Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Rayleigh Parçalanma Aerosolleri Yoluyla MRNA Poliplekslerinin Burun İçinden Ulaşılması: Burun Biriktirme ve Fonksiyonel Test İçin Vitro Yöntem

746 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70000

⸱

20 Ocak 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Rayleigh parçalanmasını viral olmayan mRNA vektörlerinin aerosolize edilmesi için hafif bir süreç olarak sunar. Aerosol mRNA vektörleri için bölgesel birikim, Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modeliyle değerlendirilmiştir. İnsan akciğer hücrelerinde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonu, aerosol sonrası mRNA vektörlerinin fizikokimyasal ve biyolojik işlevlerinin korunmasını temsil eder.

Özet

mRNA tedavilerinin burun yoluyla ilemi, aşılama ve solunum yolu hastalıklarının tedavisinde umut verici bir stratejidir ve patojenin giriş bölgesinde doğrudan bağışıklık aktivasyonu sağlar. Ancak, geleneksel aerosolizasyon yöntemleri (örneğin, ultrasonik veya yüksek basınçlı nebulizatörler) aşırı kesme kuvvetleriyle viral olmayan mRNA vektörlerini bozur ve mRNA'ların yapısal bütünlüğünü ve biyolojik aktivitelerini kaybetmesine neden olur. Rayleigh parçalama burun atomizatoru, polietilenemin (PEI)-mRNA vektörlerini nazikçe aerosolize etmek için kullanıldı. Yeşil Floresan Protein (GFP) kodlayan mRNA, katyonik poliplekslere formüle edilmiş ve aerosolleşme öncesi ve sonrası süreçleri karakterize edilmiştir. Rayleigh parçalanma süreci, minimal kesme ile sürekli bir damlacık mikro-jeti oluşturur ve böylece nanopartiküllerin fizikokimyasal özellikleri korunur. Aerosolleşme öncesi ve sonrası tutarlı parçacık boyutu, düşük polidispersite indeksi ve stabil zeta potansiyeli gözlemlendi; bu da mRNA poliplekslerinin fizikokimyasal özelliklerinin aerosolizasyon için Rayleigh parçalanması yoluyla iyi korunduğunu doğruladı. Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modeli kullanılarak PEI-mRNA aerosolleri sağlandı. Aerosolize mRNA'lar esas olarak türbinat bölgelerinde biriktirildi. Nazofarenks veya akciğer eşdeğer kesitlerinde önemsiz fraksiyonlar bulundu. Ayrıca, aerosol sonrası mRNA polipleksleri A549 insan akciğer epitel hücrelerine başarıyla iletilmiş ve tespit edilebilir GFP ekspresyonu üretmiştir. Bu protokol, Rayleigh ayrımlama aerozolizasyonunu kullanarak yıkıcı olmayan intranazal mRNA iletim yöntemini gösterir. Viral olmayan mRNA vektörlerinin fizikokimyasal özelliklerini ve biyolojik işlevlerini etkili bir şekilde korur; sulu fazı hedefli burun biriktirmesi için uygun boyutlarda damlacıklara atomize eder. Bu protokol, mRNA'ların etkili bir şekilde aerosolize edilmesi ve burun boşluğundaki bölgesel birikimlerinin değerlendirilmesi için yeni bir yaklaşım ortaya koymaktadır.

Giriş

Burun mukozasına (birçok solunum yolu patojeninin giriş portalı) aşı iletilmesi, güçlü yerel bağışıklık yaratabilir ve enfeksiyonları kaynağında engelleyebilir. Burun içi grip aşılarının başarısı ve burun içi COVID-19 aşılarının yakın zamanda onaylanması, hem mukozal hem de sistemik bağışıklık yanıtlarını indükte burun yolunun etkinliğinivurgulamaktadır 1. Bu nedenle, mRNA aşılarının burun içi dağıtımı, solunum yolu viral enfeksiyonlarını önleme stratejisi olarak büyük ilgi görmektedir. Ancak büyük bir teknik zorluk, hassas mRNA poliplekslerini stabilitelerinden ödün vermeden solumu solumu taban aerosol'e dönüştürmektir.

