Yöntem makalesi

Besin Maddesinin Pseudomonas aeruginosa biyofilm gelişimine Gerçek Zamanlı Görselleştirmesi Mikrofluidik Sistem Kullanılarak

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 Mayıs 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zengin (TSB) ve minimal (FAB) besin ortam bileşimlerinin, mikrokanalda sabit durum akış ortamında Pseudomonas aeruginosa PAO1 ve PA14 biyofilm gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patojenik bakteri Pseudomonas aeruginosa , çok sayıda nozokomial enfeksiyonun başlıca nedenidir ve artan antimikrobiyal direnci nedeniyle önemli bir halk sağlığı tehdidi oluşturmuştur. Bu makale, iki önemli P. aeruginosa suşu olan PAO1 ve PA14'te biyofilm gelişiminin gerçek zamanlı görselleştirmesi ve nicelendirilmesi için mikrofluidik sistemin kullanımını detaylandıran kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, bakteri kültürlerini sürekli ve sürekli bir ortam akışına maruz bırakmak için optik olarak şeffaf, çok kanallı mikrokanal plakaları kullanır; bunlar arasında triptik soya suyu (TSB) veya değişken karbon kaynak konsantrasyonlarına sahip modifiye edilmiş minimal titiz anaerobik et suyu (FAB) dahil olmak üzere klinik ortamlarda bulunan koşulları taklit eder. 24 saat boyunca, otomatik gerçek zamanlı görüntüleme, biyofilmlerin büyüme ve olgunlaşmasını, biyofilm yüzey alanı kapsamı, kalınlığı ve yüzey pürüzlülüğü şeklinde yüksek derecede tekrarlanabilir bir şekilde yakalar. Deneysel amaç, sonuçları kullanarak her iki suş için de biyofilm oluşumunun besin ortam bileşimindeki değişikliklerden önemli ölçüde etkilendiğini göstermektir. Bu görselleştirilmiş protokolün amacı, araştırmacılara düzenli laminar akış koşullarında biyofilm dinamiklerini inceleme yöntemi sağlamaktır ve elde edilen bilgiler, nozokomial ortamlarda erken evre P. aeruginosa biyofilmlerinin yok edilmesi için alternatif, antimikrobiyal olmayan stratejiler geliştirmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemin amacı, iki farklı kültür ortamının, yani triptik soya suyu (TSB) ve modifiye minimal titiz anaerobik çorba (FAB) olan iki Pseudomonas aeruginosa suşunun (PAO1 ve PA14) biyofilm büyümesi üzerindeki etkisini gözlemlemektir. P. aeruginosa PAO1 ve PA14 yaygın laboratuvar referans suşları olmasına rağmen, PA14 suşu bitkilerden omurgasızlara kadar daha fazla konak grubunu enfekteeder 1. TSB besin suyu genel amaçlı bir kültür ortamıdır ve karbon kaynağı olarak 2,5 g/L glukoz içerir ve organik azot için kazein ve soya peptonları bileşimi sayesinde çok çeşitli bakteriler yetiştirebilir; doğal şeker tedarikiyle birlikte osmotik dengeyi korumak için sodyumklorür 2. Buna karşılık, minimal FAB ortamı, anaerobik bakterilerin büyüme gereksinimlerini incelemek için tek bir karbon kaynağının minimum konsantrasyonları (50 kat indirgeme) ile 0,05 g/L seviyelerde formüle edilmiştir. Hem PAO1 hem de PA14 suşları tek yönlü, laminar akışa maruz kaldı ve bu da 0,01 Pa düşük duvar kesme gerilimine yol açtı. Bu kesme stresi değeri, kistik fibroz hastalarının bronşları ve gastrointestinal sistem dahil olmak üzere P. aeruginosa ile kolonize olmuş bölgelerde sıkça görülür. Biyofilm büyümesi, gerçek zamanlı biyofilm yüzdesi yüzey alanı kaplaması, kalınlığı ve yüzey pürüzlülüğünün aritmetik ortalaması değerlendirilerek 24 saat boyunca ölçüldü.

P. aeruginosa biyofilmleri, nozokomial enfeksiyonların önemli bir yüzdesinden sorumludur ve kistik fibrozlu kişiler için başlıca ölümnedenlerinden biridir 3,4,5. Karbon kaynak seviyelerinin bakteriyel biyofilm gelişimi üzerindeki etkisine dair önceki araştırmalar, biyofilm geliştirme sırasında hidrodinamik akışın kritik rolünü ihmal etmiş, P. aeruginosa enfeksiyon bölgelerini temsil etmeyen kesme gerilme değerleri kullanmış veya deney sonrası sadece biyofilm kinetik ve morfolojik analiz yapmıştır 6,7. Bu sınırlamalar, kistik fibroz hastalarında bulunan fizyolojik ortamları yakından taklit eden mikrofluidik bir kanal içinde sabit durum akış koşullarında biyofilm gelişiminin gerçek zamanlı görüntülemesi kullanılarak ele alınır.

Bu yöntem, biyofilm gelişimini incelemek için kullanılan alternatif tekniklere kıyasla önemli avantajlar sunar. 24 saatlik biyofilm büyüme döneminde gerçek zamanlı görüntülemenin uygulanması, gelişmekte olan biyofilmin rahatsız edilmemesini sağlar; çünkü kurutma veya kimyasal değişiklik gerekmez; bileşimindeki değişiklikler önlenir ve örnek manipülasyonu gerektiren yöntemlere göre daha temsilci sonuçlar eldeedilir 8. Ayrıca, düzenli hidrodinamik akış koşulları uygulanarak ve karbon kaynak konsantrasyonlarını büyük ölçüde değiştirerek, bu prosedür P. aeruginosa nozokomial enfeksiyonlarının bulunduğu bölgelerde bulunan fizyolojik ortamları daha doğru şekilde tekrarlar. Bu, 96 kuyuyla mikrotiter plakaları veya kuponlar gibi statik testler kullananlara kıyasla daha temsilci bir yöntem haline getirir; bu testler, sıvı akışının biyofilm gelişimi üzerindeki kritik etkisini yakalayamayan 9,10,11.

