Yöntem makalesi

Narenciye kabuğu özlerinde toplam fenolik ve flavonollerin belirlenmesi ve profillenmesi için entegre mikroplaka ve HPTLC stratejisi

DOI:

10.3791/70034

⸱

8 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fitoquímica (LAFIT), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA), 2Herbario Juvenal Valerio, Escuela de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional (UNA), 3Laboratorio de Productos Naturales y Ensayos Biológicos (LAPRONEB), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, sitrus kabuklarındaki flavonoller/5-hidroksiflavonlar ve fenolik bileşiklerin HPTLC profillenmesi ve nicelenmesi için birleşik AlCl₃/Folin–Ciocalteu yaklaşımını sunar ve mikroplaka analiziyle tamamlanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenolik bileşikler ve flavonoidler, narenciye yan ürünlerinin antioksidan aktivite ve işlevsel değerine önemli ölçüde katkıda bulunur. Ancak, geleneksel kolorimetrik testler yaygın olarak kullanılsa da, kromatografik ayrımdan yoksun ve kimyasal parazitlerden etkilenebilir. Bu protokol, mikroplaka spektrofotometrik testleri yüksek performanslı ince katmanlı kromatografi (HPTLC) ile birleştiren entegre bir analitik iş akışı sunar; bu süreç, narenciye kabuğu ekstraktlarında toplam fenolik içerik (TPC) ve toplam flavonoller ile 5-hidroksiflavon içeriğinin (TFHC) belirlenmesi ve profillenmesi için kullanılır. Kireç (Citrus aurantifolia) ve mandarin (Citrus reticulata) kabuklarının etanolik özleri, Folin–Ciocalteu (FC) ve alüminyum klorür (AlCl₃) testleriyle 96 delikli mikroplaka formatında değerlendirildi; ardından iki ardışık mobil faz ve çift post-kromatografik türevasyon kullanılarak HPTLC analizi yapıldı. Mikroplaka ölçümleri kireç için 74,2 mmol/g ve mandarin için 72,8 mmol/g TPC değerleri verirken, TFHC değerleri sırasıyla 15,5 mmol/g ve 6,0 mmol/g olarak belirlendi. HPTLC ayrımı, kireçte dört fenolik bandı ve mandarinde altı fenolik bandı çözmüştür. AlCl₃ türevizasyonundan sonra iki kireç bandı, flavonoller veya 5-hidroksiflavonlarla uyumlu olarak seçici olarak görselleştirildi. HPTLC tarafından tahmin edilen fenolik kötü maddelerin toplamı kireç ve mandarin için sırasıyla 22,0 ve 20,8 mmol/g kuru madde iken, kireçte TFHC 13,4 mmol/g olarak ulaşmış ve mandarinde tespit edilmemiştir. Bu bulgular, mikroplaka testlerinin toplam içeriğin hızlı ve hassas bir şekilde tahmin edilmesini sağladığını, HPTLC'nin bileşik ayrımı ve fonksiyonel grup özgül türevleme yoluyla seçiciliği artırdığını göstermektedir. Birleşik strateji, yüksek verimli tarama ve ardından kromatografik doğrulama ile karmaşık bitki matrislerinin fitokimyasal karakterizasyonu için pratik ve tekrarlanabilir bir platform sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narenciye kabukları, meyve suyu endüstrisinin bir yan ürünüdür ve antioksidanlar gibi fonksiyonel bileşiklerin varlığınıgöstermiştir 1. Nöroprotektifgıdalar 2, anti-inflamatuar, sivilce karşıtı kozmetikler3 ve gıda katkımaddeleri 4 olarak kullanılmıştır. Bu biyoaktivitelerin birçoğuflavonoidlere 5 ve fenolikbileşiklere 6 atfedilir. Flavonoid ve fenollerin toplam miktarını tahmin etmek için genel yöntemlerliteratürde belirlenmiştir 7; en yaygın yöntem spektroometri ile toplam fenolik içerik (TPC)8 için Folin-Ciocalteu ve toplam flavonoid bileşikler (TFC)9 için Alüminyum Klorürdür. Folin-Ciocalteau yöntemi, fosfotungstik-fosfomolibdik bileşiklerin redoks reaksiyonuna dayanan Folin-Denisreaksiyonu 11'in bir modifikasyonuna dayanan ilk kez 1927 yılında yayımlandı. Folin-Ciocalteau yöntemi, fenolik bileşiklerin indirgenme kapasitesiniölçür 12. Alüminyum klorür ve flavonoid testi ilk olarak 1960 yılında metal ve flavonoid ligandları arasındaki komplekslere dayanarakönerilmiştir 13.

Her iki spektrofotometrik test, bitki materyallerinde yaygın olarak bulunan fitobileşiklerin genel içeriğini tahmin etmek ve karşılaştırmak için faydalı araçlardır. Ancak, çeşitli sınırlamalara tabi olabilirler. Örneğin, harici standart14'ün kullanımından kaynaklanan bazı sınırlamalar ortaya çıkar; burada genellikle standardın kimyasal doğasının sinyal yanıtını önemli ölçüde etkilemediği varsayılır. Pratikte, bu varsayımı doğrulamak zordur, çünkü azı dişi absorptivliği, konjugasyon ve doğal ürünlerde standartlaştırılması zor olan diğer yapısal özellikler gibi faktörlere bağlıdır. Örneğin, Appel ve ark.15 , on bir meşe türünden TPC'yi değerlendirmiş ve kalibrasyon eğrilerinin eğimlerinde %50'den fazla fark bildiren sözde "kendini standart" yaklaşımı geliştirmiştir. Kendi kendine standart kullanım, örnekte bulunan aynı bileşimsel bileşik karışımını temsil etmek için tasarlanmış bir stratejidir ve böylece örnekteki gerçek Toplam Fenolik İçeriğe (TPC) daha yakın bir eşleşme sağlar16. Öz standartlar ayrıca reaktif gruplar ile ortalama moleküler ağırlık arasındaki oran hakkında da bilgi sağlar; ancak standartlaştırmak zahmetli ve zordur.

