Drosophila oositlerinde acentrosomal mikrotubul ağlarının canlı görüntülemesi ve nicel analizi için bir iş akışı

Summary

Burada, Drosophila oositindeki mikrotübul dinamiklerini analiz etmek için canlı görüntülemeyi otomatik analiz araçlarıyla birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, mikrotübul davranışının büyüme, yönelim, hız ve mekansal organizasyon dahil olmak üzere verimli ve tekrarlanabilir ölçümünü sağlar ve optimizasyon sırasında diğer hücre tiplerine uyarlanabilir.

Abstract

Mikrotübul (MT) sitoskeleti, hücre şekli, polarite, göç ve bölünme gibi birçok hücresel işlev için gereklidir. Centrozomlar, bölünen hayvan hücrelerinde ana MT-düzenleyici merkez (MTOC) olarak işlev görürken, Drosophila oositleri dahil birçok farklılaşmış hücre, MT ağlarını oluşturmak için asentrozomal yollara dayanır. Çoğalan hücrelerde MT organizasyonu hakkında geniş bilgiye göre, MT ağlarının centrozomlar olmadan nasıl bir araya geldiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Drosophila oositleri, acentrosomal MT organizasyonu ve dinamiklerini incelemek için güçlü bir model sunar. Ancak, yoğun MT ağları geleneksel görüntülemeyi zorlaştırıyor. Canlı görüntüleme, MT büyüme ve yöneliminin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar, ancak standart analiz yöntemleri sınırlıdır. Burada, aktif MT polimerizasyon bölgelerini etiketleyen Plus-End Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP) kullanılarak Drosophila oositlerinde MT büyüme dinamiklerini analiz etmek için canlı görüntüleme tabanlı bir protokol sunuyoruz. Yüksek çözünürlüklü Airyscan konfokal mikroskopi, EB1 kuyruklu yıldızlarının tespitini sağlarken, özel Fiji makroları ve Python betikleri kuyruklu yıldız yoğunluğu, hızı, uzunluğu ve yönünün akıcı ve tekrarlanabilir nicelenmesini sağlar. Bu yöntemi, kontrol oositlerini soğuk kaynaklı MT depolimerizasyonuna maruz kalanlarla karşılaştırarak, ayrıca Patronin mutantları (insanlarda CAMSAP) karşılaştırarak, korunan MT eksi uç stabilizatörü ve merkez dışı mikrotubul organizasyon merkezlerinin (ncMTOC) temel bileşeni olarak, bozuk MT dinamikleri için pozitif bir kontrol olarak doğruladık. Analizlerimiz, EB1 kuyruklu yıldızlarının ön zenginleşmesi ve karakteristik yönelim yanlılıkları dahil olmak üzere bölgeye özgü MT dinamiklerini ortaya çıkardı ve iş akışının MT büyümesindeki ince bozulmaları tespit etme hassasiyetini doğruladı. Bu yaklaşım, oositlerde MT davranışını incelemek için güvenilir ve kullanıcı dostu bir çerçeve sağlar. Adım adım protokol, bu bağlamda MT regülatörlerinin incelenmesini mümkün kılar ve uygun optimizasyonla diğer farklılaşmış hücre tiplerine, örneğin nöronlar ve epitel hücrelerine uyarlanabilir. Daha geniş anlamda, çeşitli MT mimarilerinin özel hücresel işlevlerin temelini nasıl oluşturduğunu inceleyen mekanik çalışmaları ve genetik taramaları destekler.

Introduction

Mikrotubul (MT) sitoskeleti, ökaryot hücrenin temel bir bileşenidir ve hücre şeklinin, kutupluğunun ve bölünmenin oluşturulması ve korunmasında hayati roller oynar. MT polimerlerinin büyüme ve küçüşme ile karakterize edilen dinamik davranışı, birçok MT tabanlı süreç^{için kritik öneme sahiptir 1,2}. Farklı MT dizilerinin montajı, MT'lerin çekirdeklendiği mikrotubul düzenleyici merkezlerin (MTOC) birleşik etkisine ve MT kararlılığını, yönümünü ve dinamiklerini kontrol eden çeşitli MT düzenleyici proteinlerin^{etkinliğine dayanır 1,2,3}. En iyi incelenen MTOC, interfazda hücre şekli ve polaritesinin düzenlenmesi ve mitoz ^4,5'te mitotik iğren montajı için önemli olan MT'lerin radyal dizilerini üreten centrosomdur. Ancak, nöronlar ve epitel hücrelerinde olduğu gibi mitotik çıkış veya farklılaşmada, centrozomal MTOC aktivitesi genellikle zayıflar ve aşırı durumlarda, örneğin oositlerde, ^6,7 olarak eliminasyon edilebilir. Bu durum genellikle MT sitoskeletinin hücre tipine özgü yeniden modellenmesiyle ilişkilidir; MTOC fonksiyonu genellikle diğer hücresel^{sitelere atanır (2,3,8}), genellikle merkezsiz MTOC'lar (ncMTOC) olarak adlandırılır. Mitotik hücrelerde MT organizasyonunun aydınlanmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da, mitozdan çıkan veya farklılaşma geçiren hayvan hücrelerinde MT'lerin nasıl çekirdeklendiği, stabilize edildiği ve mekansal olarak nasıl düzenlendiği hakkında nispeten az bilgi^{vardır 2}. Özellikle, canlı organizmalarda çoğu hücre bölünmez; Hücre döngüsünden çıkmış ve/veya farklılaşmışlardır. Bu nedenle, MT sitoskeletinin bu bağlamlarda nasıl monte edildiğini ve düzenlendiğini anlamak kritik öneme sahiptir. Bu bilgi, özel hücresel işlevleri desteklemek için farklı MT mimarilerinin nasıl kurulduğunu ortaya çıkarmak için gereklidir.

Drosophila melanogaster oositi, acentrozomal MT organizasyonu ve işlevini incelemek için güçlü bir sistem sağlar. Oogenezin orta aşamalarında, centrozom aktivitesi⁹ zayıflatılır ve MT'ler, oosit antero-lateral kortekste lokal olan ncMTOC'lardan üretilir (Şekil 1B). Bu MT ağı, anne mRNA'larının, proteinlerinin ve organellerinin lokalizasyonu için hayati öneme sahiptir; bu da gelecekteki embriyo eksenlerinin oluşturulması ve^{gelişimi için kritik öneme sahiptir 10,11}. Önceki çalışmalar, oositin ncMTOC'larının, kortikal aktin sitoskeletine bağlı spektraplakin proteini Shot ile kompleks oluşturan MT eksi uç proteini Patronin'den oluştuğunu göstermiştir. MT'lerin, Katanin gibi kesici enzimlerle üretilen kısa MT parçalarından büyüdüğü ve bu enzimlerin daha fazla MT polimerizasyonu için tohum olarak görev yapabildiği^önerildi. Benzer mekanizmalar, centrozomal aktivitenin azaldığı^{nöronlar 13} gibi diğer farklılaşmış hücrelerde de önerilmiştir. Ancak, kopmanın karmaşık MT ağları oluşturduğu mekanizmalar, örneğin oositte olduğu gibi, hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Bu bağlamlarda MT'lerin esas olarak kesinti temelli yeniden düzenleme yoluyla mı yoksa kesme ve de novo MT çekirdeklenmesinin birleşimi yoluyla mı oluştuğu hâlâ belirsizdir. Oosit MT ağının karmaşıklığı, MT'lerin bilinen centrozomal bağlam dışında nasıl üretildiğini ve organize edildiğini incelemek için ideal bir sistem yapar. Özellikle, bu durum görüntüleme ve analiz için de bir zorluk yaratır: oosit içindeki yoğun MT ağı, bireysel MT'leri geleneksel immünboyama veya statik görüntüleme yöntemleriyle çözmeyi^{zorlaştırır 2,14}.

Canlı görüntüleme, MT polimerizasyon olaylarının gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayarak MT ağlarının incelenmesini büyük ölçüde geliştirmiş ve MT büyümesinin dinamikleri ve yönelimi hakkında önemli bilgiler sunmaktadır. Önceki çalışmalar, oositlerde MT büyüme dinamiklerini plus-end^{belirteçleri} 14,15,16'nın canlı görüntülemesi kullanılarak başarıyla analiz etmiştir. Ancak, birçok durumda, MT dinamiklerini nicelendirmek için kullanılan görüntü analiz prosedürleri yalnızca kısa bir şekilde tanımlanır, özel veya laboratuvar özgü uygulamalara dayanır veya kamuya açık olmaz, böylece tekrarlanabilirlik ve daha geniş benimsenme sınırları vardır. Yöntemimiz, veri setleri ve deneysel koşullar arasında MT büyüme parametrelerinin standartlaştırılmış nicelendirilmesini mümkün kılan tam belgelenmiş, açık erişilebilir ve kullanıcı dostu bir analiz hattı sunarak bu önceki yaklaşımların üzerine inşa eder. Bu protokolde, MT dinamiği, MT sitoskeletinin acentrozomal MT ağları tarafından organize edildiği orta oogenezde görüntülenir. Büyüyen MT'ler, EB1-GFP (MT plus-end takip^{proteini 17,18}) kullanılarak görselleştirilir ve yüksek hızlı modda bir dizi dedektörüyle lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanılarak elde edilir. Yaklaşımımızın yeniliği, görüntü analizinde yatıyor: tamamen belgelenmiş, kullanıcı dostu, adım adım bir ürün hattı; kullanıcıların sadece ilgi duyduğu bölgeleri seçmesini gerektiriyor. Görüntü işleme ve niceliklendirme, özel Fiji makroları ve Python betikleri tarafından kolaylaştırılır; bu da EB1 kuyruklu yıldızlarının etkili, tekrarlanabilir tespitini ve büyüme yönelimi, hız ve mekansal organizasyon gibi parametrelerin çıkarılmasını sağlar. Bu çerçeve, deneysel koşullar arasında MT dinamiklerini karşılaştırmak için standartlaştırılmış ve erişilebilir bir araç sağlar.