Rayleigh parçalama aerosolizasyonu, farklı bir fiziksel prensiple çalışarak hafif bir alternatif sunar. Rayleigh parçalama cihazında, basınçlı sıvı akışı mikro ölçekli bir delikten zorla geçerek sürekli bir mikro-jet oluşturur. Jet, Plateau-Rayleigh kararsızlığı nedeniyle doğal olarak eşit boyutlarda damlalaraayrılır 2. Yüzey gerilimi sıvı sütununun, nozul çapının yaklaşık iki katı karakteristik bir dalga boyunda parçalanmasına neden olur. Ultrasonik nebülizasyonun aksine, bu süreç neredeyse hiç türbülans kayma yaratmaz; Damlacıklar, dış parçalama kuvvetlerinden değil, jetin kendi kendine istikrarsızlığından doğal olarak oluşur. Sonuç olarak, nanopartikül formülasyonları minimum stres yaşar. Rayleigh parçalanmasının lipid nanopartikül (LNP) mRNA'larını aerosolize edebildiği gösterilmiştir; bu durum boyutlarında, yüzey yükünde veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir değişiklik olmadan sprey öncesi ve sonrasında 3,4,5. Bu yöntemde, PEI-mRNA aerosolleşmeden sonra sağlam ve işlevsel kalır; bu durum, daha sert nebulizasyon tekniklerinde görülen bozulmanın aksine.

Rayleigh ayrışmasının bir diğer avantajı damla boyutu üzerindeki kontroldür. Üretilen damlacıklar nispeten büyüktür (yaklaşık 20-30 μm civarında). Bu damla boyutu burun dağıtımı için idealdir: aerodinamik çapta >10 μm olan partiküller, akciğerlere sürüklenmek yerine burun ve üst hava yollarına birikmeeğilimindedir. Rayleigh atomizer, çoğunlukla bu eşiğin üzerinde damlacıklar üreterek, doğal olarak burun boşluğuna birikmeyi hedefliyor. Hedefleme, Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modeliyle uygulama tekniklerini optimize etmek için daha da geliştirilir. AINI, in vivo sprey birikme desenlerini doğru tahmin eden 3D baskılı bir burun hava yolureplikasıdır 6. Bu modelde, burun deliğine 45° açı ile püskürtülmenintürbinatlara büyük ölçüde birikmeyi artırdığı bulunmuştur 7. Uygulama açısı, ifade deseniniönemli ölçüde etkiler 7. Nazofarenks veya akciğerler gibi hedef olmayan bölgelerde birikme istenmez, çünkü boğazda tahriş, kötü tat veya sistematik yan etkilere neden olabilir8. Bu protokolde, bu koşullar (45° sprey açısı ve kontrollü soluma hava akışı) çoğaltıldı ve mRNAaerosol 3'ün türbük birikintisi maksimize edildi. Önceki veriler, verilen mRNA kütlesinin yarısından fazlasının optimal koşullarda türbinat bölgesine odaklanabileceğini, %10'3'ün ötesine ulaşabileceğini gösteriyor. Bu hedefli teslimatın, dozun bağışıklık bölgelerinde yoğunlaştırılması (iyi damarlanmış ve bağışıklık hücreleri açısından zengindir) dozu yoğunlaştırarak aşı etkinliğini artırması beklenmektedir ve aynı zamanda atık veya yan etkilere yol açabilecek hedef dışı birikmeyi en aza indirecektir.

Bu yöntemler makalesinde, Rayleigh kırılması yoluyla mRNA'nın aerosolize edilmesi deneysel prosedürü ayrıntılı olarak açıklanmakta, AINI modelinde bölgesel birikimler değerlendirilmekte ve depolanmış mRNA'nın in vitro biyolojik aktivitesi değerlendirilmektedir. GFP kodlayan bir reporter mRNA, insan hücrelerinde transfeksiyon sonuçlarını görselleştirmek için kullanılır. HEK293T hücreler, aerosol komplekslerin işlevselliğini test etmek için seçilir. Aerosol mRNA'nın in vitro hücresel tutulmasını artırmak için, mRNA PEI ile dallanarak hücrelere eklenmeden önce PEI-mRNA polipleksleri oluşturulur. PEI, mRNA dağıtım verimliliğini artırabilen katyonik polimer transfeksiyon ajanıdır ve gen taşıması için önceki optimizasyona dayanarak burada 24:1 N:P (azot: fosfat) molar oranı kullanılmıştır. PEI, bu çalışmada yalnızca hücre-kültürü doğrulama aşamasında kullanılır ve gerçek bir buruna aerosol teslimatının bir parçası değildir (in vivo sadece LNP-mRNA'ya dayanır, ancak hücre kültüründe bu, gen ifadesinin tespiti için maksimize edilmesine yardımcı olur).

