Yöntem makalesi

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

DOI:

10.3791/69986

⸱

27 Şubat 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokollerin amacı, Drosophila embriyolarının ektodermal türeyli epitel dokularındaki pile Septat Bağlantılarının (pSJ) organizasyonunu ve bariyer fonksiyonunu değerlendirmektir. pSJ, epidermis, tükürük bezleri, trakea ve arka bağırsak dahil olmak üzere ektodermal dokuların yan zarında omurgalı dokulardaki sıkı birleşime işlevsel olarak benzer bir tıkanma bariyeri oluşturur. Drosophila'da, pSJ'lerin oluşumu için gerekli olan 30 protein tanımlanmıştır. Çekirdek pSJ proteinleri başlangıçta lateral membranın uzunluğu boyunca lokalize olur, ancak embriyogenezin 16. aşamasında birleşimin apikal lateral bölgesinde, aderen birleşiminin hemen bazalında güçlü şekilde zenginleşir. Embriyogenezin 15. evresinin sonlarına gelindiğinde, bu dokular tam işlevsel bir okkluding birleşimine sahiptir. Bu makale, kontrol ve mutant embriyolarda pSJ'lerin organizasyonu ve işlevini sorgulamak için kullanılabilecek immünboyama ve boya geçirgenlik protokollerini açıklayacaktır. Bu protokollerin başarılı kullanımı, pSJ'lerin tıkanma fonksiyonunu göstermek ve bilinmeyen bir genin birleşimin çekirdek bileşenini kodlayıp kodlamadığını test etmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitel dokularının kritik bir işlevi, bir organizmada farklı bölgeleri bölmektir. Bu farklı ortamların oluşturulması, organ fonksiyonları ve organizmayı dış tehditlerden korumak için gereklidir. Bir epitelin hücreleri arasında oluşan okkluding birleşim, bu epitelin apikal ve bazal tarafları arasında çözünen maddelerin parasellüler akışını engelleyerek bu ortamları oluşturmak ve sürdürmekten sorumludur. Omurgalı organizmalarda, tıkanan birleşim sıkı birleşim olarak adlandırılırken, Drosophila melanogaster 1,3 gibi omurgasızlarda septat birleşim (SJ) olarak adlandırılır. Eklembodlularda doku dağılımları ve ultrastruktur ile ayrılan iki SJtürü vardır 4. Pizili septat birleşimleri (pSJ'ler), epidermis, tükürük bezleri, trakea ve arka bağırsak gibi ektodermal kaynaklı dokularda bulunur. Hücreler arasındaki ekstrahücre boşlukta, aderenlerin 3,5 birleşiminin hemen tabanında yer alan elektron yoğun maddeden oluşan merdiven benzeri bir diziyle ultrayapısal olarak karakterize edilirler. Buna karşılık, pürüzsüz septat birleşimleri (sSJ), midgut ve Malpighian tübülleri gibi endodermal türeyden türetilmiş dokularda bulunur ve hücreler arasında elektron yoğunseptalar göstermez 6.

Drosophila'da yapılan genetik çalışmalar, pSJ yapısı ve fonksiyonu için gerekli olan 30 proteini ve birleşimde bulunan ancak yerleşimlerinde veya korumalarında herhangi bir işlevi olmayan ek proteinleri tespit etmiştir (7'de incelenmiştir). Bu analizlerden alınan bilim insanları, SJ proteinlerini üç sınıfa ayırmıştır. Çekirdek SJ proteinleri birleşimde bulunur ve birleşimin kurulması ve bakımı için gereklidir. Coracle (Cora), Neurexin IV, Macroglobulin komplementle ilgili (Mcr), Kune-kune ve ATPase alpha 8,9,10,11,12 dahil olmak üzere on yedi protein Core pSJ proteinleri olarak tanımlanmıştır. Dokuz protein, birleşimin kurulması ve/veya bakımı için gerekli olan ancak birleşimde mutlaka bulunmayan yardımcı pSJ proteinleri olarak tanımlanmıştır. Bu sınıf Rab5, Rab11 ve Coiled13,14 gibi proteinleri içerir. Son olarak, pSJ yerleşik proteinleri pSJ'ye lokalize olur ancak birleşimin kurulması ve bakımı için gereksizdir. Bu grubun dört üyesine örnek olarak Discs Large ve FasciclinIII 15,16 örnek olarak verilebilir.