Bu makalede, kontrol oositlerinde ve soğuk işlemle depolimerize edilmiş oositlerde MT büyümesini karşılaştırmak için bu yöntemi uygularız. Bu, hem protokolü doğrulamak hem de aday proteinlerin MT düzenlemesindeki rolünü incelemeye yönelik gelecekteki çalışmaları desteklemek için hizmet eder.

Protocol

1. Sinek genetiği

NOT: Oositteki MT'leri görselleştirmek için, bu protokol kamuya açık bir transgen (Materyal Tablosu) kullanır; bu işlem MT plus-end takip proteini EB1'i ifade eder ve GFP (Yeşil Floresan Protein)^{etiketi 19} ile etiketlenir. EB1-GFP özellikle büyüyen MT artı uçlarına bağlanır ve polimerizasyon yönünde hareket eden floresan "kuyruklu yıldızlar" olarak^{görünür 17,18}. Bu, yumurta^14,20 içindeki büyüme yönelimi, hız ve mekansal dağılımın dahil olmak üzere MT büyüme dinamiklerinin görselleştirilmesine ve nicelendirilmesine olanak tanır.

1. Tüm sinek türlerini standart mısır unu-agar ortamında standart Drosophila yetiştirme teknikleriyle 25 °C'de tutun.
2. İlgilenen bir proteinin ekspresiyonunu hedefleyen UAS-RNAi transgenini taşıyan 8–12 bakire dişi sineği, matα4-Gal4-VP16 genotipine ait 5 erkeğe çapla; EB1-GFP.
   NOT: Genetik çaprazlamaları basitleştirmek için, V32-Gal4 hattını (ikinci kromozoma yerleştirme) ile EB1-GFP hattını (üçüncü kromozomda yerleştirme) kesiştirerek bir sinek stok oluşturun. EB1-GFP bir UASp promotoru kontrolü altında olduğundan, V32-Gal4 sürücüsü EB1-GFP'nin ve istenirse sonraki çaprazlamalarda eklenen herhangi bir UAS-RNAi transgeninin ekspresyonunu indüke eder.
3. F1 yavruları (yavru) yumurtadan çıktıktan sonra, istenen genotipe sahip 10–15 dişi sinek (bir haftadan küçük) seçilin.
4. Dişileri, 2–3 erkekle birlikte, yiyeceğin yüzeyinde az miktarda maya macunu bulunan taze bir şişeye aktarın. Maya ezmesi, yumurta odası gelişimini teşvik eder ve yumurta odası gelişimini destekler. Erkeklerin varlığı çiftleşmeyi sağlar, bu da oositlerin olgunlaşmasını ve yumurta yumurtlamasını destekler. Sinekleri 2 gün boyunca 25 °C'de tutun.
   NOT: MT dinamiğindeki spesifik genlerin rolünü araştırmak için, UAS/GAL4 sistemi²¹ kullanılarak protein knockdown sağlanabilir; bu sistem kamuya açık olan maternal sürücü matα4-Gal4-VP16 (V32-Gal4 olarak da bilinir; Materyal Tablosu), bu da tohum hattında oogenezin 3–4 durumlarından Gal4 ekspresyonunu başlatır. Yukarıda açıklandığı gibi, bu sürücü EB1-GFP ve UAS-RNAi yapılarının ifadesini tetikler ve ilgilenilen proteinlerin ancak germaryum aşamasından sonra tükenmesini sağlar. Bu strateji, hedeflenen proteinlerin ilk mitotik bölünmeler ve oosit spesifikasyonu sırasında potansiyel erken işlevlerini atlar. Bu tür deneyler yapılırken, sinekler daha önce tarif edildiği gibi hazırlanmalıdır.

2. Yumurtalık diseksiyon

1. F1 dişileri standart bir sinek pedinde CO₂ kullanarak anestezi yapın ve bir dişi dişisini diseksiyon için seçin.
2. Seçilen dişiyi doğrudan 35 mm cam tabanlı bir kaba (0,13–0,15 mm cam kalınlığında) taşıyın ve sineğin üzerine bir damla görüntüleme yağı kondurun.
3. Sineği ventral yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırın (kanatlar aşağıya bakıyor). Bir çift cımbız kullanarak, alt göğsü cımbızla nazikçe tutun, ikinci bir cımbızla ise karın arka ucundan biraz karın kütikülünü sıkıştırın.
4. Üreme yolunu dikkatlice açıklıktan çıkararak nazikçe çıkarın.
5. Yumurtalıkları ve ardından bireysel yumurtalıkları cımbızla yağdan nazikçe kaydırarak izole edin. Yumurtalıkları manipüle ederken, görüntüleme için ilgi çekici olan daha hassas orta evrelere (6–9. evreler) zarar vermemek için her zaman eski yumurta odalarının (13–14. evreler) yanında tutun (Şekil 1A,B).
6. Yumurtalığın ön ucunu, germaryum ve erken evre yumurta odalarının bulunduğu yeri tutun (Şekil 1A,B). Yumurtalıkları ayırmak için yavaş ve sabit gerginlik uygulayın. Çektikçe, çeşitli gelişim aşamalarında yumurta odaları ortaya çıkar. Bu işlem, ek yumurtalıklar²² izole etmek için her yumurtalık başına birkaç kez tekrarlanabilir (gösteri için videoya bakınız).
   NOT: MT'yi depolimerize etmek için soğuk tedaviye tabi tutulan oositlerde, daha önce tarif edildiği gibi diseksiyon yapıldı, ancak görüntüleme yağı yerine BRB-80 tamponu kullanıldı. Diseksiyon edilen yumurtalıklar daha sonra BRB-80 içeren mikrotüplere aktarıldı ve 15 dakika²³ buzun buzun üzerinde kuluçka halinde tutuldu. İnkubasyondan sonra, yumurtalıklar görüntüleme yağı ile cam tabanlı bir kaba aktarıldı ve protokol 3.1. adımdan devam ettirildi.

3. Canlı görüntüleme

1. Cam taban tabağını, uygun sürgü tutucusunu kullanarak mikroskop aşamasına yerleştirin.
2. Görüntüleme için 7 veya 8. aşama yumurta odalarını seçin.
   NOT: Bu aşamalardaki yumurta odaları, oosit boyutu ve nükleer konumuna göre tanımlanabilir. Oosit, bireysel hemşire hücrelerinden açıkça daha büyüktür ve yumurta odasının yaklaşık üçte birini (7. aşama) ila yarısını (8. aşama) kaplar. Oosit çekirdeği, oositin ön korteksinde, hemşire^{hücrelerine (24}) bitişiktir konumlanmıştır.
3. Dış folikül hücre tabakasında süreklilik veya forsepsin neden olduğu mekanik bozulmaya işaret olabilecek diğer hasar belirtileri gösteren yumurta odalarını görüntülemeden kaçının. En iyi görüntü kalitesi için, yüksek sinyal-gürültü oranına (SNR) sahip hızlı bir konfokal görüntüleme sistemi ve 63x objektif (1.40 NA, yağ daldırma) kullanın. Nyquist-Shannon örnekleme kriterlerini takip ettiğinden emin olun.
4. Odaklığı ayarlayın ve uygun poziyeti belirleyin; çünkü kullanılan EB1 yapısına (örneğin, farklı promotorlar veya floresan etiketler) ve mikroskop sistemine bağlı olarak değişebilir. Sinyal, kuyruklu yıldız dinamiklerini takip edecek kadar parlak olmalı, ancak arka plan floresansı tarafından doygun veya gizlenmemelidir.
5. 488 nm lazeri GFP floroforunu uyaracak şekilde ayarlayın (%10 lazer gücü; dedektör kazancı = 750 V). GFP floroförü için uygun bir emisyon penceresi veya eşdeğer 500–550 nm emisyon penceresi seçin.
6. En az 4 dakika süren zaman geçişli filmler alın, 500 ms (2 kare/s) kare aralığı kullanarak bireysel MT plus uçlarını takip etmek için yeterli veri elde edin. (Ek Video 1, sonraki MT takip analizi için uygun temsilli bir zaman geçişi kaydını gösterir).
7. Elde edilen görüntüleri, mikroskop edinim yazılımında dizi detektör işlemcisi kullanılarak varsayılan işlem filtresi gücüne sahip işlen.
   NOT: Görüntüleme yağına batırıldıktan sonra, diseksiyon edilen yumurtalıklar 90 dakikaya kadar canlı kalır. Bu dönemde, yumurta odaları önemli dejenerasyon belirtileri olmadan görüntülenebilir. Bu dönemden sonra yeni bir dişi disseksiye edilmeli ve taze yumurta odaları görüntüleme^{için hazırlanmalıdır 20}.