Bu protokol, aerosol mRNA'nın stabilite sorununu ele alan intranazal mRNA aşısı için yeni bir yaklaşımı vurgulamaktadır. Rayleigh ayrımı, birkaç çalışmada nükleik asit dağıtımına ancak yakın zamanda uygulanmıştır 3,4,5,9 ve bu çalışma, bu tekniğin uygulanması için ayrıntılı bir metodolojik rehber sunmaktadır. Bu adım adım prosedürü izleyerek araştırmacılar, mRNA nanotaşıyıcılarının hafif aerosolleşmesini yeniden üretebilir ve biriktirme ile transfeksiyon özelliklerini değerlendirebilirler. Aşağıdaki Protokol bölümü sıralı bölümlere ayrılmıştır: (1) PEI-mRNA formülasyonu; (2) Aerosolleşmeden önce ve sonra nanopartikül karakterizasyonu (boyut ve zeta potansiyeli); (3) Rayleigh parçalama atomizerinin ve AINI burun biriktirme prosedürünün işletilmesi. Başarı için temel hususlar, örneğin RNase içermeyen koşulların korunması ve cihazın doğru hizalanması, belirtilmektedir. Sonuçlar ve Tartışma, temsil sonuçları, yöntemin geleneksel yaklaşımlara göre avantajlarını, potansiyel uygulamaları (örneğin, grip veya COVID-19 için burunaşıları 10,11,12) ile sınırlamalar ve sorun giderme ipuçlarını içerir. Bu kapsamlı metodoloji, tekrarlanabilir intranazal mRNA dağıtım deneylerini mümkün kılmayı ve iğnesiz mukozal RNA aşılarının geliştirilmesini hızlandırmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Kültür HEK293T ve A549 hücre hatları, PEI-mRNA transfeksiyonundan önce %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %2 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile tamamlayıcı ortamda yapılmıştır. Birleşim noktasına ulaştıktan sonra her iki hücre hattını yaklaşık her 48 saatte bir geçin. Tohum hücreleri, cm² başına 40.000 hücre yoğunluğunda ve ~48 saat kültür. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri transfeksiyondan hemen önce fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) yıkayarak kalıntı serumu çıkarın ve transfeksiyon koşullarını standartlaştırın. Kullanımdan önce tüm hücre kültürü şişelerini, 24 delikli plakaları, PBS, pipetleri ve pipet uçlarını otoklavlayın.

1. PEI-mRNA formülasyonu

  1. PEI-mRNA komplekslerinin oluşturulması ( in vitro transfeksiyon için)
    NOT: Bu adım yalnızca PEI hücre kültüründe transfeksiyonu artırmak için kullanılırsa gereklidir.
    1. İstenen N:P molar oranı için gerekli PEI miktarını hesaplayın.
      NOT: N:P = 24 (mRNA'da negatif yüklü fosfatların mol başına 24 mol pozitif yüklü amin anlamına gelir) kullanılır; ve 10 μg mRNA miktarı bu N/P oranında PEI-mRNA'lar oluşturmak için ~31 μg PEI gerektirir.
    2. Sulandırılmış bir PEI çözeltisi hazırlayın (örneğin, suda 1 mg/mL stok) ve otoklavlanın.
    3. mRNA'yı uygun bir konsantrasyona (örneğin, 0,2 μg/μL) seyreldin.
    4. Pei çözeltisini mRNA çözeltisine nazikçe karıştırırken ekleyin (vortex yapma).
      NOT: Karışım küçük bir tüpte olabilir; Pipetle dikkatlice yukarı aşağı veya karıştırmak için tüpü çevirin.
    5. PEI'nin mRNA'ya elektrostatik bağlanmasını sağlamak için ~20 dakika oda sıcaklığında kuluçka yapın.
      NOT: PEI kullanılmıyorsa, çıplak mRNA doğrudan aerosolize edilebilir. Ek PEI, A549 hücrelerinde gen ifadesini büyük ölçüde iyileştirdi, ancak isteğe bağlıdır ve toksisite açısından gerçek in vivo teslimat için kullanılmayabilir.