Kullanılan mikrofluidik cihaz, boyutlarının bronşioller ve bronşlar12 gibi akciğer bölümlerine benzer olması nedeniyle özel olarak seçilmiştir. Ayrıca, P. aeruginosa enfeksiyonları, ağır yanık yaraları olan hastalar için büyük bir endişe kaynağıdır; burada glikoz seviyeleri hastanın normalaralığından 13,14 anlamlı şekilde değişebilir.

Bu protokol özel olarak iki P. aeruginosa suşunu kullansa da, benzer koşullarda enfeksiyonlara neden olan veya bölgeleri kolonize eden diğer bakterilerin erken evre gelişimi üzerine yapılan araştırmalar için de geçerlidir. Ayrıca, diğer besin ortamı bileşimleri ve akış koşulları (örneğin, pulsatil ve salınımlı akışlar veya daha yüksek duvar kesme değerleri) aynı yöntemle incelenebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cam eşyaları temizleme

  1. Medya ve agar için kullanılacak iki 200 mL cam şişe, üç adet 1 L cam şişeleri ise yaklaşık 5 dakika boyunca oda sıcaklığında %10 hidroklorik asit (HCl) banyosuna batırın.
    DIKKAT: Hidroklorik asit aşındırıcıdır. Tüm asit işlemlerini uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) takarak kimyasal bir davlumboz ile gerçekleştirin.
  2. Daha sonra HCl banyosundan cam eşyaları çıkarın ve iki kez musluk suyuyla, bir kez damıtılmış suyla (dH 2O) durulayın.

2. Triptik soya suyu ortam hazırlığı

  1. TSB çözeltisini hazırlayın, temiz bir tartı ve hassas bir denge kullanarak 6 g/200 mL TSB tozu ağırlığını alın.
    NOT: Kullanılan TSB tozunun bileşimi şu şekildedir: Dekstroz (2,5 g∙L-1), Dipotasyum fosfat (2,5 g∙L-1), kazeinin pankreas sindirimi (17 g∙L-1), soya ununun Papaik sindirimi (3,0 g∙L-1) ve Sodyum klorür (5,0 g∙L-1).
  2. 200 mL dH2Oölçüm silindiri kullanarak ölçün ve daha önce temizlenmiş cam şişelerden birine dökün.
  3. 6 g TSB'yi 200 mL dH2Oiçeren temiz cam şişeye ekleyin, şişeyi sıkıca kapatın ve yaklaşık 2 dakika karıştırarak tozu çözerek TSB çözeltisi ortamı oluşturulur.
  4. Çözüm sterilize etmek için 121 °C sıcaklıkta ve 1,5 atm basınçta 15–20 dakika boyunca otoklav TSB ortam çözeltisi alınır.
    NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) TSB çözeltisi kullanımlar arasında oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) saklanabilir ve gelecekteki deneyler için kullanılabilir.

3. Titiz anaerobik et suyu ortamı hazırlama

  1. FAB ortam iz metal çözeltisi hazırlayın.
    1. Ayrı ve temiz tartı tekneleri ve spatula kullanın; kütleler 0,5–210 g arasında tartılarken hassas bir denge, 0,001–0,5 g arasındaki kütleler ise analitik bir teraziye kullanılır. Aşağıdaki bileşenleri ve miktarlarını ölçün: CaSO 4.2H 2O (200 mg∙L-1), FeSO4.7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4.5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4.7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4.7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1) ve H3BO3 (5 mg∙L-1)7,9.
    2. Her bir bileşeni, içinde 1 L dH2Obulunan 1 L temizlenmiş cam şişeye ekleyin vedH 2O ile iyice karıştırın.
    3. Kalan iki 1 L sterilize cam şişeye 1 ml karışımı 1 L dH2Oile ekleyin ve iyice karıştırın.
  2. Gece kültürleri için 20 mM sodyum sitratla takviyeli FAB hazırlayın
    1. Aşağıdaki bileşenleri ve miktarlarını ayrı, temiz tartma tekneleri ve spatula ile ölçün; 0,5-200 g arasındaki kütleleri tartırken hassas bir denge ve 0,001-0,5 g arasındaki kütleleri tartırken analitik bir tartı: Sodyum sitrat (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO4.2H 2O(6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) ve CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Tüm bileşenleri, 1 LdH2Ove 1 mL iz metal çözeltisi içeren kalan 1 L sterilize cam şişelerden birine ekleyin.
    3. İyice karıştırın.
  3. Biyofilm büyümesi için 0,3 mM glikoz takviyeli FAB hazırlayın.
    1. 20 mM sodyum sitratı 0,3 mM glikozla değiştirin. 3.2.1 adımında listelenen aynı bileşenleri ve kütleleri kullanın.
    2. Kalan temizlenmiş 1 L cam şişede 0,3 mM glikoz FAB bileşenlerini 1 mL dH2Oile 1 mL iz metal çözeltisi ile ekleyin ve iyi karıştırın.
  4. Ortamı sterilize etmek için 121 °C buhar sıcaklığında ve 1,5 atm basınçta 15-20 dakika otoklav yapın.
    NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) FAB ortam çözeltisi, kullanımlar arasında oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) saklanabilir ve gelecekteki deneyler için kullanılabilir.

4. TSB agar hazırlama

  1. 8 g/200 mL TS agar hassas denge ve yıkanmış tartı ile spatula ile ölçün.
  2. Aynı hassas dengeyi kullanarak ayrı bir tartı kullanarak bakteriyolojik derece agar'da 1 g/200 mL ölçün.
  3. Bir ölçüm silindiri kullanarak 200 mL dH2Oölçüp daha önce temizlenmiş son cam şişeye dökün.
  4. Her iki agar bileşenini 200 mL dH2O içine dökün ve iyi karıştırın.
  5. Ortamı sterilize etmek için 121 °C sıcaklıkta ve 1,5 atm basınçta 15–20 dakika otoklav yapın.
    NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) TSB agar, kullanımlar arasında oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) saklanabilir ve gelecekteki deneylerde kullanılmadan önce yeniden ısıtılması gerekir.