4. Görüntü İşleme

MT dinamikleriyle ilişkili çeşitli parametreleri nicelikten ölçemek için grafikler ve istatistikler oluşturmak için aşağıdaki iş akışını gerçekleştirin. Her adımı ya makro/script üzerinden otomatik olarak ya da protokolü takip ederek manuel olarak yürütün (Şekil 2). Bu iş akışında kullanılan tüm Fiji makroları, takip betikleri ve Python analiz kodu, Ek Kodlama Dosyaları 1–7 olarak sağlanmıştır.

1. Görüntü ön işleme - ADIM 1
   Aşağıdaki adımlar, foto ağartmayı düzelterek ve arka plan gürültüsünü azaltarak ham zaman geçişli görüntüleri hazırlayarak takip için sinyal kararlılığını sağlar. İlk olarak, EB1 görünürlüğü, uzamsal bant geçiş filtresi olarak işlev gören Gaussyen Farkı (DoG) filtresi kullanılarak artırılır. Hafif bulanıklaştırılmış bir görüntüden ağır bulanık bir görüntü çıkararak, bu süreç düşük frekanslı sitoplazmik sis ve yüksek frekanslı piksel gürültüsünü bastırırken, EB1 kuyruklu yıldızlarının difraksiyon sınırlı sinyalini izole eder. İkinci olarak, özellikle büyüyen MT uçlarını güçlendirmek için zamansal gradyan filtresi uygulanır. Görüntü yığını, zamansal boyutu mekânsal Y eksenine eşlemek için yeniden dilimlenir. Daha sonra [-1 0 1] çekirdeği ile 1D bir dönüşüm uygulanır ve her piksel için zamansal türev hesaplanır; hareketli kuyruklu yıldızların ön kenarı en hızlı artan yoğunluğun olduğu yer vurgulanır. Yığın daha sonra orijinal boyutlarına geri dilimlenir, bileşik bir görüntüye birleştirilir ve analiz için dışa aktarılır.
   NOT: Bu adım, bir klasördeki tüm dosyalar için makro dosyasını File1.Step1_MTs_macro.ijm (Ek Kodlama Dosyası 1) Fiji'ye girdi ve makroyu çalıştırdı.
   1. Ön koşul eklenti kurulumu (Tek seferlik kurulum)
      1. Fiji'yi başlatın. Menü çubuğunda Eklentiler > Kurulum'a gidin.
      2. Dosya tarayıcısında, bu protokolle sağlanan File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Ek Kodlama Dosyası 7) dosyasını seçin.
      3. Eklentiyi kaydetmeniz istendiğinde, hedefin Fiji kurulum dizininizdeki varsayılan eklentiler klasörü olduğundan emin olun ve Kaydet'e tıklayın.
      4. Fiji'yi yeniden başlatarak kurulumu tamamla.
         NOT: Bu derlenmiş eklenti versiyonu, Fiji'nin yerleşik sürümüyle aynıdır, ancak ayrı bir Java Geliştirme Kiti (JDK) kurulumu gerekliliğini ortadan kaldırarak kurulum sürecini kolaylaştırır.
   2. Çamaşır suyu düzeltme ve denoizasyon:
      1. Fiji'yi açın, ardından her dosyayı Bio-Formats importer eklentisi ile açın
      2. Zaman içinde floresans bozulmasını Bleach Correction eklentisini çalıştırarak Simple-Ratio çamaşır suyu düzeltmesini (arka plan = 0) kullanarak telafi edin.
      3. Kalman Stack Filter Compiled (acquisition_noise = 0.1; bias = 0.7) çalıştırarak rastgele foton gürültüsünü bastırır ve gerçek sinyal dinamiklerini zaman içinde koruyorlar
      4. İsterseniz, işlem süresini azaltmak için ortaya çıkan görüntü zaman boyutunu kırpın.
         NOT: Bu adımlar, daha sonra 1. adımın sonunda (4.1.5) kanal 1 olarak görünen bir sesli görüntü üretir (Şekil 3A). İlk 5 ila 10 kareyi (zaman noktalarını) hariç tutmak önerilir, çünkü Kalman filtresinin dönen penceresi bu ilk kareleri yalnızca kısmen filtreler.
   3. Gaussların (DoG) özellik geliştirme farkı:
      1. 4.1.2.4'ten olan görüntüyü iki kez çoğaltın (Resme sağ tıklayın ve Duplicate'a tıklayın).
      2. Gauss Bulanıklık Eklentisi'ni düşük sigma kullanarak bir kopyaya uygulayın (σ = 1).
      3. Gauss bulanıklık eklentisini diğer kopyaya yüksek sigma (σ = 8) kullanarak uygulayın.
      4. Eklenti Görüntü Hesaplayıcısını açın ve ince detayları izole etmek için yüksek sigma görüntüsünü düşük sigma görüntüden (= Düşük – Yüksek) çıkarın.
      5. Fiji'nin Math > Subtract yöntemini kullanarak arka planı kaldırın ve gerektiğinde sadece gerçek sinyali koruyacak bir değer seçin (DoG eşiği = 100).
         NOT: Bu adımlar, daha sonra 1. adımın sonunda (4.1.5) kanal 2 olarak görünen bir Gauss farkı görüntüsü üretir (Şekil 3B).
   4. EB1-GFP sinyal geliştirme:
      1. 4.1.2.4'ten görüntüyü seçin ve Reslice eklentisini kullanarak ayarlar: top, Ara Yok.
      2. MT ipuçlarını geliştirmek için çekirdekli Convolve 2D eklentisini [–1 0 1] kullanın.
      3. Reslice eklentisini aynı ayarlarla tekrar kullanarak orijinal görüntü boyutlarını geri kazandırın.
      4. NOT: Bu adımlar, geliştirilmiş EB1-GFP sinyaliyle bir görüntü üretecektir. Bu görüntü daha sonra 1. adımın sonunda (4.1.5) kanal 3 olarak görünecektir (Şekil 3C).
      5. Kanalları birleştir ve görüntüyü dışa aktar:
         1. MT EB1-GFP görüntüsü (4.1.2.4) ile Difference of Gaussians görüntüsü (4.1.3.5) ve EB1-GFP sinyal geliştirme görgesi (4.1.4.3) Merge Channels eklentisini kullanarak birleştirin. Birleştirme sürecinde daha fazla analiz için kullanılacak görüntünün Kanal 3'te yer aldığından emin olun.
         2. Ortaya çıkan dosyayı .tif dosyası olarak, adlandırma formatını kullanarak kaydedin: "filename"_processed.tif. Aşağı akış analizi için kullanılan görüntünün _processed.tif ile bittiğinden emin olun
2. İlgi Alanları (ROI) - ADIM 2
   Bu adımda, oositin anteroposterior ekseni boyunca üç ROI tanımlanacaktır: ön (ROI1), orta (ROI2) ve arka (ROI3). Bu mekansal segmentasyonu uygulayarak oositin farklı bölgelerinde MT dinamiklerinin analizini mümkün kılın.
   NOT: Bu Adım 2, her "dosya adı" için_processed.tif makro dosyasını File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Ek Kodlama Dosyası 2) Fiji'ye sürükleyip Çalıştır tuşuna basarak çalıştırılabilir. Makro, kullanıcıya yumurtada manuel olarak bir dikdörtgen çizmesini ister. Çokgenin başlangıcına (ilk tıklama) en yakın bölge, ilk yatırım getirisine karşılık gelir. Seçilen dikdörtgen bölge otomatik olarak eşit dikdörtgen yatırım getirisi oranlarına bölünür. Eğer hiçbir yatırım getirisi kaydedilmezse, sonraki adımlar tam görüntüde yayınlanır.
   1. Yatırım getirisi (ROI) Tanımı:
      1. Hedef dosyayı Eklentiler → Bio-Formatlar → Bio-Formats Importer ile açın.
      2. Poligon aracını kullanarak istediğiniz bölgeyi kapsayan bir ilgi alanı çizebilirsiniz.
      3. Seçilen bölgeyi ROI Yöneticisi'ne ekleyin (T tuşuna basın).
      4. 4.2.1 adımını tekrar edin, ihtiyacınız olan yatırım getirisi sayısını belirtin.
   2. Ölçü ve ihracat alanı:
      1. İlk yatırım getirisini seçin
      2. Analyze → Measure'ı çalıştırın ve Area değerini "filename" adlı bir dosya olarak kaydedin_processed_RoiArea.csv
         NOT: Dosya adı orijinal görsel adıyla eşleşmeli ve şu şekilde bitmelidir: _processed_RoiArea.csv
      3. ROI Yöneticisi'ni kullanarak ROI'ları kaydedin. Aynı dosya adını kullan. tek bir ROI için ROI uzantısı veya birden fazla ROI için .zip uzantısı.
3. EB1-GFP kuyruklu yıldızlarını tespit etme ve takip etme - ADIM 3
