Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Arabidopsis thaliana'da FRET tabanlı biyosensörlerin nicel oran metrik analizi, hücrealtı bölmelerdeki analizlerin canlı ölçülmesini mümkün kılmaktadır

365 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

24 Şubat 2026

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

Bu makalede

Özet

Förster rezonans enerjisi transferi (FRET) tabanlı biyosensörler kullanılarak canlı hücrelerin subhücre bölmelerindeki moleküllerin veya iyonların nicel analizi için bir protokol sunuyoruz. Standartlaştırılmış görüntüleme, ikili maske işleme ve Arabidopsis thaliana (A. thaliana)'da fosfata uygulanan doğrusal regresyonla oranmetrik analiz içerir, ancak diğer biyosensörler ve organizmalar için geniş çapta uygulanabilir.

Özet

Floresan biyosensörler, canlı hücrelerdeki metabolit veya iyon konsantrasyonlarındaki dinamik değişiklikleri izlemek için invaziv olmayan ve çok yönlü bir yaklaşım sunar. Özellikle, FRET tabanlı biyosensörler, biyosensör ifade seviyelerinden bağımsız olarak subhücre analizi seviyelerini bildiren ratiometrik ölçümler sağlar. Bitkilerde FRET tabanlı biyosensörlerin nicel oranimetrik analizi için kapsamlı ve standartlaştırılmış bir protokol tanımlıyoruz. Protokol, kullanıcıları canlı numune hazırlama, bağışçıların konfokal görüntü alımı, FRET ve alıcı kanalları, ilgi gören subhücre bölgeleri için ikili maske üretimi ve ardından regresyon tabanlı orantımetrik veri analizi süreçlerinde rehberlik eder. Birincil çıktı, genotipler, dokular, gelişim evreleri ve tedavi koşulları arasında nicel karşılaştırmalar yapılmasını sağlayan regresyondan türetilen oran metrik okumadır. Örnek olarak inorganik fosfat için cpFLIPPi-5.3m biyosensörü kullanarak, A. thaliana'nın kloroplast stromasındaki inorganik fosfat seviyelerinin ölçümünü gösteriyoruz. Bu analitik çerçeve, diğer FRET tabanlı biyosensörler ve model sistemlere geniş çapta uygulanabilir olup, metabolitlerin ve iyonların in vivo olarak hassas uzaylı-zamansal nicelendirilmesini sağlar. Bu strateji, metabolitlerin ve iyonların hücrealtı dinamiklerine ölçülebilir içgörüler sunar ve çeşitli deneysel ortamlarda karşılaştırmaları destekler.

Giriş

Canlı bitki hücrelerinde metabolit ve iyon dinamiklerinin izlenmesi, metabolik yolların ve sinyal ağlarının uzay ve zamanda nasıl koordine edildiğini anlamak için gereklidir 1,2. Hücresel metabolit seviyeleri, besin bulunabilirliği, ışık yoğunluğu ve stres gibi çevresel ipuçlarına yanıt olarak hızla dalgalanır3. Bunlar arasında, enerji transferi, sinyal ve metabolik düzenlemede önemli rollere sahip inorganik fosfat (Pi) seviyesi özellikle önemlidir, ancak hücre altı dinamikleri ölçülmesizordur 4.

Standart kolorimetrik testler ve fosfor-31 nükleer manyetik rezonansı (³¹P)-NMR, toplam veya bölmesel Pi'yi tahmin edebilir, ancak tek hücre çözünürlüğüne sahip değildir ve sınırlı zamansalhassasiyete sahiptir 5,6. Sinkrotron X-ışını spektrometrisi ve radyotracer görüntüleme hücrealtı veya akı bilgisi sağlarken, Pi'yi fosforile metabolitlerden güvenilir şekilde ayırt edemezler ve genellikle invazivdirler. Sulu olmayan fraksiyonlama ve enzim bazlı kinetik testler, stromal ve sitozolik Pi'nin dolaylı tahminlerini sunar, ancak bu yaklaşımlar emek yoğun ve kontaminasyonakarşı hassastır 7,8. Bu sınırlamalar birlikte, FRET tabanlı biyosensörlerin canlı görüntülemesi gibi Pi gibi metabolitlerin izlenmesi için yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip yıkıcı olmayan yöntemlere olan ihtiyacı vurguluyor.

