Method Article

Yeniden oluşturulmuş bazaz zarı boyunca farklı hücre tipleri arasındaki dolaylı etkileşimlerin incelenmesi için üç boyutlu ortak kültür yöntemi

DOI:

10.3791/70027

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, çok az özel ekipman gerektiren ve çeşitli deneysel tekniklerle kolayca analiz edilebilen, yeniden oluşturulmuş bir bazal zarla ayrılan iki hücre tipinin üç boyutlu ortak kültürü için basit bir yöntemi detaylandırmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) ortak kültür, hücre-hücre etkileşimlerini in vitro deneyler kullanarak doğru şekilde incelemek isteyen araştırmacılar için hızla gelişen bir tekniktir. Hücresel ve hücre dışı ortam arasındaki sınırlı etkileşimler ve bozuk hücre morfolojisi dahil olmak üzere monokatmanlı hücre kültürünün sınırlamaları, in vivo hücresel ortamın simülasyonuyla ele alınır. Yapısal destek sağlamak için iskele kullanarak ve biyolojik olarak aktif hücre dışı matriks bileşenleri dahil edilerek, 3B kültürler dokuyla daha uyumlu davranış ve morfolojiler sergiler. Bu tür bir 3D ortama birden fazla hücre tipinin dahil edilmesi, biyomimetik model sisteminde hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanır. Her birinin kendine özgü avantajları ve zorlukları olan geniş bir 3D ortak kültür teknolojisi yelpazesi ortaya çıkmıştır. Çoğu zaman bu teknolojiler özel ekipman, karmaşık bir kurulum veya özel teknik bilgi gerektirir. Ayrıca, yeniden yapılandırılmış bazal zarla ayrılmış iki hücre tipi arasındaki dolaylı hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için birkaç standart yöntem mevcuttur. Burada, sadece temel teknik beceriler gerektiren ve daha yaygın materyaller kullanarak bazaz zarı boyunca dolaylı hücre-hücre etkileşimlerini başarıyla yeniden düzenleyen 3D bir ko-kültür yöntemi tanımlıyoruz. Bir hücre tabakası, Matrigel şeklinde bir hücre dışı matriks tabakasıyla kaplanır ve üstüne ikinci bir hücre tipi tohumlanır. Ortaya çıkan ortak kültür beş gün boyunca korunur; bu noktada hücreler immünofluoresans ile morfolojik değişiklikler açısından analiz edilir veya daha ayrıntılı genomik, transkriptomik veya proteomik analizler için ortak kültürden çıkarılır. Bu protokol, fiziksel temasın bazaz zarı tarafından yasaklandığı durumlarda hücre-hücre iletişiminin hücre davranışı üzerindeki etkisini incelemek için idealdir. Araştırmacılar daha fazla in vivo ile ilgili hücre kültürü yöntemlerini tercih etmeye devam ettikçe, yüksek giriş engellerini önlemek için daha sade bir yaklaşım gereklidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro hücre kültürü, sağlam, hızlı ve yaygın olarak kullanılan bir araştırma tekniğidir. Geleneksel hücre kültürü yöntemleri güçlü olsa da, in vivo ortamlardan büyük ölçüde farklıdırlar. Tek katmanlı hücre kültürünün mekansal olarak kısıtlı yapısı, gen ifadesi, morfolojisi ve biyokimyasında değişikliklere yol açar 1,2,3. Üç boyutlu (3D) kültür teknikleri bu eşitsizliği giderir; hücreler, organ ve dokularda bulunan ekstrasellüler matriksi (ECM) simüle edilen bir iskele içinde büyütülür. 3D kültürde, hücreler in vivo 4,5 gibi morfoloji ve davranış sergiler. Ancak, tek başına 3D kültür, in vivo mikroortamın birçok bileşenini tam olarak yansıtmaz çünkü diğer hücre tiplerinden katkılar yok.