Fonksiyonel olarak sağlam bir pSJ'nin kurulması, embriyogenezin ortasında tüm çekirdek pSJ proteinlerinin tam olarak eksprese edildiği çok aşamalı bir süreçtir. Bazı çekirdek pSJ genleri anne yoluyla ifade edilir, ancak hepsi12-17. aşamada güçlü zigotik ekspresyon gösterir. 12. aşamada, çekirdek pSJ proteinleri yan zarın boyunca her yerde lokalize olur. 13-16. evrelerde, çekirdek pSJ proteinleri endositoz edilir ve ardından pSJ bölgesindeki lateral membrana geri döner. Bu süreç, Rab5 ve Rab1114 dahil olmak üzere pSJ yardımcı proteinleri gerektirir. 16. aşamada, çekirdek pSJ proteinleri lateral membran boyunca pSJ bölgesine sıkıca lokalize olur. Bu gözlemlerle uyumlu olarak, birleşimin tam kapatıcı işleviembriyogenez 12'nin geç 15. aşamasında gerçekleşir. Bu, en iyi şekilde boya geçirgenliği testi ile gösterilir. Birleşim oluşmadan önce, rodamin gibi floresan bir işaretleyici ile işaretlenmiş 10 kDa'lık bir dekstran boncuk, hücreler arasındaki parasellüler boşluktan geçebilir. Etiketlenmiş dekstran hemokoel'e enjekte edilirse, trakea, tükürük bezi ve arka bağırsak gibi tübüler epitellerin lümenine hızla birikir. PSJ 15. evrenin sonunda fizyolojik olarak sıkı hale geldikten sonra, enjekte edilen dekstran epitelin bazal tarafına sınırlıdır ve bu organların lümeninde (apikal alan) birikemez.

Çekirdek pSJ proteinleri, her çekirdek pSJ proteininin doğru subhücre lokalizasyonu için diğer tüm çekirdek pSJ proteinlerinin bulunmasına ihtiyaç duyduğu karakteristik bir özelliğesahiptir 18,19. pSJ oluşumundaki bu karşılıklı bağımlılık, çekirdek pSJ proteinlerinin tanımlayıcı özelliğidir ve bu makalede sunulan protokollerin temelini oluşturur. Çekirdek veya yardımcı pSJ genlerindeki mutasyonlar embriyonik ölümlülüğe yol açar ve evre 16 embriyolarda lateral membran boyunca diğer çekirdek pSJ proteinlerinin yanlış lokalizasyonu ile karakterize edilir; normal apikal lateral bölgelerine sıkı bir şekilde lokalizelenmiş değiller. Buna karşılık, pSJ-yerleşik genlerdeki mutasyonlar çekirdek pSJ proteinlerinin yanlış lokalizasyonuna yolaçmaz 15. Çekirdek ve yardımcı pSJ gen mutasyonlarında pSJ'nin fonksiyonel bozulması, evre 16 veya 17 mutant embriyolarda trakea, tükürük bezleri veya arka bağırsaklarda işaretlenmiş 10 kDa dekstranın birikmesiyle ortaya çıkar. Son olarak, çekirdek ve aksesuar pSJ proteini arasındaki ayırt edici özellik, onların subhücresel lokalizasyonudur. Çekirdek pSJ proteinleri oluştuklarında pSJ ile sıkı ilişkilidir, oysa yardımcı pSJ proteinleri birleşimin montajı için kritik olsa da, mutlaka birleşimde bulunmazlar. Yardımcı pSJ proteinlerinin en iyi örnekleri Rab5 ve Rab11'dir. Her ikisi de plazma zarından erken döneme ve endozomların geri dönüşümüne ve ardından plazmamembranına 14'e geri taşınmasına yardımcı olan sitoplazmik proteinlerdir. Yeni bir potansiyel pSJ proteininin çekirdek bileşen mi yoksa yardımcı protein mi olduğunu ayırt etmek için, genellikle spesifik bir antikor oluşturmak veya floresan etiketli rekombinant bir protein ifade etmek faydalıdır; böylece bu proteinlerin pSJ olgunlaşma sürecinin çeşitli noktalarında nerede lokalileştiğini belirler.