5. Petri kabı Pseudomonas Aeruginosa kültürü

  1. Mikrodalgada yaklaşık 5 dakika veya çözelti sıvı olana kadar eritin.
  2. Kullanım için hazır olan %70 etanol solüsyonuyla bir sınıf II güvenlik kabini yüzeyini açıp dezenfekte edin. Bu bölümdeki tüm adımları bu sınıf II güvenlik kabininde gerçekleştirin.
  3. 25 mL agar çözeltisini 50 mL'lik bir şişeye ölçüp 90 mm Petri kabına dökün ve agarın sertleşmesini bekleyin.
  4. -80 °C dondurucudan P. aeruginosa PAO1 ve PA14 dondurulmuş stoklarını alın. Stokları kuluçka makinesine yaklaşık 5 dakika veya içindekiler tamamen eriyene kadar 37 °C'ye yerleştirin.
  5. Aşılama döngüsünü eritilmiş P. aeruginosa stoklarından birine daldırın ve örneği agarın üzerine yayın.
  6. Diğer P. aeruginosa suşu için 5.5. adımı tekrarlayın; biri PAO1 süzü, diğeri PA14 süzü ile olmak üzere iki ayrı P. aeruginosa Petri kabı kültürü oluşturulur.
  7. Her Petri kabını içindeki P. aeruginosa suşu, canlanma tarihi ve baş harflerle etiketleyin, ardından 16–18 saat boyunca 37 °C'de kuluçka makinesine koyun.
    NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) P. aeruginosa PAO1 ve PA14 Petri kapları, 4 °C'de 4 haftaya kadar saklanabilir ve gelecekteki deneyler için kullanılabilir.

6. Pseudomonas aeruginosa PAO1 ve PA14 gliserol stokları

  1. Kullanım için bir sınıf II güvenlik kabinini açıp dezenfekte edin, gece kültürlerini saklamak için sekiz adet 50 mL şişe seçin.
  2. Daha önce üretilmiş TSB ve sodyum sitrat FAB ortamı (bölüm 3) kullanılarak, sekiz şişeden dördüne 5 ml TSB ortamını, kalan dördüne ise sodyum sitrat minimum FAB ortamı dökebilirsiniz.
  3. Daha önce kuluçka içinde bulunan Petri kapları ve aşılama döngüsü kullanılarak, P. aeruginosa PAO1 Petri kabındaki beş ayrı koloniye dokunun ve TSB şişelerinden birine aktarın. Bunu sodyum sitrat FAB ortamı ve P. aeruginosa PA14 süzümü Petri kabı için tekrarlayın.
  4. Temiz bir aşılama döngüsünü kalan dört TSB ve sodyum sitrat FAB ortam şişesine doğrudan daldırarak kontrol cihazları oluşturun.
  5. Tüm sekiz şişenin hepsini 16–18 saat boyunca 200 RPM ve 37 °C sıcaklıkta sallanan kuluçka makinesinde kuluçka yapın ve net şekilde etiketleyin.
  6. Kültür şişelerini alın, P. aeruginosa ile aşılananların bulanık olduğundan ve kontrol olarak kullanılanların temiz olduğundan emin olun.
  7. P. aeruginosa'yı kültür ortamından ayırmak için dört P. aeruginosa aşılanmış şişeleri 4000 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca 20 °C'de santrifüj edin. Santrifüjün dengede olduğundan emin olun.
  8. Üst yüzeyi dikkate alın ve P. aeruginosa pelletini %15 gliserol içeren 1 mL çözelti ile santrifüjledikten sonra tekrar askıya alın, 150 μL gliserol ve 850 μL taze TSB veya sodyum sitrat FAB ortamı içerir.
  9. Yeniden süspansiyon edilmiş kültürleri 1 mL şişelere aktarın ve -80 °C dondurucuya koyun.
    NOT: (DURAKLAMA NOKTASI) Gliserol stokları uzun vadeli depolama için -80 °C'de saklanabilir ve gelecekteki deneyler için kullanılabilir.

7. Gece kültürlerinin optik yoğunluğunun ölçülmesi

  1. 6.1–6.5 numaralı adımları tekrarlayın; sadece iki TSB orta şişesi için, biri kontrol olarak diğeri PAO1 P. aeruginosa suşu ile olsun.
  2. 1 mL TSB ortamını 1 mL spektrofotometre şişesine, sınıf II güvenlik kabininde pipet yapın ve 0,9 mL TSB ortamını ikinci şişeye aktarın, böylece 0,1 mL gece kültürü ekleyin.
  3. Spektrofotometreyi 600 nm ışık dalga boyuna ayarlayın ve makineyi kalibre etmek için 1 mL TSB spektrofotometre şişesiyle 0.1 mL süspansiyonşişesinin 15 optik yoğunluğunu ölçün.
    1. Ölçülen soğurma 0.1 değilse, gereken süspansiyon hacmini yeniden hesaplayın.
      NOT: 0.1 (V1) soğukkans ölçümü elde etmek için gereken süspansiyon hacmi, başlangıçtaki 0.1 mL süspansiyon şişesi absorbansı ölçümü C 1, süspansiyonun ayarlandığı istenen absorbans C2 ve istenen yoğun gece süspansiyon hacmi V2 kullanılarak hesaplanabilir:
      C1V1 = C2V2
      Yukarıdaki örnekte, C1 = 3.59, C2 = 0.1 ve V2 = 10 mL ise, gece boyunca askı hacmi 10 mL çözeltiyle 0.279 mL olur.
  4. TSB ortamını 50 mL'lik bir şişeye ölçün ve 10 mL 0.1 OD 600 nm süspansiyon oluşturmak için gereken süspansiyon hacmi kadar TSB ortamını çıkarın. Gece kültürü kullanılarak, hesaplanan süspansiyon hacmini ve yaklaşık 5 saniyelik vorteksi ekleyin.
  5. 10 mL ayarlanmış süspansiyondan 1 mL'ni spektrofotometre şişesine aktarın ve soğurmayı tekrar ölçün, böylece 0.1 olduğundan emin olun.
  6. PA14 ve TSB ortamı ile hem P . aeruginosa suşları hem de sodyum sitrat FAB ortamı için yukarıdaki 7.1–7.5 ölçülerini tekrarlayın.