Alüminyum klorür kompleksleşmesine dayalı toplam flavonoid bileşik testi, sonçalışmalarda kritik şekilde değerlendirilmiş (17,18), bu çalışmalar, AlCl₃'nin özellikle iki flavonoid alt grubuyla kompleksler oluşturduğu sonucuna varmıştır: flavonoller ve 5-hidroksiflavonlar. Genellikle, flavonoller maksimum emilimi yaklaşık 440 nm gösterirken, 5-hidroksiflavonlar yaklaşık 415 nm emer. Ayrıca, bazı flavonoidler türevleşme olmasa bile 415–440 nm aralığında içsel emilim gösterebilir ve kompleksleşme sırasında soğurma artışı bireysel bileşikler arasında değişir. Ayrıca, her iki kolorimetrik testte de ayrım yoktur ve bu nedenle farklı fenolik bileşenleri ayırt edemez; Bu özellik toplam içeriğin tahmini için avantajlı olabilir, ancak sınırlı özgüllük sağlar. Bu hususlar, kolorimetrik tespitten önce bireysel bileşenleri çözen ve böylece gerçek test yanıtlarını spektral veya kimyasal girişimlerden ayıran analitik bir stratejiye olan ihtiyacı vurgular.

Bu sınırlamalara rağmen, bu tür testler bitki ve meyve özlerinde biyoaktif fenolik bileşiklerin genel taraması için değerli araçlarolmaya devam etmektedir 19. Olası girişimleri değerlendirmek için, hem Folin–Ciocalteu hem de AlCl₃ reaktifleriyle ortaya çıkarılan yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) yöntemi etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir. Kromatografik ayrım, kompleksleşmeden önce önceden var olan emilim bantlarına sahip interferant maddelerin tespit edilmesini sağlarken, fotoğraf dokümantasyonu çoklu emilim maksimumlarının eşzamanlı analizini sağlar. Buna ek olarak, HPTLC analizi, HPLC–MS/MS gibi daha kapsamlı kromatografik tekniklere göre daha düşük çözücü tüketimi, birden fazla numunenin eşzamanlı işlenmesi nedeniyle (plaka başına 18 tane kadar) daha kısa analiz süresi ve post-kromatografik türevlemenin seçiciliği sayesinde karmaşık karışımların kolaylaştırılmış yorumlanması gibi birçok avantajsunar 21.

Bu çalışmada, narenciye kabuğu özlerinde toplam polifenolik içerik (TPC) ve toplam flavonoller ile 5-hidroksiflavon (TFHC) içeren spesifik bileşiklerin yüksek performanslı ince katmanlı kromatografik (HPTLC) ayrımı ile belirlenmesi için entegre bir protokol sunuyoruz; ayrıca mikroplaka kolorimetrik testine dayalı genel bir içerik tahmini sunulmaktadır. Fenolik bileşiklerin düzlemsel kromatografik nicelizasyonu Folin–Ciocalteu reaktifi kullanılarak yapılırken, alüminyum klorür türevi yalnızca flavonoller ve 5-hidroksiflavonlara karşılık gelen bantların kromatografik tanımlanması için uygulanır. Bu yaklaşımda, TFHC belirleme, kromatografik olarak çözülen ve kimyasal olarak tanımlanmış bileşiklerin Folin–Ciocalteu yanıtına dayanır; alüminyum klorür kompleksleşmesine değil. HPTLC analizi, bileşik spesifik ayrım ve görselleştirmeyi mümkün kılarak bireysel fenolik bileşenlerin tanımlanmasına ve potansiyel spektral girişimlerin tespitinesine olanak tanır. Ayrıca, toplam TPC ve TFHC'nin hızlı tahmini için mikroplaka tabanlı spektrofotometrik bir yöntem sunulmakta olup, karmaşık bitki matrisleri için tamamlayıcı yüksek verimli tarama aracı sunmaktadır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Meyve kabuğu hazırlama

  1. Her meyveden yaklaşık 50 g kabuğu çıkarın ve onları yenilebilir kısımdan ayırın. Temsilci sonuçlarımız için, mandalinler yerel bir mağazadan (Şili'den ithal edilen Isabelline çeşidi) satın alındı ve San José, Kosta Rica yakınlarındaki bir ağaçtan (kupon örneği JVR-16434) limes toplandı.
  2. Kabukları plastik zip-lock poşete koyup -20 °C'de en az 2 saat dondurun.
  3. Dondurulmuş kabukları önceden soğutulan dondurucuya aktarın, poşetleri açık tutun ve tamamen kuruyana kadar gece boyunca vakum (0.1 mbar) uygulayın.
  4. Her kurutulmuş malzemeyi bıçak fırlatıcı ile yaklaşık 0,1 mm boyutunda öğütün.

2. Çıkarma

  1. Yaklaşık 100 mg kuru, öğütülmüş narenciye kabuğunu (lime veya mandarin) tartın ve 15 mL'lik cam tüpe yerleştirin.
  2. Tüpe 3 mL %60 etanol ekleyin.
  3. Karışımı 40 °C'de ultrasonlu bir banyoda 10 dakika boyunca sonikle geçirerek bitki hücrelerini bozabilir ve fitokimyasal salınımı kolaylaştırır.
  4. Örneği 850 × g ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
  5. Etanolik süpernatantı dikkatlice Pasteur pipeti kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye aktarın, böylece tortunun bozulması önlenir.
  6. Nemli katı kalıntıyı içeren tüpe ek 3 mL %60 etanol ekleyin.
  7. Yukarıda açıklanan sonikasyon ve santrifüj adımlarını 2.3 ve 2.4. adımlarda tekrarlayın.
  8. Üstten atılan maddeyi aynı hacimsel şişeye aktarın ve önceki ekstraktla birleştirin.
  9. Önceki adımları (2.6–2.8) tekrarlayarak üçüncü bir çıkarma gerçekleştirin.
  10. Kombine ekstraktı (≈9 mL) iki damla 0.1 mol/L HCl ile asiküle edin (antosiyaninler ve diğer fenolik bileşiklerin stabilitesini artırmak için) ve hacmi metanol ile 10 mL'ye getirin.
  11. Bu prosedürü her örnek için üç adet olarak uygulayın.