Bu protokollerin amacı, potansiyel çekirdek ve yardımcı pSJ proteinlerini pSJ yerleşik proteinlerinden kesin bir şekilde ayırt etmektir. Birçok çalışma, gelişim sırasında pSJ proteinlerinin morfogenez ve apikal-bazal polaritedeki rolleri de dahil olmak üzere ek, kapatıcı olmayanrolleri ortaya koymuştur 17,20,21,22. PSJ biyolojisine ilgi arttıkça ve daha fazla potansiyel pSJ proteini tespit edildikçe, burada sunulan basit ve kolay yorumlanabilir protokoller, araştırmacıların bu proteinlerin pSJ organizasyonunu ve kapatma fonksiyonlarını doğru şekilde tanımlamalarına yardımcı olacaktır. Literatürde, pSJ proteinlerinin karakterizasyonu için birçok ek deneysel yaklaşım tanımlanmıştır; bunlar arasında Fotobeyazlamadan Sonra Floresans Geri Kazanımı (FRAP) ve iletim elektronmikroskopisi 6,23 bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar genellikle çok faydalı olsa da, burada sunulan immünboyama testi pSJ protein lokalizasyonunun pahalı ve zaman alıcı ultrastruktural yöntemler olmadan hızlı görselleştirilmesini sağlarken, boya geçirgenliği testi sadece görüntülemeyle elde edilemeyecek fonksiyonel bir pSJ bütünlüğü okuması sunar. Ayrıca, bu testler kaliteli floresan mikroskobu ve temel bir mikroenjeksiyon sistemi gibi standart laboratuvar ekipmanlarıyla da yapılabilir. Bu testlerin Drosophila 16. evre embriyolarının analizi için optimize edildiğinin ve sSJ'lerin organizasyonu veya işlevini değerlendirmek için uygun olmadığı belirtilmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Embriyoların evrelenmesi

  1. Uygun genotiplere sahip sağlıklı erkek ve dişi sinekleri çaprazlayın (örnekler için Materyaller Tablosu'na bakınız) ve onları embriyo toplama kafeslerine taze elma suyu tabakları ile maya macunu sürterek yerleştirin. Embriyo toplamaya başlamadan önce sineklerin yumurta toplama kafeslerine bir iki gün alışmasına izin verin.
  2. Embriyoları elma suyu tabaklarında topla ve 16. aşamaya (yumurta bıraktıktan (AEL) 16 saat sonra 25 °C'de 16 saat AEL'ye kadar gelişmelerine izin verin. Yetişkinlerin döllenmiş yumurtaları elma suyu tabaklarına 1-2 saat bırakmasına izin verin, tabağı yumurta toplama kafesinden çıkarın ve ardından 25 °C'de 13-16 AEL derecesine kadar yaşlandırın. Alternatif olarak, embriyoları gece boyunca 25 °C'de toplayın ve ardından fiksasyondan önce veya görüntüleme sırasında 16. evre embriyoları seçin.
    NOT: Embriyonik aşamalanma, bağırsak morfolojisiyle değerlendirilebilir; bu morfoloji, UV spektrumundaki otofloresans ile (yani DAPI kanalı) en kolay görselleştirilir. Evre 16 embriyolarda, bağırsak vücudun uzun eksenine dik üç paralel, uzun oval olarak görünür (Şekil 1H).