Hücreler arasında doğrudan (temas) ve dolaylı hücre-hücre etkileşimleri, in vivo 7,8 hücrelerin davranışında önemli bir rol oynar. Bu etkileşimleri özetlemek için birden fazla hücre tipi birlikte 3B bir ortamda kültürlenerek 3D ortak kültür modelleri gerekir. Bu teknikler kullanılarak, in vitro gibi bir büyüme ortamı oluşturulabilir ve sonuçların biyolojikönemi artırılır 9,10. Ancak, belirli bir deney için gereken ortam ne kadar spesifik olursa, metodoloji o kadar karmaşık hale gelir. Bazal zar matrisi ile ayrılmış hücreler arasındaki hücre-hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılabilecek standart bir model sistemi eksiklik vardır. Bu nedenle, bu protokol, bazaz zar matrisi boyunca gerçekleşen hücre-hücre etkileşimlerini sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde simüle etmek için tasarlanmıştır. Daha önce kurulmuş bir 3D kültürmodeli 11'den uyarlanan bu teknik, kültürde iki farklı hücre tipini fiziksel olarak ayırmak ve salgılanan faktörlerin geçmesine izin vermek için bir Matrigel tabakası (ECM jeli) kullanır. Başlangıçta, adipositlerin mezenkimal meme kanseri hücreleri üzerindeki dolaylı etkisini incelemek için tasarlanmıştı, ancak çeşitli hücre tiplerine uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir. Bu yöntemin belirli bir deneysel tasarım için uygun olup olmadığına dikkatlice düşünülmelidir. Bu yöntem doğrudan hücre-hücre etkileşimine izin vermez ve bu nedenle bazal zar matrisi üzerinden hücreler arasında dolaylı iletişimi içeren in vivo senaryolarla sınırlı olmalıdır. Örneğin, bu sistem sitotoksik T hücreleri ile tümör hücreleri arasındaki etkileşimleri modellemek için ideal olmaz, çünkü hücreler genellikle doğrudan etkileşime girerler. Bunun yerine, bazal zarın ilgilenen iki hücre tipini doğal olarak ayırdığı biyolojik senaryoları düşünün. Örneğin, bu yöntem intravazasyon öncesi tümör hücreleri ile damar endotel hücreleri arasındaki etkileşimlerin incelenmesinde uygulanabilir.

Yaygın bir alternatif 3D ortak kültür yöntemi, özel mikrofluidik çiplerin veya "organ-on-a-chip (OoC)" kullanımını içerir. OoC sistemleri güçlüdür ve bireysel deneylere uyarlanabilir, ancak çip tasarımı, malzeme seçimi, çevresel ekipman, optimizasyon ve veri toplama için önemli zaman ve kaynak gerektirir12,13. Ayrıca, şu anda temel membran matrisinin biyolojik ve fiziksel ipuçlarını sağlayıp mikrofluidikakışa müdahale etmeyen, standart bir materyal veya yöntem yoktur. Bu nedenle, OoC teknolojisinin bazaz zarı boyunca hücre-hücre etkileşimlerinin çalışmalarına uygulanması ek zorluklar da beraberinde bulunmaktadır. Bu protokolde belirtilen yöntem, biyolojik önemi ve erişilebilirliği koruyan standartlaştırılmış bir alternatif sunmayı amaçlamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol (Şekil 1A), bazal zar matrisi boyunca hücre-hücre etkileşimlerini yeniden düzenlemek için tasarlanmış 3D bir ko-kültür sistemini özetler. Aşağı akış analizi konfokal mikroskopi kullanılarak (Şekil 1B) veya ko-kültür içinden hücreler alınarak (Şekil 1C) mümkündür. İki hücre popülasyonu arasında bir ECM jel tabakasının sıkıştırıldığı 'sandviç' yapısı kullanılarak protokol özel bir cihaz gerektirmez ve modern hücre kültürü tekniklerinin temel bilgisiyle gerçekleştirilebilir.

1. 3D Ortak kültür hazırlığı

NOT: Özetlenen protokol, 3T3-L1 adipositleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri kullanılarak 3D ko-kültür yönteminin temsili bir uygulaması olarak tasarlanmıştır. Farklı hücre tiplerinin kullanımı, hücre tohumlama yoğunluğunun optimize edilmesini ve ECM jel partilerinin ön test edilmesini gerektirecektir. Bu protokol, adipositsiz kontrol ve koşullu medya kontrolünün kullanımını ele alır. Deneysel hedefe bağlı olarak daha fazla kontrol gerekebilir.

