Yöntem makalesi

Davranışsal Deneye Dayalı Zebrafish Larvalarında MPTP Kaynaklı Parkinson Benzeri Davranışsal Fenotiplerin Fenotipik Profillenmesi

DOI:

10.3791/70041

⸱

15 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, MPTP ile tedavi edilen zebrafish larvalarında Parkinson hastalığına benzeyen motor ve motor dışı eksiklikleri değerlendirmek için davranışsal fenotipleme paradigması oluşturur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, larva zebrabalıklarında MPTP kaynaklı Parkinson hastalığı (PD) için benzersiz, çok parametrik davranışsal fenotipleme protokolünü tanıtmaktadır. Zebrabalıklarda PD benzeri patolojinin kimyasal indüksiyonu, yüksek verimliliğe sahip, genetik olarak yönetilebilir bir sistem sağlar, ancak çoğu çalışma dar bir şekilde temel lokomotor testler veya basit ışık-karanlık geçişlerine odaklanmıştır. Bu sınırlı yaklaşımlar, bradikinezi ve sensorimotor bozukluklardan anksiyete benzeri davranışlar ve uyku bozukluklarına kadar uzanan PD ile ilgili disfonksiyonların daha geniş spektrumunu kapsayamıyor. Bu boşluğu gidermek için, bu çalışma 6 tamamlayıcı testten oluşan entegre bir batarya geliştirdi: genel lokomotor ve keşif sürüşünü değerlendirmek için lokomotor test; kaygıya bağlı kenar tercihi davranışlarını tespit etmek için tigmotaksis değerlendirmesi; bradikinezi ve bozulmuş motor reaktiviteyi kaydetmek için irkilme tepkisi testi; risk alma ve strese yanıt verme değerlendirmesi için ışık-karanlık meydan okuma testleri; fotomotor yanıt paradigmaları (strob ışık uyarısı dahil) sensorimotor ve refleksif hareketi nicelikten ölçemek için; ve uyku-uyanıklık davranışını ölçmek için uyku-uyanıklık düzenlemesi izleme. Larva zebra balıkları, döllenme sonrası 1 gün (dpf) ile 5 dpf arasında subletal MPTP konsantrasyonlarına maruz kalır ve davranışsal değerlendirmeler 4 ila 6 dpf arasında başlatılır. Yüksek çözünürlüklü otomatik takip, her testte birden fazla davranışsal uç nokta oluşturur. Bu yaklaşım, daha önce tespit edilmemiş PD benzeri değişiklikleri ortaya çıkarır; örneğin, düzensiz uyku mimarisi, bozulmuş alışkanlık öğrenmesi, duyusal-motor ve refleksif hareket gibi erken motor olmayan semptomları yansıtır. Bu testleri birleştirerek, araştırmacılar insan PD'sinin karmaşıklığını daha yakından yansıtan kapsamlı bir davranışsal belirti elde ederler. Bu protokol, PD patogenezini inceleme, aday tedavileri tarama ve çevresel modülatörleri inceleme paradigmasını genişletir. Bu koleksiyonun hedefini, güçlü ve çok yönlü fenotipleme yoluyla çeviri önemini artıran yenilikçi hayvan modelleri sunma hedefini temsil ediyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığından sonra en yaygın ikinci nörodejeneratifbozukluktur 1. Son yıllarda yaygınlığı ve etkilenen kişi sayısı istikrarlı bir şekilde artmakta olup, dünya çapında önemli bir halk sağlığısorunu oluşturmaktadır 2. PD görülme oranı 3,4 yaş ile belirgin şekilde artmaktadır. Klinik olarak, PD hem diskinezi, bradikinezi, dinlenme titremesi ve duruş dengesizliği gibi motor semptomlar hem de bilişsel bozukluk, kaygı ve uyku bozuklukları gibi çeşitli motor olmayan semptomlarlakendini gösterir 5. Şu anda PD tanısı öncelikle motor semptomlarınvarlığına bağlıdır 6; Ancak bu belirtiler ortaya çıktığında, substantia nigra'daki dopamin nöronların %60'ından fazlası zatenkaybolmuş 7. Motor olmayan semptomlar genellikle daha erken ortaya çıksa da, spesifik ve objektif değerlendirme kriterlerinin olmaması erken tanı ve müdahaleyizorlaştırır 8. Şu anda PD'nin birincil tedavisi, beyinde dopamine dönüştürülenlevodopa 9'un verilmesini ve böylece striatumdaki dopamin seviyelerinin yenilenmesini içerir. Bu tedavi semptomları geçici olarak hafifletse de, hastalığın ilerlemesinidurdurmaz. Bu nedenle, PD'nin patogenezi ve ilaç taraması üzerine daha fazla araştırma yapılması gereklidir.

Uygun hayvan modelleri oluşturmak, PD patogenezi ve anti-PD ilaç taraması üzerine araştırmalar için hayati öneme sahiptir. Şimdi, PD çalışmaları için üç ana model var: kimyasal indüksiyonmodeli 11, gen düzenlememodeli 12 ve insan xenotransplantasyonmodeli 13. Yaygın kullanılan model hayvanlar arasındafareler 14 gibi kemirgenler vemaymunlar gibi insan olmayan primatlar yer alır 15. Son zamanlarda, zebrabalıklar (Danio rerio), küçük boyutları, hızlı büyümesi, insanlarla yüksek genetik homolojisi ve şeffaf embriyoları gibi avantajlarıyla PD çalışmalarında giderek daha fazla ilgi görmektedir16. Dopamin nöron hasarını indüklemek için nörotoksin MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin) kullanmak, 17,18 olarak dopamin nöron hasarını indüklemek için klasik bir yöntemdir. Subletal MPTP konsantrasyonlarına maruz kalan zebra balıkları çeşitli PD benzeri davranışfenotipleri sergiler 19.