2. Embriyoların fiksasyonu ve immünboyaması

  1. Bir embriyo toplama sepeti ile naylon ağ (120 mm ağ) birleştirin. Açıklığı ve sepet dişlerini naylon file ile kapatın, sonra kapağı vidalın.
  2. Embriyoları elma suyu tabağından fırça ve embriyo yıkama solüsyonuyla nazikçe çıkarın. Embriyo karışımını embriyo toplama sepetine dökün ve embriyoları damıtılmış suyla durulayın.
    NOT: Suyu embriyo toplama sepetinin içine doğru yönlendirmeye dikkat edin ve embriyoları sepet kenarlarına sıçratmaktan kaçının; bu da yapışma nedeniyle embriyo kaybına yol açabilir.
  3. Embriyoları, embriyo toplama sepeti ve embriyoları %50 ticari çamaşır suyu içeren (nihai konsantrasyonu %3,75 sodyum hipoklorit) içeren bir tepsiye batırarak dekorionizasyon yapın. Embriyoları çamaşır suyu ile karıştırın ve oda sıcaklığında 3-5 dakika suya batırın. Sepeti çamaşır suyu makinesinden çıkarın ve embriyoları damıtılmış suyla durulayın, su akışını tekrar sepetin içinden aşağı yönlendirin.
  4. 20 mL'lik bir sintilasyon şişesine eşit hacimde taze %4 paraformaldehit çözeltisi ve heptan ekleyerek bir fiksasyon şişesi hazırlayın. Paraformaldehit çözeltisi için uygun miktarda paraformaldehit sıcak (~90 °C) 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) kimyasal bir duman kaplıfanında çözünür. Çözülme sürecini hızlandırmak için, formaldehit çözeltiye girene kadar sabitte 10 μL 14 N Sodyum Hidroksit (10 mL PBS başına) ekleyin, ardından pH nötr hale getirilmek için 10 μL 14 N Hidroklorik asit ekleyin.
    DIKKAT: Paraformaldehit ve heptan ile çalışırken her zaman laboratuvar önlüğü, gözlük ve eldiven takın ve sadece kimyasal bir hava kaputu altında kullanın. Paraformaldehit kanserojen ve koroziftir, heptan ise son derece yanıcı ve cilt ile göz tahrişine neden olur.
  5. Embriyo toplama sepetini söküp, dekoryonlu embriyolarla birlikte naylon ağı heptana daldırın. Embriyolar naylon yüzeyinden ayrılır ve heptan (üst katman) ile sabitleme (alt katman) arasındaki arayüze yerleşir. Embriyoları, fiksasyon şişesini platform sarstıcında dakikada 240 devir (RPM) ile 20 dakika boyunca sallayarak sabitleyin.
  6. Fiksasyon şişesinden Pasteur pipetiyle kimyasal bir buharlı kapüşonla düzeltin. Tamiri onaylı tehlikeli kimyasal atık konteynerine atın. Eşit miktarda metanol ekleyin, fiksasyon odasını kapatın ve odayı 5-10 saniye boyunca sertçe sallayın. Sabitlenmiş embriyoklar vitelline zarfından kopup metanolün alt tabakasına (alt tabaka) çöker. Vitelline zarfları ve vitelline zarfından ayrılamayan embriyolar arayüzde kalacak ve 2.7. adımda çıkarılacaktır.
    DIKKAT: Metanolü kullanırken her zaman laboratuvar önlüğü, gözlük ve eldiven takın, çünkü metanol zehirli ve yanıcıdır.
  7. Heptanı Pasteur pipetiyle çıkarın ve onaylı tehlikeli kimyasal atık konteynerine atın. Sonra, metanolün çoğunu çıkararak embriyoları küçük bir metanol havuzunda bırakın ve metanolu tehlikeli kimyasal atıklara atabilirsiniz. 5 ml metanol ekleyin, embriyoları karıştırın ve yerleşmelerine izin verin. Metanolun çoğunu tekrar çıkarın ve bu işlemi 2 kez daha tekrarlayın.
  8. Embriyoları metanolde 0,8 mL cam kültür tüpüne aktarın. Metanolü çıkarın ve 750 mL blok çözeltisi ekleyin (PBS artı %1 normal eşek serumu ve %0,1 Triton X-100). Embriyoları PBS'de 3 kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında blok çözeltisinde 30 dakika kuluçka geçirin, platform sallayıcıda nazikçe karıştırın.
  9. Embriyoları PBS'de bir kez daha durulayın ve ardından blok artı primer antikorlar ekleyin. Çekirdek bir pSJ proteinine (örneğin Coracle) ve bir adherens bağlantı proteinine (örneğin E kadherin) karşı antikorlar kullanın. Embriyoları birincil antikorda gece boyunca 4 °C'de veya oda sıcaklığında 3-4 saat boyunca nazikçe karıştırarak platform sallayıcıda inkubka edin.
  10. Birincil antikorlarla blok çıkarılır ve embriyoları PBS ile üç kez durulayın. Block ekleyin ve embriyoları platform sallayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yıkalayın.
  11. Embriyoları PBS'de bir kez daha durulayın, ardından bloklayıcı çözelti ve 2.9. adımda kullanılan birincil antikorlara özgü floresan işaretli ikincil antikorları ekleyin. Embriyoları oda sıcaklığında 3-4 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın.
  12. İkincil antikorlarla bloku çıkarın ve embriyoları PBS'de üç kez durulayın. Block ekleyin ve embriyoları platform sallayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yıkalayın.
  13. Embriyoları PBS'de bir kez daha durulayın, ardından Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytına aktarın. Fazla PBS'yi küçük Whatman kağıdı şeritleriyle uzaklaştırın, embriyolara dokunmamaya özen gösterin. Embriyoları montaj ortamıyla (ticari olarak mevcut veya %90 gliserol, %10 1 M Tris, pH 8.0, %0.5 n-propil gallat ile solmamaya karşı bir madde) kaplayın. Uygun boyutta 1.5 numaralı bir cam ile kaplayın ve kenarlarını oje ile kapatın.