   EB1-GFP kuyruklu yıldızlarını tespit etmek ve zaman içindeki hareketlerini takip etmek için TrackMate^{eklentisi 25'i} kullanın.
   NOT: STEP 3 her "dosya adına" uygulanabilir_processed.tif makro dosyası File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Ek Kodlama Dosyası 3) Fiji'ye sürüklenip RUN tuşuna basılır. Sonra işlenecek bir klasör seçin. Yatırım getirisi otomatik olarak yüklenir ve analiz her dosya için yapılır, karşılık gelen spot ve track çıktıları üretilir. Toplu işlemeden önce, varsayılan dedektör ve takip cihazının kuyruklu yıldızların boyutu ve dinamiklerine uygun olup olmadığını görsel olarak doğrulamak için 2–3 temsilci görüntünün analiz edilmesi önerilir. Ayarlar uygunsa, kullanıcı ilgili parametreleri ayarlayarak EB1 uçlarını doğru şekilde takip edebilir, böylece yanlış negatif ve yanlış pozitifleri en aza indirebilir.
   1. Hedef dosyayı Eklentiler → Bio-Formatlar → Bio-Formats Importer ile açın
   2. TrackMate eklentisini açın. T ve Z değişimi istenirse EVET seçeneğini seç.
   3. Log Detector'ı seçin. Parçacık çapını 0.5 μm'ye ayarlayın (gerekirse ayarlayın)
   4. Kalite eşiğini 30'a ayarlayın (gerekirse ayarlayın). Hem Alt piksel lokalizasyonunu hem de Ön İşlemi medyan filtreyle etkinleştirin.
   5. Ek nokta filtrelerini kaldırın. Kalman Takip Yöntemini seçin
   6. Başlangıç arama yarıçapını 0.5, arama yarıçapını 0.7 ve maksimum kare boşluğunu 2 olarak ayarlayın (gerekirse ayarlayın - İlk arama yarıçapı takip cihazını tohumlar, arama yarıçapı bir noktanın kareler arasında ne kadar hareket edebileceğini kontrol eder ve maksimum kare boşluğu yörüngede kısa süreli kayboluşlara izin verir).
   7. Ortaya çıkacak parça filtrelemesini atlayın. Parça tamamlandıktan sonra Spots → Export to CSV'ye gidin ve dosyaya "filename" adını verin_ROI01_spots.csv
   8. NOT: Dosya isimlendirmesi, analiz edilen yatırım getirisi sayısını yansıtmalıdır. Birden fazla ROI kullanılıyorsa, her çıkış dosyasını _ROI01, _ROI02 gibi karşılık gelen bir tanımlayıcıyla birlikte kaydedin.
4. Veri görselleştirme ve nicel analiz - ADIM 4
   İzleme verilerini işlemek ve kuyruklu yıldız sayısı, hız, ömür, açısal tutarlılık ve yön gibi temel parametreleri hesaplamak için Python betiklerini kullanın. Bu betikler, MT dinamiklerinin nicel analizini desteklemek için özet tablolar (CSV dosyaları), grafikler ve istatistiksel analizler üretir (Şekil 4).
   1. Yazılım ortamı kurulumu:
      1. Python (3.12) dağıtımını kurun. Aşağıdaki harici Python kütüphanelerinin kurulduğundan emin olun ( pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook vasiyeti üzerinden): Pandas ve NumPy (veri yapısı işleme ve sayısal hesaplama için), SciPy ve Statsmodels (özellikle scipy.stats, dairesel istatistikler ve hipotez testi için), Matplotlib ve Seaborn (gül grafikleri ve istatistiksel çubuk grafikler üretmek için), IPython (defter içindeki görüntüleme araçları için), Jupyter Notebook (defterin kullanımı için).
      2. Özel analiz modüllerini (File_5_MTModule1.py ve File_6_MTModule2.py – Ek Kodlama Dosyaları 5 ve 6) analiz defterinin yanında kök dizine yerleştirin (Dosya 4_Step4_MTs_results.ipynb – Ek Kodlama Dosyası 4).
      3. Python terminalinde "jupyter notebook" komutunu çalıştırarak Jupyter notebook'u açın ve File 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4 notebook'u yükleyin.
   2. Giriş verileri ve parametre tanımı:
      1. Biyolojik replikasyonları deneysel meta verileriyle eşlemek için veritabanını doldurun.
      2. Her deney için şunları belirtin: Temel Adı: Dosya adlarında bulunan benzersiz tanımlayıcı dizisi, Durum: Deneysel grup (ör, "Kontrol", "Tedavi edilmiş"), Düzeltme Açısı: Yatırım getirisi ile biyolojik eksenle hizalanmak için gereken açı (örneğin, Ön = 0°).
      3. Parametreleri ayarlayın: görüntü formatı ve dpi'yi dışa aktarın, renk çizim yapın ve açısal hesaplamalar için varsayılan bin boyutunu
      4. Veri filtreleme parametrelerini kısa parçalar hariç tutacak şekilde ayarlayın: Minimum Pist Uzunluğu: bu süreden kısa parçalar atılır
   3. Analiz boru hattının yürütülmesi:
      1. Ham takip verisini işlemek için tüm kod hücrelerini okuyun ve çalıştırın. Script, veritabanı listesinde şu prosedürel adımları yerine getirmek için yineleme yapar:
         1. Her Temel Ada bağlı tüm ROI'ye özgü CSV dosyalarını tanımlayın.
         2. Minimum uzunluğa göre filtre izleri (sadece 3 kareden fazla sürede devam eden yörüngeler tutulur), anlık hızları hesaplar, toplam yer değiştirmeyi hesaplar ve referans açısı düzeltmesini tüm yörüngelere uygular.
         3. Kuyruklu yıldız sayısını, meta veriden yüklenen ROI alanına göre normalleştirerek kuyruklu yıldız yoğunluğunu hesaplayın.
      2. İşlenen verileri bir ana veri setine (df_all) toplayın ve her yatırım getirisi için genel özet istatistikleri (ortalama hız, pist süresi ve açısal tutarlılık vektör uzunluğu) hesaplayın.
      3. make_combined_rose_panel fonksiyonunu çalıştırarak gruplanmış gül alanları oluşturun. Bu, her deneysel koşulda tüm ROI'lar için açısal dağılımların yan yana bir panel karşılaştırmasını sağlar. Skaler metrikler için çubuk grafikler oluşturmak amacıyla create_comprehensive_analysis_plots_enhanced çalıştırın.
      4. Belirli yönelim analizini yapmak için run_angle_analysis_pipeline fonksiyonunu çalıştırın:
         1. Parçaları iki stratejiyle yönlendirme kutularına sınıflandırın: Kardinal Binning (90° genişliğinde 4 kutu: Kuzey/Ön, Doğu/Sağ, Güney/Geri, Batı/Sol) ve Anterior/Posterior Binning (2 bin, 180° Anterior vs. Posterior).
         2. Her bir yumurta başına tanımlanmış her yönde hareket eden izlerin yüzdesini hesaplayın.
   4. İstatistiksel analiz ve çıktı üretimi:
      1. Tanımlanmış skaler metrikler üzerinden yineleme yapın: Alan başına kare başına ortalama kuyruklu yıldız sayısı, ortalama kuyruklu yıldız takip süresi ve ortalama kuyruklu yıldız hızı. Her metrik için şunları yapar:
         1. Deneysel koşullar arasında bağımsız karşılaştırmalar için Kruskal-Wallis veya Mann-Whitney U testleri yapılabilir.
         2. Yatırım getirisi oranları arasında tutarlılığı değerlendirmek için Friedman veya Wilcoxon testleri yapın.
         3. Her yatırım getirisi içinde yönelim tercihlerini (örneğin, Kuzey ve Güney) değerlendirmek için Friedman ve Wilcoxon İmzalı Rütbe testleri ( Pratt yöntemi kullanılarak) gerçekleştirilir.
         4. Aşağıdaki sonuçları Sonuçlar dizinine aktarın: Özet CSV'ler (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), İstatistiksel Raporlar (örneğin, Ortalama kuyruklu yıldız velocity_mwu.csv) ve Grafikler (yüksek çözünürlüklü PNG dosyaları).
            NOT: Adım 4 yalnızca Python'da yürütülebilir. File_4_Step4_MTs_results.ipynb dosyasını açın ve tüm hücreleri okuyun ve çalıştırın. Her hücre, yürütme talimatları ve ilgili beklenen sonuç içerir.