Ancak, günümüzde zebrafish PD çalışmalarının çoğu ağırlıklı olarak temel lokomotor davranışlar veya basit ışık-karanlık geçişler üzerineodaklanır 16,20 ve tek boyutlu davranışsal testler, özellikle motor olmayan fonksiyondaki davranışsal değişiklikleri PD'nin karmaşık davranışsal özelliklerini tam olarak yansıtmakta zordur. PD, motor kontrolün ötesinde birden fazla nörodavranışsal sistemi içeren bir hastalıkolduğu düşünüldüğünde 21,22,23, çoklu sistem fenotiplerini yakalamak için çok parametrik davranışsal fenotip değerlendirme yöntemi acil olarak gereklidir 24.

Buna göre, bu çalışma MPTP ile işlenmiş zebrafish larvalarında PD benzeri davranış fenotiplerini daha kapsamlı tanımlamak için çoklu parametrik ve hızlı davranışsal fenotipleme testi protokolü oluşturmaktadır. MPTP'nin subletal dozu (50 μM)25, döllenme sonrası 1 ila 5 gün arasında larvalara uygulanmıştır (dpf)16,20,26. 4 ile 6 dpf 16,20,24 arasında 6 davranışsal test yaptık: uyku-uyanık düzenleme izleme, fotomotor tepki paradigmaları, tigmotaksis değerlendirmesi, lokomotor değerlendirme, irkilme tepki testi ve ışık-karanlık meydan okuma testleri. Bu davranışsal değerlendirmeler, hareket eksiklikleri, sensorimotor, alışkanlık öğrenme, risk alma, strese yanıt verme ve uyku-uyanık ritmi gibi hem motor hem de motor dışı yönleri kapsar.

Zebrabox yüksek verimli video izleme sistemi ve nicel analiz yöntemini kullanarak, çeşitli davranışsal parametreleri çıkardık ve niceleştirdik ve MPTP ile vahşi tip (WT) grup arasındaki davranışsal farklılıkları istatistiklere göre karşılaştırdık. Mevcut zebrafish PD testleriyle karşılaştırıldığında, bu çok parametrik davranışsal pil, standart bir çerçeve içinde motor ve motor dışı fenotipleri yakalar. Otomatik takip sistemi, objektif davranışsal veri edinimini ve yüksek tekrarlanabilirliği sağlar. Ayrıca, larvaların küçük vücut boyutu, bireysel hayvanların çoklu kuyulu plakalara yerleştirilmesine olanak tanır ve yüksek verimli değerlendirme yapılmasını sağlar. Yukarıdaki avantajlar, PD'nin patolojik mekanizmasını derinlemesine analiz etmek, aday ilaçları veya bileşikleri taramak ve çevresel faktörlerin PD'nin oluşumu veya gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için faydalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balıklarını içeren bu çalışma, hayvan bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüş ve Shandong Üniversitesi Farmasaçı Bilimleri Fakültesi Etik Komitesi (No.YXDW2025-0056) tarafından onaylanmıştır. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. MPTP Hazırlığı

  1. 1× E3 ortamını 100× E3 stok çözeltisi 1:100 ile ultrasaf su ile incelendirerek hazırlayın (örneğin, 5 mL 100× E3 ile 495 mL ultra saf su karıştırarak 500 mL 1× E3 ortamı elde edin).
    NOT: E3 orta malzemesini kullanım gününde taze hazırlayın.
  2. 50 mL'lik santrifüj tüpüne 5,0 mg MPTP tozu ekleyerek ve E3 ortamını 25 mL nihai hacme (santrifüj tüpünü karıştırma kabı olarak kullanın, ancak santrifüj gerektirmez) 1 mM MPTP stok çözeltisi hazırlayın. Çözümü 1 mM MPTP stok çözelti olarak etiketleyin. Stok çözeltiyi karanlıkta sakla.
  3. 50 μM MPTP çözeltisi hazırlanır: 1 mM MPTP stok çözeltisinden 2,5 mL temiz bir kaba aktarılır ve 47,5 mL E3 ortamıyla seyreltirilerek 50 μM MPTP nihai konsantrasyonda 50 mL nihai hacmi elde edilir. Stok çözeltinin kalan kısmı karanlıkta saklanmaya devam etti.
    DIKKAT: MPTP güçlü bir nörotoksindir ve son derece dikkatli ele alınmalıdır. Her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin. MPTP atıklarının kurumsal biyogüvenlik yönergelerine göre bertaraf edilmesi.