3. Mikroplaka spektrofotometrisi ile toplam flavonol ve 5-hidroksiflavon içeriği (TFHC)

  1. Quercetin stok çözeltisi (100 μg/mL) veya eşdeğer flavonoid standardı hazırlayın.
    1. 10 mg quercetin ile 0.1 mg hassasiyetle bir teraziyle tartın.
    2. Quercetini yaklaşık 5 mL %95 etanolde çözüp çözeltiyi stok çözeltisi olarak etiketlenmiş 10 mL'lik hacimsel bir şişeye aktarın.
    3. Kabı 2 ml %95 etanol ile iki kez durulayın ve durulamaları masaya ekleyin.
    4. Hacimi %60 etanol ile hedefe getirin.
    5. Tablo 1'e göre 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde standart çözeltiler (10–100 μg/mL) ve bir boşluk hazırlayın.
    6. Tüm örneklerin ve standartların 0.2–0.8 emilim aralığında olduğundan emin olun, gerekirse konsantrasyonları ayarlayın.
    7. Mikroplaka düzenini, Şekil 1'e göre her kuyuya 60 μL boşluk, numune veya standart dağıdarak hazırlayın. Her örnek veya standart için üç tekrarlama yapın.
    8. %2 alüminyum klorür, %5 sodyum asetat ve %80 metanol içeren sulu çözeltiler ayrı reaktif rezervuarlarına dağıtın.
      NOT: Alüminyum klorür ve metanol çözeltileri dikkatle kullanın. Alüminyum klorür çözeltileri tahriş edicidir ve metanol yutma, soluma ve cilt emilimiyle toksiktir. Cilt ve göz teması kurmaktan kaçının ve uygun PPE giyin
    9. 8 kanallı çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 10 μL AlCl₃ çözeltisi, 10 μL sodyum asetat çözeltisi ve 200 μL %80 metanol ekleyin.
    10. Tabağı orta yoğunlukta 10 saniye sallayın ve 30 dakika karanlıkta kuluçka yapın.
    11. 415 nm'de absorbansı ölç. Eğer çalkalama mümkün değilse, inkubasyondan önce mikropipetle manuel olarak karıştırın (Şekil 2).
    12. Kalibrasyon eğrisinden numune emilimi değerlerini interpole edin ve gerektiğinde seyreltme, hacim ve kütle düzeltme faktörleri uygulanır.

Tablo 1: Toplam flavonoller ve 5-hidroksiflavon içeriği (TFHC) kalibrasyon eğrisi için quercetin standartlarının miktarları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Toplam flavonoller ve 5-hidroksiflavon içeriği (TFHC) mikroplaka analizi için mikroplaka düzeni. (A) Mikroplaka şeması. (B) Yazılım Gen5 düzen programı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Toplam flavonoller ve 5-hidroksiflavon içerik analizi için mikroplaka yazılım kurulumu. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Mikroplaka spektrofotometrisiyle toplam polifenolik içerik (TPC)

  1. Bir gallik asit standart eğrisi (0.000–0.120 mg/mL) hazırlayın.
    1. Yaklaşık 0.0123 g gallik asit (%98 saflık) analitik bir tartı kullanarak tartın ve damıtılmış suda çözün.
    2. Çözeltiyi 10 mL'lik hacimsel bir şişeye aktarın, iki kez durulayın ve stok çözeltiyi elde etmek için damıtılmış suyla işarete kadar doldurun.
    3. Stok çözeltisinin 1 mL'sini damıtılmış suyla 10 mL'ye seyreltirerek çalışma çözeltisi hazırlayın.
    4. Çalışma çözeltisini Tablo 2'ye göre daha da seyrelterek kalibrasyon standardları hazırlayın.
    5. Absorbans değerleri 0.2–0.8 aralığının dışında kalıyorsa konsantrasyonları ayarlayın.
    6. Folin–Ciocalteu çalışma reaktifini, ticari reaktifi damıtılmış suyla 1:14 seyreltilerek hazırlayın.
      NOT: Folin–Ciocalteu reaktifi ve hidroklorik asit çözeltileri aşındırıcıdır. Sıçrayışlardan ve doğrudan temastan kaçının. Bir gaz kapasasıyla reaktif muamele yapın.
    7. Her örnekten, standart veya boş numuneden 30 μL pipetle, Şekil 3A'daki düzeni takip ederek 96 delikli bir mikroplakaya alın, her örnek başına üç kopya kullanarak.
    8. Her kuyuya çok kanallı pipet kullanarak 215 μL Folin–Ciocalteu çalışma reaktifi eklenin.
    9. Her kuyuya 50 μL %20 sodyum karbonat çözeltisi ekleyin ve mikropipetle iyice karıştırın.
    10. Plakayı 20 dakika boyunca 40 °C'de çalkalayarak kuluçka yapın (Şekil 3B).
    11. 755 nm'de absorbansı ölç.

Tablo 2: Toplam Fenolik İçerik (TPC) Kalibrasyon Eğrisi için Gallik Asit Standartları Miktarları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Toplam fenolik içerik (TPC) mikroplaka analizi için mikroplaka düzeni ve yazılım kurulumu. (A) Düzen. (B) Yazılım programı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Yüksek performanslı ince katmanlı kromatografi analizi için kullanılan genel koşullar

  1. Standart eğriler
    1. Yukarıda bölüm 3 ve 4'te açıklandığı gibi quercetin ve gallik asit (her biri 100 μg/mL) stok çözeltileri hazırlanır.
    2. Gallik asit, 2, 4, 6, 8, 10 ve 12 μL hacimlerde altı şerite uygulanır.
    3. Tanımlama için ayrı şeritlere ayrı ayrı hatlara ayrı ayrı 5 μL gallik asit ve quercetin uygulayın.
  2. Plaka düzeni:
    1. Sabit faz olarak 10 × 20 cm silika jel 60 F₂₅₄ alüminyum tabanlı TLC plakası kullanın.
    2. Uygulama parametreleri şu şekilde ayarlanır: Y pozisyonu 7,0 mm, bant uzunluğu 6,0 mm, ilk X konumu 14,0 mm, raylar arasındaki mesafe 9,4 mm.
    3. Her bant başına 10 μL ekstrakt uygulayın, püskürtme gazı olarak azot kullanın.
    4. Çözücü cephe mesafesini 70 mm olarak ayarlayın.
  3. Plaka geliştirme:
    1. 40 mL hareketli faz içeren manuel odada plakalar geliştirmek ve mobil faz ve odanın duvarıyla temas halinde filtre kağıdı kullanarak odanın doygunluğu için 10 dakika izin vererek mobil fazın buharlarının oda atmosferini doygunlaştırmasına yardımcı olmak için izin verilmelidir.
    2. Plakaları MP1 veya MP2 kullanarak geliştirin, belirtildiğinde çift geliştirme gerçekleştirin. Mobil Faz 1 (MP1), etil asetat:formik asit:asetik asit:sudan (100:11:11:26); ve toluen:etil asetat: formik asit (5:4:1) içeren MP2.
      NOT: Buhar kapasolasında HPTLC plakaları geliştirin. Mobil faz bileşenleri (etil asetat, toluen, formik asit ve asetik asit) uçucudur, toluen ve etil asetat ise son derece yanıcıdır. Buhar solumaktan kaçının ve ateşleme kaynaklarını ortadan kaldırın.
    3. Tabakları oda sıcaklığında kurutmaya bırakın.
  4. Türevleşme
    1. Folin–Ciocalteu reaktifi (300 μL reaktif + 600 μL %50 etanol) ile püskürtül, kısa bir süre ısı tabancasıyla kurutulun ve %50 etanol içinde 1 mL %10 sodyum karbonat ile püskürtün.
    2. Ayrıca, diğer plakalara %1 alüminyum klorür ve %50 etanol ile sprey yapın.
  5. Renk gelişimi stabil olana ve plakalar tamamen kuruyana kadar bir ısı tabancasıyla eşit şekilde ısıtın.