2. Nanopartikül karakterizasyonu (boyut ve zeta potansiyeli)

NOT: Ölçüm parametrelerini yazılımda ayarlayın ve ölçü veya zeta potansiyelini ölçmek için analizörü kullanmadan önce yöntem olarak kaydedin. Yöntem kurulumu cihazın çalıştırılması için gereklidir ve parametreler ölçüm ortamına, kullanılan küvete ve numunenin özelliklerine bağlıdır.

  1. Dinamik ışık saçılması (DLS) aerosolleşme öncesi
    1. Bir parçacık boyutu analizörü kullanarak, formülasyonun seyreltilmiş bir örneğini tek kullanımlık boyutlandırma küvetine yükleyin (örneğin, 0.2 μg/μL 500 μL).
    2. Analizörü açın ve bağlı bilgisayarda Software13'ü açın.
    3. Pencerenin üstündeki Ölçüt butonuna tıklayın.
    4. Pencerenin üstündeki mavi Dosya simgesine tıklayarak önceden ayarlanmış boyut yöntemini seçin.
    5. Protokolü örnek isimiyle uyumlu şekilde yeniden adlandırın.
    6. Hazını açmak için analizörün kapağının düğmesine basın.
    7. Küveti hazneye yerleştirin.
    8. Yazılım penceresinin üstündeki yeşil Çalıştır butonuna tıklayın. Ölçümüntamamlanmasını bekleyin 13.
    9. Yazılım penceresinin üstündeki Analiz Butonuna tıklayın ve ardından sonuçsayfası 13'teki Boyut butonuna tıklayın.
    10. İstatistik Tablo'dan ortalama hidrodinamik çapı (Z-ortalaması) ve polidispersite indeksini (PDI) alın.
    11. Analizörün kapağı düğmesine basarak hazneyi açın, küveti çıkarın ve kapağı kapatın.
    12. Küveti atın ve atomizörü RNAazsız su ile %70 v/v etanol ile durulayarak dezenfekte edin ve boyut ölçümleri arasında kurutmayı kolaylaştırın.
      NOT: Rayleigh atomizeri için, memelikte tuz birikintisi veya kalıntı kalmadığından emin olun, çünkü bunlar püskürtme performansını etkileyebilir.
  2. Zeta potansiyel öncesi aerosolleşme
    1. Aynı aleti (veya bir Zeta potansiyel analizörü) kullanın, formülasyonun seyreltilmiş bir örneğini katlanmış bir kapiler hücreye yükleyin (örneğin, 0.2 μg/μL'de 700 μL).
    2. Analizörü açın ve bağlı bilgisayarda Software13'ü açın.
    3. Pencerenin üstündeki Ölçüt butonuna tıklayın.
    4. Pencerenin üstündeki mavi Dosya simgesine tıklayarak önceden ayarlanmış zeta yöntemini seçin.
    5. Protokolü örnek isimiyle uyumlu şekilde yeniden adlandırın.
    6. Hazını açmak için analizörün kapağının düğmesine basın.
    7. Küveti hazneye yerleştirin.
    8. Yazılım penceresinin üstündeki yeşil Çalıştır butonuna tıklayın. Makinenin13 numaralı çalışmasını bekle.
    9. Yazılım penceresinin üstündeki Analiz Butonuna tıklayın ve ardından sonuçsayfası 13'teki Zeta butonuna tıklayın.
    10. Zeta potansiyelini (yüzey yükü) İstatistikler Tablosu'na bakarak elde edin.
    11. Analizörün kapağına basarak odayı açın, örneği çıkarın ve kapağı kapatın.
    12. Küveti ve atomizeri RNAazsız su ve %70 v/v etanol ile durulayın; böylece Zeta potansiyeli ölçümleri arasında dezenfekte edin ve kurutmayı kolaylaştırın.
      NOT: Rayleigh atomizeri için, memelikte tuz birikintisi veya kalıntı kalmadığından emin olun, çünkü bunlar püskürtme performansını etkileyebilir.