2. Zebrafish embriyolarının hazırlanması ve gruplanması

  1. Cinsel olarak olgun erkek ve dişi yetişkin zebra balıklarını seçin ve çıkarılabilir bölücülü üreme tankları kullanarak kontrollü üreme yapmayı gerçekleştirin. Saat 20:00'de, erkek ve dişi zebra balıklarını üreme tanklarına ayrı ayrı 2:3 oranında yerleştirin ve bölücülerle ayırın.
  2. Ertesi gün, çiftleşme için saat 8:00'de bölücüleri kaldırın ve böylece yumurtlama başlar. Embriyoları 1 saat sonra topla ve temiz sistem suyla üç kez yıkay.
  3. Embriyoları taze E3 ortamıyla 100 mm Petri kaplarında yerleştirin ve 28 °C'de 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngü altında kuluçkaya alın (ışıklar 08:00-22:00 arası açık olsun).
    NOT: Normal gelişimi sağlamak için 20 mL ortamda her tabak başına 50 embriyoyu aşmayın.
  4. 1 dpf hızında, döllenmemiş, deformasyon yapmış ve anormal embriyoları dikkatlice Pasteur Pipiti ile çıkarın ve zebrafish embriyolarını içeren çözeltiyi yerine koyun. WT grubu için mevcut ortamı taze E3 embriyo ortamı ile değiştirin. MPTP ile işlenmiş grup için, ortamı 50 μM MPTP çözeltisi ile değiştirin (Şekil 1A), ardından her iki grubu da kuluçka makinesine geri gönderin.
  5. Her iki grup için de çözeltiyi değiştirin ve ölü ya da sağlıksız embriyoları her 24 saatte bir çıkarın. MPTP ile işlenmiş grup için, MPTP çözümünü 1 dpf sabahından 4 dpf sabahına kadar her gün değiştirin (Şekil 1A). Daha sonra, MPTP ile işlenmiş grubu 5 dpf sabahından deneyin sonuna kadar E3 ortamına geçirin.
    NOT: Çözeltiyi Pasteur Pipet ile nazikçe değiştirin. Petri kabının kenarından ortamı yavaşça aspire edin ve embriyoların rahatsızlığını en aza indirmek için Petri kabının duvarına taze çözelti ekleyin.

3. Uyku - uyanık düzenleme izleme

  1. 4 dpf'de, her gruptan saat 18:00'de zebrafish larvalarını seçin ve onları uç kesilmiş, her kuyuya bir larva olarak değiştirilmiş 3 mL Pasteur Pipetiyle 96 kuyu takılı bir plakaya aktarın (Şekil 1B). İlk dört sıra WT gruplarını, son dört satır ise MPTP gruplarını temsil eder (her grupta 48 zebrafish).
    NOT: Zebra balıklarını uyarmak veya zarar vermemek için, Pasteur Pipettes'i 4 dpf zebrafish larvalarının boyutundan daha geniş bir delik elde etmek üzere (10 mm) keserek değiştirin (vücut uzunluğu 3,7 mm'yigeçiyor).
  2. Her bir kuyuyu stereo mikroskopla inceleyin; her zebrafish larvasının sağlıklı görünmesi, yüzgeçlerin açık ve düzenli sallandığı, vücudun dik olması ve yüzme mesanesininşişirildiğinden emin olun. Her kuyunun zebra balığının sağlıklı olduğundan emin olduktan sonra, her kuyuyu E3 ortamı ile doldurun.
    NOT: Her kuyunu E3 orta ile neredeyse şişkinlikle doldurun, böylece yüzey gerilimi korunur. Sıvıyı dikkatlice ekleyin, böylece kabarcıklar oluşmasını ve çapraz kuyudan taşmasını önleyin.
  3. Balığı ve sıvıyı 96 delikli bir tabakaya aktardıktan sonra, uyku-uyanık davranış testinden önce 30 dakika boyunca uyum sağlamak için Zebrabox odasına yerleştirin.
    NOT: 96 kuyruklu plakayı Zebrabox haznesine yerleştirmeden önce, video takip sonuçlarını kirin etkilememesi için plakanın altını dikkatlice temizleyin.
  4. Zebralab video takip yazılımını açın, Kuantlaştırma modunu seçin ve 96 kuyuluklu plakanın Zebrabox odasının altına merkezi konumlandırıldığından emin olun.
  5. Işık ayarını saat 22:00'da ışığı kapatıp 8:00'da açacak şekilde ayarlayın; bu, zebra balığının yetiştirildiği ışık koşullarıyla uyumludur. Gündüz saatlerinde beyaz ışık genellikle yaklaşık 1000 luks civarındadır. Yazılım parametrelerini şu şekildeayarlayın 29: tespit eşiği, 40; burst, 25 (hareket eşiği); donma (hareket için eşik noktası), 4; kutu boyutu 60 saniyet; toplam izleme süresi, 52 saat (ilk gün 20:00'den üçüncü gün 00:00'a kadar). Uyku-uyanık prosedürünü saat 20:00'de başlatın.
    NOT: İşlem başladıktan sonra, deney boyunca dışarıdan gelen herhangi bir ses ve titreşimi yasaklayın, böylece zebra balığının normal uyku-uyanık ritmini etkilemesin. Uzun süreli izleme sırasında su buharlaşmasını önlemek için, 96 kuyu tabakasını şeffaf plastik sargıyla kaplayın.
  6. 52 saat sonra, uyku-uyanık deneyini durdurun ve veri dosyasını kaydedin. 96 kuyruklu plakayı ZebraBox'tan çıkarın.
    NOT: MATLAB ve Excel kullanarak, uyku nöbetleri sayısı (uyku nöbeti en az 1 dakika süren hareketsizlik dönemleri olarak tanımlanır)29, ortalama uyku nöbeti süresi (ortalama uyku nöbetleri), toplam uyku süresi (izleme süresi boyunca tüm uyku dönemi), uyku gecikmesi (hafif bir geçişten ilk uyku kriminin başlangıcına kadar olan süre) gibi gerekli parametreler bulunuyor. ortalama aktivite (tüm izleme dönemi boyunca lokomotor aktivite olarak tanımlanır) ve uyanık aktivite (uyku dönemleri hariç sadece uyanık dönemde lokomotor aktivite olarak tanımlanır) veri dosyasından çıkarılıp analiz edilmiştir.
    1. WT grubu ile MPTP ile tedavi edilen grup arasındaki farkları karşılaştırmak için Öğrencinin t-testini kullanın. Ayrıca, MATLAB yazılımı ile 52 saat boyunca zebra balıklarının uyku eğrisi, uyanık aktivite eğrisi ve ortalama aktivite eğrisini çizin.