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı biyosensörler, hücre içi iyon ve metabolit dinamiklerinin in vivo analizleri için güçlü araçlardır. Erken çalışmalar, bu tür biyosensörlerin hücrelerdeki glikoz, sukroz ve ATP konsantrasyonlarının izlenmesindefaydasını göstermiştir (9,10,11). Daha yakın zamanda yapılan ilerlemeler, bu yaklaşımı kalsiyum, nitrat, fosfat, oksin, absisik asit ve gibberellin izlemek için genişletmiştir ve besin ve hormon düzenlemeleri 12,13,14,15,16 hakkında değerli bilgiler sunmaktadır.

cpFLIPPi-5.3m, bitki hücrelerinde subhücre Pi seviyelerini izlemek için optimize edilmiş FRET tabanlı bir Pi biyosensörüdür17. Bu biyosensör, bir FRET donörü (eCFP, geliştirilmiş camgöbeği floresan protein) ve bir FRET alıcısı (cpVenus, Venüs sarı floresan proteininin modifiye bir varyantı) tarafından çevrelenen siyanobakteriyel Pi-bağlanma proteininden oluşur ve Pi bağlandığında konformasyonel bir değişim geçirir. Bu değişiklik, konfokal görüntüleme yoluyla yakalanan Pi-bağımlı FRET-türetilen floresan sinyalini değiştirir; böylece Pi konsantrasyonundaki artış FRET/donör oranının azalmasına yol açar. Pi-bağımlı orantımetrik analiz, görüntülerin sonradan işlemesi sırasında alıcı ve donör emisyonlarının yoğunluklarıkarşılaştırılarak yapılır 18.

Canlı bitki dokularında nicel oran metrik FRET analizi, donör (CFP) ve akseptör (cpVenus) floroforlarının spektral kanaması ve çapraz uyarılması için düzeltme gerektirir18. Bleed-through, FRET kanalında CFP emisyonu tespit edildiğinde ortaya çıkarken, çapraz uyarılma CFP uyarılışı sırasında cpVenus'un uyarılmasından kaynaklanır. Bu spektral artefaktlar, özellikle pigmentli bitki dokularında hücreler ve subhücre bölmeleri arasında değişebilir ve bu nedenle orantımetrik ölçümleri karıştırır. Düzeltilmiş veya duyarlı FRET emisyonu elde etmek için, ham FRET sinyalinden sızma ve çapraz uyarılma katkıları aşağıdaki gibi çıkarılır:

Duyarlı FRET emisyonu = Ham FRET emisyonu - sızma - çapraz uyarılma

Bleed-through ve çapraz uyarılma için düzeltme faktörleri, CFP veya cpVenus'u bireysel olarak biosensör18 ile aynı hücresel ve alt hücresel konumlarda eksprese eden görüntüleme bitkileri tarafından belirlenir. Duyarlı FRET emisyonu daha sonra aşağıdaki şekilde hesaplanır:

Duyarlı FRET emisyonu = Ham FRET emisyonu - (CFP emisyonu × sızma düzeltme faktörü) - (cpVenus emisyonu × çapraz uyarılma düzeltme faktörü)

Duyarlı FRET emisyonunun donör emisyonuna oranı (FRET oranı), ligand konsantrasyonunda göreceli değişiklikler bildirir ve biyosensör ifadeseviyelerinden bağımsızdır. 19.

cpFLIPPi-5.3m biyosensör, A. thaliana ve diğer türlerin ayrı hücrealtı bölmelerine başarıyla hedeflenmiş ve böylece Pidinamikleri 18,20,21,22'nin görselleştirilmesini sağlamıştır. Bu biyosensör, sitozolik Pi dağılımında ve dokular arasında taşınımda heterojenlik ortaya koymuş ve kloroplast stromal Pi dalgalanmalarını taşıyıcı aktivite ve fotosentetik performanslailişkilendirmiştir 20,21. Biyosensör belirli bir dinamik aralıkta değişiklikleri bildirdiğinden, yorumlama için aralığın in vivo Pi seviyelerini kararlı görüntüleme koşullarında kapsaması gerekir. Düzensiz aydınlatma veya çok düşük biyosensör bolluğu, oranmetrik ölçümleri etkileyebilir; bu da standart alım ayarlarının ve Pi duyarsız kontrolsensörü 20 gibi uygun negatif kontrollerin önemini vurgular. İlgi alanları (ROI) arasında FRET oranı varyasyonu minimum olduğunda, regresyon analizi uygun olmayabilir ve ROI ortalamalarının birleştirilmesi önerilir.