3. Rayleigh parçalanma aerozolizasyonu ve burun birikimiyle

  1. Atomizer ve AINI kurulumu
    1. Rayleigh parçalama burun atomizeri cihazını ve Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modelini birleştirin.
      NOT: AINI modeli, insan burun boşluğunun farklı bölgelerine (örneğin, burun deliği vestibülü, türbinat bölgesi, koku bölgesi, nazofarenks) karşılık gelen anatomik olarak temsil eden boş kesitlerden oluşur.
    2. Kullanımdan önce tüm AINI bileşenlerinin temiz ve kuru olduğundan emin olun (kalıntılar biriktirme sonuçlarını etkileyebilir). Deiyonize su9 ile yıkayarak ve ardından etanol veya organik bir çözücüyle temizleyin.
    3. AINI'yi, çıkışında vakum pompasına bağlı olan bir Yeni Nesil Darbe Cihazına (NGI) bağlayarak burun kanallarından hava akışını çekin.
    4. Akış hızını 7.5 L/da'ya ayarlayın - bu akış yetişkinlerde yavaş ve derin burun solumasınıtemsil eder 6. NGI'nin indüksiyon portuna bağlı kalibre edilmiş bir akış ölçer (veya rotametre) kullanın. Pompayı akış ölçer 7.5 L/dakika gösterene kadar ayarlayın.
      NOT: Test için gerekli akış hızında hava akışını ölçmek için bir akış ölçer kullanın.
    5. Bu hava akışını püskürtme süresi boyunca koruyun. Cihazı AINI'ye doğru şekilde mühürlemek için Parafilm kullanın.
  2. Atomizerin konumlandırılması
    1. Rayleigh kırılma atomizerinin nozulunu AINI burun deliğinin (vestibül bölümü) girişine 45° açıyla yerleştirin.
    2. Atomizörü işlem sırasında kaymaz hale getirin (tüm bağlantılar, model bölümleri, boru ile pompa) hava geçirmez olsun.
  3. Örnek yükleniyor
    1. Hazırlanan PEI-mRNA süspansiyonunu nazikçe karıştırarak homojenlik sağlanır (kabarcık oluşmasını önlemeyin).
    2. Örneği atomizer rezervuarına çekin.
      NOT: Cihaz tasarımına bağlı olarak, bu, atomizer'a bağlanan bir şırınga veya pipet ucu doldurulmasını içerebilir.
    3. Örneği cihaza yükleyin.
      NOT: Örneğin, atomizer'daki merkezi bir kapağı veya odayı çıkarın, örneği pipetleyin ve cihazı güvenli bir şekilde yeniden monte edin. Herhangi bir sızıntı olmadığından ve gerekirse cihazın doğru şekilde astarlandığından emin olun.
  4. Aerosolün üretimi
    1. Cihazın talimatlarına göre, püskürtme başlatmadan önce veya aynı anda hava pompasının hava akışını (AINI üzerinden 7,5 L/dakika) açın.
    2. Aerosolizasyonu başlatmak için Rayleigh parçalama atomizerini etkinleştirin.
      NOT: Manuel şırıngala tahrikli atomizör için, şırınganın pistonunu düzenli olarak bastırarak sıvıyı delikten geçirin. Mümkünse tüm örnek hacmini tek seferde sürekli püskürtün. Piston düzgün bir şekilde bastırılmalıdır ki stabil bir çalışma basıncı oluşturulsun, çünkü formülasyon ancak yüksek basınca basınçlandırıldıktan ve mikro-delik14 içindeki duvar kesme hızına maruz kaldıktan sonra aerosolize edilir. Hızlı piston hareketleri basıncı değiştirir ve dolayısıyla hem kesme hızını hem de kesme pozlamasüresini değiştirir 14.
    3. Akış hızının tüm süreç boyunca 7.5 L/dakika olarak kaldığından emin olun. Aerosol damlacıkları burun geçiş modelinden geçmeli ve aerodinamik boyutlarına göre farklı bölgelere birikmelidir.