5. İstatistiksel analiz:

NOT: İzleme verilerinin Gauss dışı dağılımı nedeniyle, tüm karşılaştırmalar için parametrik olmayan istatistiksel testler kullanılmıştır.

1. Deneysel koşullar arasındaki bağımsız farkları (örneğin, Kontrol ve Tedavi Edilen) Mann-Whitney U testi (iki grup için) veya Kruskal-Wallis testi ile değerlendirin, ardından >2 grup için) sonradan çiftli Mann-Whitney karşılaştırmaları yapılacaktır.
2. Aynı yatırım getirisi içindeki yönelimsel tercihleri Friedman testi (küresel fark) ve ardından Wilcoxon İmzalı Sıralama testi (çift olarak) kullanarak değerlendirin.
3. Sıfır farklı berakları Pratt yöntemiyle yönetin.
4. İkili karşılaştırmaları düzeltilmemiş p-değerleri olarak raporlayın, böylece istatistiksel güç korunur. Hem ham hem de düzeltilmiş p-değerleri bildirmek için sunulan betikleri kullanın; anlamlılık 0.05 olarak belirlenmiştir. Tüm özet istatistikleri Ortalama ± Standart Hata (SEM) olarak bildirin, aksi belirtilmedikçe).

Results

Bu protokol, Drosophila melanogaster oositlerinde MT büyüme dinamikleri ve polaritesini oogenezin orta aşamalarında başarıyla analiz etmek için EB1-GFP kullanarak, aktif MT polimerizasyon ^17,18 noktalarını işaretleyen artı uç takip proteini olarak kullanılmıştır. Lazer taramalı konfokal mikroskopiyle görüntülendiğinde, EB1-GFP parlak, noktalı "kuyruklu yıldızlar" olarak görünür ve MT büyüme^17,18 yönünde hareket eder (Şekil 3A; Ek Video 1). Bu kuyruklu yıldızların izlenmesi ve nicelendirilmesi, oositteki MT çekirdeklenmesi, uzaması ve organizasyonunun hassas şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bu iş akışı protokolü kullanılarak, kontrol oositlerinde ve MT ağının deneysel bozulmasına maruz kalan oositlerde MT dinamikleri değerlendirildi. Özellikle, EB1 kuyruklu yıldız davranışı üç durumda karşılaştırıldı: tedavi edilmemiş kontrol oositleri, soğuk tedavi edilen kontrol oositleri ve soğuk muamele ile tedavi edilen heterozigot patronin mutant^{oositler 12,26}. Soğuk tedavi, MT depolimerizasyonunu indükler ve iyileşme sırasında MT yeniden büyümesinin değerlendirilmesini sağlar. Heterozigot patronin mutantı (+/patr⁰⁵²⁵²) oositler, bozulmuş MT dinamikleri için pozitif kontrol olarak dahil edilmiştir. Patronin, korunmuş bir MT eksi uç stabilizatörü²⁷ ve^{oositlerde 12} ve diğer dokularda ncMTOC'ların temel^{bileşenidir 2}. Önceki çalışmalar, MT depolimerizasyonuna maruz kalan patronin mutantlarının yeniden büyüme¹² sonrası EB1 kuyruklu yıldız sayısında anlamlı bir azalma gösterdiğini göstermiştir. Böylece, heterozigot patronin mutantlarının dahil edilmesi, yöntemin bilinen MT-yeniden büyüme kusurlu arka plana karşı doğrulanmasına olanak sağladı. 7-8. evre oositler, centrozomlar zayıflatıldığında ve MT'ler asentrozomal yollar aracılığıyla üretildiğinde görüntülendi.

Önceki gözlemlerle uyumlu olarak, EB1 kuyruklu yıldızlarının en yüksek yoğunluğu oositin ön bölgesinde tespit edildi ve arka^14,15 yönünde kademeli bir azalma yaşandı (Şekil 5B; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2). Gerçek MT polimerizasyon olayları ile sabit veya düzlem dışı sinyaller arasında ayrım yapmak için, bu protokol tespit edilen EB1-GFP odaklarının toplam sayısını hareketli olan odak alt kümesi arasında ayrım yapar. Hareketsiz kesim muhtemelen ağırlıklı olarak eksenel düzlemde hareket eden sabit kuyruklu yıldızları veya kuyruklu yıldızları temsil eder (Şekil 5A,B). MT iz uzunluğu ve büyüme hızının analizleri, sabit sinyallerin veya eksenel hareketlerin yer almasını önlemek için yalnızca mobil EB1-GFP kuyruklu yıldızları üzerinde yapıldı; bu da yol uzunluğu ve hızının tahminini engelleyebilecek aksinel hareketlerin dahil edilmesini sağladı. Toplam EB1-GFP odakları ve hareketli fraksiyon, genel algılama ile dinamik davranış arasında doğrudan karşılaştırma yapılmasına olanak sağlamak için ayrı grafiklerde sunulur (Şekil 5A,B). Kontrol oositlerinde, protokol ön bölgede 0.189 ± 0.02 SEM EB1 hareketli kuyruklu yıldız/^{μm 2} (18.9 EB1 kuyruklu yıldız/100^{μm 2}) ölçümledi; ardından orta ve arka bölgelerde 0.064 ± 0.02 SEM ve 0.043 ± 0.01 SEM EB1 hareketli kuyruklu yıldız/μm² (6.4 ve 4.3 EB1 kuyruklu yıldız/100^{μm 2}) (Şekil 5B; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2). Aynı gelişim aşamasında EB1 kuyruklu yıldızlarını ölçen önceki²⁸ çalışma, hareketli EB1-GFP kuyruklu yıldızları için burada tespit edilen değerlerden daha yüksektir; bu da 100μm² için 48,54 EB1 kuyruklu yıldızı tespit edilmiştir. Ancak, ölçülen değerler, tespit edilen toplam EB1-GFP kuyruklu yıldız sayısı dikkate alındığında tutarlıdır (Şekil 5A; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2). O çalışmanın Malzemeler ve Yöntemler bölümü, oositlerin görüntülenmesi için kaç z-yığının kullanıldığını belirtmemektedir. Bu nedenle, analizde birden fazla z-yığının dahil edilmiş olması ve bunun tespit edilen EB1-GFP kuyruklu yıldızlarının sayısının artmasına katkıda bulunmuş olabileceği mümkündür. Bildirilen değerleri etkileyebilecek bir diğer faktör ise, kuyruklu yıldız nicelesi için seçilen oosit bölgesidir. İlgi çekici bölgeler, EB1 kuyruklu yıldız yoğunluğunun en yüksek olduğu en ön kutbuna daha yakın seçilseydi, burada sunulan ölçümlere kıyasla ortalama kuyruklu yıldız yoğunluğunu artırabilirdi. Buna rağmen, burada elde edilen sonuçlar aynı büyüklük mertebesinde olup, daha önce bildirildiği gibi EB1 kuyruklu yıldız yoğunluğunun arka bölgeye doğru azalmasını^{tutarlı şekilde yansıtmaktadır 14,15}.

Soğuk kaynaklı MT yeniden büyümesinin ardından, kontrol oositlerinde EB1 kuyruklu yıldız sayısı tedavi edilmemiş kontrollerle karşılaştırılabilir oldu ve bu da güçlü MT iyileşmesini gösterdi. Buna karşılık, önceki^{raporlarla uyumlu olarak,} patronin mutantları ön bölgede hareketli EB1 kuyruklu yıldızlarının sayısında (ROI1) her iki kontrole kıyasla anlamlı bir azalma gösterdi (Şekil 5B; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2). Orta ve arka bölgelerdeki kuyruklu yıldız sayıları (ROI 2 ve 3) de daha düşük eğilimli olsa da, bu farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (Şekil 5B). Burada gözlemlenen azalma, nokodazol bazlı testlerde^{bildirilen 12} testlere göre daha az belirgindir. Bu muhtemelen sadece bir allelin mutasyona uğradığı heterozigot patronin mutantlarının kullanımını yansıtır. Ayrıca, soğuk kaynaklı depolimerizasyon protokolü tüm MT'leri tamamen depolimerize etmeyebilir ve buzdan uzaklaştırma ile görüntüleme arasındaki 5–15 dakikalık aralık, veri toplamadan önce MT çekirdeklenmesi ve yeniden büyümesine olanak tanır. Buna karşılık, nokodazol bazlı testler, kolsemid inaktivasyonu anında UV lazer¹² mikroskopu kullanılarak yapılır. Buna rağmen, bu sonuçlar bu protokolün MT organizasyonunda biyolojik olarak ilgili, bölgeye özgü değişiklikleri tespit edebildiğini göstermektedir. Ayrıca, ncMTOC'ların ve oositin önündeki temel bir ncMTOC bileşeni olan Patroninin zenginleşmesiyle de uyumludur. Orta ve arka bölgelerdeki kuyruklu yıldız sayılarındaki zayıf azalma, bu evrelerde ncMTOC ve Patronin'in arka korteksten gelişimsel olarak dışlanmasını^{da yansıtabilir. 12}.