  1. Hücre kültürü ve çözelti hazırlığı
    1. 3T3-L1 pre-adiposit ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarının kültürlerini edinip oluşturulur. Tüm hücreleri aseptik teknikle sınıf II biyolojik güvenlik kabinde ve standart yapışkan hücre kültürü yöntemleriyle bağımsız olarak büyütmekve bakım yapmak 15. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medyasında (DMEM) 3T3-L1 hücrelerini %10 (v/v) Yeni Doğan Baldır Serumu (NBCS) ve %1 Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL) ile takviye edin. RPMI 1640'ta MDA-MB-231 hücrelerini %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL) takviye edilmiş şekilde korumak.
      NOT: Bakım sırasında 3T3-L1 hücrelerinin %80 birleşme oranını aşmasına asla izin vermeyin ve 20. geçiş sayısının üzerindeki kültürler kullanmayın.
    2. 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO 4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 içeren 1x fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) stok çözeltisi edinin veya hazırlayın.
    3. 50 mL PBS-glisin yıkama çözeltisi hazırlamak için 0.375 g glikin eklenerek 50 mL PBS ile nihai glisin konsantrasyonu 100 mM olur. Çözeltiyi 4 °C'de 12 aya kadar saklayın.
    4. 50 μL Triton X-100 ile 9,5 mL PBS ekleyerek 10 mL geçirimlilik tamponu hazırlayın. Triton X-100 nihai konsantrasyonu %0,5 (v/v) için 10 mL'ye doldurun. 4 °C'de sakla ve 1 ay içinde kullan.
    5. 50 μg sığır serum albümini (BSA), 100 μL Triton X-100 ve 25 μL Tween-20'den 45 mL'ye PBS ekleyerek 50 mL immünofluoresans (IF) tamponu hazırlayın. Dolgu 50 mL'ye kadar alın, nihai konsantrasyon %0,1 (v/v) BSA, %0,2 (v/v) Triton X-100 ve %0,05 (v/v) Tween-20 olur. 4 °C'de sakla ve 1 ay içinde kullan.
    6. 10 mL hayvan serumu ekleyerek 9 mL IF tamponuna 10 mL bloklayıcı tampon hazırlayın; böylece son konsantrasyon %10 serum elde edilir. 4 °C'de sakla ve 1 ay içinde kullan.
      NOT: Serumun tür kimliği, kullanılan ikincil floresan antikorların konak türüne bağlıdır (bkz. 2.2.4).
    7. ECM jeli (toplam protein konsantrasyonu ~9-9,5 mg/mL) 4 °C'de gece boyunca eritilebilir. 1.5 mL mikro-santrifüj tüplerinde 500 μL aliquot hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
      NOT: ECM jeli oldukça değişkendir ve her hücre tipinde beklenen davranışı tetiklemek için doğrulanmalıdır. Farklı hücre tipleri farklı protein konsantrasyonları veya matriks sertliği gerektirebilir.
      NOT: Oda sıcaklığında polimerizasyonu önlemek için ECM jelini tutarken her zaman önceden soğutulan pipet uçları ve kapları kullanın. Kullanım sırasında ECM jelini her zaman buzda tutun.
  2. Adiposit farklılaşması
    1. 50.000 ila 80.000 3T3-L1 ön adipositini, 0,5 mL standart büyüme ortamında 4 kuyuyla bir oda slaytında 2 kuyuya tohumlayın. Boş kuyular adipositsiz ve koşullu medya kontrolleri için kullanılacak.
      NOT: Oda kaydırmalı hücre kültürleri mekanik bozulmaya yatkındır. Ortamın vakum aspirasyonundan kaçının ve manuel pipettörlerle nazik bir pipetleme tekniği kullanın.
    2. 50.000 ila 80.000 adet 3T3-L1 ön adipositini, 0,5 mL standart büyüme ortamında 24 kuyu doku kültür plakasının tek bir kuyusuna tohumlayın. Bu, koşullu medya kontrolü için koşullu ortam toplamak için kullanılacaktır.
    3. Her iki kültürün 24 saat içinde %100 birleşime ulaşmasına izin verin.
    4. Büyüme ortamını, %10 FBS takviyesi içeren DMEM, 0,5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ve 1 μM deksametazon içeren adipogenez başlatma ortamı ile değiştirerek başlatın. Hücreleri %5CO2 inkubatörde 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
    5. 48 saat sonra, harcanan ortamı %10 FBS ve 10 μg/mL insülin içeren yeni adipogenez ilerleme ortamı ile değiştirin. Hücreleri %5CO2 inkübatörde 37 °C'de 48 saat daha kuluçka yapın.
    6. 3D eş-kültüre devam etmeden önce, hücrelerin %>60'ında lipid damlacıklarının varlığı görsel olarak doğrulanacaktır. Lipid damlacık birikimi yavaşsa, ilerleme ortamını %10 FBS takviyeli DMEM ile değiştirin ve lipid içeriğini her 24 saatte bir izleyin.
  3. 3D ortak kültürün üst üste binmesi ve sürdürülmesi
    1. ECM jeli gece boyunca 4 °C'de çözülür ve ardından üst üste işlemeye devam eder.
      NOT: Lot-lot değişkenlik etkilerini önlemek için, tek bir çalışmada tüm deneylerde aynı parti ECM jelinin kullanılması önerilir.