Bu makalede, A. thaliana'da cpFLIPPi-5.3m'nin nicel oranimetrik analizi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; bunlar arasında konfokal görüntüleme, ikili maskelerle görüntü segmentasyonu ve canlı hücrelerde Pi'nin dinamik izlenmesi için FRET oranı hesaplamaları yer almaktadır. Bu yöntem, FRET tabanlı biyosensör sinyallerinin analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar; oran metrik veriler doğrusal regresyon ve deneysel koşullarda istatistiksel karşılaştırmalar kullanılarak analiz edilir. Temsilci veriler, pht2'de değiştirilmiş kloroplast stroma Pi birikimi kullanılarak gösterilmiştir; 1, cpFLIPPi-5.3m sensörü 21,23'ü ifade eden bir kloroplast Pi taşıyıcı mutant. Bu protokol, biyosensör spektral düzeltmeleri, görüntüleme ayarları ve nicel analiz adımlarını detaylandırarak araştırmacıların FRET tabanlı orantımetrik görüntülemeyi diğer deneysel sistemlere uygulamalarına yardımcı olacaktır. Tanımlanmış deneysel bağlamlarda görüntü alımı ve regresyon tabanlı analizi standartlaştırarak, iş akışı eşleşen koşullarda analiz edilen örnekler arasında FRET yanıtlarının tutarlı karşılaştırmasını destekler. Metabolit taşıması veya metabolizması değişmiş mutantlar veya transgenik hatlar dahil olmak üzere, canlı bitki dokularındaki analit seviyelerindeki hızlı ve bölüme özgü değişiklikleri ölçmek isteyenler için uygundur. Bu standartlaştırılmış yaklaşım, bitki biyolojisinde nicel canlı hücre görüntüleme çalışmalarının tekrarlanabilirliğini kolaylaştıracaktır. Burada tanımlanan kloroplast-lokalize Pi biyosensörüne ek olarak, analitik strateji diğer FRET tabanlı biyosensörler ve organizma-spesifik dokulara uyarlanabilir, ancak biyosensör-spesifik kalibrasyon ve kontrol ölçümleri sağlanırsa.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: cpFLIPPi-5.3m ve cpFLIPPi-null (sitozolik ve plastid-hedefli varyantlar) ifade eden Arabidopsis transgenik hatları daha önce17,18 ve pht2 olarak üretilmiştir; 1-1 (CS19883) Arabidopsis Biyolojik Kaynak Merkezi'nden alındı; MS ortamı, kapak gözlükleri, perflorodekalin, konfokal mikroskop ve 40x yağ daldırma hedefi (sayısal apertür 1.3), uyarılma lazerler (CFP/445 nm ve cpVenus/515 nm veya enstrümana uygun emisyon dalga boyları), CFP, cpVenus/FRET ve cpVenus alıcı için emisyon filtreleri, kamera veya dedektörler, görüntü analiz çalışma istasyonu, FIJI24 ve Excel gibi programlardan alındı.