    4. Zaten birikmiş damlaların daha aşağı çekilmesini veya düzensiz şekilde kurumasını önlemek için hava pompasını hemen kapatın.
  5. AINI'den örnek koleksiyonu
    1. AINI modelini dikkatlice bireysel anatomik segmentlerine ayırarak her bölgeden biriktirilmiş nanopartikülleri toplayın.
      NOT: Sökmeden önce, bölümleri takip etmek için yönelimi not edin veya işaretleyin.
    2. Altı bölmeden birikintiler toplayın: (i) atomizer cihazı, (ii) burun vestibülü bölümü, (iii) türbinat bölümü, (iv) koku alanı, (v) nazofarenks bölümü ve (vi) herhangi bir sonraki yakalama (örneğin, bağlı NGI aşamaları veya akciğer nüfuz eden fraksiyonu temsil eden son filtre)
    3. Her bölme için, biriktirilen materyali yıkamak için ölçülen bir hücre kültürü ortamı hacmi kullanın.
      NOT: Örneğin, türbinat birikintisini toplamak için, türbinat kesitini ayırın ve iç yüzeylerini tek kullanımlık pipet kullanarak 5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile iyice durulayın. Tüm yüzeyleri nazikçe yıkayın, sonra durulamayı etiketli 15 mL santrifüj tüpüne dökün (transferi kolaylaştırmak için huni kullanın). Durulama sırasında, segment yatay veya hafifçe eğik tutularak tam iç yüzey temasını sağlamak ve sıvının kaçmasını önlemek için yapılmıştır. Vestibülü, koklu alan, nazofarenks ve diğer bölümler için benzer şekilde tekrarlayın; her biri için 5 mL taze DMEM kullanıp ayrı etiketli tüplerde toplayın.
    4. Atomizer cihazından kalan örnekleri geri alın.
      NOT: Şırınga tipi bir şırınga için şırıngayı ve memeliği bir tüpte durulayın.
    5. AINI bir NGI'ye bağlıysa, sıvıyı NGI (kaskad darbe makinesi) aşamalarından alınarak ince parçacıkları hapseye düşürmek için (örneğin, aşamaları DMEM ile durulayarak yakalamak).
    6. Tüpü toplanan sıvıyla kapatın.
      NOT: Damlaları tezgah yüzeylerinde veya buharlaşma yoluyla kaybetmekten kaçının.
  6. Koleksiyon sonrası yönetim
    1. Toplandıktan hemen sonra, PEI-mRNA örnekleri transfeksiyon için hücrelere ayrı ayrı yerleştirildi.
      NOT: PEI-mRNA örneklerini transfeksiyon için kullanmadan önce ~1-2 saat (en fazla 6 saate kadar) buzdolabında bırakabilir. Her toplanan PEI-mRNA örneğinden, aerosol sonrası vektörlerin (yani DLS ve zeta ölçümlerinin) karakterize edilmesi için belirli bir hacim (maksimum 1 mL) alınır.
  7. Cihazın temizlenmesi
    1. Her denemeden sonra atomizer ve AINI modelini iyice temizleyin, böylece sonraki deneylerin çapraz kontaminasyonunu önleyin.
    2. Tüm AINI bölümlerini ve atomizör parçalarını deiyonize suyla durulayarak ortam ve nanopartikülleri çıkarın, ardından %70 etanol ile dezenfekte edin ve kurutmayı kolaylaştırın.
      NOT: Cihazda veya modelde küçük delikler varsa, onları bir şırıngayla yıkamak için kullanın.
    3. Tüm parçaları tamamen havalanacak şekilde kurutun (veya düşük ısıda bir kurutma dolabına yerleştirin) ve tekrar monte edin. Rayleigh atomizörü için, memelikte tuz birikintisi veya kalıntı kalmadığından emin olun, çünkü bunlar püskürtme performansını etkileyebilir.