8. Uygulanabilir hücre sayısı

  1. dH2O'yu sınıf II güvenlik kabininde kare Petri kabına aktarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 180 μL'yi şeffaf 96 delikli polistiren plaka16'nın 2–9 numaralı sütunlarına aktarın.
  2. 10 mL 0.1 OD 600 süspansiyonunu ayrı bir kare Petri kabına aktarın ve çok kanallı pipet kullanarak süspansiyonun 200 μL'sini 96 kuyu polistiren plakanın 1. kolonuna aktarın.
  3. 96 kuyuklu polistiren plakanın 1. sütunundan çok kanallı pipet kullanılarak 20 μL'den fazla süspansiyon aktarılır, ardından kanal 2'deki 20 μL seyreltilmiş süspansiyon kanal 3'e aktarılır, tekrar tekrar kanal dokuzuna yapılır ve 10-1'den 10-8'e kadar süspansiyon seyreltmeleri oluşturulur.
  4. 50 mL TS agar (bölüm 4 ve 5.1) bir şişe kullanarak sınıf II güvenlik kabininde kare Petri kabına aktarın ve agar bulanık hale gelene kadar bırakın.
  5. 2–9 numaralı sütunlar boyunca her bir kuyudan 10 μL'yi TS agar Petri kabına kolon şeklinde aktarın; çok kanallı pipet kullanılarak, sütunların birbirine temas etmemesini sağlayın.
  6. TS agar'ı 37 °C'de 24 saat kuluçkalayın, aktarılan seyreltmeler yerleşene kadar beklensin.
  7. Petri kabının sayılabilir olup olmadığını belirleyerek mililitre (mL) başına koloni oluşturan birimleri (CFU) hesaplayın (30 ila 300 koloni arasında).
  8. Kullanılan 10 mL süspansiyonun seyrelme faktörünü belirleyin; bu durumda, süspansiyon 1/10'a (0.1 OD 600) kadar seyreltilmiştir.
  9. Her kaplamalı kolonun bireysel seyrelme faktörlerini hesaplayın. Bu, her sütuna eklenen seyreltilmiş süspansiyon miktarının, askı eklendikten sonra kolonun toplam hacmine bölünmesidir. 96 kuyu tabelasının 2. sütununda (Petri kabının 1. sütununda) 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Her bir sütunun bireysel seyrelme faktörlerini çarparak toplam seri seyrelme faktörünü hesaplayın.
    NOT: Bu durumda, her sütundan diğerine 20 μL aktarıldığından, her sütunun toplam hacmi 200 μL olduğundan, her seri seyreltme 1/10 idi. Toplam seri seyrelmesi 1 × 10-8 oldu.
  11. Sulandırma 96 kuyu tabakasından Petri kabına aktarılırken kaplama seyrelme faktörünü belirleyin. CFU/mL'yi belirlemek için, her bir (10 μL) kaplamalı kolonun hacmini 1 mL'ye böl. Bu durumda: figure-protocol-1.
  12. Son sulandırma faktörü, orijinal süspansiyon seyrelme faktörü (0.1) ile toplam seri seyrelme faktörü (1 × 10-8) ve kaplama seyrelme faktörü (figure-protocol-2) ile çarparak belirlenir.
  13. Orijinal örnekteki CFU∙mL-1'i hesaplayın, plakadaki CFU'yu nihai seyreltme faktörünün tersi ile çarpın.
    NOT: Bu durumda, 200 CFU sayılırsa, bu 200 1/1 × 10-8 × uygulanması anlamına gelir ve CFU/mL 2 ×10 10 CFU∙mL-17 olur.