6. Yüksek performanslı ince tabaka kromatografisiyle toplam flavonoller ve 5-hidroksiflavon içeriği (TFHC) ile toplam fenolik içerik (TPC) analizi için geliştirme

  1. Örnekleri üçlü şeritlerde, gallik asit ve quercetin referans yollarıyla birlikte uygulayın (tanımlama için, adım 5.1.4'te açıklandığı gibi).
  2. MP1 kullanarak bir plaka geliştir.
  3. Plakayı MP2 kullanarak tekrar geliştirin.
  4. Daha önce tarif edildiği gibi plakayı FC reaktifi kullanarak türetin.
  5. Plakayı beyaz aydınlatma ile 254 nm ve 366 nm UV aydınlatmalarıyla fotoğraf olarak belgeleyin.
  6. Prosedürü tekrarlayın, AlCl3 türevleşmesi için son adımı değiştirin, Şekil 4'te gösterildiği gibi.

figure-protocol-4
Şekil 4: TPC ve TFHC'nin HPTLC ile analizi için VisionCats adımları. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkarma koşulları
Burada açıklanan genel ekstraksiyon protokolü %60 etanol kullanırken, daha öncebildirildiği gibi 22. Diğer sebze kaynaklarına ekstrapolasyon yapıldığında, ekstraksiyon koşulları çözücünün polaritesi ve döngü sayısı açısından optimize edilebilir. Hem çözücü hem de döngü sayısının seçilmesinin kapsamlı bir gerekçesi başkabir yerde detaylandırılmıştır 16. Çözücü seçimi önceki literatür ve polarite indeksleriyle yönlendirilebilir; Genel olarak, etanol veya metanol ile asetonun hidroalkol karışımları önerilir. Optimal ekstraksiyon döngü sayısı (n), sabit toplam hacmi 10/n mL'lik 1–5 döngüye bölünerek ve ardından sıvı ekstraktların bir araya getirilmesiyle değerlendirilebilir. Farklı çıkarma döngü sayılarının verimliliği daha sonra istatistiksel olarak karşılaştırılır ve TPC testinde maksimum emilimi sağlayan koşul belirlenir.

Mikroplaka ve HPTLC nicelendirmesi
Hem mikroplaka testi hem de HPTLC analizi için standart kalibrasyon eğrileri Şekil 5'te sunulmaktadır. Folin–Ciocalteu mikroplaka yöntemiyle toplam fenolik içerik (TPC) belirlenmesi ve aynı reaktifle türevlenmiş HPTLC plakaları için, referans bileşik olarak gallik asit kullanılarak kalibrasyon eğrileri oluşturuldu. Gallik asit, sadece TPC nicelendirmesi için en yaygın kullanılan standartlardan biri olduğu için değil, aynı zamanda kireç ve mandarin örneklerine uygulanan aynı mobil faz koşullarında elüasyon yapılabildiği için seçilmiştir. Quercetin ayrıca HPTLC testi için potansiyel bir standart olarak değerlendirildi; ancak bu kromatografik sistem için uygun olmadığı kanıtlandı; çünkü çözücü cephesiyle birlikte elüasyon yapmış ve güvenilir şekilde nicelendirilemiyordu. Buna rağmen, TFHC, referans standardı olarak quercetin kullanılarak belirlenmiştir; çünkü gallik asit, ne flavonol ne de 5-hidroksiflavon olduğu için alüminyum klorürle renkli bir kompleks oluşturmaz.

figure-results-1
Şekil 5: Kireç, mandarin, gallik asit ve quercetin HPTLC plakası, MP1 ile ardışık olarak gelişmiş, ardından MP2 ile alüminyum klorür (AlCl₃) ve Folin–Ciocalteu (FC) reaktifleriyle ayrı türevlendirilmiştir. AlCl₃ türevizasyonundan sonraki kromatografik profil gösterilmiştir. Kısaltmalar: FC, Folin–Ciocalteu türevasyonu; AlCl₃, alüminyum klorür türevleşmesi; W, beyaz ışık aydınlatması; 366, 366 nm'de UV aydınlatması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Toplam fenolik içerik (TPC) ve toplam flavonoid ve hidroksisinnamik asit içeriği (TFHC) sonuçları Tablo 3'te sunulmaktadır. Beklendiği gibi, TFHC değerleri TPC değerlerinden anlamlı derecede düşüktü; kireç örneklerinde yaklaşık beş, mandarin örneklerinde ise on iki kat daha düşüktü.

Tablo 3: Mandarin ve kireç toplam fenolik içeriği için mikroplaka yöntemiyle sonuçlar. Kısaltmalar: Abs: absorbans, CV: varyasyon katsayısı, DF: seyreltme faktörü, GAE: gallik asit eşdeğerleri, IR: Bağımsız çoğaltma, QE: quercetin eşdeğerleri, Rep: tekrar, SD: standart sapma, TFHC: Toplam flavonoller ve 5-hidroksiflavon bileşikleri, TPC: Toplam fenolik içerive ve figure-results-2 ortalama. *Kuru maddeye göre hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Benzer şekilde, HPTLC analizinden elde edilen sonuçlar Tablo 4'te özetlenmiştir. Kromatografik ayrım, farklı bileşiklere karşılık gelen bireysel bantların görselleştirilmesini sağlar. Kireç örneklerinde dört fenolik bileşen, mandarin örneklerinde ise altı fenolik bileşen tespit edildi. Bu bantların hiçbiri, kullanılan referans standartların (gallik asit ve kersetin) tutma faktörlerine uymuyor ki bu da beklentilerle uyumludur.