    2. 3T3-L1'lerin başarılı şekilde farklılaşmasından sonra, harcanmış kültür ortamı çıkarılır ve ~50 μL küçük bir tampon kalır.
    3. Odadaki her bir adiosit içeren yuvaya dikkatlice 110 μL ECM jeli ekleyin, adiposit monotabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin.
      NOT: ECM jeli oda sıcaklığında hızla katılaşır. Erken matris polimerizasyonunu önlemek için, ECM jelini her zaman buz üzerinde tutun ve uçları -20°C'de önceden soğutulan.
    4. Boş adipositsiz kontrol kuyusuna 110 μL ECM jeli ekleyin. Matrigel'in eşit bir yayılmasını sağlamak için, kuyunun köşelerine ve ortasına damla olarak ekleyin. Pipet ucunu kullanarak Matrigel'i kazımadan kültür yüzeyine nazikçe yayın.
    5. ECM jelinin polimerleşmesi için sürgü 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın.
    6. Bu kuluçka aşamasında, MDA-MB-231 hücreleri toplanıp sayılır
      İSTEREĞE BAĞLI: Bu hücrelerin floresan etiketlenmesi ile ilgili ayrıntılar için adım 1.4'e bakınız.
    7. %2 ECM jeli (v/v) içeren meme büyüme ortamında 30.000 hücre/mL seviyesinde seyreltilmiş MDA-MB-231 hücreleri süspansiyonu hazırlayın.
      NOT: Optimal hücre tohumlama yoğunluğu hücre tiplerine göre değişir ve denemeden önce optimize edilmelidir. NOT: Meme büyüme ortamı, meme epitel hücreleri için optimize edilmiş ticari olarak sunulan bir hücre kültür ortamıdır. %0,4 sığır hipofiz ekstraktı, 10 ng/mL Epidermal büyüme faktörü (rekombinant insan), 5 μg/mL İnsülin (rekombinant insan) ve 0,5 μg/mL Hidrokortizon içerir. Ortak kültür ortamı, her iki hücre tipinin ihtiyaçlarına uygun şekilde dikkatlice seçilmelidir.
    8. ECM jeli polimerize olunduktan sonra, her kuyuya nazikçe 450 μL MDA-MB-231 süspansiyonu ekleyin. Bu da toplam hücre sayısının 13.500 hücre/kuyu olmasına yol açar.
      NOT: Bu aşamada hücre süspansiyonunun jel üzerinde eşit olmayan bir üst üste binmesi mümkündür. Odanın yanlarını görsel olarak değerlendirin ve odanın her tarafına hafifçe dokunarak eşit dağılım yapın.
    9. 24 kuyu plakasındaki adiposit kültürüne, %2 ECM jeli (v/v) içeren 450 μL meme büyüme ortamı ekleyin. Her 48 saatte bir hasat yapıp medyayı değiştir.
    10. Ortak kültürü en fazla 5 gün sürdürmek, medya değişiklikleri her 48 saatte bir yapılmak.
      NOT: Vakum aspirasyonundan kaçının ve nazik pipetleme kullanın. ECM jelinin ayrılması, ortak kültür bakımı sırasında ortaya çıkabilecek olası bir sorundur.
    11. Sadece koşullu medya kontrol kuyusu için, seyreltilmiş hasat edilen adiposit (adım 1.3.9'dan itibaren) 1:1 ortamı taze medya ile koşullandırdıktan sonra 2. ve 4. günlerde harcanan ortak kültür medyası yerine koşuldur.
      NOT: Bu noktada, ortak kültür dönemi sona ermiş olup, morfoloji ve belirtici ifadesini belirlemek için kültürlerin sabitlenmesi ve boyaması yoluyla ( bkz. bölüm 2) ya da hücrelerin ortak kültür ortamından çıkarılması ve hücrelerin aşağı akış analizine hazırlanması ( bkz. bölüm 3) analiz edilmelidir.
  4. Floresan hücre etiketleme (İsteğe bağlı)
    NOT: Üst üste örtülü hücrelerin etiketlenmesi, immünoflüoresans görüntü yakalama sırasında üst üste örtülen hücrelerin tespit edilmesine yardımcı olmak için 1.3.7. adımdan önce yapılabilir.
    1. Karboksifloressein Diasetat Succinimidyl Ester (CFSE) için 5 mM stok çözeltisi hazırlanarak 10 mg CFSE'yi 4,22 mL DMSO'da çözerek hazırlanın. 500 μL alikotları -20 °C'de, ışıktan korunarak sakla.
    2. 1.3.6. adımdan itibaren hücreleri saydıktan sonra, hücreleri 5 mL PBS ile bir kez yıkayın. Ortaya çıkan peleti 1x PBS ile 1.000.000 hücre/mL nihai konsantrasyona yeniden süsküy.
    3. Hücre süspansiyonu başına 1 μL 5 mM CFSE ekleyerek nihai çalışma konsantrasyonu 5 μM. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ışıktan korunarak inkübe edin.
    4. CFSE boyamalarını 5 hacim kültür ortamı ekleyerek söndürebilirsiniz. Oda sıcaklığında ekstra 5 dakika kuluçka yapın.
    5. Pellet hücrelerini alıp kalan CFSE'yi çıkarmak için PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri önceden ısıtılmış meme büyüme ortamında yeniden süspansiyona alın. Oda sıcaklığında 10 dakika daha kuluçka yapın, böylece boya kalmasın.
    6. Tohum, floresan etiketli hücreler, adımda 1.3.7'de tarif edildiği gibi. Protokolün geri kalanı ise tanımlandığı gibi uygulanabilir.