Kontrol oositlerindeki EB1 iz uzunluğunun analizi, oositin ön bölgesinde daha uzun kuyruklu yıldız izleri (0.613 μm ± 0.04 SEM) ve orta ve arka bölgelerde daha kısa kuyruklu yıldızlar (sırasıyla 0.463 μm ± 0.04 SEM ve 0.488 μm ± 0.05 SEM) ortaya çıktı (Şekil 5C; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2). Bu bulgu, arka kutupta MT'lerin ön kutupa göre daha kısa süreler kaldığını gösteren önceki verilerle tutarlıdır ve arka kutuptaki MT'lerin^{daha kısa olduğunu öne sürmektedir 14}. Soğuk tedavi edilen heterozigot patronin mutant oositlerde, ön ve arka bölgelerde EB1 kuyruklu yıldız uzunluğu, soğuk tedavi edilen kontrollere kıyasla anlamlı şekilde azalmıştır. Orta bölgede de benzer istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir eğilim gözlemlenmiştir (Şekil 5C; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2), MT stabilitesinde kısmi bir azalma önermektedir. Bir arada, bu sonuçlar Patronin'in eksi-end MT stabilizatörü olarak bilinen rolünü destekler ve Drosophila kültürlü hücrelerdeki önceki gözlemlerle tutarlıdır; burada Patronin kaybı daha kısa MT iğnelerine yol^{açmaktadır 12,27}. Bu bulgular, bu protokolün MT dinamiklerinde ince ama biyolojik olarak anlamlı bozulmaları tespit etmedeki hassasiyetini de vurgulamaktadır.

Kontrol oositlerinde EB1 kuyruklu yıldız hızı ölçülürken, analiz, ön, orta ve arka bölgelerde ortalama hızlar sırasıyla 0,208 ± 0,01 μm/s, 0,207 ± 0,01 μm/sek ve 0,202 ± 0,01 μm/s olarak tespit edildi (Şekil 5D; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2), bu da önceki çalışmalar^14,15 ile tutarlıdır. Kontrol oositler, ön bölgeden arka bölgeye doğru MT büyüme hızında hafif bir azalma gösterdi. Bu, ncMTOC'ların ve potansiyel olarak tanımlanamayan diğer mikrotübul ilişkili proteinlerin (MAP'ler) antero-lateral bölgelerde zenginleşmesini yansıtabilir; bu proteinler MT büyümesini ve yayılmasını kolaylaştırır ve böylece gözlemlenen posterior azalmaya katkıda bulunur. Soğuk tedavi edilen oositlerde, patronin heterozigot mutantlar, kontrol gruplarına kıyasla MT büyüme hızında hafif bir azalma yönünde, istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir eğilim gösterdi, ancak bu fark istatistiksel anlamlılığa ulaşmadı (Şekil 5D; Tablo 1; Ek Tablolar 1 ve 2). Bu bulgu, patronin mutantlarını ifade eden Drosophila sinir kök hücrelerinde yapılan önceki gözlemlerle^{tutarlıdır 29}.

ncMTOC'ların oositin antero-lateral bölgesinde lokalizasyonu ve arka bölgeden dışlanması sonucunda çoğu MTOC'nin eksi uçları antero-lateral kortekste sabitlenmiş şekilde yetiştirilmesine yol açar. Sonuç olarak, oosit içinde antero-posterior bir RT gradyanı oluşur ve mütevazı bir yön yanlılığı vardır: MT'lerin %60'ı arka tarafa doğru, %40'ı ise ön^14'e doğru büyür. Protokolümüz, kontrol oositlerindeki bu yanlılığı oositin tüm bölgelerinde başarıyla tespit etti (Şekil 5E). MT yönelimindeki yanlılık daha belirgin şekilde arka bölgede daha belirgindi, daha önce^{bildirildiği gibi 14}. Özellikle, bu arka yön yanlılığı zenginleşmesi, kontrol ve heterozigot patronin mutant oositlerde soğuk tedavi sonrası kaybolmuştur (Şekil 5E,F). Soğuk tedavi edilen kontrol oositlerinde, MT yönelimi tüm bölgelerde öne yönelme büyümeye kaymıştır. Bu kayma, ön ve orta bölgelerde bir eğilim olarak ortaya çıktı ve arka bölgede istatistiksel olarak anlamlı hale geldi (Şekil 5F). Arka tarafa yönelik bu eğilim kaybının olası bir açıklaması, soğuk tedavi koşullarında, yeni polimerize olmuş MT'lerin motor proteinler gibi MT stabilizasyonunu ve/veya çapraz bağlamayı destekleyen MAP'lerle ilişki kurması için zaman gerektirebileceğidir. Bu faktörlerin gecikmeli işe alınması, arka yönlü MT'lerin pekiştirilmesini bozabilir. Özetle, bu protokol oositler içindeki MT büyümesi, uzunluğu, hızı ve yöneliminin hassas ve nicel analizini sağlar. Önceki çalışmalarla uyumlu olarak, MT dinamiklerinde bölgeye özgel, biyolojik olarak anlamlı değişiklikleri güvenilir şekilde tespit eder ve heterozigot patronin mutantlarında yapılan gözlemlerle gösterildiği gibi, MT davranışındaki ince farklılıkları çözme hassasiyeti gösterir.