3. İmmünboya embryoların görüntülemesi ve veri analizi

  1. En iyi sonuçlar için embriyoları 40x yağ daldırma objektif olan konfokal mikroskopta görüntüleyin. Kontrol embriyolarını kullanarak konfokal üzerinde lazer yoğunluğunu ve kazancı ayarlayın; böylece pikselleri aşırı doygunlaştırmadan güçlü bir floresan sinyal elde edin. Tercih edilen 16. aşama embriyoları (yani, mutant embriyoları tanımlamak için dengeleyici kodlu GFP ifade etmeyenler) orta bağırsak morfolojisi kullanılarak belirleyin. Taramayı tükürük bezine veya arka bağırsağa odaklayın; çünkü bu organlar polarize olup, uzun yan zarlara sahiptir; bu membranlar yapışkan birleşimini, pSJ'yi ve kalan yan yüzeyi ayırt etmek için idealdir. Tükürük bezinin veya arka bağırsağın lümeninin mümkün olan en büyük çapını içeren z pozisyonunda görüntü, epitel hücresinin tam yan zarını gözlemlemek.
    NOT: Şekil 1C'de gösterilen örnek, 561 nm lazer için lazer yoğunluğu 1.59 ve 3.3 kazanç ile 2.0 lazer yoğunluğu ve 21.7 kazanç ile HC PL APO 40x/1.3 CS2 yağ daldırma lensi ile konfokal mikroskopta çekilmiştir (bkz. Malzemeler Tablosu).
  2. En az 20 kontrol ve mutant 16. evre embriyoda polarize bir doku görüntüleyin. Sadece embriyolardan alınan veriler, adherens bağlantı işaretleyicisi membranın apikal lateral bölgesine sıkıca lokalize edilmiş, böylece embriyonun uygun şekilde sabitlenip boyandığından emin olur. Sonrasında, pSJ belirtecisinin lateral zar boyunca dağılımını kaydedin. Vahşi tip 16. evre embriyolarda, yan zarın ~%10-15'i büzere, adherens birleşimine kadar güçlü bir şekilde zenginleşmeye dikkat edin.
    NOT: Yan membran boyunca pSJ proteininin %10-20'sinin bile yanlış lokalizasyonu, pSJ organizasyon defekti için tanısal bir yöntemdir. pSJ organizasyon kusurları, tüm çekirdek ve aksesuar pSJ mutant embriyolarda güçlü bir şekilde nüfuz eder, bu yüzden mutant embriyoların %75-100'ünün açıkça yanlış lokalize edilmiş pSJ proteini göstermesini beklemelisiniz.

4. Boya enjeksiyonu için hazırlık

  1. Rodamin etiketli 10 kDa Dextran'ı 0,5 M Sodyum Fosfat, pH 7,5 ve 5 mM Potasyum Klorür içinde 1 mg/mL'ye çözerek taze bir boya çözeltisi oluşturun.
  2. İğne çekicisi kullanarak bir kapiller tüpü (1.0 mm OD x 0.5 mm ID with Fiber) cam iğneye çekin.
    NOT: İğne çekiciler kendine özgü sahiptir ve ideal iğne ayarları genellikle günlük olarak değişir. İyi iğneler kademeli olarak keskin bir uca doğru inceler ve Şekil 2A'da gösterilen şekiller arasında yer almalıdır. Soldaki iğne daha uzundur ve embriyoya bastırılırken bükülebilir. Bu, iğneyi noktadan daha uzağa kırılarak düzeltilebilir. Sağdaki iğne iyidir ama ilk kırıldığında daha büyük bir deliğe sahip olur ve embriyoya çok fazla sıvı itebilir. Eğer böyle olursa, daha ince uçlu yeni bir iğneye geçin. İğne çekicinin koşulları doğru şekle iğne oluşturduğunda aynı anda birkaç iğneyi çekmek en iyisidir. Fazla iğneler, iğneleri bağımsız olarak sabitlemek için bir parça köpük veya bant ile kapalı bir kapta saklanabilir.
  3. İğneyi mikromanipülatör üzerindeki iğne tutucusuna yükleyin. Mikromanipülatörü ters bir mikroskobin yanına yerleştirin (Şekil 2F). İğneyi mikroskop slaytına mümkün olduğunca paralel konumlandırın ve slaytın yanıyla aynı z düzleminde olacak şekilde aşağı indirin.
  4. Mikroskop slaydının kenarına vurarak iğnenin ucunu kırın. İğneyi sürgü seviyesinin üzerine kaldırın ve yükleme için çıkarın.
  5. Kapiller tüpünü en küçük pipet ucu (P2 veya P10 ucu) kullanarak boya ile doldurun veya iğnenin arka ucunu boyanın bulunduğu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek kapiller hareketle doldurun.
  6. Doldurulmuş iğneyi iğne tutucusuna yeniden doldurun ve mikroskop slaytı yüzeyindeki halokarbon yağı damlasına biraz enjekte ederek dekstranın akışını test edin.
    NOT: İyi kırılmış bir iğne, basınç eklemeden sızdırmaz ve akış hızı, şırıngadaki pistona uygulanan basınca göre ayarlanabilir.