2. İmmünofluoresans

  1. Takıntı
    NOT: ECM jelinin depolimerizasyonunu ve yıkama sırasında örneklerin kaybolmasını önlemek için, tüm reaktiflerin kullanımdan önce ~30 dakika oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin.
    1. 5 gün boyunca ortak kültür yaptıktan sonra, medyayı 500 μL PBS ile değiştirin.
      NOT: 2.1.2'den 2.3.7'ye kadar olan adımlar steril olmayan koşullarda gerçekleştirilebilir.
    2. PBS'yi çıkarın ve yerine %2 paraformaldehit (PFA) ile (taze hazırlanmış) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kullanın.
      NOT: ECM jeli PFA'ya hassastır ve jel tabakasının ayrılmasına yol açabilir.
      UYARI: PFA zamanla formaldehite ayrılır. PFA ile çalışırken buhar solumaktan kaçının, yeterli havalandırmayı sağlayın ve her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (örneğin eldiven, laboratuvar önlüğü, göz koruması) giyin.
    3. PFA'yı çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 500 μL PBS-Glycine yıkama çözeltisi ile kuyuları hafifçe çalkalayın.
      NOT: PBS-Glycine yıkama kullanımı, serbest aldehitlerin arka plan floresansı üretmesini önlemek için kritiktir. PBS'de glisinsiz yıkama.
    4. 2.1.3 adımını iki kez tekrarlayın, toplamda üç yıkama yapın. Depolama koşulları için 2.1.5'e bakınız, gerekmezse 2.2.2'ye geçin.
    5. Bu noktada protokol 1 haftaya kadar duraklatılabilir ve kaydırma 4 °C'de saklanabilir. Slaytı saklamak için, tüm kuyuları 1 mL PBS ile doldurun ve oda sürgüsünün kapağını ince bir parafilm şeritiyle mühürleyin. Kızdırmayı ıslatılmış hassas bir dokunun üstüne yas, ışık geçirmez bir kapta düz yerleştirin, böylece kültürler kurumasın.
  2. Antikor boyama
    1. Daha önce depolanmış slaytları oda sıcaklığına getirin, PBS'yi çıkarın ve 500 μL taze PBS ile 15 dakika boyunca nazik bir çalkalama ile kuyularınızı yıkarsınız. Eğer 2.1.4 adımından doğrudan devam ediyorsa bu adımı atlayın.
    2. Hücreleri, 500 μL permeabilizasyon tamponu ile oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karıştırılmadan permeabilize edilir.
    3. Kuyrukları 500 μL PBS ile yıkayın, 15 dakika hafif çalkalayın. Iki kez tekrarlayın, toplamda 3 yıkama olur.
    4. Her kuyuya 500 μL bloklayıcı tampon ekleyin ve oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 1 saat kuluçka yapın.
      NOT: Bloklayıcı tampon içindeki kaynak serum türünün ikincil antikorun konak türüyle eşleştiğinden emin olun. Bu protokolde eşek serumu ve eşek ikincil antikorları kullanıyoruz.
    5. Üreticinin önerilerine göre IF tamponu içindeki birincil antikorları seyreltirin. Bloklayıcı tamponu çıkarın ve her kuyuya 300 μL seyreltilmiş antikor çözeltisi ekleyin.
    6. Chamber slaytının kapağını parafilm ile mühürleyin ve sürgü ışığı geçirmez bir kapa yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de hafif bir hareketle kuluçka yapın.
    7. Kuyrukları 500 μL IF tamponu ile 15 dakika hafif çalkalayarak yıkayın. Iki kez tekrarlayın, toplamda 3 yıkama olur.
    8. Üretici önerilerine göre uygun floresan etiketli ikincil antikoru IF tamponu içinde seyreltin. Her kuyuya 300 μL ikincil antikor seyreltme ekleyin ve oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 1 saat kuluçka yapın.
      NOT: Bu adımdan sonra foto ağartmayı sınırlamak için uzun süre ışığa maruz kalmaktan kaçının.
    9. 2.2.7 adımını tekrarlayın.
    10. PBS'de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren 300 μM stok çözeltisini 1:800 derecesinde seyreltin. Her kuyuya 300 μL ekleyin ve oda sıcaklığında, hafif çalkalayarak 20 dakika kuluçka yapın.
    11. Hücreleri 500 μL PBS ile 5 dakika boyunca hafif bir çaltınlıkla yıkayın. Bir kez tekrarlayın.
  3. Sürgü montajı
    1. Kültürleri rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok kalıntı PBS (PBS) çıkarın. Kapağı değiştirin ve odayı cam sürgüden ayırın, oda sürgü üreticisi tarafından sağlanan aletle alın.
    2. Hassas bir iş dokusu kullanarak, ECM jelini bozmadan kalan PBS'yi çıkarmak için sürgünün kenarlarını silin.
    3. Silikon sızdırmazlığı sürprizle ve 18G iğne ile sürdürün. Silikonun sertleşmesi için 3 dakika bekle.
    4. Silikon setlenirken, her kuyuya 1-2 damla antiifade montaj malzemesi ekleyin. Baloncuklardan kaçının. Eğer baloncuklar oluşursa, kültüre zarar vermeden dikkatlice bir pipet kullanarak çıkarabilirsiniz.
    5. Silikon yerleştikten sonra, cam kapak parçasını sığ bir açıyla nazikçe indirin. Kaplama kaydırırken hava kabarcıklarını çıkarmak için forseps veya pipet ucu kullanın. Örtü parçalanmasını önlemek için hafif baskı kullanın.
    6. Kaydırı oda sıcaklığında ışık geçirmez bir kaba koyup gece boyunca bekleyin. Slayt daha sonra 4 °C'de saklanabilir ve protokol 1 haftaya kadar duraklatılabilir.
      NOT (İsteğe Bağlı): Slaytları daha iyi kapatmak için, kaplama kaymasından 1 saat sonra kaplamanın kenarlarına şeffaf oje uygulayın.
    7. Konfokal floresans mikroskobu ile 10-20x büyütme ile görüntü slaytları. Operatör yanlılığını en aza indirmek için beş rastgele görüş alanı yakalayın.