1 . Numune hazırlama

  1. Transgenik A. thaliana hatlarının üretimi
    1. cpFLIPPi-5.3m biyosensör ve Pi-duyarsız kontrol (cpFLIPPi-Null), sadece donör (CFP) ve sadece akseptör (cpVenus) kontrollerini bitki ekspresyonu vektörlerineklonlayın 17.
    2. Stabil ifade için, A . thaliana bitkilerini sgs3-13 mutant arka planında Agrobacterium tumefaciens çiçek sosu ile dönüştürün, T1 tohumlarını hasat edin ve uygun seçim ajanı içeren fosfinotrisin (örneğin 10 μg/mL) içeren 0,5x Murashige & Skoog (MS) agar plakalarında dönüştürücü seçilin.
    3. Biyosensörleri ifade eden A. thaliana tohumlarını %70 etanol içinde 1 dakika batırarak sterilize edin, 1 dakika boyunca %50 ağartıcıya geçirin ve ardından 6-10 kez steril suyla durulayın.
      DIKKAT: Etanol ve çamaşır suyu tahriş edicidir ve uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılırken ele alınmalıdır. Tohum sterilizasyonu kimyasal bir duman kapasonu veya iyi havalandırılan alanda yapın; böylece buhar solumayı önleyin ve çamaşır suyu ile etanol doğrudan karıştırmayın. Atık çözeltilerini kurumsal kimyasal güvenlik yönergelerine göre bertaraf et.
    4. Tohumları 2-3 gün boyunca karanlıkta 4°C'de katmanlaştırarak çimlenme senkronize edilir, ardından tohumları agar-katılaşmış veya sıvı 0,5x MS ortamına aktarın; deneysel tasarım için %0,25 sukroz ve istenen Pi konsantrasyonu (250 μM) içerir. Dönüştürücü seçiyorsa seçim ajanını da ekleyin.
    5. Plakaları 21°C, 16 saat ışık, 8 saat koyu fotodöngü, 120 μmol·mÁ�²·s⁻¹ ışık yoğunluğu ve ~%60 göreli nem olarak ayarlanmış kontrollü bir büyüme odasına aktarın. Kökleri görüntülemek için 4-7 gün boyunca fide yetiştirin veya yaprakları görüntülemek için fideleri 21 gün toprağa aktarın.
    6. Pi tedavileri test ediliyorsa, fidanları istenen Pi ortamına aktarın (örneğin, Pi dolu için 250 μM Pi; Pi eksikliği için 10 μM Pi) ve tedaviyi belirlenen süre boyunca sürdürün (örneğin, akut Pi yoksunluğu için 48 saat).
    7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
    8. Ligand-duyarsız kontroller olarak cpFLIPPi-null'u ifade eden aynı genetik arka plandaki hatları değerlendirin.