5. Embriyoların montajı ve boya enjeksiyonu

  1. Evre 16 veya 17 embriyoları (kontrol ve mutant) orta bağırsak morfolojisini aşama belirtisi olarak kullanarak seçin.
  2. 22 x 22 # 2 kalınlığında bir kapak kullanarak bir elma suyu tabağı üzerinde girintili bir çizgi oluşturun. Elma suyu tabağı üzerinde yaklaşık 25 aşamalı embriyoyu arka uçları çizgiye değecek ve ventral yüzeyi yukarıya bakacak şekilde hizala.
  3. 22 x 22 #2 bir kapak parçasına çift taraflı bant uygulayın. Bandı embriyo çizgisine dokundurun ve örtü kuşağını hafifçe ovuşturarak embriyoları plakadan kapak üzerindeki çift taraflı banda taşıyın (Şekil 2B).
  4. Kaplama kaydırağı, bir damla halokarbon yağı ekleyerek ve kapiller hareketiyle bir bağ oluşturarak mikroskop kaydırına takın. Kapak kayışı, buzlu herhangi bir kısmın tam tersi olacak şekilde kaydırağın yanına daha yakın konumlandırın. Embriyoları 3-5 dakika boyunca bir kurutucu kapta veya laboratuvar tezgahında havada 10-15 dakika boyunca kurutun (Şekil 2C-E). Embriyoları tamamen Halokarbon yağı ile kaplayın.
    NOT: Embriyolar kuruduktan sonra biraz daha az durgun olur ancak güçlü şekilde gevşek olmaz. Şekil 2E'de gösterilen embriyolar, %42 göreli nemin olduğu 21,2 °C olan bir odada 15 dakika boyunca hava kurutmaya bırakıldı.
  5. Embriyolarla birlikte slaytı, embriyolar yukarıya bakacak şekilde (hedeften uzak) ters mikroskopa monte edin. Mikromanipülatörü, iğnenin embriyoların arka ucuna mümkün olduğunca paralel bir açıyla bakacak şekilde hizalaması (Şekil 2G). Mikromanipülatörün z eksenini iğnenin ucu embriyonun orta noktasına (dorsal-ventral eksen boyunca) hizalayacak şekilde ayarlayın.
  6. Embriyoları, aşamayı hızla iğneye hareket ettirerek iğne ucu embriyonun hemokoline girerek enjekte edin. 10, 25 veya 50 mL'lik bir şırınga kullanarak az miktarda boya (~0.2-0.5 nL) enjekte edin. İğneyi hızla çekin, aşamayı bir sonraki embriyoya taşıyın ve işlemi tekrarlayın. 10 dakika içinde mümkün olduğunca çok embriyo enjekte edin.
    NOT: İğnenin embriyoya yaklaşık %25'i kadar yerleştirilmesi önemlidir, böylece boya, ön ve arka bağırsak lümeniyle sürekli olan perivitellin boşluğuna doğrudan enjekte edilmez. Enjeksiyon yapılan boya, embriyonun "şişirdiği" ve embriyonun daha kabarık görünmesini sağlamalıdır. Aşırı enjeksiyon, enjeksiyon bölgesinden bir boya ve hemolimf baloncukluğuna yol açar ve kaçınılmalıdır.
  7. Ek halokarbon yağı ekleyin ve embriyoları 22 x 22 #2 örtü örtü ile kaplayın. Ek halokarbon yağı, iki örtü tabakası arasında daha tasa bir tabaka oluşturur ve embriyoların ezilmesini engeller.