4. Fotomotor tepki paradigmaları

NOT: Fotomotor yanıt paradigmaları (strob ışığı dahil), 5 dpf larvalarda yüksek verimli davranışsal testlerdir; bu testler ışığın ani geçişine yanıt olarak duyusalmotor ve refleksif lokomotor değişiklikleri nicelikleşir. Bu test, 2 paradigma içeren 96 kuyu bir plaka kullanılarak gerçekleştirildi: (1) 1 dakika karanlıktan 1 dakika sabit ışığa (1000 lx) ışık geçişi ve (2) 1 dakika karanlıktan 1 dakika strobing ışığa geçişi içeren strob ışık yanıtı.

  1. 5 dpf larvaları 96 kuyu ölçülü bir plakaya (her kuyuda 1 larva) yerleştirin (Şekil 1B) ve her kuyuyu E3 ortamıyla doldurun. Ortalama olarak toplam 96 larvanı WT grubu ve MPTP grubuna ayırın.
  2. Karanlık-sabit ışık paradigması:
    1. 5 dpf larvalarla dolu 96 delikli plakayı Zebrabox'a yerleştirin ve testten önce larvaların karanlıkta 5 dakika alışmasına izin verin.
    2. Tracking online analiz modunu açın.
    3. Işık geçiş programını şu şekilde ayarlayın: 0-60 s: Koyu, 60-120s: Sabit ışık (1000 lx).
    4. Protokolü başlatın, 120 saniyelik test boyunca her 6 saniyede bir ilgili hareket parametrelerini toplayın.
    5. Protokolü 120. saniyede durdurun, veri dosyasını dışa aktarın. Larvaları çevreye alıştırmak için 5 dakika boyunca tam karanlığa bırakın ve onları aşağıdaki karanlık-strob ışığı testine hazırlayın.
  3. Karanlık-strob ışık paradigması:
    1. Işık geçiş programını şu şekilde ayarlayın: 0-60 s: Koyu, 60-120 saniye: 10 Hz'de strob ışığı (1000 lx).
      NOT: 10 Hz'lik bir strob, saniyede 10 ışık darbesine karşılık gelir. ZebraLab'ta, ışık yoğunluğunu her 100 ms'de 0'dan 1000 lx'e değiştirerek bunu uygulayın.
    2. 5 dakikalık karanlık adaptasyon tamamlandıktan sonra, karanlıktan strobe ışık testine başlayın. 120 saniyelik test boyunca her 6 saniyede bir hareket parametreleri toplayın.
  4. Veri analizi: Test bittikten sonra veri dosyasını dışa aktarın. MATLAB yazılımı kullanarak yüzme mesafesini her 6 saniyede bir çıkar. Her iki testin 2 dakikalık süresinde yüzülen toplam mesafeyi (6 saniye başına ortalama değer) çizin. Donma indeksini ışında 1 dakikada toplam mesafeyi30 ışıkta kat edilen toplam mesafeden çıkararak hesaplayın.
    NOT: Donma İndeksi < 0 donma davranışını gösterir; Donma indeksi > 0 kaçış anlamına gelir; Donma indeksi = 0 reaksiyon olmaması anlamına gelir. WT grubu ile MPTP ile tedavi edilen grup arasındaki farkları karşılaştırmak için Öğrenci t-testi ve iki yönlü ANOVA kullanın. Her grup için toplam 48 zebrafish larvası (n = 48) kullanıldı.