3. Aşağıya doğru analiz için ortak kültürlerin hasadı

NOT: Hücrelerin veya biyomoleküllerin toplanması, immünoflüoresans ile tutarsızdır. Diğer aşağı akış analizleri için standart 24 kuyruklu kültür tabaklarında aynı hücre konsantrasyonları ve hacimleri kullanılarak 1. ve 2. bölümlerde belirtilen ortak kültürlerin yetiştirilmesi önerilir.

  1. Hücre çıkarımı
    1. Boş malzemeyi çıkarın ve buz gibi PBS ile kuyuları nazikçe yıkayın. Bir kez tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapın.
    2. Geniş delikli pipet ucu kullanarak, burada geri kazanım çözümü olarak adlandırılan 1 mL buz soğukluğu hücre geri kazanım solüsyesi ekleyin. ECM jel tabakasını bozmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipet yapın. Sıvıyı 1.5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Hücre kurtarma çözümü, ECM jeline gömülü hücreleri nazikçe serbest bırakmak için tasarlanmış ticari olarak mevcut enzimatik olmayan bir çözümdür. Özel bir bileşimdir ve bazı hücre tipleriyle uyumsuz olabilir. Alternatif olarak, ECM jelinin enzimatik depolimerizasyonu Dispase veya Accutase gibi hafif proteinazlar kullanılarak düşünülebilir. Bu, 37 °C kuluçka ve kuluçka süresinin optimize edilmesini gerektirir.
    3. Her kuyuya 250 μL buz soğuğu geri kazanım solüsyesi ekleyerek kalan hücreleri toplayın. İlgili mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    4. Tüpleri 4-5 kez ters çevirerek karıştırın.
    5. Tüpleri buza aktarın ve hafif bir çaltımla 60 dakika kuluçka yapın. Her 10 dakikada bir, tüp içeriğinin çökmesini önlemek için tüpleri 2-3 kez ters çevirin.
    6. Santrifüj tüpleri 300 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 5 dakika boyunca
    7. Görünür bir hücre pelletinin varlığını doğrulayın. Dikkatlice üst malzemeyi çıkarın ve 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin. Santrifüj 300 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de kullanın. Bir kez tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapın. Pelletin, başlangıçta tohumlanmış hücrelerin %80-90'ını içermesini, her hücre tipinin oranlarının sabit kalmasını bekleyin.
      NOT: Bu noktada, hücre peleti lizize edilip protein veya nüklein asitler toplanabilir. Lizlenmiş pelletler -80 °C'de saklanabilir ve protokol 3 ay boyunca duraklatılabilir. Lysis 3.2 ile uyumsuzdur.
  2. Tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    1. Pelleti 200 μL %0,25 tripsin-EDTA içinde yeniden süspansiyon. Sonra, 37 °C'de 3-4 dakika kuluçka yapın.
    2. Tripsin sindirimini azaltmak için 600 μL tam büyüme ortamı ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve 500 μL oda sıcaklığında PBS ekleyin.
    4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g santrifüj yapın. Bir kez tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapın.
    5. Pellet, %0,04 BSA ile 80 μL PBS ile yeniden süspansiyon, 40 μm hücre süzülcesi kullanılarak filtre süspansiyonu ile yapılır.
    6. 5 μL süspansiyonu 5 μL tripan mavisi içinde seyreltin. Hücreleri sayın ve hemasitometrede canlılığı değerlendirin. Hücreler artık aşağı akış analizine hazırdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün bazaz zarı boyunca hücre-hücre etkileşimlerinin etkilerini incelemedeki etkinliğini göstermek için, Şekil 2 ve Şekil 3 önceki bir yayından (Pallegar ve ark.16) temsilci sonuçlar olarak yeniden kullanılmıştır. Şekil 4 ve Şekil 5 , bu protokolün meme kanseri olmayan hücrelere uyum sağlayabilmesini ve birlikte kültür ortamından hücrele...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel hücre kültüründe karmaşık hücre-hücre etkileşimlerinin eksikliği, ilaç yanıtlarını ve hastalık ilerlemesini in vivo daha doğru incelemek için organ ve doku modellerinin geliştirilmesine ihtiyaç olduğunu ortaya koymaktadır. 3D ortak kültür sistemlerinin geliştirilmesi, hücre-hücre etkileşimlerinin sonuçlarının in vivo çalışmalara gerek kalmadan incelenmesine olanak tanıyarak bu boşluğu doldurmaya katkıdabulunmuştur