2 . Konfokal görüntüleme

  1. Kökler için, fideleri büyüme ortamı/steril suya cam bir kaydırak üzerine yerleştirin. Kökleri sıkıştırmadan düzleştirmek için küçük bir örtü örtüyün. Hemen görüntü ver.
  2. Yapraklar için, hedef yaprağı (örneğin, 21 günlük bitkilerde 3. veya 4. yaprak) kesin, adaxial yüzeyi kaydırma şeklinde aşağı yerleştirin.
  3. Gerekirse hava boşluklarını açmak için 10-15 μL perflorodekalin ile infiltrasyon yapın ve numuneyi düzleştirmek için küçük bir cam ağırlığıyla nazikçe üzerine konturun. Hemen görüntü ver.
  4. Canlı hücreler için uygun yüksek NA objektif kullanın (örneğin, 40× / 1.2-1.3 NA). Karşılaştırılabilirliği korumak için tüm örnekler için aynı amaç kullanın.
  5. Metamorph yazılımını kullanarak uyarılma ve emisyon kanallarını ayarlayın ve görüntüleri yakalayın (Şekil 1).
    NOT: Donör (CFP) emisyonunu yakalamak için: ~445 nm uyarılma (veya enstrümata uygun CFP hattı) ve donör emisyonunun toplanması (örneğin, 470-500 nm bant geçişi) kullanılabilir. Örneğin, 445 nm lazerin %70'te uyarılması (Şekil 1A) ve 1000 ms pozlama süresi (Şekil 1B) CFP emisyonunu yakalamak için kullanılmıştır. FRET'in (duyarlı alıcı emisyonu) yakalaması için: donör dalga boyunda uyarılma (445 nm) ve alıcı emisyon bandının toplanması (örneğin, 530-560 nm). Doğrudan alıcı kanalını yakalamak için: alıcı uyarılmasında uyarılma (örneğin, 500-515 nm) ve FRET ile aynı alıcı emisyon bandının toplanması.
  6. Görüntüleri sıralı olarak alın: donör uyarımı/donör emisyonu, donör uyarımı/FRET emisyonu, ardından alıcı uyarım/akseptör emisyonu. Foto ağartmayı (500-1000 ms) sınırlamak için alan başına görüntüleme süresini kısa tutun.
    NOT: Her hücresel konum için (kök sitozolü, yaprak mezofil sitozolü, kloroplast stroması), optimal lazer gücü, dedektör kazancı ve pozlama süresi (Şekil 1) siten belirlenin ki piksel yoğunlukları yerel arka planın üzerinde ancak dedektör doygunluğunun altında olsun. Belirli bir konum için donör uyarımından türetilen kanallar (donor ve FRET) için aynı yakalama ayarlarını koruyun. Görüntüleme parametreleri numune, mikroskop, ışık kaynağı ve tespit sistemine bağlıdır ve bu nedenle ampirik olarak belirlenmeli, kabul edilebilir aralıklar bu protokolde tanımlandığı şekilde regresyon analiziyle değerlendirilmeli ve belgelenmelidir. Burada kullanılan görüntü yakalama yazılımı Metamorph sürüm 7'dir.
  7. Hedef konum için tüm görüntülerde aynı dedektör hassasiyetini kullanın (örneğin, burada 2,4x kazanç ve sıfır ofset kullanıldı). Birden fazla dedektör kullanıyorsanız, her dedektör için spektral yanıtları karakterize edin ve belgeleyin.
  8. İlgilendiğiniz her doku/genotip için kontrol görüntüleri edinin.
    1. Her kanal için arka plan otofloresansını belirlemek amacıyla dönüşüm yapmamış vahşi tip dokuyu görüntüleyin.
    2. Her konum için aynı yakalama ayarlarında sadece donör (CFP) ve sadece alıcı (cpVenus) ifade eden görüntü bitkileri, spektral düzeltme katsayıları (kanama ve çapraz uyarılma) elde eder. Birden fazla bireyden (≥6-8) çeşitli emisyon yoğunluklarında görüntüler alın.