5. Thigmotaksislerin değerlendirilmesi

  1. İki adet 6 kuyruklu plaka seçin, her kuyunu 4 mL E3 ortamı ile doldurun.
  2. 5 dpf'de, WT grubundan ve MPTP ile işlenmiş gruptan zebrafish larvaları toplandı ve iki 6-kuyu tabakasına yerleştirildi (biri WT grubu, diğeri MPTP ile işlenmiş grup, her kuyuda 1 larva) (Şekil 1C).
    NOT: Larvaların başlangıç konumunun kuyuların ortasında olduğundan emin olun.
  3. Tigmotaksis değerlendirmesinden önce, kuyu plakaları Zebrabox'un uygun yerine 15 dakika önceden yerleştirilmelidir.
  4. Veri toplama ve analiz: Çizim Alanı fonksiyonunu kullanarak, her kuyunun gözlem alanında iki konsantrik daire çizin (merkez dairesinin yarıçapı deliğin yarıçapının 1/2'sini oluşturur) (Şekil 1C), kalan parametreler ise lokomotor değerlendirme ile aynı şekilde ayarlanır. Protokolü 5 dakikalık tigmotaksis değerlendirmesi için başlatın ve paralel bir deney yapın.
    NOT: Program bittikten sonra, Zebralab yazılımı zebrafish larvalarının yörüngesini 5 dakika içinde ve çeşitli ilgili hareket parametreleri üretir. Veri dosyasında, an1 her kuyunun tüm alanını, an2 ise her kuyunun iç bölgesini temsil eder. Dolayısıyla total dis(an1) ve total dur(an1) toplam yüzme mesafesi ve tüm kuyunun içinde toplam süre ile ifade edilirken, total dis(an2) ve total dur(an2) sırasıyla iç bölgede geçirilen mesafe ve zamanı temsil eder.
    1. Thigmotaksisi aşağıdaki formüllerle hesaplayın:
      Dış bölgede yüzülen mesafenin yüzdesini hesaplayın:
      figure-protocol-1
      Dış bölgede geçirilen zamanın yüzdesini hesaplayın:
      figure-protocol-2
    2. WT grubu ile MPTP tedavisi gören grup arasındaki tigmotaksis farklarını karşılaştırmak için bir Öğrencinin t-testini kullanın. Her grup için toplam 24 zebrafish larvası (n = 24) kullanıldı.

6. Lokomotor değerlendirme

  1. 5 dpf ile WT grubundan ve MPTP ile işlenmiş gruptan zebrafish larvaları seçilir ve sırasıyla iki 12 kuyu tabakasına aktarılır (biri WT grubu, diğeri MPTP ile işlenmiş grup, her kuyu başına 1 larva, 2 mL E3 ortam ile) (Şekil 1D).
    NOT: Zebrafish larvalarının boyutlarının benzer olduğundan emin olun ve seçilen larvaların açık yüzgeçleri, dik duruşu, yüzme mesanesi iyi genişlemesi ve düzenli hareket hali olmalıdır.
  2. Lokomotor değerlendirmeden önce, uyum sağlamak için kuyu plakasını Zebrabox'un test pozisyonuna 15 dakika önceden yerleştirin.
    NOT: Adaptasyon sırasında ışık koşullarının test sırasında ışık koşullarıyla uyumlu olduğundan emin olun.
  3. 15 dakikalık bir alışma döneminden sonra, takip modunu seçin - çevrimiçi analiz, her larvanın lokomotor aktivitesini otomatik bilgisayarlı video takip sistemi kullanarak 5 dakika boyunca kaydedin. Zebralab yazılımını kullanarak hareket izlerini ve çeşitli ilgili lokomotor parametreleri her 60 saniyede bir toplarak, tam veri dosyasını dışa aktarıyor ve MATLAB ile her larvanın toplam mesafesini ve ortalama hızını 5 dakikada analiz ediyorum.
    1. WT grubu ile MPTP ile tedavi edilen grup arasındaki farkları karşılaştırmak için Öğrenci t-testi ve iki yönlü ANOVA kullanın. Her grup için toplam 24 zebrafish larvası (n = 24) kullanıldı.

7. Irkilme tepki testi

NOT: Bu test, ani karanlığa geçişlerle ortaya çıkan görsel irkilme tepkisini (VSR) ölçür; bu tepki karanlık flaş kaynaklı ürkilme olarak da bilinir. Bu irkilme tepkisi testi, ani, milisaniye ölçeğinde karanlık patlamalarla tetiklenen fotik uyarınan görsel irkilmeyi değerlendirir. Sürekli davranışsal yanıtların değerlendirilmesini sağlayan karanlık-strob ışık paradigmasının aksine, bu test akut görsel uyarana karşı hızlı, refleksif motor tepkilere odaklanır.

  1. Hazırlıklar: 5 dpf ile WT grubundan ve MPTP ile işlenmiş gruptan zebrafish larvaları seçilir ve sırasıyla iki 12 kuyuyla hazırlanmış plakaya (biri WT grubu, diğeri MPTP ile işlenmiş grup, her kuyu başına 1 larva, 2 mL E3 ortam ile) aktarılır (Şekil 1D).
  2. Irkilme tepki testinden önce, uyum sağlamak için kuyu plakasını Zebrabox'un test pozisyonuna 5 dakika önceden yerleştirin.
  3. Uyarılma parametrelerini ayarlayın: Zebralab yazılımını açın, Tracking online analiz modunu çalıştırın, Light-triggering arayüzünü açın, aşağıdaki 3 tetikleme yönteminden birini kullanın, Enhanced uyarıcını etkinleştirin, oturum başladığında olarak ayarlayın; geçiş programında, karanlık flaş ritmi şu şekilde tanımlanır (program 21 saniyeden sonra tetiklenmeye başlar): Geçiş 1: 5 ms, %100 ışık yoğunluğu; geçiş 2: 2890 ms, %100 ışık yoğunluğu; geçiş 3: 5 ms, %0 ışık yoğunluğu; geçiş 4: 100 ms, %0 ışık yoğunluğu; Periyodik yanıp sönmesini sağlamak için geçiş listesini tekrarla .
  4. Başlatma protokolü: Numeriscope video kayıt fonksiyonunun açık olduğundan emin olun, yüksek verimlilikli otomatik takip bu 90'lar testinde 30 davranışsal uç noktayı kapsayan çok boyutlu bir veri seti oluşturur.
  5. Veri analizi: Patlama yanıt testi tamamlandıktan sonra, ham veri dosyalarını dışa aktarın ve analiz için MATLAB yazılımına aktarın. Her larvanın yüzme mesafesini 3 saniyelik aralıklarla ve ortalama yüzme hızını hesaplayın.
    1. Her grup için flaş uyarıcısından sonra yapılan tepe hareket mesafesini, tepe hızını veya yanıt gecikmesini belirleyin. WT grubu ile MPTP ile tedavi edilen grup arasındaki farkları karşılaştırmak için Öğrenci t-testi ve iki yönlü ANOVA kullanın. Her grup için toplam 24 zebrafish larvası (n = 24) kullanıldı.