9. Mikrofluidik sistem kurulumu ve deneysel çalışma

  1. Her P. aeruginosa suşuyla birlikte 5 mL kültür ortamı aşılayın, gece kültürü oluşturuldu ve 37 °C'de 16–18 saat kuluçka yapın.
  2. Mikrofluidik sistemi ve ilgili yazılımı kurun.
    1. Mikrofluidik sistem bileşenlerini şu sırayla etkinleştirin: Güç kaynağı, mikrofluidik sistem kontrolörü, CMOS kamera, muhafaza ısıtıcıları, mikroskop, bilgisayar ve ilgili monitörler.
    2. Mikrofluidik yazılımı aktive edin ve çok kanallı plakanın yanında bulunan 48 kuyuyla 0–2 Pa çok kanallı plaka ilişkili barkodu girerek eşlik eden kontrol modülü arayüzünü başlatın.
  3. P. aeruginosa çok kanallı plaka kuyu aşılama prosedürünü ayarlayın.
    1. Gece kültürünün optik yoğunluğunu 0.1 OD600'e ayarlayın.
    2. 50 μL 0.1 OD 600 süspansiyonunu altı kanalın her birinin çıkış yuvasına paralel olarak sınıf II güvenlik kabini içinde aktarın.
      NOT: Anormal sonuç tanımlama olasılığını en üst düzeye çıkarmak için aynı anda altı kanal paralel olarak çalıştırıldı.
    3. 48 kuyruklu çok kanallı plaka kapağını değiştirin ve sistem kuluçka makinesinin içindeki hareketli aşamaya aktarın ve sabitleyin.
  4. P. Aeruginosa çok kanallı plaka kanalı aşılama prosedürünü ayarlayın.
    1. Mikrofluidik sistem kontrol modülünü kullanarak mikrofluidik kanalları şu şekilde seçin: Manuel > Sütunlar 1–4 > Sıvı: TSB 37 °C'de > Maksimum Kesme (Pa): 0.1 (1 dyne∙cm-2 = 0.1 Pa) ve 48 kuyuyla 0–2 Pa çok kanallı plaka diyagramından bir çıkış kuyusu seçin.
    2. Akışı 2–4 saniye sonra durdurmak için iptal düğmesini seçin ve plakayı 30 dakika boyunca bırakın; böylece hücreler sürekli akışa başlamadan önce kanal alt tabakasına bağlandığından emin olun.
      NOT: 30 dakikalık bir süre, planktonik P. aeruginosa bakterisinin alt kanal duvarına yapışmasına yardımcı olarak yerçekimi kuvveti sağlar. Bu süre bakteri ve besin ortamının türüne bağlı olarak değişir.
    3. Çok kanallı plakayı hareketli kuluçka aşamasından çıkarın ve 1 mL taze TSB'yi sınıf II güvenlik kabindeki altı kanalın her birinin giriş yuvasına aktarın.
    4. Çok kanallı plakayı kuluçka makinesinin içindeki hareketli aşamaya aktarın ve yerine sabitleyin.
  5. AutoRun'u kur.
    1. 24 saatlik deneyler boyunca kullanılan akışın doğada P. aeruginosa'nın bulunduğu yerlerle ilgili olduğundan emin olun; manuel > kesme gerilmesi: 0.01 Pa'ya geçin ve hacmdeki hacim akış hızını (μL⋅h-1) kaydedin. Bu değeri 48 kuyu mikrokanal plakası için 8.2 μL⋅h-1 olduğundan emin edin.
    2. Hacm akış hızını m3∙s-1'e dönüştürün, kanal kesit alanını (m2) hesaplayın ve 0,01 Pa hidrodinamik kesme gerilmesinde akış hızını belirleyin.
      NOT: Akışkan hacmi akış hızı denklemini kullanıp yeniden düzenleyerek, kanal boyunca sıvı hızı hesaplanabilir:
      figure-protocol-3
      Burada U, çok kanallı plakadaki kanalların mikrokanal kesit alanı (m2) olarak belirtilir.
    3. TSB ortamının yoğunluğu, ρ ve dinamik viskozitesi μ kullanılarak akış Reynolds sayısını hesaplayın ve P. aeruginosa biyofilmlerinin akış aralığında bulunduğundan emin olun. 0.01 Pa hidrodinamik kesme gerilimi için, TSB ve FAB ortamları için Reynold sayısının sırasıyla 0.0117 ve 0.0165 olduğundan emin olun. Bu aralığın dışındaysanız, sıvı koşullarının TSB olarak ayarlandığından emin olun.
      figure-protocol-4
      Burada Dh, kullanılan mikrokanalın hidrolik çapıdır ve şu kullanılarak elde edilir:
      figure-protocol-5
      Burada, w ve h, kullanılan mikrokanalın genişliğini (m) ve yüksekliğini (m) temsil eder.
    4. Görüntü alma bölgesindeki akış akışının tam olarak gelişmesini sağlamak için sıvı gelişim süresini hesaplayın.
      NOT: Laminar sıvının bir kanaldan geçme süresi, Reynolds sayısı Re ve kanalların hidrolik çapı Dh kullanılarak hesaplanabilir:
      Ldev = 0.06ReDh
    5. Otomatik çalıştırmayı kurun: Otomatik Çalıştırmayı düzenle > Protokol kurulumu > süre: 24 saat, 1 tekrarı ve 0.01 Pa kesme gerilimi ile. Protokolü kaydet.
    6. Yeni oluşturulan protokolü bir tekrarla 1–6 kanallarına uygulayarak Sequence Setup sekmesinde yeni bir dizis oluşturun ve 37 °C'de sıvı TSB seçin. Bu diziyi kaydet.
  6. Çok Boyutlu Erişim penceresi kullanarak görüntü edinimi kurun.
    1. Sistem yazılımıyla Çok Boyutlu Edinim'i seçin, ardından canlı düğmeyi ( Çok Boyutlu Kazanım penceresinin sol altında) seçin. Mikroskop aşamasında canlı görüntü düğmesi ve kamera büyütmeleri 5× ile 40× arasında mikroskop dokunmatik ekranında görüntü alanındaki bir kanalı göstererek 1–6. kanalları görüntülemek için yönlendirin.
    2. Kamerayı görüntü alınmaya hazırlayın: Çok Boyutlu Alım > Kaydet: Kaydedilecek görüntüler için bir dizin seçin > Zaman geçişi: Süre: 24 saat, hidrodinamik akışla aynı süre > Zaman Aralığı: Her alınan görüntü arasındaki süre, 10 dakika olarak ayarlanmıştır.
    3. Kamera ayarlarını Dalga Boyu > Aydınlatma: parlak alan %50 kamera %50: siyah-beyaz > otomatik pozlama: her zaman > elde edilen: her zaman noktası > otomatik odak: asla.
    4. Biyofilm görüntülerini yakalamak için kamera konumlarını belirleyin; büyütmeyi 20× olarak ayarlayın; bu zaman 665,6 μm × 665,6 μm boyutlarında bir görüş alanı oluşturulur ve kanal izleme bölgesinin ortasına gidin; burada kanal numarası ortada kazınacaktır.
    5. Sahne konumunu kamera tarafından yakalanması için ekleyin, Sahne etiketi bölümine gidin ve ekleme butonunu seçerek dizine ekleyin.
      1. Bunu, kanal izleme bölgesinin girişinden yukarı ve 3.0016 mm yukarıdaki noktalar için tekrarlayın; burada konum kamera görüş alanının orta noktasını temsil eder.
        NOT: Bu görüntüleme pozisyonları, izleme bölgesi boyunca biyofilm büyümesinin temsillerini sağlamak ve içindeki akışın tam olarak gelişmesini sağlamak için seçilmiştir. Bu durumda, her mikrokanal için üç görüntü alınır; bu durumda her 10 dakikada 18 görüntü alınır.
  7. Deneysel çalışma yapın
    1. Sistem kontrol modülü penceresinde AutoRun > Run Setup > Sequence: 0.01 PA dizisini seçin, ardından başlat'ı seçin.
    2. Hemen ardından Çok Boyutlu Satın Alma penceresine > Edin. Bu, 24 saatlik deneysel prosedürün her 10 dakikasında 18 görüntünün alınmasını başlatır ve deney sona erdiğinde 2610 görüntü üretir.
      NOT: Yukarıdaki bölüm, aynı koşullarla yapılan ilk deneyin ardından yaklaşık 48 saat daha altı mikrokanal üzerinde yeniden üretilmiştir.