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yöntemin geliştirilmesi kısmen Kanser Araştırma Derneği tarafından finanse edilmiştir. GRK, Kanada Kanser Derneği'nin Carol Ann Cole Lisansüstü Öğrenciliği tarafından, Beatrice Hunter Kanser Araştırma Enstitüsü'nün Kanser Araştırma Eğitim Programı aracılığıyla sağlanan fonlarla desteklendi. PMMB, Balear Adaları Sağlık Araştırma Enstitüsü'nden (IdISBa) 2024 yılında alınan MOBILITAS program hibesi tarafından desteklendi. Şekil 1 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 Kuyu doku kültür plakasıCorning3524
24 x 60 mm Kapak CamıUltimate Scientific170-C2460
PBS'de %4 paraformaldehitInvitrogenJ61899. AK1x PBS'de %2'ye seyreltildi
4 Yuva Odalı Kültür SlaytlarıFalcon354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Eşek Anti-Keçi IgG (H+L)Jackson İmmünoaraştırma Laboratuvarları Inc.705-607-003
Parlak Çizgi HemacytometresiHausser Scientific3120
CellTrace CFSE Proliferasyon KitiInvitrogenC34570
Hücre Kurtarma ÇözümüCorning354253
DAPISigma-Aldrich Kanada Şirketi.D9542
Eşek Fare karşıtı IgG (H+L) çapraz adsorbe ikincil antikor, DyLight 594InvitrogenSA5-10168
Eşek Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, fenol kırmızısı yokGibco21041025
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, Yüksek Glikoz, PiruvatGibco11995-065
Fetal Sığır Serumu, Kanada KökeniGibco12483-020
Flowmi Hücre Süzgeçleri, 40 & mikro; MBel-Art136800040
GE Advanced Silikon Pencere ve Kapı, TemizHenkel Uluslararası2811093
Keçi Poliklonal Anti ZO-1SantaCruz BiyoteknolojisiSC8146Birincil antikor, üretimi durduruldu
Fare Monoklonal Anti ZO-1SantaCruz BiyoteknolojisiSC33725Üretimi durdurulan SC8416 anti ZO-1'in yerine alternatif birincil antikor
Meme Epitel Hücreli Bazal OrtamPromocellC-21210
Matrigel, Fenol Kırmızısız, Büyüme Faktörü Azaltılmış, LDEV içermeyenCorning356231Protein Konsantrasyonu: 9-9.6 mg/mL
Fare Monoklonal Anti-VimentinSigma-Aldrich Kanada Şirketi.V2258Birincil antikor
Yeni Doğmuş Buzağı Serumu, Yeni Zelanda KökeniGibco16010159
Penisillin-streptomisinGibco15140-122
Fosfatla tamponlu tuzlu süm, pH 7.4Gibco10010023
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934
Saf Fare Anti-E-CadherinBD Biosciences610181Birincil antikor
Tavşan Poliklonal Anti-Claudin 7 AbcamAB27487Birincil antikor
RPMI 1640, GlutaminGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Trypan Blue Lekesi (%0,4)Gibco15250-061
Tripsin 0.25%-EDTAGibco25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of medical science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  5. Lagies, S., et al. Cells grown in three-dimensional spheroids mirror in vivo metabolic response of epithelial cells. Communications Biology. 3 (1), 246(2020).
  6. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Developmental Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  7. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 9 (1), 196(2024).
  8. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Current biology: CB. 30 (16), R921-R925 (2020).
  9. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G., Husseini, G. A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. Journal of Biomedical Science. 31 (1), 7(2024).
  10. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7 (1), 45270(2017).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Leung, C. M., et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 33(2022).
  13. Srivastava, S. K., Foo, G. W., Aggarwal, N., Chang, M. W. Organ-on-chip technology: Opportunities and challenges. Biotechnology Notes. 5, 8-12 (2024).