Tablo 4: Toplam Fenolik İçerik ve AlCl3'e karşılık gelen bantlar için sonuçlar, AlCl3 ile türevlenmiş HPTLC ile bileşikleri ortaya koydu. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4 ayrıca, HPTLC analizinden tahmin edilen toplam fenolik içeriği de gösterir; bu miktar kromatografik olarak tespit edilen bireysel bileşiklerin toplamı olarak hesaplanır (TPC'ye benzer). Ayrıca, tablo flavonollere veya 5-hidroksiflavanlara atanmış bantların kümülatif içeriğini de içerir (Rf = 0.46 ve 0.62 kireç; mandarinde hiç tespit edilmemiştir). Bu bantlar, AlCl₃ ile türevleşmeden sonra sarı renkte göründü ve 366 nm UV aydınlatması altında sarımsı floresans gösterdi. Ancak, türevleşmeden önce görünür bir renk gözlemlenmemiştir; Şekil 5'te gösterildiği gibi.

HPTLC analizi için Folin-Ciocalteu (FC) türevasyonu, fenolik bileşiklerin kapsamlı tespitini sağlar, ancak küçük girişimler olabilir. Ayrıca, alüminyum klorür (AlCl₃) türevasyonu, seçici olarak flavonoidlerin bir alt kümesini boyayabilir. Her iki reaktifin birlikte uygulanması, yöntem standartlaştırmasını iyileştirir ve her iki yaklaşımın bazı doğal sınırlamalarını hafifletmektedir. Özellikle, flavonoid olmayan bir bileşiğin FC altında karakteristik mavi rengi ve AlCl₃ altında sarı-kırmızı emilimi sergilemesi pek olası değildir. Ayrıca, önceden var olan kromoforlar, türevleşmeden önce aynı yoğunlukta görülüyorsa girişim olarak dışlanabilir.

Şekil 5'te gösterildiği gibi, kireç ekstraktı Rf 0.62 ve 0.46 seviyelerinde iki bant göstermiştir; bunlar gelişmemiş plakada tespit edilemiyordu ancak hem Folin–Ciocalteu (FC) hem de AlCl₃ türevleşmesinden sonra net bir şekilde görünür hale geldi. Bu davranış, flavonoid doğalarını destekler; muhtemelen neoeriocitrin vehesperidin 23'e karşılık gelir. Kireçte Rf 0.21 ve 0.37'de, mandarinde ise Rf 0.36, 0.39, 0.42, 0.46, 0.54 ve 0.89 oranlarında ek fenolik bileşenler gözlemlendi. Bu bantlar FC türevizasyonundan sonra tespit edilebiliyordu ancak AlCl₃ tedavisinden sonra tespit edilemiyor; bu da flavonoid olmayan fenolik bileşiklere karşılık gelebileceklerini gösteriyor. Literatüre göre, mandarinde bildirilen başlıca flavonoid olmayan fenolikler arasında klorojenik asit ve trans-ferülikasit 24,25 bulunmaktadır. Kireçte, daha önce tanımlanan diğer bileşikler arasında kumarik asit ve dihidroksiferülikasit 23 bulunur. Buna rağmen, bu atamaların onaylanması için ek referans standartlarıyla analiz yapılması gerekir.

HPTLC mobil fazlı karşılaştırması
Her iki mobil aşama da, daha önce bildirilen 26,27,28 sistemlerinin bir modifikasyonu olarak geliştirilmiştir. Daha polar hareketli faz (MP1, Şekil 6A), fenolik bileşenlerin MP2'ye kıyasla daha üstün ayrımı sağladı. Buna karşılık, daha az polar mobil faz (MP2) (Şekil 6B), aynı kromatografik çalışma içinde hem örnek bileşenlerin hem de referans standartlarının eşzamanlı tutulmasını mümkün kıldı. Ancak, MP2 koşullarında, örnek bileşenlerin Rf değerleri nispeten düşüktü ve bazı bileşikler Şekil 6'da gösterildiği gibi orijina yakın kalmıştır. Bu sınırlamayı gidermek için, MP1 ve ardından MP2 kullanılarak çift geliştirme prosedürü uygulandı. Bu strateji, örnek bileşenlerinin daha iyi göçünü ve çözünürlüğünü sağlarken, aynı plakada aynı kromatografik koşullarda gallik asit standartlarına göre nicel olarak nicelleştirilmesini sağladı. Quercetin, AlCl₃ tedavisinden önce hafif bir sarı renk göstermişti, bu renk türevleşmeden sonra yoğunlaştı. Hem kireç hem de mandarin özleri için, kökeninde kalan bir bantın yanı sıra iki ayrı bant gözlemlenmiştir. Ayrıca, AlCl₃ türevasyonundan sonra 0.14 Rf değerine sahip sarı bir bant açıkça görünür hale geldi.

figure-results-3
Şekil 6: Kireç, mandarin, gallik asit ve quercetin HPTLC plakaları, mobil faz 1 (A) ve mobil faz 2 (B) ile geliştirilmiştir. Her plaka için soldan sağa doğru izler, gelişmiş (türevlenmemiş), Folin–Ciocalteu türevlenmiş ve AlCl₃ türevlenmiş örneklere karşılık gelir. Görselleştirme beyaz ışık aydınlatması altında gerçekleştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnek toplama ve depolama, fitokimyasal analizlerin bütünlüğünü sağlamada kritik adımlardır. Toplandıktan sonra, örnekler buzdolabında taşınmalı ve bozulmayı en aza indirmek için mümkün olan en kısa sürede dondurularak kurutulmalıdır. Kurutulmuş biyolojik materyaller genellikle stabil olsa da, çözelti içindeki özetler buzdolabında saklandıklarında bile oldukça daha belirgindir. Bu nedenle, analitik değerlendirmeler tercihen taze hazırlanmış ekstraktlar üzerinde yapılır. Soğuk ve ışık korumalı koşullarda birkaç gün veya oda sıcaklığında birkaç saat bile olsa, uzun süreli depolama miktarı, kromatografik profillerde gözlemlenebilir değişikliklere, bant yoğunluğunda değişiklikler ve çökelti oluşumuna yol açabilir. Bu değişiklikler genellikle oksidasyon, hidroliz veya kompleksleşme reaksiyonları gibi kimyasal dönüşümlerle ilişkilidir. Bu nedenle, tüm reaktivler ve özetler kimyasal stabilitelerini korumak için soğuk ve karanlık koşullarda depolanmalı ve işlenmelidir.