8. Açık ve karanlık meydan okuma testi

  1. 5 dpf ile zebrafish larvalarını ayrı ayrı iki 24 kuluk plakaya (Şekil 1E) aktarın; her kuyuya bir larva ve her kuyu başına 1 mL E3 ortamı sağlanır. Her plakada 24 larva bulunuyordu ve iki 24 kuyulu plaka WT grubu ve MPTP ile işlenmiş grup olarak eşit şekilde bölündü (n = 24 grup başı).
  2. Test öncesi, 24 delikli plakayı Zebrabox içindeki belirlenmiş test alanına yerleştirerek test ortamına uyum sağlamak için 5 dakikalık bir ışık alışması süreci uygulanır. Çevrimiçi Takip Analiz modunu etkinleştirin. Işık programını şu şekilde yapılandırın: 6 dakika sürekli ışık ve ardından 4 dakika tam karanlık (Şekil 1E). Toplam test süresi 10 dakikadır ve veri puanlarının toplanma süresi 60 saniyedir.
    NOT: Küresel 6 dakikalık ışık, uyum sağlama ve alışkanlık içindir; böylece stabil temel lokomotor ve özel ışık-karanlıkyanıtları sağlanır 31,32.
  3. 10. dakikada, davranış kaydını durdur ve veri kaydet. Plakayı dikkatlice Zebrabox'tan çıkarın.
  4. Her larva için, her 60 saniyelik aralıkta yüzme mesafesini çıkarın. Işık aşamasında (0-6. dakika), karanlık aşamada (7-10. dakika) ve toplam 10 dakikalık sürede kat edilen mesafeyi hesaplayın. Karanlık aşamada thigmotaksis davranışını ve alışkanlık öğrenme performansını nicelikle ölçemek.
    NOT: Alışkanlık öğrenimi, bir hayvanın sürekli bir uyarıcı/ortama maruz kaldığında davranışsal tepkinin azalmasıolarak tanımlanır 33,34 ve ışıktan karanlığa geçişi takip eden 1. dakika ile 4. dakikada taşınan ortalama toplam mesafe (mm) istatistiksel olarak karşılaştırılarak değerlendirilmiştir. WT grubu ile MPTP ile tedavi edilen grup arasındaki farkları karşılaştırmak için Öğrenci t-testi ve iki yönlü ANOVA kullanın. Her grup için toplam 24 zebrafish larvası (n = 24) kullanıldı.

9. MPTP atıklarının bertarafı

NOT: Her davranışsal deneyden sonra, MPTP temas ettiği yüzeyleri (örneğin laboratuvar tezgahları ve ZebraBox) taze hazırlanmış sodyum hipoklorit (ağartıcı; ≥%10 v/v) ile sprey ve silin.

  1. MPTP'nin sıvı atıklarını (kalan maruziyet çözeltileri ve durulama ortamı dahil) ve katı atıkları (örneğin Pasteur pipetleri, eldivenler, Petri kapları ve çok kuyu tabakları) toplayın. Onları açıkça tehlikeli nörotoksik atık olarak etiketleyin.
  2. Kontamine sıvı atık ve katı malzemeler en az 24 saat boyunca taze hazırlanmış sodyum hipoklorit (ağartıcı; ≥%10 v/v) ile arındırın, ardından kurumsal düzenlemelere uygun olarak bertaraf edilir.
  3. MPTP ile işlenmiş zebrafish larvalarını, seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine (örneğin, %6 çamaşır suyu ile 1:5 oranında) 5 dakika35 boyunca batırarak ötenazileyin. Hareket ve kalp atışı eksikliği nedeniyle ölüm kesinleşti. Dekontamin edilmiş larvalar ve ortamlar kurumsal bertaraf için tehlikeli biyolojik atık olarak muamele edilmeli (kurumsal onaylı protokollere doğru).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uyku-uyanıklık düzenleme izleme
52 saatlik uyku-uyanık düzenleme izleme 4 dpf'de başladı ve 96 kuyu bir plaka kullanılarak gerçekleştirildi. MPTP ile tedavi edilen zebra balıkları, WT grubuna kıyasla uyku yapısında anlamlı bozulmalar gösterdi. Temsil eden uyku eğrileri, uyanık aktivite grafikleri ve ortalamalı aktivite izleri Şekil 2'de gösterilmiştir. Zebrafish larvalarında uyku-uyanıklık düzenleme analizinin parametreleri