Şekil 1: Drosophila melanogaster oojenezisi (A) Drosophila yumurtalığında oogenesis'in genel görünümü. Her yumurtalıkta 12–16 yumurtalık bulunur ve bunlar yumurta üretim hattı olarak işlev görür. Oogenesis, germaryumda başlar; burada 2–3 germ kök hücresi asimetrik olarak bölünür ve bir kök hücre ile bir kız hücre oluşur ve farklılaşmaya başlar. Bu hücreler, halka kanallarıyla birbirine bağlı 16 hücreli bir kist oluşturmak için 4 mitotik bölünme geçirir. Bu hücrelerden biri oosit olurken, diğerleri hamiye hücresi olarak hizmet eder ve oositlerin büyümesini ve gelişimini destekler, arka uçta 14. evre bir oosite ulaşır. (B) 9. aşama Drosophila yumurta odasının şeması. MT'ler, antero-lateral kortekste lokalize olan ve^{oositin 12'nin} arka tarafından dışlanan ncMTOC'lardan üretilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protokol iş akışı diyagramı. Yumurtalık diseksiyon ve canlı görüntülemeden kuyruklu yıldız takibi ve nicel analizlere ana adımların genel bakışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 7–8. aşama oositlerin işlenmesiyle oluşturulan temsil görüntüler. (A-E) Kontrol soğuktan tedavi görmüş ve heterozigot patronin^{05252 soğuk muamele edilen 05252} oositlerden alınan 7–8. aşama oositlere uygulanan görüntü işleme iş akışını gösteren temsil edici görüntüler. Kanallar, 150 karelik zaman geçişli bir filmden maksimum 2 kare projeksiyondan alınan ve kare başına 0,5 saniye ile elde edilen temsil eden bir görüntüdür. (A) Kanal 1, ilgili görüntülenen oositten ses kalitesi almış bir görüntünün oluşturulmasına karşılık gelir. (B) Kanal 2, Gauss görüntüsünün farkının oluşturulmasına karşılık gelir. (C) EB1-GFP kuyruklu yıldızlarının sinyalinin kuyruklu yıldızların uçlarını göstermek için güçlendirildiği bir görüntünün oluşturulmasına karşılık gelen Kanal 3. (D) Kanal 2 ve 3'ün birleşmesi, kanal 2'nin işlenmesiyle ortaya çıkan kuyruklu yıldız uçlarının görselleştirilmesine yardımcı olur. (E) MT dinamiklerini göstermek için Temporal Color kodu eklentisi kullanılarak FIJI'deki zaman geçişli C noktasından oluşturulan EB1-GFP kuyruklu yıldız yörüngeleri. Renk kodu, 20 kare için zaman projeksiyonunu gösterir (kareler arasında 0.50 saniye). Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: STEP 4 Jupyter Notebook'ta bir bölümün ekran görüntüsü. Defter, kendi kendini açıklayan talimatlar sunan Markdown hücreleriyle yapılandırılmıştır; ardından gerçek zamanlı sonuçlar ve loglar veren kod hücreleri gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: EB1-GFP kuyruklu yıldız dinamiklerinin kontrol ve soğuk işlenmiş 7-8. aşama oositlerde analizi. Veriler, kontrol soğukla tedavi edilen ve patronin⁰⁵²⁵² soğuk tedavi edilen oositler için ortalama ± ROI başına SEM (ROI1–ROI3) anlamına gelir. EB1-GFP kuyruklu yıldız ölçümleri, FIJI'de işlenen zaman geçişli görüntülerden elde edildi; aksi belirtilmedikçe, analizler Channel 3'te işlenen görüntüler üzerinde yapılmıştır. Toplam EB1-GFP kuyruklu yıldız sayısı Kanal 2 görüntülerinden (DoG Görüntüsü) analiz edildi. İstatistiksel anlamlılık Kruskal–Wallis testi ve ardından Mann–Whitney post-hoc karşılaştırmaları veya uygun olduğunda Friedman testi ve ardından Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler testleri kullanılarak değerlendirildi (p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001). (A) EB1-GFP kuyruklu yıldız sayılarının ortalama sayısını gösteren dağılım nokta grafiki. (B) Hareketli EB1-GFP kuyruklu yıldızlarının ortalama sayısını gösteren dağılım nokta grafiki. (C) Ortalama EB1-GFP kuyruklu yıldız takip uzunluğunu gösteren dağılım nokta grafiki. (D) Ortalama EB1-GFP kuyruklu yıldız hızını gösteren dağılım nokta grafiki. (E) Kontrol (n = 14) içindeki ROI1–ROI3 içindeki EB1-GFP izlerinin yönelimini gösteren gül grafikleri, kontrol soğuk tedavi edilen (n = 12) ve patronin⁰⁵²⁵² soğuk tedavi (n = 11) oositlerde gösterilir. Her bir yumurta başına her izin ortalama yüzdesi, ön (A) veya arka (P) doğrultusunda, her durum ve yatırım getirisi için belirtilir. (F) EB1-GFP kuyruklu yıldız takip açılarının yumurtanın ön ve arka taraflarına doğru ortalama yüzdesini gösteren çubuk grafik. Yüzde oranlar her bir oosit başına hesaplanmış ve her ROI içindeki kuyruklu yıldız yöneliminin göreli dağılımını temsil etmektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Metrik	ROI	Kontrol (n=14)	Kontrol soğuk muamele (n=12)	patronin05252 soğuk muamele (n=11)
Toplam EB1-GFP kuyruklu yıldız sayısı (#/μm2)	ROI 1 (ön)	0.667 ± 0.18	0.691 ± 0.20	0.570 ± 0.17
	ROI 2 (orta)	0.394 ± 0.11	0.532 ± 0.15	0.400 ± 0.12
	ROI 3 (geri)	0.353 ± 0.09	0.561 ± 0.16	0.378 ± 0.11
Hareketli EB1-GFP Kuyruklu Yıldız Sayı (#/μm2)	ROI 1 (ön)	0.189 ± 0.02	0.175 ± 0.03	0.099 ± 0.03
	ROI 2 (orta)	0.064 ± 0.02	0.091 ± 0.02	0.056 ± 0.02
	ROI 3 (geri)	0.043 ± 0.01	0.104 ± 0.03	0.047 ± 0.02
EB1-GFP Kuyruklu Yıldız Sırf Uzunluğu (μm)	ROI 1 (ön)	0.613 ± 0.04	0.621 ± 0.03	0.478 ± 0.07
	ROI 2 (orta)	0.463 ± 0.04	0.535 ± 0.03	0.410 ± 0.05
	ROI 3 (geri)	0.488± 0.05	0.543 ± 0.04	0.393 ± 0.05
EB1-GFP Kuyruklu Yıldız hızı (μm/s)	ROI 1 (ön)	0.208 ± 0.01	0.198 ± 0.01	0.188 ± 0.01
	ROI 2 (orta)	0.207 ± 0.01	0.199 ± 0.01	0.186 ± 0.01
	ROI 3 (geri)	0.202 ± 0.01	0.194 ± 0.01	0.177 ± 0.01

Tablo 1. Analiz edilen oositlerde ön-arka bölgelerde EB1-GFP kuyruklu yıldız ölçümlerinin özeti. Ölçümler, kontrol soğuk tedavi edilen ve heterozigot patronin⁰⁵²⁵² soğuk tedavi edilen oositlerden alındı. İlgi duyulan bölgeler ROI1 (ön), ROI2 (orta) ve ROI3 (geri) olarak tanımlandı.

Ek Tablo 1. Deneysel koşullar arasında EB1-GFP kuyruklu yıldız ölçümlerinin istatistiksel analizi. P-değerleri, her bir ROI (ROI1-ROI3) için kontrol kontrol, kontrol soğuk tedavi edilen ve heterozigot patronin⁰⁵²⁵² soğuk tedavi edilen oositler arasındaki farkları gösterir. Üç koşul arasında küresel karşılaştırmalar Kruskal–Wallis testi kullanılarak yapıldı, ardından Mann–Whitney sonrası ikili karşılaştırmalar yapıldı.  Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Tablo 2. Her deneysel koşulda yatırım getirisi oranları arasında EB1-GFP kuyruklu yıldız ölçümlerinin istatistiksel karşılaştırması. P-değerleri, kontrol soğuk tedavi edilen ve heterozigot patronin⁰⁵²⁵² soğuk tedavi edilen oositlerde ROI1 (ön), ROI2 (orta) ve ROI3 (posterior) arasındaki farkları gösterir. Her durum içindeki yatırım getirisi arasındaki genel farklar Friedman testi kullanılarak değerlendirildi. ROI'lar arasındaki çift karşılaştırmalar daha sonra Wilcoxon eşleştirilmiş çiftler imzalı sıralama testleri kullanılarak gerçekleştirildi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Video 1. Kontrol aşaması 7–8 oositte plus-end izleme proteini EB1-GFP'nin zaman geçişli görüntülemesi, sonraki MT izleme analizi için uygun temsili bir alım göstermekte (Şekil 3 ile ilgili). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Görüntü ön işleme için bir Fiji/ImageJ makrosu. Foto ağartma düzeltmesini, Kalman filtrelemesini ve arka plan çıkarma işlemlerini Gaussların Farkı (DoG) filtresi kullanarak otomatikleştirir. Ayrıca, takipten hızlılığını artırmak için MT uçlarının ön kenarlarını keskinleştirmek için zamansal gradyan artırımı (yeniden dilimleme ve 1D konvolüsyon) uygular. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Yarı otomatik İlgi Bölgesi (ROI) tanımı için bir Fiji/ImageJ makrosu. Kullanıcıdan oosit sınırını tanımlamasını ister; böylece analizin bölgesel tabakalanması mümkün olmak için seçimi otomatik olarak eşit mesafeli bölgelere (örnek 3 bölge: Ön, Merkezi ve Geri) ayırır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Trackmate kullanarak EB1 kuyruklu yıldızlarının otomatik takibi gerçekleştiren bir Python scripti (Fiji/ImageJ içinde çalıştırılır). Önceden işlenmiş görüntüleri toplu olarak işliyor, tanımlanmış kalite parametreleriyle kuyruklu yıldızları tespit ediyor, onları yörüngelere bağlıyor ve ham koordinat verilerini CSV dosyaları olarak dışa aktarıyor. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Nicel analiz için birincil arayüz olarak hizmet veren bir Jupyter Defteri. Ham takip verilerini yükler, analiz boru hattını çalıştırır ve gül grafikleri, istatistiksel özet tabloları ve kuyruklu yıldız yoğunluğu, hızı ve ömrü için karşılaştırma grafikleri dahil tüm nihai çıktıları oluşturur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 5: File_5_MTModule1.py. Veri çıkarma ve temel geometrik hesaplamalar için kullanılan temel yardımcı fonksiyonları içeren özel bir Python modülü. ROI dosyalarını bulma, anlık hızları hesaplama ve temel açısal yer değiştirmeleri hesaplama fonksiyonlarını içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 6: File_6_MTModule2.py. Gelişmiş analiz ve görselleştirme fonksiyonlarını içeren özel bir Python modülü. Bu sistem, yönelim analizi boru hattı (Kardinal vs. Eksenel bineleme), sağlam istatistiksel testler (Friedman/Wilcoxon ile Pratt yöntemi) ve yayın kalitesinde kutup (gül) grafiklerin oluşturulması için algoritmaları barındırır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Ek Kodlama Dosyası 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Ön işlem makrosunda gürültü azaltma adımları için Fiji/ImageJ için derlenmiş bir Java Kalman Filter eklentisi gereklidir. Bu bağımsız sürüm, ayrı bir Java Geliştirme Kiti (JDK) ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanıcının yazılım kurulumunu basitleştirir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın

Discussion

Oositlerde MT dinamiklerinin canlı görüntülenmesi, anlamlı bilgi elde etmek için yüksek kaliteli veri setleri ve nicel analizler gerektiği için benzersiz zorluklar yaratmaktadır. Önceki çalışmalar canlı görüntüleme^{yaklaşımları} 14,15,16 rapor etmiş olsa da, görüntü analiz adımları genellikle oldukça özelleştirilmiş ve protokoller tekrarlanabilirlik için yeterli detay sunmamaktadır. Sonuç olarak, kapsamlı görüntüleme veya hesaplama uzmanlığına sahip olmayan araştırmacılar, bu analizleri tekrarlamada engellerle karşılaşabilir. Bu zorlukları gidermek için, yüksek çözünürlüklü Airyscan canlı görüntülemeyi kullanıcı dostu, otomatik makrolar ve betiklerle birleştiren sadeleştirilmiş bir iş akışı geliştirildi. Bu boru hattı, EB1 kuyruklu yıldızlarının verimli tespiti ve takibini sağlar, ardından MT yönelimi, hızı ve mekansal organizasyonun nicel analizini sağlar. Manuel müdahaleyi en aza indirerek ve net, adım adım talimatlar sunarak iş akışı, oositlerde MT dinamik analizinin erişilebilirliğini ve tekrarlanabilirliğini destekler.