4. Hücre görüntüleme

NOT: Transfeksiyondan sonra transfeksiyon ortamını çıkarın ve pozlamayı sonlandırmak için yerine taze, tam bir ortamla değiştirin. Raporlayıcı ekspresyonu ve hücre iyileşmesi için 48 saat kültür hücreleri. ~%80 birleşme durumunda, hücreleri %4 formaldehit ile 8 dakika sabitleyin, ardından çekirdekleri 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 300 nM) ile 5 dakika boyayın ve görüntülemeden önce 2 kez PBS yıkaması uygulanır.

  1. Flüoresans görüntüleme
    1. DAPI ve GFP için filtre setleriyle birlikte floresans mikroskobu kullanın.
    2. DAPI boyalı çekirdekleri görselleştirmek için Mavi kanal ile başlayın (uyarılma dalga boyu = 385 nm, emisyon dalga boyu = 477,5 nm).
    3. GFP-pozitif hücreleri görselleştirmek için Yeşil kanala geçin (uyarılma dalga boyu = 488 nm, emisyon dalga boyu = 525 nm).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yöntemlere odaklanan bir makale olarak, ayrıntılı sonuçlar birincil amaç değildir; Ancak, protokolün her bir parçasının beklenen sonuçlarını göstermek için temsilci bulgular sunulmaktadır. Aşağıda belirtilen şekiller, yöntemin geçerliliğini destekleyen örnek veriler (örneğin grafikler veya görseller) göstermektedir, ancak gösterim dışında yeni nicel analizler dahil edilmemiştir.

Damla boyutu ve birikme desenleri:
Rayleigh parçalama atomizer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde, formülasyonun aerosolize edilmesinden önce, mRNA hücre alımını artırmak için PEI ile dallanır. Bu, in vitro doğrulama sırasında LNP-mRNA teslimatıiçin bir vekil işlevi görür 10,15. PEI-mRNA, LNP formülasyonlarının çoğu işlevini, önemli biyolojik ve fonksiyonel özellikleri de dahil olmak üzere korur. 10. PEI'deki pozitif yüklü amin grupları, elektrostatik etkileşimlerle negatif yüklü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, King's Lisans Araştırma Bursu (KURF) ve King's College London tarafından sağlanan Öğrenci Fırsat Fonu tarafından sağlanan mali desteği takdir ettiler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
50 mL santrifüj tüpleriSigma-Aldrich Company LimitedCLS430829-500EA
50– 1000 μ L pipet uçlarıSigma-Aldrich Company LimitedZ740031-1000EA
A549 Hücre HattıAmerikan Tip Kültürü KoleksiyonuATCC CRM-CCL-185
Hava Akışı ÖlçerYokYokGenel hava akışı ölçer kullanılabilir.
Alberta İdealize Burun Girişi (AINI) modeliTSI Incorporated (Copley Scientific, Birleşik Krallık aracılığıyla)0001-01-8540
Otoklav gösterge bandıSigma-Aldrich Company LimitedZ744090
DAPISigma-Aldrich Company LimitedD1306
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)Gibco, Thermo Fisher Scientific11966025
Saf etil alkolSigma-Aldrich Company Limited32221-MMerck üzerinden satın alındı
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco, Thermo Fisher ScientificA5256701
FormaldehitSigma-Aldrich Company LimitedF8775
HEK293T Hücre HattıAmerikan Tip Kültürü KoleksiyonuATCC CRL-3216
Heraeus HERAsafe HS 12 Biyogüvenlik KabiniHeraeusYok
Yeni Nesil Darbe ÜreticisiMSP'ler, TSI'nin bir bölümü0170-01-1000Bu ürün ayrıca Copley Kataloğu'nda, bölüm numarası 5201'de yer almaktadır.
Nikon DS-Qi2 Monokrom Mikroskop KameraNikonYok
Nunc Hücre Kültürü İşlenmiş Çok TabakThermo Fisher Scientific142475
Nunc EasYFlask hücre kültürü ile işlenmiş şişelerThermo Fisher Scientific156340
ParafilmSigma-Aldrich Company LimitedP7793-1EA
Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL)Gibco, Thermo Fisher Scientific15140148
Fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) tabletlerThermo Fisher Scientific18912014
Polietilen hidroklorürSigma-Aldrich Company Limited764965-1GSLS üzerinden satın alındı
Rayleigh Jet Burun AtomizeriResyca BV EnschedeYumuşak Burun Spayı Adaptörü
RNAsız suThermo Fisher ScientificJ60610. EQC
Cuvette ÖlçüMalvern PanalyticalZEN0040
Katlanmış Kapiller hücreMalvern PanalyticalDTS1070
Zetasizer ProMalvern PanalyticalZetasizer Pro
Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer yazılımıMalvern PanalyticalYok