  14. Gu, P., Xu, A. Interplay between adipose tissue and blood vessels in obesity and vascular dysfunction. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 14 (1), 49-58 (2013).
  15. Noel, V., Berry, M. D. Culture of Adherent Cancer Cell Lines. Cancer Cell Biology: Methods and Protocols. , 19-29 (2022).
  16. Pallegar, N. K., Garland, C. J., Mahendralingam, M., Viloria-Petit, A. M., Christian, S. L. A Novel 3-Dimensional Co-culture Method Reveals a Partial Mesenchymal to Epithelial Transition in Breast Cancer Cells Induced by Adipocytes. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 24 (1), 85-97 (2019).
  17. Martin, T. A., Ye, L., Sanders, A. J., Lane, J., Jiang, W. G. Cancer Invasion and Metastasis: Molecular and Cellular Perspective. Madame Curie Bioscience Database [Internet]. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK164700/ (2013).
  18. Ma, W., Tavakoli, T., Derby, E., Serebryakova, Y., Rao, M. S., Mattson, M. P. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC developmental biology. 8, 90(2008).
  19. Kim, Y. J., Lee, H. S., Kim, D., Byun, H. K., Koom, W. S., Koh, W. Bilayer 3D co-culture platform inducing the differentiation of normal fibroblasts into cancer-associated fibroblast like cells: New in vitro source to obtain cancer-associated fibroblasts. Bioengineering & Translational Medicine. 10 (1), e10708(2024).
  20. Sourouni, M., et al. Establishment of a 3D co-culture model to investigate the role of primary fibroblasts in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Reports. 6 (4), e1771(2023).
  21. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Materials Today Bio. 15, 100301(2022).
  22. Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3760(2012).
  23. Ooi, J. Y. Y., Tsang, Y. S., McMahon, L. P., Wong, L. Protocol for in vitro immunofluorescence staining in a Transwell co-culture system. STAR protocols. 6 (4), 104162(2025).
  24. Wallisch, S., et al. Protocol for establishing a coculture with fibroblasts and colorectal cancer organoids. STAR Protocols. 4 (3), 102481(2023).
  25. Ildiz, E. S., Gvozdenovic, A., Kovacs, W. J., Aceto, N. Travelling under pressure - hypoxia and shear stress in the metastatic journey. Clinical & Experimental Metastasis. 40 (5), 375-394 (2023).
  26. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. 202 (1), 1-8 (1992).
  27. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1387(2021).
  28. Ahmad, Z., et al. Versatility of Hydrogels: From Synthetic Strategies, Classification, and Properties to Biomedical Applications. Gels. 8 (3), 167(2022).
  29. Jinka, R., Kapoor, R., Sistla, P. G., Raj, T. A., Pande, G. Alterations in Cell-Extracellular Matrix Interactions during Progression of Cancers. International Journal of Cell Biology. 2012, 219196(2012).
  30. Short, A. R., Czeisler, C., Stocker, B., Cole, S., Otero, J. J., Winter, J. O. Imaging Cell-Matrix Interactions in 3D Collagen Hydrogel Culture Systems. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  31. Zeng, F., Yang, W., Huang, J., Chen, Y., Chen, Y. Determination of the lowest concentrations of aldehyde fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging and quantification. Histochemistry and Cell Biology. 139 (5), 735-749 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Co CultureBasement MembraneIndirect Cell InteractionsCell Cell CommunicationExtracellular MatrixBiomimetic ModelImmunofluorescence AnalysisMorphological ChangesIn Vitro Cell CultureMatrigel Scaffold
Video Coming Soon

Related Articles