10. Z-stack birikimi

  1. Her deneysel çalışmanın sonunda, üç kanal seçin ve bu kanallar boyunca üç bölümden oluşan z-yığınlarını 40× büyütmede elde edinin; Çok Boyutlu Edinim > Ana Seçeneği açın: 'Z Serisi' hariç tüm seçenekleri işaretinden çıkarın.
  2. Multi Dimensional Acquisition içinde bir kanal boyunca bir bölüm seçildikten sonra Z-serisine gidin ve > Etkileşimli ayarları değiştirin: Artış: 0.5 ve her iki işaret kutusunu işaretinden çıkarın.
  3. Mikroskop odaklama düğmesini kullanın ve biyofilm odak dışı olana kadar döndürün ve Set Top To Current'i seçerek z-mesafesini girin. Bu işlemi tekrarlayın, ancak odalama düğmesini ters yöne döndürüp Set Bottom To Current'i seçin. Bu, mikroskopa z-stack'ı yakalama mesafesi verir.
  4. Z-stack'i kaydetmek için Kaydetme penceresinden bir klasör seçin ve edinmeye başlamak için pencerenin sağ alt köşesindeki Acqui'yi seçin.

11. Deney sonrası görüntü ve veri analizi

  1. Biyofilm yüzdesi yüzey alanı verilerini edinin.
    1. Alınan görüntüleri sistem yazılımına şu seçeneklerle yükleyin: Analiz araçları > Çok Boyutlu Verileri İnceleme > Temel Dosyayı Seç > Dizini Seç: kaydedilen görüntülerin olduğu klasöre gidin ve seçin > Dalga Boyu 1> Görünümü ve alınan görüntü sayısını yatay olarak gösteren orta kare bölüme yukarıdaki küçük, gri kutuya sağ tıklayın, sol köşe.
    2. Her kanal bölümünün görüntülerini teker teker yükleyin, Aşama konumunu seçin: görüntülemek için konumu seçin > Görsel(ler)i yükleyin. Resim serisini TIFF dosyası olarak kaydedin.
    3. Biyofilmi vurgulayan Karanlık Nesneler için Eşik Görüntü > Otomatik Eşik seçerek görüntüyü eşik etegin, ardından Dikdörtgen Bölge aracıyla görüntüyü sınırlayın.
      NOT: Eşik edilmiş görüntünün sol tarafındaki kaydırıcı, biyofilm ile arka plan arasındaki farkı daha iyi ayırt etmek için eşik yoğunluğunu değiştirmek için yukarı ve aşağı hareket ettirilebilir. Eğer görüntüde gölgeler varsa, kısmayı sınırlayın, çünkü gölgeler varsayılan olarak vurgulanmış olabilir, ölçüm değerleri değiştirilmesin.
    4. 24 saat deney boyunca görüntüdeki biyofilmin yüzdelik yüzey alanı kapsamına dair verileri, sistem yazılımı penceresinde MM Standart > Ölçüm > Bölge Ölçümleri seçerek dikdörtgen sınır içindeki vurgulanan biyofilm hakkında bir veri tablosu oluşturularak Eşik Alanı %'si dahil olmak üzere alın. Bir günlük dosyasını açıp kaydetmek için Open Log'u seçin ve veriyi günlük dosyasına girmek için F9: Log Veriler'i seçin.
    5. Bir tablo açın ve her kanal bölümü için 24 saatlik Biyofilm verilerini kullanarak 24 saat boyunca biyofilm yüzdesi yüzey alanını gösteren bir grafik oluşturun.
  2. Biyofilm kalınlığını ve aritmetik ortalama yüzey pürüzlülüğünü elde edin.
    1. Z-stack'i Fiji'ye (ImageJ) kaydettim, kaydedilen dosyayı Fiji kontrol çubuğuna sürükledim ve 8-bit görüntüye dönüştürdüm: Image > Type > 8-bit.
    2. Biyofilm ile kanal yüzeyi arasındaki kontrastı artırarak istenmeyen gürültüyü ortadan kaldırın: Görüntü > > Parlaklık/Kontrastı Ayarlayın.
    3. Görüntüyü eşik olarak belirleyin, biyofilm piksel değeri 255 (beyaz) ve arka plan piksel değeri 0 (siyah): Görüntü > Eşik > Ayarlayın.
    4. Görüntünün ölçeğini ayarlayın, Analiz > Ölçeği Ayarlayın > Piksel cinsinden Mesafe: 2048 > Bilinen mesafe: 332.8 > Piksel en-boy oranı: 1.0 > Uzunluk birimi: μm.
      NOT: Bilinen mesafe 332,8 μm'dir; çünkü kullanılan Hamamatsu kamerasının görüş alanı 2048 × 2048 piksel arasındadır; her piksel 6,5 μm boyutta ve görüntüler 40 × büyütmeyle çekilmiştir.
    5. Z-yığınını, her z-yığını dilimideki biyofilm yüzey alanını hesaplayan ve toplayan ve serinin kalınlığını hesaplamak için giriş ölçek değerlerini kullanan özel bir makro18 (Ek Dosya 1) kullanarak analiz edin; böylece hacim bulunabilir. Alternatif olarak, hesaplanan hacmi yüzey alanına bölerek biyofilm kalınlığını bulun.
    6. Her z-serisinden biyofilmin aritmetik ortalama yüzey pürüzlülüğü değerlerini ImageJ (Fiji değil) eklentisi SurfCharJ'yi indirerek elde edin ve eklentiler klasörüne kaydedin.
    7. Kayıtlı yığını kontrol çubuğuna sürükleyip 32-bit bir görüntüye dönüştürerek z-stack'i ImageJ'ye yükleyin: Görüntü > Türü: 32-bit.
    8. Yığının yüzeyindeki gri değerlerdeki varyasyonu gösteren bir yüzey grafiki oluşturun: Grafik >Profilini Analiz > Daha Fazlası: Yüksek Çözünürlüklü Grafik. Yüksek çözünürlüklü grafiki 32-bit'e dönüştürün.
    9. Aritmetik ortalama yüzey pürüzlülüğü değerini SurfCharJ eklentisini başlatarak elde edin: Eklentiler > SurfCharJ > Pürüzlülük hesaplaması: Ortalama örnekleme süresi (): 10.
      NOT: SurfCharJ eklentisi, z-yığının yüzeyi boyunca çeşitli gri değerleri kullanarak aritmetik ortalama yüzey pürüzlülüğünü hesaplar. Yüzey pürüzlülüğü parametrelerini içeren bir tablo üretilecektir, ilgilenilen tek parametre aritmetik ortalama yüzey pürüklüğü olan Ra'dır. Tablo değerleri piksellerden mikrometreye dönüştürülmelidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölüm, yukarıdaki protokol prosedürü uygulanırken temsil eden sonuçları özetlemektedir. Tüm deneyler, her biri altı paralel kanaldan oluşan en az üç bağımsız biyolojik kopya ile gerçekleştirildi ve veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. Tüm grafiklerdeki hata çubukları, şekil kılıflarında tanımlandığı gibi standart sapmayı temsil eder.