3 . Görüntü işleme

  1. FIJI veya ImageJ gibi analiz yazılımlarında donör (donör uyarılma/emisyon için CC olarak adlandırılır), FRET (donör uyarılma/alıcı emisyonu için CY) ve akseptör (alıcı uyarılma/emisyon için YY olarak adlandırılır) kanallarının ham görüntülerini açın. (Şekil 2).
  2. Aynı ayarlarla görüntülenen dönüştürülmemiş bitkilerden eşdeğer konumlarda birden fazla (5-10) yatırım getirisi örneği alarak kanal başına ortalama arka plan yoğunluğunu belirleyin. Her ilgili kanal görsünden ortalama arka plan değeri çıkarılır.
  3. FIJI'de izlenecek adımlar
    1. Analiz et> Ölçümleri Ayarlayın > Ortalama gri değeri seçin. Arka plan yoğunluğunu belirli bir yatırım getirisi veya tüm görüntünün ortalamasını seçerek ölçün.
    2. Analiz Et> Ölç sekmesine tıklayın. Değerleri bir Excel elektronik tablosuna kaydedin ve her kanal için ortalama arka plan değerlerini hesaplayın. Biyosensör mekânsal sınırını belirlemek için donör (CFP) görüntüsünü eşik olarak belirleyin (donör genellikle en düşük sinyale sahiptir). Eşikli bağışçı görüntüsünü ikili bir maskeye dönüştürün (Şekil 3 A).
    3. Tab Image'e tıklayın> Eşiği Ayarlayın>
    4. Eşik belirleme için bir pencere açılacak. Eşik için Max Entropy yöntemini seçin. Mekânsal sınırı, bu durumda kloroplast stromasını belirleyin ve eşik uygulanır. Bu, siyah-beyaz bir ikili görüntü oluşturur (Şekil 3 B).
    5. Sek'e tıklayın Matematik> Böl> 255 değerini girin. Görüntü tamamen beyaz olacak. Bu ikili maske görüntüsünü .tiff dosyası olarak kaydet.
    6. İkili maske, üç arka plan çıkarılmış görüntüyle çarparak analiz için maskeli görüntüler oluşturulur (Şekil 3C).
    7. FIJI'de ikili maske dosyasını açın.
    8. Sekme Process> Math>Çarpma seçeneğine tıklayın.
    9. Bir görüntü olarak ikili maske, diğeri olarak arka plandan çıkarılan CC görüntüsünü seçin.
    10. CY ve YY için adımları tekrarlayın.
    11. İncelenilen yapıya uygun maskeli görüntülere (tüm hücre, sitozol, kloroplast stromal) yatırım getirisi çizin. Her yatırım getirisi için, donör, FRET ve doğrudan alıcı kanalları için ortalama piksel yoğunluklarını çıkarın. Geri akım istatistiksel analiz için ROI meta verilerini (görüntü adı, koordinatlar, deneysel durum, çoğaltma kimliği) kaydedin.
    12. CC, CY ve YY görüntülerini aç.
    13. Tab Math> Çıkar> Ortalama arka plan değerini gir. Alternatif olarak, bu Excel'de hassas FRET hesaplamadan hemen önce yapılabilir.
    14. Maskeli CC dosyasını açın.
    15. Tab Process > Image calculator'a tıklayın. CC'yi maskeli CC görüntü dosyasıyla çarp. Bu yeni bir 32-bit görüntü dosyası açacak.
    16. Ana görev çubuğundaki uygun FIJI araçlarıyla yatırım getirisi çizin. Örneğin, burada kloroplast stroması "Oval" ROI aracı kullanılarak seçilir. ROI'ları bir ROI yöneticisine ekleyin (ctrl+T). Her resim için 5-10 yatırım getirisi seçin. "Hepsini göster" seçeneğini işaretle. Bu yatırım getirisi (ROI'lar) ayrı bir metafile olarak saklanabilir (Şekil 3D). ROI yöneticisini kapatmayın.
    17. Sek'e tıklayın Analiz et> Ölçümleri ayarla> Ortalama gri değeri seç.
    18. ROI yöneticisinde "Ölçüt" seçeneğine tıklayın.
    19. Seçilen yatırım getirisi oranlarının ortalama piksel değerleri ayrı bir pencerede bir liste olarak görünecektir.
    20. Bu verileri Excel'e kopyalayın. ROI yöneticisini kapatmayın.
    21. Maskeli CC dosyasının CY ve YY görüntüleriyle çarpılmasını tekrarlayarak her kanalda ROI yöneticisi kullanılarak aynı yatırım getirisi ölçümlerini elde edin. Değerleri Excel'de sakla.