Her iki tekniği karşılaştırıldığında (Tablo 3 ve Tablo 4), sistematik nicel farklılıklar belirgindir. Hem kireç hem de mandarinde, mikroplaka testiyle elde edilen TPC değerleri, HPTLC tarafından tahmin edilenlerden yaklaşık üç kat yüksekti. Kireçte, TPC mikroplaka ile 74,2 mmol/g iken, HPTLC'de DM 22,0 mmol/g idi; TFHC değerleri sırasıyla 15,5 mmol/g ve 13,4 mmol/g idi. Mandarin dilinde, TPC mikroplaka ile 72,8 mmol/g iken, HPTLC ile 20,8 mmol/g seviyeye ulaşmıştır. TFHC için mikroplaka yöntemi 6,0 mmol/g verirken, HPTLC ile ilgili bant tespit edilmedi.

Bu tutarsızlıklar, her yöntemin içsel sınırlamaları ve yanıt mekanizmalarıyla açıklanabilir. Folin–Ciocalteu (FC) testi, sadece fenolik bileşiklerle değil, aynı zamanda askorbin asit, tirozin, formik asit ve asetikasit 29 gibi çeşitli fenolik olmayan indirgentici maddelerle ve diğer düşük moleküler ağırlıklı indirgenticlerle de reaksiyona girdiği bilinmektedir. Bu tür bileşikler, genel spektrofotometrik sinyale katkıda bulunur ve potansiyel olarak TPC'nin aşırı tahminine yol açabilir. Ayrıca, küçük fenolik bileşenler, bireysel konsantrasyonları HPTLC'de belirgin ve ölçülebilir bantlar üretemeyecek kadar düşük olsa bile, mikroplaka testinde toplam emilimi topluca artırabilir. Bazı küçük veya yüksek polar metabolitler de kullanılan kromatografik koşullarda tutulamayabilir, çözülemeyebilir veya görselleştirilmez.

figure-discussion-1
Şekil 7: Flavonoller ve 5-hidroksiflavonlarla oluşan AlCl₃ komplekslerinin şematik temsili. (A) Flavonoller ve (B) 5-hidroksiflavonlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tespit kimyasındaki metodolojik farklılıklar, gözlemlenen varyasyonlara daha da katkıda bulunur. FC reaksiyonu, reaktifan azalması nedeniyle soğurma oranında önemli bir artış sağlar ve bu da yüksek analitik duyarlılık sağlar. Buna karşılık, AlCl₃ yöntemi nispeten spesifik değildir ve belirli flavonoidlerle kompleks oluşuma dayanır. Flavonoller genellikle maksimum emilimi yaklaşık 410 nm civarında, 5-hidroksiflavonlar ise yaklaşık 440 nm18 civarında emer ve Al3⁺ ile olan kompleksleri Şekil 7'de gösterilmiştir. Ancak, kompleksleşme sonrası emilimdeki artış nispeten ılımlıdır; bu da AlCl₃ testini flavonoidler dahil olmak üzere renkli matris bileşenlerinin parazitine karşı daha duyarlıdır.

Bu sınırlamalara rağmen, HPTLC'de FC ve AlCl₃ türevlemelerinin birleşik kullanımı, fenolik analiz için güçlü bir tamamlayıcı strateji temsil etmektedir. Bu yaklaşım, FC reaksiyonunun yüksek hassasiyetini, AlCl₃ kompleksleşmesi ve kromatografik ayrımın sağladığı yapısal ayrımcılıkla birleştirir. Ayrıca, UVaydınlatması 30 altında karakteristik sarımsı bantlar sergilediği bilinir ve bu da bileşik sınıflandırma ve doğrulamayı destekler.

Mikroplaka yöntemleri, yüksek verimli tarama için özellikle avantajlıdır. Minimum örnek hazırlığı, düşük reaktif tüketimi gerektirir ve onlarca örneğin eşzamanlı analizini mümkün kılar. Tipik laboratuvar koşullarında, yaygın olarak kullanılan enstrümantlarla yaklaşık 4 saat içinde tam bir mikroplaka testi yapılabilir. Bu özellikler, mikroplaka testlerini hızlı karşılaştırmalı çalışmalar, rutin kalite kontrolü ve büyük örnek setlerinin ön değerlendirmesi için son derece uygun kılar. Buna karşılık, HPTLC daha zaman ve emek gerektiren bir yapıya sahiptir; tam bir analitik iş akışı genellikle 7–8 saat sürer. Ayrıca, tüm laboratuvarlarda bulunmayabilecek özel enstrümantlara dayanır ve özel plakalar ile türev reaktiflerin kullanımı analiz başına maliyeti artırır. Bir diğer sınırlama ise, çok düşük konsantrasyonlarda bulunan metabolitlerin standart görselleştirme koşullarında tespit edilemez kalmasıdır. Ancak, bu pratik ve hassasiyetle ilgili sınırlamalar, kromatografik ayrımıntemel avantajı 30,31 ile dengelenir. HPTLC, karmaşık bitki matrislerinde bireysel bileşenlerin çözümlenmesini, gerçek test yanıtlarının doğrulanmasını ve potansiyel interferantif bileşiklerin tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, seçici post-kromatografik türevleme, bileşiklerin fonksiyonel gruplara (örneğin, flavonoller ve 5-hidroksiflavonlar) doğrudan sınıflandırılmasını sağlar ve böylece kimyasal yorumu toplam içerik tahmininin ötesinde geliştirir.