PAO1 ve PA14 suşlarının TSB ortamında 37 °C ve 0.01 Pa hidrodinamik duvar kesme gerilmesi altında 24 sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü oluşturan birkaç kritik adım, alternatif ve daha geleneksel yöntemlere kıyasla biyofilm oluşumunun daha kapsamlı ve doğru analizini mümkün kılar. Önemli bir bileşen, 350 μm × 70 μm × 4 mm (B × H × L) boyutlarında mikro ölçekli kanallara sahip 48 kuyuklu bir mikrokanal plakasının kullanılmasıdır. Bu boyutlar, kistik fibroz hastalarının idrar kateterleri veya akciğer bronşiyolları gibi hastane ortamlarında bulunan akış koşullarını ve mikro ortamları özellikle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Sheffield Üniversitesi Mekanik, Havacılık ve İnşaat Mühendisliği Fakültesi'ne (MAC) finansman için teşekkür etmek isterler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Modifiye FAB ortamı için
48-kuyu 0-2 Pa mikrokanal plakası - cam kapak kayışıHücre Mikrosistemleri910-0047-5PackMedya akışı ve biyofilm
büyümesi için gerçek zamanlı görüntüleme ile mikrokanallar
-80 ve derece; C DondurucuThermo Fisher Scientific1.16057E+15Gliserol stoklarını daha fazla kullanıma kadar depolamak için
Agar, Bakteriyolojik SınıfAcros Organics443570010Agar plakaları için - kültürlenen bakteriler
Analitik DengeVWRVWRI611-2297Kullanılan ortam bileşenlerini ölçmek için
OtoklavPriorklav4304Cam eşyalarını sterilize etmek için
BioFlux 1000HTBen & L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- mikrosistemler/cihaz/bioflux-1000ht-
kesme-akış-sistemi/ 		Mikrokanal akışı ve biyofilm büyüme deneyleri için
BioFlux Kontrol ModülüBen & L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
mikrosistemler/cihaz/bioflux-1000ht- kesme-akış-sistemi/ 		Mikrokanallar içinde medya akışını ve biyofilm büyümesini kurmak ve izlemek
BioFlux Montaj YazılımıBen & L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Mikrokanallar içinde medya akışını ve biyofilm büyümesini kurmak ve izlemek
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Modifiye FAB ortamı için
CaSO4.2H2OChemCruzA17191 L minimum metal çözeltisi için
Şeffaf Polistiren 96 Kuyu PlakasıCorning, Yardımcı YıldızCLS7007Uygulanabilir hücre sayısı için
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-11 L minimum metal çözeltisi için
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100G1 L minimum metal çözeltisi için
Eppendorf Tüpleri 3810XEppendorf30125150P. aeruginosa gliserol stokları için
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005E1 L minimum metal çözeltisi için
Fiji (ImageJ)Ulusal Sağlık Enstitülerihttps://imagej.net/software/fiji/downloa
DS		Z-yığınlı görüntü işleme
GlikozSigma-Aldrich50-99-7Glukozla modifiye FAB ortamı için
GliserolSigma-Aldrich56-81-5P. aeruginosa gliserol stokları için
H3BO3Fisher Scientific10043-35-31 L minimum metal çözeltisi için
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Kamera Model C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UMikrokanal akışı ve biyofilm büyümesi için
deney gerçek zamanlı görüntüleme
KH2PO4Fisher Biyoreaktifleri7778-77-04Modifiye FAB ortamı için
Metillenmiş RuhSigma-Aldrich2857Mikrobiyoloji dolabını temizlemek için
kullanımından önce ve sonra
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GModifiye FAB ortamı için
Mikrobiyoloji Kabini Sınıf IIThermo Fisher Scientific42111226Bakteri
kirletici bakteri, et suyu veya agar olmadan protokol adımlarını uygulamak
Mini Kuluçka MakinesiLabnet Internationalsn03171014PAO1 ve PA14'ü -80 derece ve dereceden sonra eritmek için; C dondurucu ve
ilk 24 saat bakteriyel agar plakası büyümesi için
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-51 L minimum metal çözeltisi için
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Modifiye FAB ortamı için
NaClSigma-AldrichS5886-500GModifiye FAB ortamı için
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-61 L minimum metal çözeltisi için
Hassas DengeVWRVWRI611-2299Kullanılan ortam bileşenlerini ölçmek için
Soğutmalı SantrifüjHeraeus40289841P. aeruginosa kültürünün
gliserol stokları için süpernatanttan ayırılması
Yarı-Mikro KüvetlerAlpha LaboratuvarlarıX72053Optik yoğunluk ölçümleri için
Sallama Kuluçka MakinesiINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- shaker/multitron-standardıGece kültürleri için
Sodyum sitratSigma-Aldrich71498-250GSodyum sitratla modifiye FAB ortamı için
Steril Plastik Aşılama HalkalarıMicrospec15782105P. aeruginosa PAO1 ve PA14 için agar plakaları ve şahin tüplerine inokulasyonu
Triptik Soya Agar, vegitonMillipore14432-500G-FAgar plakaları için - kültürlenen bakteriler
Triptik Soya SuyuSigma-AldrichT8907Susuz kültür ortamı - 6 g/200 mL
Tip 1 Su DispenseriThermo Fisher Scientificsn42103311Damıtılmış su için
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-01 L minimum metal çözeltisi için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
  2. T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from: https://www.merckmillipore.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/275/615/t8907dat.pdf (2018).
  3. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 7 (2), 277-281 (2001).
  4. Pseudomonas Aeruginosa - Biofilm Formation, Infections and Treatments. , IntechOpen. (2021).
  5. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A Review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  6. She, P., et al. Effects of exogenous glucose on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. MicrobiologyOpen. 8 (12), e933(2019).