4. Orantımetrik analiz

  1. Microsoft Excel'i açın ve aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin (Şekil 4).
  2. Düzeltme katsayılarının hesaplanması.
    1. Her hücresel konum için, sadece donör bitkilerden FRET kanalı yoğunluklarını (Y ekseni) donör yoğunluklarına (X ekseni) karşı çizin. Doğrusal bir regresyon yapın. Eğim, donör sızma katsayısıdır ( a olarak adlandırılır).
    2. Sadece akseptör olan bitkilerden (Y ekseni) FRET kanal yoğunluklarını doğrudan alıcı yoğunluklarına (X ekseni) karşı çizerek tekrarlayın. Eğim, alıcı çapraz uyarılma katsayısıdır ( b olarak adlandırılır).
    3. Sağlam katsayılar elde etmek için birden fazla bitkiden alınan ≥15-20 yatırım getirisi kullanın. Kloroplast stroması için 50-60 kloroplast seçilir.
  3. Her yatırım getirisi için duyarlı FRET hesaplayın:
    Duyarlı FRET = Ham FRET - (× donörü) - (b × alıcı)
    burada a ve b , yukarıda türetilen konuma özgü katsayılardır (Şekil 4).
  4. Havuzlanmış yatırım getirileri için duyarlı FRET (Y ekseni) ile donör kanal yoğunlukları (X-ekseni) arasında grafik çizim. Doğrusal bir regresyon uydurursanız, Excel y = mx + c formatında bir uyum sağlar; burada y duyarlı FRET yoğunluklarına, x donör yoğunluklarına, c y kesişimine, m ise regresyon eğimine karşılık gelir. Uyarlanan regresyonlar için R² notu var. Genellikle, R² 0.8-1 arasında değişir ve iyi bir uyumu temsil eder (Şekil 4).
  5. Sitozolik ve stromal ölçümler için, FRET/donör eğimini (duyarlı FRET ÷ donor) eğimini oranmetrik okuma olarak da hesabın ve kullanın; bu oran FRET oranı olarak da adlandırılır.
    NOT: Regresyon için uyum hatası, eğimin standart hatasını temsil eder (Excel'de LINEST fonksiyonunu kullanın). İlgilendiğiniz örnekler ve genotipler arasında konuma özgü seçimi tutarlı şekilde kullanın. Birden fazla yatırım getirisi ve bağımsız tesisten alınan verilere uygulanan doğrusal regresyon, FRET oranının sensör bolluğundan bağımsız olduğunu doğrular.
  6. Kalibrasyon, kontroller ve spesifik olmayan etkilerin ayırt edilmesi.
    1. FRET oranındaki (pH, iyon gücü ve fotofizik) içindeki potansiyel spesifik olmayan değişiklikleri Pi-spesifik değişikliklerden ayırmak için paralel olarak ifade edilen ve aynı şekilde işlenen cpFLIPPi-null (ligand-duyarsız varyant) kullanın.
    2. Alanlarla birlikte ROI düzeyinde verileri topla: genotip, bölme, çoğaltılan bitki ID, ROI ID, donör, alıcı, ham FRET, duyarlı FRET, uyarlanmış oran (uygun olduğunda). Ham yoğunlukları koruyun.
    3. Popülasyon karşılaştırmaları için birincil istatistikler olarak regresyondan türetilen eğimleri kullanın; SE ± eğimleri ve %'yi göreli hataya rapor eder.
    4. Regresyondan türetilen parametrelere uygun çıkarımsal istatistikleri (örneğin, Öğrencinin t-testi veya ANOVA) uygulayın. Dağılımlar normalliği ihlal ediyorsa parametrik olmayan testler kullanın. Uygunsa birden fazla karşılaştırmayı düzeltin.
  7. Kalite kontrol kontrol listesi (veri kabul edilmeden önce)
    1. Her görüntü için üç kanalın da dedektör doygunluğunun altında olduğunu ve yeterli sinyal-gürültü oranına sahip olduğunu (>2-10x arka plan) doğrulayın.
    2. Donör ve alıcı tek florofor kontrollerinin aynı ayarlarda görüntülendiğini ve düzeltme katsayıları a ve b türetilirken doğrusal ilişkiler elde edildiğini doğrulayın.
    3. Görüntü kaydının doğru olduğunu ve maskelerin biyosensör içeren bölgeleri doğru tanımladığını doğrulayın.
    4. cpFLIPPi-null kontrolünün Pi hassasiyetinde beklenen eksiklik gösterdiğini doğrulayın.
  8. Görüntülerin dışlanmasına yardımcı olacak temsil kalite kontrol metrikleri
    1. Doygunluk oranı: 16-bit görüntüler için piksellerin %1-2'sinden azı maksimum yoğunluğa (65.535) ulaşır.
    2. Arka plan seviyesi: Hücresiz bölgelerde ortalama yoğunluk ~50-200 birim arasında değişir.
    3. Piksel yoğunluğu aralığı: Ortalama yoğunluklar arka planın çok üzerinde olsa da doygunluğun altında kalır (~2.000-20.000 birim).
    4. Sinyal-gürültü oranı (SNR): Değerler 2-10'u aşmalıdır.