Kaynaklar

  1. Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
  2. Van Hoeve, W., et al. Breakup of diminutive Rayleigh jets. Phys Fluids. 22 (12), (2010).
  3. Li, H. Y., et al. Targeted nasal delivery of LNP-mRNAs aerosolised by Rayleigh breakup technology. Int J Pharm. 672, 125335(2025).
  4. He, P., et al. Rayleigh-based soft mist inhalers preserve mRNA-LNP integrity for pulmonary delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 115, 107651(2026).
  5. Biesel, A., et al. Soft mist inhaler nebulization by Rayleigh-breakup largely preserves functional integrity of liposomal mRNA in respirable aerosols. Eur J Pharm Sci. 214, 107300(2025).
  6. Chen, J. Z., Finlay, W. H., Martin, A. In vitro regional deposition of nasal sprays in an idealized nasal inlet: comparison with in vivo gamma scintigraphy. Pharm Res. 39 (11), 3021-3028 (2022).
  7. Chen, J. Z., Kiaee, M., Martin, A. R., Finlay, W. H. In vitro assessment of an idealized nose for nasal spray testing: comparison with regional deposition in realistic nasal replicas. Int J Pharm. 582, 119341(2020).
  8. Hopke, P. K., Wang, Z. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. , Springer. US, Boston, MA. (2012).
  9. Wang, H., et al. Evaluation of Rayleigh jet atomizer for intranasal delivery of lipid nanoparticle-siRNA formulations: stability, deposition, and device performance. Int J Pharm. 683, 126084(2025).
  10. Moreno Herrero, J., et al. Compact polyethylenimine-complexed mRNA vaccines. Nat Nanotechnol. 20 (9), 1323-1331 (2025).
  11. Geall, A. J., et al. Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14604-14609 (2012).
  12. Xi, J., Lei, L. R., Zouzas, W., Si, X. A. Nasally inhaled therapeutics and vaccination for COVID-19: developments and challenges. MedComm. 2 (4), 569-586 (2021).
  13. Zetasizer Advance Series User Guide. , MAN0592-15-EN edn, Malvern Panalytical. (2023).
  14. Method of aerosolizing nanoparticle formulations. China patent. , CN116723892A (2023).
  15. Casper, J., et al. Polyethylenimine (PEI) in gene therapy: current status and clinical applications. J Control Release. 362, 667-691 (2023).
  16. Jin, Y., et al. A novel experimental approach to measure nebulized droplet deposition pattern and deposition fraction in an idealized mouth-to-throat model. Phys Fluids. 35 (8), (2023).
  17. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  18. Liu, J., et al. Turbinate-homing IgA-secreting cells originate in the nasal lymphoid tissues. Nature. 632 (8025), 637-646 (2024).
  19. Debus, H., Baumhof, P., Probst, J., Kissel, T. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: biophysical characterization and in vitro transfection properties. J Control Release. 148 (3), 334-343 (2010).
  20. Brandtzaeg, P. Potential of nasopharynx-associated lymphoid tissue for vaccine responses in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 183 (12), 1595-1604 (2011).
  21. Foley, R. A., et al. Lipid nanoparticles for the delivery of CRISPR/Cas9 machinery to enable site-specific integration of CFTR and mutation-agnostic disease rescue. bioRxiv. , (2025).
  22. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  23. D'Angelo, I., et al. Hybrid lipid/polymer nanoparticles for pulmonary delivery of siRNA: development and fate upon in vitro deposition on the human epithelial airway barrier. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 31 (3), 170-181 (2018).
  24. Movia, D., Bazou, D., Volkov, Y., Prina-Mello, A. Multilayered cultures of NSCLC cells grown at the air-liquid interface allow the efficacy testing of inhaled anti-cancer drugs. Sci Rep. 8 (1), 12920(2018).
  25. Waltl, E., Eckl-Dorna, J., Selb, R., Valenta, R., Niederberger, V. Characterisation and culture of primary human nasal epithelial cells and the influence of interferon-gamma. Clin Transl Allergy. 4 (2), P21(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İntranazal mRNA İletimiPolietilenimin mRNAA549 HücreleriAlberta Nazal Giriş SistemiGFP EkspresyonuViral Olmayan mRNA VektörleriAerosolize mRNA Transfeksiyonu
Rayleigh Parçalanma Aerosolleri Yoluyla MRNA Poliplekslerinin Burun İçinden Ulaşılması: Burun Biriktirme ve Fonksiyonel Test İçin Vitro Yöntem
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.