  7. Klausen, M., et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. Mol Microbiol. 48 (6), 1511-1524 (2003).
  8. Preda, V. G., Săndulescu, O. Communication is the key: biofilms, quorum sensing, formation and prevention. Discoveries (Craiova). 7 (3), e100(2019).
  9. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  10. Seneviratne, C. J., Yip, J. W. Y., Chang, J. W. W., Zhang, C. F., Samaranayake, L. P. Effect of culture media and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis. Arch Oral Biol. 58 (10), 1327-1334 (2013).
  11. Rajewska, M., Maciąg, T., Narajczyk, M., Jafra, S. Carbon source and substrate surface affect biofilm formation by the plant-associated bacterium Pseudomonas donghuensis P482. Int J Mol Sci. 25 (15), 8351(2024).
  12. Goswami, S., Dey, C. COVID-19 and SARS-CoV-2: The Science and Clinical Application of Conventional and Complementary Treatments. , CRC Press. Boca Raton. (2022).
  13. Jeschke, M. G. Clinical review: Glucose control in severely burned patients - current best practice. Crit Care. 17 (4), 232(2013).
  14. Badoiu, S. C., et al. Glucose metabolism in burns—What happens. Int J Mol Sci. 22 (10), 5159(2021).
  15. Wacogne, B., et al. Concentration vs. optical density of ESKAPEE bacteria: A method to determine the optimum measurement wavelength. Sensors. 24 (24), 8160(2024).
  16. Meyer, C. T., et al. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nat Microbiol. 8 (12), 2304-2314 (2023).
  17. Allen, T. Serial Dilution Problem Help. , The University of Vermont. Available from: https://www.uvm.edu/~btessman/calc/serhelp.html (2012).
  18. Blog Post: Loading and Measurement of Volumes in 3D Confocal Image Stacks with ImageJ. , VISIKOL. Available from: https://visikol.com/blog/2018/11/29/blog-post-loading-and-measurement-of-volumes-in-3d-confocal-image-stacks-with-imagej/ (2024).
  19. Kasetty, S., Katharios-Lanwermeyer, S., O'Toole, G. A., Nadell, C. D. Differential surface competition and biofilm invasion strategies of Pseudomonas aeruginosa PA14 and PAO1. J Bacteriol. 203 (22), e0026521(2021).
  20. Shen, Y. Role of biofilm roughness and hydrodynamic conditions in Legionella pneumophila adhesion to and detachment from simulated drinking water biofilms. Environ Sci Technol. 49 (7), 4274-4282 (2015).
  21. Sankari, A., Sharma, S. Cystic Fibrosis. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  22. Cameron, K., Jarvis, K. Urinary Catheterisation for Adults Clinical Guideline. , Available from: https://www.rightdecisions.scot.nhs.uk/media/2210/urinary-catheterisation-adultsfinal.pdf (2022).
  23. IV access improvement project guidelines: choosing catheter sizes. , Children's Hospital of Philadelphia. Available from: https://www.chop.edu/clinical-pathway/iv-access-improvement-project-guidelines-choosing-catheter-sizes (2017).
  24. Casadevall, A., Fang, F. C. Reproducible science. Infect Immun. 78 (12), 4972-4975 (2010).
  25. Sutlief, A. L., et al. Live cell analysis of shear stress on Pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system. J Vis Exp. (143), e58926(2019).
  26. Shear Flow BioFlux Plates. , Cell Microsystems. Available from: https://cellmicrosystems.com/wp-content/uploads/2024/09/BioFlux-Brochure_v6-Single-page.pdf (2024).
  27. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Med Princ Pract. 28, 28-35 (2019).
  28. Jahid, I. K., Lee, N. -Y., Kim, A., Ha, S. -D. Influence of glucose concentrations on biofilm formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J Food Prot. 76 (2), 239-247 (2013).
  29. De Plano, L. M., Caratozzolo, M., Conoci, S., Guglielmino, S. P. P., Franco, D. Impact of nutrient starvation on biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: An analysis of growth, adhesion, and spatial distribution. Antibiotics. 13 (10), 987(2024).
  30. Tan, X., et al. Alkaline phosphatase LapA regulates quorum sensing-mediated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 under phosphate depletion stress. Microbiol Spectr. 11 (6), e0206023(2023).
  31. Quan, K., et al. Water in bacterial biofilms: pores and channels, storage and transport functions. Crit Rev Microbiol. 48 (3), 283-302 (2022).
  32. Green, A. S. Modelling of peak-flow wall shear stress in major airways of the lung. J Biomech. 37 (5), 661-667 (2004).
  33. Lee, K., Han, J. Analysis of the urine flow characteristics inside catheters for intermittent catheter selection. Sci Rep. 14, 13273(2024).
  34. Wang, C., et al. Carbon starvation induces the expression of PprB-regulated genes in Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 85 (22), e01705-e01719 (2019).
  35. Sarinas, P. S. A., et al. Inspiratory flow rate and dynamic lung function in cystic fibrosis and chronic obstructive lung diseases. Chest. 114 (4), 988-992 (1998).
  36. Franca, M. J., Valero, D., Liu, X. Turbulence and Rivers. Treatise on Geomorphology. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  37. Shroder, J. F. Treatise on Geomorphology. , Elsevier Science & Technology. San Diego. (2022).
  38. Narciso, D. A. C., Pereira, A., Dias, N. O., Melo, L. F., Martins, F. G. Characterization of biofilm structure and properties via processing of 2D optical coherence tomography images in BISCAP. Bioinformatics. 38 (6), 1708-1715 (2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Laminer AkBiyofilm KantifikasyonuY zey Alan Kaplama OranAntimikrobiyal DirenNozokomiyal Enfeksiyonlar
Video yakında

İlgili makaleler