Buna göre, büyük ölçekli çalışmalarda, analitik iş akışı mikroplaka testleriyle başlayarak hedef bileşik seviyelerinin yüksek olduğu örnekleri hızlıca tespit edebilir. Seçilen örnekler, bireysel bileşenleri görselleştirmek, seçiciliği değerlendirmek ve çift türevasyon yoluyla olası girişimleri değerlendirmek için HPTLC analizine tabi tutulabilir. Bu entegre strateji ( Şekil 8'de gösterilmiştir) hız ve verimliliği kimyasal özgüllük ve yapısal içgörü ile birleştirir.

figure-discussion-2
Şekil 8: Örnek taraması ve analizi için önerilen iş akışı. (A) Büyük bir örnek partisinin yüksek verimli mikroplaka taraması. (B) Seçilmiş örneklerin HPTLC analizi, Folin–Ciocalteu yöntemiyle nicelik ve AlCl₃ türevasyonu yoluyla flavonoller ile 5-hidroksiflavonların tanımlanması için. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

HPTLC ile karşılaştırıldığında, HPLC, literatürde bildirilen en yaygın alternatif olan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HPLC–HRMS) ile birleştiğinde benzersiz hassasiyet ve bireysel bileşiklerin kesin yapısal tanımlanmasınısağlar 32. Buna rağmen, HPLC–HRMS analizleri doğası gereği daha yavaştır; çünkü her kromatografik çalışma ardışık olarak yapılmalıdır ve bu analizler, çözücü saflığı gereksinimleri ve solvent tüketimiyle ilgili maliyetler oldukça yüksektir. Ayrıca, fonksiyonel sınıf taraması genellikle karmaşık veri işleme ve bileşik spesifik yorumlama gerektirirken, HPTLC türevizasyon sonrası bileşiklerin doğrudan görsel gruplanmasını sağlar. Sonuç olarak, HPTLC, hızlı mikroplaka taraması ile kapsamlı HPLC–MS analizi arasında etkili bir ara platform oluşturur; veri verimliliği, maliyeti ve kimyasal seçiciliği dengeler.

Flavonoid ve fenolik analiz, gıda bilimi, nutrasötik, ilaç, tarım ve malzeme araştırmalarında geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir. Gıda biliminde, meyve suları, şaraplar ve çaylar gibi ürünlerin antioksidan kapasitesini, özgünlüğünü, raf ömrünü ve kalite kontrolünü değerlendirmek için kullanılır; ayrıca fenolik olgunluk33'e dayalı optimal hasat süresinin belirlenmesi de dahil olmak üzere tarımsal çalışmaları desteklemek için kullanılır. Nutrasötik sektöründe, fenolik profilleme, yeşil çay ekstraktı kapsülleri, üzüm çekirdeği ekstraktı takviyeleri, quercetin tabletleri ve narenciye biyoflavonoid formülasyonları gibi ticari ürünlerin standartlaştırılması ve kalite güvencesi için gereklidir. Farmastik ve biyomedikal araştırmalarda, bu analizler antioksidan, anti-inflamatuar ve antimikrobiyal potansiyele sahip biyoaktif bileşiklerin taranmasınıdestekler 6. Tarım ve bitki fizyolojisinde, fenolik determinasyon bitki stres tepkilerini değerlendirmeye ve ürün iyileştirme stratejilerini yönlendirmeye yardımcı olur. Ayrıca, malzeme biliminde—özellikle bitkiden kaynaklı korozyoninhibitörleri çalışmalarında 34,35—fenolik karakterizasyon, kimyasal bileşimi adsorpsiyon davranışı ve koruyucu verimlilikle ilişkilendirmeye yardımcı olur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özellikle Rektör Yardımcısı Yolanda Pérez-Carrillo ve videograf Natalia Silva-Maffio'ya video kayıt desteği sunduğu için Extension Başkan Yardımcısına teşekkür ediyoruz. Araştırma Başkan Yardımcısı tarafından verilen "UNA'da Üretilen Bilginin Yayılmasını Destekleme Fağı"nı yayın maliyetlerini desteklediği için minnettarlıkla teşekkür ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL eppendorf tüpleriEppendorf
10 mL hacimli şişeEisco LaboratuvarlarıCH0451B10/19 Polipropilen Stopper, Borosilikat Cam, Amber - Beyaz Gradasyon Izi, Tolerans ve Plusmn; 0,025 ml 
100 & mikro; L ve 1000 µ L mikropipet uçlarıGenel
100– 1000 µ L mikropipetiEppendorfResearch Plus
10&ntir; 100 & mikro; L mikropipetiEppendorfResearch Plus
15 mL kapalı cam borularGenel
50 mL bedeklerGenel
8 kanallı çok kanallı mikropipletTermoBilim
96 kuyuyla mikroplakalarGreiner655891Polisikloolefin, cam taban, siyah
Analitik denge  ± 0.0001 g
Otomatik TLC ÖrnekleyiciCAMAGATS4
SantrifüjTermoBilimSorvall ST8R≥ 850 & Times; g
Filtre kağıdı WhatmanOda doygunluğu için
Dondurucu kurutucuLABCONCOModel 10
Plastik reaktif rezervuarlarıEppendorf
Düz Uçlu ve Kaşık Uçlu SpatulaMerck kimyasallarıHS15906
Synergy HT Çok Algılı Mikroplaka OkuyucuBioTek InstrumentsSynergy HT
TLC silika jel 60 F254 alüminyum arkalı plakalar (10 & kez; 20 cm)Merck
TLC püskürtücüsüSigma-Aldrich20 mL
TLC VisualizerCAMAG2
Ultrasonik banyo/temizleyiciCreworksZX-04040 derece sıcaklık kontrolü ile; C
UV LambUPVUVGL-58
VisionCATS yazılımıCAMAG
Zip-lock torbalarGenel1/4 galon