Yumurtalık diseksiyonu ve örnek hazırlama kritik ilk adımlardır. Mekanik hasarı önlemek için oositler dikkatlice disseksiye edilmeli ve görüntüleme süresi canlılığı korumak için 90 dakika ile^{sınırlandırılmalıdır 20}. Evre seçimi önemlidir: orta-oogenezden sonra oosit büyür ve sitoplazmada sarı biriktirir; bu da EB1 sinyalinin görselleştirilmesini evre 9 ötesinde giderek zorlaştırır. Bu nedenle, 9. evreden sonra^{görüntüleme önerilmez 20}. Ayrıca, tekrarlanabilir nicelikler için, mümkün olduğunda, karşılaştırılabilir boyutta oositler tercih edilir; çünkü bu, tanımlanmış ilgi alanlarının örnekler arasında eşdeğer ön-arka pozisyonlara karşılık gelmesini sağlar.

Tekrarlanabilirlik için sıcaklık kontrolü esastır. Sinek stokları, özellikle sıcaklık dalgalanmalarına duyarlı olan GAL4/UAS sistemi kullanıldığında, normal gelişimi ve tutarlı EB1-GFP ifadesini desteklemek için standart kültür koşullarında (25 °C) tutulmalıdır. Görüntüleme sırasında sıcaklık kararlılığı da aynı derecede önemlidir, çünkü değişimler MT dinamiklerini etkileyebilir. Sıcaklık kontrollü bir oda gerekmese de, alım sırasında sıcaklık dalgalanmalarından kaçınmak önerilir.

Görüntü alımı için, yüksek hassasiyeti ve geliştirilmiş SNR'si nedeniyle dizi dedektörü konfokal görüntüleme seçildi; böylece alınım sonrası ses çıkarma ihtiyacını en aza indirdi. Yüksek sayısal açıklık hedefleri (mümkün olduğunca yüksek) ve uygun kırılma indisi eşleşmesi kombinasyonu, yoğun ağlarda bireysel kuyruklu yıldızların çözümlenmesi için kritik olan yan ve eksenel çözünürlüğü maksimize etmek için kullanılmalıdır. Ayrıca, kuyruklu yıldız takibinde doğruluk kaybını önlemek için Nyquist-Shannon³⁰ örnekleme kriterleri XYZ ve zamanda takip edilmelidir. Aynı derecede önemli olan, görüntü düzleminin z-ekseni boyunca dikkatli seçimidir. Çok derin görüntüleme, ışık saçılması nedeniyle floresans kaybına yol açarken, alımı kortikal yüzeye sınırlamak EB1 kuyruklu yıldızlarının tam dinamiklerini yakalayamıyor. En bilgilendirici veriler ara bir z-konumunda elde edilir. Çekirdek seçilen düzlem içinde yer alan oositlerden kaçınılmalıdır, çünkü nükleer bölme sitoplazmanın büyük bir bölümünü yer değiştirir ve EB1 izleri yoktur; böylece tespit edilebilir kuyruklu yıldız sayısı azalır.

Dizi dedektörü tabanlı konfokal görüntüleme için optimize edilmiş olsa da, bu analiz hattı donanımdan bağımsızdır ve dönen disk konfokal mikroskopisi gibi diğer modalitelerle uyumludur. Ancak, kullanıcılar daha düşük NA veya SNR içeren sistemlerin makronun ön işleme parametrelerinde (örneğin gürültü toleransı/DoG sigma) ayarlamalar gerektirebileceğini ve bu çalışmada sunulan değerlere kıyasla kuyruklu yıldız tespit yoğunluğunun azalmasına yol açabileceğini bilmelidir. Buna rağmen, mutlak değerler sistemler arasında değişiklik gösterse de, deneysel koşullar ile ROI'lar arasındaki göreceli eğilimler sağlam kalacaktır.

Oositin büyük 3D yapısı göz önüne alındığında, 2B görüntüleme sadece MT ağının optik bir bölümünü yakalar. Sonuç olarak, z-ekseni boyunca dik hareket eden kuyruklu yıldızlar odak düzleminden çıkabilir; bu da yol ömrü ve mutlak hızın (sadece hız vektörünün xy-bileşeni ölçüldüğünden) hafife alınmasına yol açabilir. Ancak, tüm oositin yüksek hızlı 3D hacimsel görüntülemesi, daha küçük görüş alanları (FOV), daha kısa pozlama süreleri ve daha hızlı dedektör yanıt süreleri gerektirir; böylece SNR düşürülür ve alım süresini birden fazla z-dilim arasında dağıtır; bu da hızlı EB1 kuyruklu yıldızlarını takip etmek için gereken zamansal çözünürlüğü zayıflatır. Hareketsiz kuyruklu yıldızları ve odak dışı artefaktları azaltmak için, odak düzleminde geçen geçici noktaları kaldırmak için (3 kare < izler hariç) konvolüsyon ve minimum iz süresi filtreleri uygulandı. Ayrıca, bu geometrik sınırlama deneysel koşullar boyunca eşit şekilde uygulandığından, kuyruklu yıldız yoğunluğu, hızı ve yönelimdeki gözlemlenen göreceli farklılıklar sağlam kalır. Işık alan mikroskobu gibi yeni teknikler ideal olarak tam 3B yapıyı aynı anda yakalamak ister, ancak henüz yaygın olarak erişilebilir değiller. Buna rağmen, tüm MT-dinamik parametreleri için ölçülen değerler önceki raporlarla tutarlıdır ve bu protokolün farklı deneysel kurulumlarda MT dinamiklerini incelemek için uygun olduğunu gösterir.

Bu protokoldeki makroları kullanmadan önce, yazılım parametrelerinin doğru optimize edildiğinden emin olmak için ilk birkaç görüntünün manuel olarak işlenilmesi önerilir. Görüntüleme çözünürlüğü, büyütme, sinyal-gürültü oranı, kare hızı ve verinin tek düzlemli mi yoksa z-stack mi olduğu gibi faktörler takip doğruluğunu etkileyebilir. Parametreleri yineleme olarak ayarlayarak ortaya çıkan izleri görsel olarak inceleyerek yanlış pozitif ve yanlış negatifleri en aza indirmek. Optimize edildikten sonra, tekrarlanabilirliği sağlamak için parametreleri veri setleri arasında tutarlı şekilde uygulayın.

Son olarak, biyolojik yorumla ilgili bazı sınırlamalar belirtilmelidir. EB1-GFP, büyüyen MT plus uçlarını seçici olarak etiketler ve böylece tüm MT popülasyonundan ziyade aktif MT polimerizasyon alanlarını raporlar. Görüntüleme döneminde bulunan stabil, polimerizasyon etmeyen MT'ler bu yöntemle tespit edilmez. Bu sınırlama, çoğu MT'nin oldukça dinamik olduğu orta oojenez oositlerde daha az kısıtlayıcı olsa da, protokolü önemli stabil MT popülasyonlarına sahip diğer hücre tiplerine, örneğin^{nöronlar 31'e} uygularken dikkate alınmalıdır.

Sonuç olarak, bu iş akışı Drosophila oositlerinde MT dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ve nicel analizini mümkün kılar. Optimize edilmiş diseksiyon, dizi dedektörü konfokal canlı görüntüleme ve otomatik analiz araçlarını entegre ederek, MT regülatörlerini asentrozomal bağlamda incelemek için titiz ama erişilebilir bir yöntem sunar. Öncelikle oositlerde doğrulanmış olsa da, bu yaklaşımın prensipleri optimizasyon sırasında diğer hücre tiplerine, örneğin nöronlar ve epiteller gibi bölünmeyen hücrelere uyarlanabilir ve genetik taramalar ve MT organizasyonunun mekanik çalışmaları için ölçeklenebilir bir platform sunar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Pensetler	Güzel Bilim Araçları	11252-20
EB1::GFP	Dr. Antoine Guichet'ten, CNRS, Institut Jacques Monod, Fransa		Genotip: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Cam tabanlı Petri kapları	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	7062	Genotip: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Kimyasalları	24627.188
Patronin mutantı	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	16647	Genotip: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118	Bloomington Drosophila Stok Merkezi	3605
Airyscan 2 ile Zeiss LSM 980	Zeiss