck | 270725 | HPLC derecesi |
| Akrilamid:Bis-akrilamid çözeltisi | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 NHS sukcinimidil ester | Termo Fischer | A20009 | |
| Amicon Ultra Santrifüj Filtreleri (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Amonyum klorür | Merck | 1330-500G | |
| Ampisilin | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Kimyasalları | K054.1 | |
| Beta-merkaptoetanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Bio-Gel P-30 ile Bio-Spin Kolonları | Bio Rad | 7326231 | Etiketli RNA arındırılması için |
| Katalaz | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Kimyasalları | K057.4 | |
| Cy3 HNS esteri | Cytiva | PA13105 | |
| Cy5 NHS sukcinimil ester | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Termo Fischer | R0861 | |
| Diklorodimetilsilan | Merck | 440272 | |
| DNA oligomerleri (tether) bir 5′-amino bağlayıcı C6 | Termobilimsel | N/a | |
| Dnase I | Termo Bilimsel | 18047019 | |
| EDC | Termobilimsel | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| EMCCD kamera | Andor | ||
| Etanol | Merck | 1085430250 | |
| Glikoz | Merck | D9434-1KG | |
| Glikoz oksidaz | Merck | G2133-50KU | |
| Gliserol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Kimyasalları | K056.4 | |
| HCL | Merck | 1.00318 | |
| Heksan | Termo Fischer | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 boyutlu hariç tutma sütunu | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Magensiyum klorür | Merck | M8266-1KG | |
| Metanol | Merck | 34885-M | HPLC derecesi |
| Nötravidin | Termo Fischer | 31000 | |
| Nikel sülfat | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Q5 Polimeraz | NEB | M0491S | In vitro transkripsiyon şablonunun üretiminde kullanılıyor |
| RNase A | Termobilimsel | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Sodyum Asetat | Merck | S7545-100G | |
| Sodyum klorür | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Spermidin | Merck Yaşam Bilimi | S2626 | |
| Tris Üssü | Termo Bilimsel | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| Urea | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Kimyasalları | K055.3 |
Kaynaklar
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).