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kang, H. J., Chawla, S. P., Jo, C., Kwon, J. H., Byun, M. W. Studies on the development of functional powder from citrus peel. Bioresour Technol. 97 (4), 614-620 (2006).
  2. Furukawa, Y., et al. Isolation and characterization of neuroprotective components from citrus peel and their application as functional food. Chem Pharm Bull. 69 (1), 2-10 (2021).
  3. Kim, S. S., Lee, J. A., Kim, J. Y., Lee, N. H., Hyun, C. G. Citrus peel wastes as functional materials for cosmeceuticals. J Appl Biol Chem. 51 (1), 7-12 (2008).
  4. Shyu, Y. S., Lu, T. C., Lin, C. C. Functional analysis of unfermented and fermented citrus peels and physical properties of citrus peel-added doughs for bread making. J Food Sci Technol. 51 (12), 3803-3811 (2014).
  5. Hasnat, H., et al. Flavonoids: A treasure house of prospective pharmacological potentials. Heliyon. 10 (6), e27533(2024).
  6. Albuquerque, B. R., Heleno, S. A., Oliveira, M. B. P. P., Barros, L., Ferreira, I. C. F. R. Phenolic compounds: Current industrial applications, limitations and future challenges. Food Funct. 12 (1), 14-29 (2021).
  7. Khoddami, A., Wilkes, M., Roberts, T. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 18 (2), 2328-2375 (2013).
  8. Kupina, S., Fields, C., Roman, M. C., Brunelle, S. L. Determination of total phenolic content using the Folin-C assay: Single-laboratory validation, first action 2017.13. J AOAC Int. 102 (1), 320-321 (2019).
  9. Matić, P., Sabljić, M., Jakobek, L. Validation of spectrophotometric methods for the determination of total polyphenol and total flavonoid content. J AOAC Int. 100 (6), 1795-1803 (2017).
  10. Folin, O., Ciocalteu, V. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. J Biol Chem. 73 (2), 627-650 (1927).
  11. Folin, O., Denis, W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J Biol Chem. 12 (2), 239-243 (1912).
  12. Lamuela-Raventós, R. M. Folin-Ciocalteu Method for the Measurement of Total Phenolic Content and Antioxidant Capacity. Measurement of Antioxidant Activity & Capacity. , John Wiley & Sons. (2017).
  13. Christ, B., Müller, K. H. Zur serienmäßigen bestimmung des gehaltes an flavonol-derivaten in drogen. Arch Pharm. 293 (12), 1033-1042 (1960).
  14. Carter, J. A., Barros, A. I., Nóbrega, J. A., Donati, G. L. Traditional calibration methods in atomic spectrometry and new calibration strategies for inductively coupled plasma mass spectrometry. Front Chem. 6, 504(2018).
  15. Appel, H. M., Govenor, H. L., D’Ascenzo, M., Siska, E., Schultz, J. C. Limitations of Folin assays of foliar phenolics in ecological studies. J Chem Ecol. 27 (4), 761-778 (2001).
  16. Cubero-Román, E., Carvajal-Miranda, Y., Rodríguez, G., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P. Antioxidant and antimicrobial activity of two Costa Rican cultivars of ber (Ziziphus mauritiana): An underexploited crop in the American tropic. Food Sci Nutr. 11 (6), 3320-3328 (2023).
  17. Shraim, A. M., Ahmed, T. A., Rahman, M. M., Hijji, Y. M. Determination of total flavonoid content by aluminum chloride assay: A critical evaluation. LWT. 150, 111932(2021).
  18. Mammen, D., Daniel, M. A critical evaluation on the reliability of two aluminum chloride chelation methods for quantification of flavonoids. Food Chem. 135 (3), 1365-1368 (2012).
  19. Salih, A. M., et al. Optimization method for phenolic compounds extraction from medicinal plant (Juniperus procera) and phytochemicals screening. Molecules. 26 (24), 7454(2021).
  20. Loescher, C. M., Morton, D. W., Razic, S., Agatonovic-Kustrin, S. High performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) for the qualitative and quantitative analysis of Calendula officinalis–Advantages and limitations. J Pharm Biomed Anal. 98, 52-59 (2014).
  21. Attimarad, M., Mueen Ahmed, K. K., Aldhubaib, B. E., Harsha, S. High-performance thin layer chromatography: A powerful analytical technique in pharmaceutical drug discovery. Pharm Methods. 2 (2), 71-75 (2011).
  22. Dellapina, G., et al. Flavonoid-rich extracts from lemon and orange by-products: Microencapsulation and application in functional cookies. Foods. 14 (19), 3346(2025).
  23. Sanches, V. L., et al. Comprehensive analysis of phenolics compounds in citrus fruits peels by UPLC-PDA and UPLC-Q/TOF MS using a fused-core column. Food Chem X. 14, 100262(2022).
  24. Kaur, S., Singh, V., Chopra, H. K., Panesar, P. S. Extraction and characterization of phenolic compounds from mandarin peels using conventional and green techniques: A comparative study. Discover Food. 4 (1), 60(2024).
  25. Quispe-Fuentes, I., Uribe, E., López, J., Contreras, D., Poblete, J. A study of dried mandarin (Clementina orogrande) peel applying supercritical carbon dioxide using co-solvent: Influence on oil extraction, phenolic compounds, and antioxidant activity. J Food Process Preserv. 46 (1), e16116(2022).
  26. Tatkare, P. C., Jadhav, A. P. Development and validation of a novel high-performance thin-layer chromatography method for the quantitative estimation of neohesperidin from Citrus aurantium peel extract. JPC J Planar Chromatogr Mod TLC. 35 (6), 579-584 (2022).
  27. Wagner, H., Bladt, S. Plant Drug Analysis. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin. (1996).
  28. Apraj, V., et al. Pharmacognostic and phytochemical evaluation of Citrus aurantifolia (Christm) Swingle peel. Pharmacogn J. 3 (26), 70-76 (2011).
  29. Bastola, K. P., Guragain, Y. N., Bhadriraju, V., Vadlani, P. V. Evaluation of standards and interfering compounds in the determination of phenolics by Folin-Ciocalteu assay method for effective bioprocessing of biomass. Am J Anal Chem. 8 (6), 416-431 (2017).
  30. Sultana, S., et al. Investigating flavonoids by HPTLC analysis using aluminium chloride as derivatization reagent. Molecules. 29 (21), 5161(2024).
  31. Pawar, K. N., Kadam, S. P., Redasani, V. K. A systematic review on high performance thin layer chromatography (HPTLC). Int J Pharm Res Appl. 10 (3), 402-416 (2025).
  32. Saftić Martinović, L., Barbarić, L., Gobin, I. Qualitative and quantitative mass spectrometry approaches for the analysis of phenolic compounds in complex natural matrices. Appl Sci. 15 (23), 12529(2025).
  33. de Araújo, F. F., de Paulo Farias, D., Neri-Numa, I. A., Pastore, G. M. Polyphenols and their applications: An approach in food chemistry and innovation potential. Food Chem. 338, 127535(2021).
  34. Castro-Castro, V., Jiménez-Bonilla, P., Álvarez-Valverde, V., Rodríguez-Yáñez, J. Pichichio extracts (Solanum mammosum) as a corrosion inhibitor of low carbon steel in an acidic environment. Pure Appl Chem. 98 (2), 283-300 (2026).
  35. Evaluation of natural products as corrosion inhibitors: Pinus caribaea and Pachira quinata bark extracts on steel. Villalobos-Ugalde, A., Piedra-Marín, G., Rodríguez-Yañez, J., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P., Soto-Fallas, R. M. 6th IEEE International Conference on BioInspired Processing (BIP 2024), , (1109).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Citrus Peel ExtractsTotal Phenolic ContentTotal FlavonolsMicroplate AssaysHPTLC AnalysisPhenolic ProfilingFlavonoid DeterminationFolin Ciocalteu AssayAluminum Chloride AssayPhytochemical Characterization
Video yakında

İlgili makaleler