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, MPTP kaynaklı PD benzeri davranış fenotipini değerlendirmek ve analiz etmek için kapsamlı bir protokol geliştirmiş ve doğrulamıştır. Bu protokol, 6 farklı testi, lokomotor değerlendirme, tigmotaksis testi, irkilme yanıt testi, fotomotor tepki paradigmaları (strob ışık uyarısı dahil), ışık-karanlık meydan okuma testi ve uyku-uyanık düzenleme izlemesini entegre ederek PD'nin motor ve motor dışı kusurlarını değerlendirip tasvir etti. Sonuçlar, WT grubuna kıyasla MPTP ile tedavi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 21906095), Shandong Üniversitesi Genç Akademisyen Gelecek Programı Sponsorluğu, Shandong Doğa Bilimleri Vakfı (No. ZR2019BB018), Shandong Üniversitesi'nin Temel Araştırma Fonları (No. 2017GN0030), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No. 2018M640640). Ayrıca, Yaşlı Rehabilitasyon ve Hemşirelik için Dijital Fujian Büyük Veri Enstitüsü'nün 2025 Açık Araştırma Fonu tarafından da desteklenmektedir (Hibe No. BDRI202502) ve Nankai Üniversitesi Eğitim Bakanlığı'nın Biyoaktif Malzemeler Ana Laboratuvarı'ndan 2025 Açık Araştırma Fonu'nu (Hibe No. SWHX-202503). Jinan Mikroekolojik Biyomedikal Shandong Laboratuvarı Araştırma Projesi (Hibe No.JNL-2023002KF). Yazarlar, deney sırasında gösterdikleri destek için Shandong Üniversitesi Qilu Hastanesi Qilu Hastanesi Laboratuvar Hayvan Merkezi'ne ve Shandong Üniversitesi Qilu Hastanesi Klinik Laboratuvar Bölümü'nden Dr. Sun Chengxi'ye teşekkür etmek isterler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 kez; E3 stok çözümüŞanghay Feixi BiyoteknolojisiYok34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2· içerir; 2H2O ve 9,78 g MgCl2· Litre başına 6H2O
12-Hole Hücre Kültür PlakasıNEST Biyoteknolojisi712011Tedavi edilmemiş, pirojenik olmayan, steril, polistiren. Zebrafish larva davranış testleri için kullanılır
24-Hole Hücre Kültür PlakasıNEST Biyoteknolojisi702011Tedavi edilmemiş, pirojenik olmayan, steril, polistiren. Zebrafish larva davranış testleri için kullanılır
3 mL Pasteur PipetBiologix30-0238A1
6-Hole Hücre Kültür PlakasıNEST Biyoteknolojisi703011Tedavi edilmemiş, pirojenik olmayan, steril, polistiren. Zebrafish larva davranış testleri için kullanılır
96-Hole Hücre Kültür PlakasıNEST Biyoteknolojisi701011Tedavi edilmemiş, pirojenik olmayan, steril, polistiren. Zebrafish larva davranış testleri için kullanılır
MATLAB R2020aMathWorks, ABD YokMATLAB R2020a, Kampüs genelinde lisans, Shandong Üniversitesi yazılım portalından alınmıştır (softms.sdu.edu.cn). Zebrafish larva davranış verilerinin istatistiksel analizi için kullanılır.
Microsoft ExcelMicrosoftYokMicrosoft Excel (Microsoft Office'in bir parçası), Shandong Üniversitesi lisanslı yazılım portalı üzerinden kurulan sürüm (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin) Beyotime411252815 mg
Petri KabıNEST Biyoteknolojisi704202100 mm, steril, kolay tutuşlu sap, TC ile işlenmiş
Sodyum hipoklorit çözeltisiMacklinS817439Stok ev çamaşır suyu çözeltisi (%6-14 aktif klor bazlı), &ge'ye kadar seyreltilmiş durumda; yüzey ve atık dekontaminasyonu için %10 v/v; ayrıca MPTP ile işlenmiş zebrafish larvalarının ötenazi için 1:5 (%6 ağartıcı: su) oranında seyreltilmiştir.
Stereo MikroskopOlympusSZX2 serisi
Zebrabox Yüksek Çözünürlüklü Video Takip Sistemi Viewpoint, Fransa Yok
Zebralab Yazılımı Viewpoint, Fransa YokVersiyon (3,52,3,87)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elbaz, A., Carcaillon, L., Kab, S., Moisan, F. Epidemiology of Parkinson's disease. Rev. Neurol. (Paris). 172 (1), 14-26 (2016).
  2. Elgueta, D., et al. Analyzing the Parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human alpha-synuclein. J Vis Exp. (185), e63313(2022).
  3. Peng, S. Y., Liu, P., Wang, X. W., Li, K. Y. Global, regional and national burden of Parkinson's disease in people over 55 years of age: a systematic analysis of the global burden of disease study, 1991-2021. BMC Neurol. 25, 178(2025).
  4. Zhu, J. Q., et al. Temporal trends in the prevalence of Parkinson's disease from 1980 to 2023: a systematic review and meta-analysis. Lancet Healthy Longev. 5 (7), 464-479 (2024).
  5. Goldman, J. G. Non-motor symptoms and treatments in Parkinson's disease. Neurol Clin. 43 (2), 291-317 (2025).
  6. Kobylecki, C. Update on the diagnosis and management of Parkinson's disease. Clin Med. (Lond). 20 (4), 393-398 (2020).
  7. Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7, 116(2021).
  8. Tolosa, E., Garrido, A., Scholz, S. W., Poewe, W. Challenges in the diagnosis of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 20 (5), 385-397 (2021).
  9. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. J. Parkinsons Dis. 3 (3), 255-269 (2013).
  10. Kalia, L. V., et al. Disease-modifying therapies for Parkinson's disease: Lessons from multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 20 (12), 724-737 (2024).
  11. Thirugnanam, T., Santhakumar, K. Chemically induced models of Parkinson's disease. Comp. Biochem. Physiol C Toxicol Pharmacol. 252, 109213(2022).