6. Görüntüleme ve veri analizi

  1. Floresan bileşik mikroskop veya konfokal mikroskop üzerinde görüntüleme yapın (net sonuçlar elde etmek için 10x veya 20x hava hedefi yeterlidir). Konfokalda, embriyoda derinliğin yaklaşık dörtte biri boyunca (dorsal ventral eksen boyunca) z stack görüntüleme, işaretlenmiş dekstranın trakea ve arka bağırsak lümenine girip girmediğini ortaya çıkarır (tükürük bezlerini görmek için daha derin kesitler veya embriyoların üst kısmında ventral yüzey olacak şekilde yeniden yönlendirilmesi gereklidir).
    NOT: Şekil 3'te gösterilen örnekler, 561 nm lazer için 2.0 lazer yoğunluğu ve 13.6 kazancı olan HC PL APO 10x/0.4 CS2 kuru lensle konfokal mikroskopta çekilmiştir. 24 z dilimleri, z adım boyutu 2.4 nm ile elde edildi (bkz. Malzemeler Tablosu).
  2. Enjekte edilen embriyonun 10 dakika yaşlanmasına izin verin, ardından trakea, tükürük bezi veya arka bağırsağın lümenini işaretli dekstran birikmesi için inceleyin. Her embriyonun genotipini ve evresini kaydedin ve herhangi bir tübüler organda etiketlenmiş deksran birikip birikmediğini kaydedin. Perivitellin boşluğunun da boya ile güçlü şekilde boyanmış olduğu embriyolara dikkat edin; çünkü bunlar o uzaya istemeden enjekte edilmiş embriyoları temsil edebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokoller, evre 16 Drosophila embriyolarında ektodermal dokularda pSJ'lerin organizasyonu ve işlevini incelemek için kullanılır. Bu protokoller yalnızca pSJ'ler için geçerlidir ve sSJ'leri sorgulamak için kullanılamaz. Evre 16 embriyolarda diğer pSJ proteinlerinin pSJ bölgesine lokalize edilmemesine ve 16. aşamada bir tıkanma birleşimi oluşturulamamasına yol açan bir gendeki mutasyon, ya çekirdek pSJ geninde ya da yardımcı pSJ geninde bulunur. İkisi arasındaki temel fark...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, floresan mikroskopi yeteneklerine sahip mütevazı laboratuvarlarda gerçekleştirilebilen iki nispeten basit test kullanarak çekirdek ve yardımcı pSJ proteinlerini tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. İlk test, olgun polarize epitellerde pSJ'nin moleküler organizasyonunu sabit mutant embriyoların konfokal görüntülemesi kullanılarak inceler. İkinci test, 16. evre canlı embriyolara boyalı 10 kDa dekstran molekülleri enjekte ederek pSJ'nin tıkanma fonksiyonunun bütünlüğünü test eder...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan sinek stokları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ederiz. Çalışmada kullanılan antikorlar için Gelişimsel Çalışmalar Hibritoma Bankası'na teşekkür ediyoruz. Ayrıca, Case Western Reserve Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ne, embriyoların genotiplenmesi ve diseksiyon aşamasında Leica MZ10F floresan stereomikroskopunu ve boya enjeksiyonu deneyleri için DMi8 ters floresan mikroskopunu kullandıkları için teşekkür ederiz. Mikromanipülatörü sağladığı ve bu çalışmada sunulan boya enjeksiyonu deneyinde kullanılan birkaç iğneyi çektiği için CWRU Tıp Fakültesi Genetik ve Genom Bilimi Profesörü Helen Salz'a teşekkür ederiz. Bu proje, Ulusal Bilim Vakfı (IOS 2111069) tarafından REW'ye verilen bir hibe ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İğneler için kapiller tüp (Boro 1 X 0.5/Fiber)FHC30-30-1
Konfokal mikroskopLeicaStellaris 5 
Enjeksiyon için 22 x 22 2 kalınlığında kap camıFisher Scientific12-540-B
Kapak camı 22 x 30 1.5 kalınlıkta görüntüleme içinCorning2980-233
İmmünboyama için kültür tüpü (6 x 50 mm) Fisher Scientific14-958-A
Embriyo toplama kafesiGenesee Scientific59-100
Floresans stereomikroskopuLeicaMZ10 F
Halokarbon yağı (700)Genesee Scientific59-131
HeptaneFisher ScientificH350-4