5. İki regresyon eğimi arasındaki farkı istatistiksel test

  1. İki eğimin (iki genotip veya tedaviden regresyondan türetilen FRET oran eğimleri) önemli ölçüde farklı olup olmadığınıbelirleyin 25.
  2. Test istatistiği ve özgürlük derecelerini aşağıdaki gibi hesaplayın
    figure-protocol-1
    özgürlük dereceleri df = n1 + n2 - 4. m1 ve m2, doğrusal regresyondan alınan eğimlere karşılık gelir, sb1 ve sb 2 her eğimin standart hatasını (LINEST veya regresyon çıktısından elde edilir) ifade eder ve n1 ile n 2 örneklem boyutlarıdır (her regresyona uyacak ROI sayısı).
  3. T için df ile iki kuyruklu bir p-değeri elde edin (örneğin, t-dağılım tablosu veya çevrimiçi hesapmakinesi 26 kullanın). Çevrimiçi hesap makinesi (Şekil 5C) kullanılırken, önceki adımda elde edilen sb1 ve sb2 ile n1 ve n2 ile p-değerini hesaplamak ve test istatistiklerini hesaplamak için girin.
  4. Yorum, p < α (örneğin, α = 0.05) ise, null hipotezi reddedilir (eğimler anlamlı şekilde farklı değildir). Rapor b1, b2, sb1, sb2, t, df ve p.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Konfokal görüntüleme

Konfokal mikroskopi ve Metamorf yazılımı kullanılarak, A.thaliana yaprak dokularındaki (WT) ve pht2'deki FRET donör ve akseptör sinyallerini görselleştirmek için ayrı kanallar alındı; 1 kloroplast Pi taşıyıcı mutantı (Şekil 2). Temsilci görüntüler, Pi biyosensörünün net subhücre lokalizasyonunu gösterir; kloroplastlar yalnızca bireysel hücrelerde değil, farklı doku tipleri ar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, FRET tabanlı biyosensörler kullanarak metabolitlerin veya iyonların canlı hücre ölçüsünü standartlaştırmak için standartlaştırılmış bir yaklaşım sunar. Temel avantajlar arasında invaziv olmayan ratiometrik ölçüm ve birden fazla subhücresel bölmeyeuygulanabilirlik yer alır 17,20,21,22. İkili maskelerin ve doğrusal regresyonun kullanımı, hassasiyeti ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmayla ilgili çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu protokolün geliştirilmesini destekleyen W.K.V. laboratuvarının eski üyelerinin katkılarını takdir ediyoruz. Mali destek ABD Enerji Bakanlığı, Bilim Ofisi, Biyogörüntüleme Teknolojisi Programı (DE-SC0014037) ve Temel Enerji Bilimleri (DE-FG02-04ER15559) tarafından sağlanmıştır. A.S.R., kısmen Texas A&M Üniversitesi Hagler İleri Araştırma Enstitüsü'nden sağlanan fonlarla desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
40X yağ batdırma hedefi Olympushttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4PGörüntüleme ve görüntüleme için objektif mercek;
Kapak gözlükleri / örtü kapaklarıVWR48393-081Örnek yerleştirme için kapak fişi
FIJI (ImageJ)Açık kaynak2.9.0Görüntü analiz yazılımı
Ters Olympus IX81 mikroskobuOlympushttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfKonfokal görüntüleme sistemi
iXon3 897 EMCCD kamera Andor Teknolojisihttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897Konfokal görüntüleme sisteminin bir parçası
MetaMorph yazılımı V7Moleküler Cihazlar. LLCSürüm 7Görüntü analiz çalışma istasyonu
Microsoft Excel Microsoft Suitev16.68Veri analiz yazılımı
Murashige & Skoog (MS) medium KesonMSP11-10LTBitki büyüme ortamı
Perflorodekalin (Acros Organic)Acros OrganicsP9900-25GGörüntüleme ortamı
FosfinottrisinSigma77182-82-2Antibiyotik
Bitki büyüme odasıConvironÖzel YapıBüyüme odası
Yokogawa CSU-X1 dönen disk konfokal birimiYokogawahttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/Konfokal görüntüleme sisteminin bir parçası

Kaynaklar

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
  5. Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
  6. Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
  7. Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
  8. Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
  9. Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
  10. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  11. Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  12. Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
  13. Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
  14. Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
  15. Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
  16. Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
  17. Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
  18. Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
  19. Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
  20. Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
  21. Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
  22. Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
  23. Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
  24. Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
  26. Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
  27. Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
  28. Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
  29. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
  30. Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FRET Biyosens rleriCanl H cre G r nt lemeKonfokal MikroskopiRegresyon Analizinorganik Fosfat l mKloroplast StromasMetabolit Kantifikasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.