  12. Crabtree, D. M., Zhang, J. H. Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res. Bull. 88 (1), 13-32 (2012).
  13. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 16 (3), 269-274 (2015).
  14. Dovonou, A., et al. Animal models of Parkinson's disease: bridging the gap between disease hallmarks and research questions. Transl. Neurodegener. 12, 36(2023).
  15. Potts, L. F., et al. Modeling Parkinson's disease in monkeys for translational studies: A critical analysis. Exp. Neurol. 256, 133-143 (2014).
  16. Doyle, J. M., Croll, R. P. A critical review of zebrafish models of Parkinson's disease. Front. Pharmacol. 13, 835827(2022).
  17. Bagwell, E., Larsen, J. A. A review of MPTP-induced Parkinsonism in adult zebrafish to explore pharmacological interventions for human Parkinson's disease. Front. Neurosci. 18, 1451845(2024).
  18. Feng, X. -Z., et al. Behavioral assessments of spontaneous locomotion in a murine MPTP-induced Parkinson's disease model. J Vis Exp. 143, e58653(2019).
  19. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Y. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front. Neurosci. 18, 1432102(2024).
  20. Brinez-Gallego, P., et al. Experimental models of chemically induced Parkinson's disease in zebrafish at the embryonic larval stage: A systematic review. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 26 (4), 201-237 (2023).
  21. Xu, Z. H., et al. Deep clinical phenotyping of Parkinson's disease: Towards a new era of research and clinical care. Phenomics. 2 (5), 349-361 (2022).
  22. Tinaz, S. Functional connectome in Parkinson's disease and Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 21, 24(2021).
  23. Costa, H. N., et al. Parkinson's disease: A multisystem disorder. Neurosci Bull. 39 (1), 113-124 (2023).
  24. Christensen, C., Thorsteinsson, H., Maier, V. H., Karlsson, K. Æ Multi-parameter behavioral phenotyping of the MPP⁺ model of Parkinson's disease in zebrafish. Front Behav Neurosci. 14, 623924(2020).
  25. Zhang, S., et al. Anti-Parkinson's disease activity of phenolic acids from Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts and their autophagy activation mechanism. Food Funct. 11 (2), 1425-1440 (2020).
  26. Maleski, A. L. A., et al. Integrated behavioral and proteomic characterization of MPP⁺-induced early neurodegeneration and Parkinsonism in zebrafish larvae. Int J Mol Sci. 26 (14), 6762(2025).
  27. Vauti, F., et al. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PLoS One. 15 (8), e0237167(2020).
  28. Parichy, D. M., et al. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Lee, D. A., Oikonomou, G., Prober, D. A. Large-scale analysis of sleep in zebrafish. Bio Protoc. 12 (3), e4313(2022).
  30. Shen, Q., et al. Rapid well-plate assays for motor and social behaviors in larval zebrafish. Behav Brain Res. 391, 112625(2020).
  31. Rock, S., et al. Detailed analysis of zebrafish larval behaviour in the light-dark challenge assay shows that diel hatching time determines individual variation. Front Physiol. 13, 827282(2022).
  32. Hillman, C., Kearn, J., Parker, M. O. A unified approach to investigating 4 dpf zebrafish larval behaviour through a standardised light/dark assay. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 134, 111084(2024).
  33. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacol. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  34. Gomez-Laplaza, L. M., Gerlai, R. Latent learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 208 (2), 509-515 (2010).
  35. Winn, A. A., Prestia, K. A., Peneyra, S. M. Testing alternative surface disinfection agents for zebrafish (Danio rerio) embryos. J Am Assoc Lab Anim Sci. 60 (5), 510-518 (2021).
  36. Wagle, M., Nguyen, J., Lee, S., Zaitlen, N., Guo, S. Heritable natural variation of an anxiety-like behavior in larval zebrafish. J Neurogenet. 31 (3), 138-148 (2017).
  37. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: a critical review. Behav Brain Res. 214 (2), 157-171 (2010).
  38. Schnorr, S. J., Steenbergen, P. J., Richardson, M. K., Champagne, D. L. Measuring thigmotaxis in larval zebrafish. Behav Brain Res. 228 (2), 367-374 (2012).
  39. Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish. EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).
  40. Lee, H. B., et al. Key HPI axis receptors facilitate light adaptive behavior in larval zebrafish. Sci Rep. 14 (1), 7759(2024).
  41. Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients. Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).
  42. Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldua, D. Neurotoxicity assessment in adult Danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank. J Vis Exp. 201, e65869(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zebrafish Parkinson ModeliMPTP nd ksiyonuDavran sal FenotiplemeZebrafish LarvalarLokomotor AnalizTigmotaksi De erlendirmesirkilme Tepkisi TestiI k Karanl k ChallengeUyku Uyan kl k zlemesiOtomatik Video Takibi

İlgili makaleler