Ters floresans mikroskobuLeicaDMi8
Embriyoları dekoryonlaştırmak için ağ sepetlerGenesee Scientific46-101
MetanolFisher ScientificA412-4
MikromanipülatörNarishigeMN151
Mikroskop slaytlarıFisher Scientific12-544-2
İğne çekiciDavid Kopf enstrümanlarıModel 720
Normal Eşek SerumuJackson ImmunoReseaerch017-000-121
Naylon mesh (120 um)Genesee Scientific57-102
Objektif lens HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1Leica11506537
Objektif lens HC PL APO 10x/0.40 CS2Leica15506407
Objektif lens HC PL APO 40x/1.30 CS2Leica15506358
Petri plakaları 60 x 15 mmCorning351007
Platform sallayıcıGlobe ScientificGTR-FS
Birincil antikor (Korakl)DSHBC566.9
Birincil antikor (Korakl)DSHBC615.16
Birincil antikor (E kadherin)DSHBDCAD2
Birincil antikor (Mcr)Ward laboratuvarı, CWRUGine domuzu poliklonal
10 kDa dextran etiketli rodaminMoleküler ProblarD1824
İkincil antikor (eşek anti-kobayı Cy3)Jackson ImmunoReseaerch706-165-148
İkincil antikor (eşek anti-fare Cy2)Jackson ImmunoReseaerch715-225-151
İkincil antikor (eşek anti-sıçan Cy5)Jackson ImmunoReseaerch712-175-150
Masa üstü shakerNew Brunswick ScientificC2 platform sarstırıcı
Tegosept (metil 4-hidroksibenzoat)TCIH0216
Triton X-100Fisher ScientificBP151500
Fiksasyon için şişeler (20 ml WHEATON sıvı scintillasyon şişeleri)Fisher Scientific03-341-73C
Whatman 3MM  Kromatografi MakalesiFisher Scientific05-716-6H
Uçan hisse senetleritam genotiphisse sayısıKaynak
cor4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
w1118w[1118]5905BDSC
Çözümtarif
10x PBS90 g NaCl, 20 g Na2HPO4 ve 8.3 g NaH2PO4.H2O ile dH20 karışımı ile 1L. Filtre steril edilsin. İmmünboyama aşamalarında yıkama adımları için dH2O ile 1X seyreltir.
%10 Triton X-100 çözümü1 ml Triton X-100 ile 9 ml dH2O'yu platform rocker üzerinde çözünene kadar karıştırın. Oda sıcaklığında sakla.
%50 çamaşır suyuEmbriyoları dekoryonlaştırmadan önce 10 ml ticari çamaşır suyu (%7,5 sodyum hipoklorit) 10 ml suya karıştırın.
Elma suyu tabakları15 g Drosophila agarı 725 ml dH2O içinde kaynatın. 25 g şeker ve 250 ml elma suyu ekleyin ve karıştırana kadar karıştırın. Çözeltiyi 55 C'ye kadar soğut, sonra 1.3 g tegosept ekleyip nazikçe karıştır. 60 x 15 petri plakalarına dökün ve soğutun. 4 C'de depola.
Engelleme çözümü9,8 ml 1X PBS'yi, 100 ul %10 Triton X-100 ve 100 ul Normal Donkey Serumu ile 15 konik bir tüpte karıştırın.
Embriyo yıkama çözeltisi70 g NaCl ve 2 ml Triton X-100 ile 1L dH2O karıştırarak 10X embriyo yıkama çözeltisi yapın. Çalışan çözüm için dH2O ile 1X'e seyrelt.
Düzeltme10 ml 1X PBS'yi mikrodalgada önceden ısıtın. 0.4 g  ekleyin; paraformaldehit ve pipet karışımı. Çözülmeyi hızlandırmak için 10 ul 14N NaOH ekleyin. 90 C'lik ısı bloğuna çözünene kadar koyun. Katı paraformaldehit kalmayınca, pH nötr hale getirmek için 10 ul 14N HCL ekleyin. Paraformaldehit kullanırken her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve gözlükler takın.
Montaj medyası9 ml gliserol ve 1 ml Tris baz pH 8.0 karıştırın. 0,05 g n-propil-gallat ekleyin,  karıştırıp ısıtarak erisin. Aliquot 0.5 ml eppendorf tüplerine aktarın. 
Rodamin dekstran çözeltisiRodamin etiketli 10 kDa Dekstranı 0,5M Sodyum Fosfat, pH 7,5 ve 5 mM Potasyum Klorür'de 1 mg/ml'ye çözünerek taze boya çözeltisi yapın.
Hamaya ezmesi50 g ticari maya (Red Star) ile bir tutam sakroz ve kalın bir macun elde edecek kadar su ile karıştırın. 4 C'de depola.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K vr ml Septal Bile ke NoktalarDrosophila Embriyolarmmunboyama ProtokolEpitel Bariyer FonksiyonuTemel SJ ProteinleriLateral MembranEktodermal DokularS k la t r c Bile keAdherens Bile ke

İlgili makaleler