Yöntem makalesi

Farelerde Sosyal Davranış Ağının İki Renkli Çok Lifli Fotometri Kayıtları

DOI:

10.3791/70049

⸱

17 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lif fotometrisi, derin beyin sinir popülasyonlarından kalsiyum aktivitesini kaydetmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Burada, farelerde derin beyin sinirsel popülasyonlarından kalsiyum aktivitesi ve diğer dinamik floresan sinyallerin özelleştirilebilir, çok alanlı iki renkli görüntülemesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiber fotometri, sinyallerin fiber optik kablo üzerinden toplu olarak kaydedilmesi, serbest hareket eden kemirgenlerdeki nöron gruplarından kalsiyum aktivitesini kaydetmek için faydalı bir yöntemdir. Özellikle, bu yöntem, genetiğe özgü küçük nöron popülasyonlarını beynin daha ventral ve daha az erişilebilir bölgelerinde hedeflemeyi halledilebilir bir sorun haline getirir; çünkü hücresel çözünürlükte kaydedilmesi hâlâ zordur. Bu teknik, paketli çoklu lifli yaklaşımla aynı anda birden fazla bölgeden kaydedecek şekilde ölçeklenebilir ve her kayıtlı bölgede genetik stratejilerle birden fazla hücre tipini hedefleyebilir. Burada, fare sosyal davranış ağını (12 siteye kadar) hedeflemek için özelleştirilmiş çoklu fiber diziler nasıl oluşturulacağı ve ekleneceği için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, özelleştirilmiş çoklu lifli dizimizle birden fazla bölgenin başarılı hedeflenmesi için gereken cerrahi ameliyat prosedürlerini ve her bölgede genetik olarak tanımlanmış iki sinir popülasyonunun eşzamanlı görüntülenmesi için yeşil ve kırmızı kaymalı kalsiyum aktivite göstergelerinin viral yaklaşımını detaylandırır. Bu bölgelerden sosyal davranış sırasında ticari olarak bulunan tamamlayıcı bir metal-oksit yarı iletken (CMOS) kamera sistemi kullanarak nasıl kayıt yapılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, bu protokol kalite kontrol yöntemlerini gösterir ve gürültü düzeltme ile standartlaştırma için ön işleme boru hattını detaylandırır. Son olarak, aracın büyük ölçekli beyin ağları hakkında yeni bulgular ortaya çıkarmak için bazı potansiyel uygulamalarını tartışıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiber fotometri, fiber optik kablolar aracılığıyla floresan sinyallerin toplu olarak kaydedilmesi, derin beyin bölgelerinde sinir popülasyon aktivitesini ölçmek için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Çoğu zaman, bu bölgeler mikroendoskopi veya geleneksel elektrofizyolojik yaklaşımlarla kolayca erişilemez 1,2,3. Çağdaş sistem sinirbiliminde temel hedeflerden biri, davranış üretiminde yer alan büyük ölçekli, hücre tipine özgü beyin ağlarının kullandığı hesaplamaları belirlemek ve çözmektir. Nöropiksel problar ve ticari olarak bulunan çoklu lifli ferrullar, doğrusal hizalı sinirpopülasyonlarından 4,5,6,7 kaydetme konusunda üstün olurken, geniş alan kortikal görüntüleme yüzeysel kortikal dinamikleri mükemmel şekilde kapsama sağlar 8,9. Ancak, mekansal olarak dağılmış ama işlevsel olarak bağlı subkortikal sinir popülasyonlarından aynı anda kayıt yapmak teknik olarak zorlayıcı 5,10,11,12 olarak kalmıştır. Ayrıca, fotometri için birden fazla tek lifli ferrul kullanarak birden fazla derin beyin yapısını hedeflemek mümkün olsa da, bu yaklaşım birbirinden yeterince uzakta olan sinir popülasyonlarıyla sınırlıdır ve birden fazla ferrul implanteedilebilmektedir 12. Özel çok lifli fotometri dizileri, bu boşluğu en az kısıtlamayla özgürce davranan hayvanlarda birçok subkortikal bölgeden eşzamanlı kayıtlar mümkün kılarak kapatır ve karmaşık davranışlar sırasında ağ düzeyinde koordinasyona benzersiz bir pencere sunar.

Sosyal davranış ağı (SBN), büyük ölçekli beyin ağı dinamiklerini araştırmak için ideal bir sistemi temsil eder. SBN, sosyal davranışın oluşumunda yer alan yoğun şekilde birbirine bağlı ve evrimsel olarak korunmuş subkortikal yapılar kümesidir ve tüm omurgalısınıflarında (13,14,15) tanımlanmıştır. Bu yapılar geleneksel olarak lateral septum, preoptik alan, stria terminalis'in yatak çekirdeği, ön ve ventromedial hipotalamik çekirdekler, medial amigdala, nucleus accumbens ve periaqueductal gri 13,14,15 içerir ancak bunlarla sınırlı değildir. SBN içinde, moleküler belirteçlerle tanımlanan spesifik sinir popülasyonları sosyal davranış düzenlemesinde kritik roller oynar. SBN ɣ-aminobutirik asit-erjik (GABAerjik) nöronlar (veziküler GABA taşıyıcısının (VGAT'ın ekspresyonuyla işaretlenen) ve glutamaterjik nöronlar (veziküler glutamat taşıyıcısının (VGlut) ekspresyonuyla işaretlenen) ağdaki başlıca uyarıcı ve inhibitör hücre tiplerini temsil eder ve muhtemelen sosyal eylemin modülasyonunda ayrışabilir rolleroynar 16,17,18,19 . Bu klasik nörotransmitter sistemlerinin ötesinde, cinsiyet hormonu sinyalleri ağın işlevinde kritik bir rol oynar. Örneğin, birçok erkek ve kadın sosyal davranışı östrojen reseptörü alfa ifadesini gerektirir ve SBN nöronlarındaki bu reseptörleri ifade eden aktivite bu davranışları nedensel olarakyönlendirir 16,20,21,22,23,24,25,26 . Buna ek olarak, SBN sinir popülasyonları dopamin, arginin vazopressin, oksitosin, opioidler, taşikin, nöropeptid Y, prolaktin, oreksin, aguti-ilişkili peptit, melanokortinler, kisspeptin ve gonadotropin salgılayan hormon 17,18,19,27,28,29,30 gibi birçok nöromodülatör sistemin ligandları ve reseptörleriyle zenginleştirilmiştir.31 ve genetik olarak kodlanmış sensörlerdeki son gelişmeler, bu çeşitli sinyal moleküllerinin çoğunun (32,33,34,35,36,37,38) takibini mümkün kılar. SBN sinir popülasyonları subkortikal yapılar boyunca mekansal olarak dağılmış olduğundan, geleneksel deneysel hazırlıklar (örneğin, hücre dışı elektrofizyoloji, kortikal yüzey görüntüleme ve çok lifli fotometriye daha önceki yaklaşımlar) bu büyük ölçekli beyin ağı boyunca anlık aktivite dinamiklerini yakalayamaz. Buna rağmen, genetik olarak tanımlanmış sinir popülasyonlarında kalsiyum dinamiklerini nöromodülatör salınım desenleriyle birlikte izleyerek, özel çok noktalı lif fotometri platformları, hangi hücre tiplerinin ve sinyal moleküllerinin sosyal davranışın belirli özelliklerini kodladığını ortaya çıkarabilir ve yeni mekanik içgörüler sağlar.

Burada, serbestçe hareket eden farelerde 12'ye kadar beyin bölgesinden eşzamanlı kaydı mümkün kılan çok siteli, iki renkli fiber fotometri için özelleştirilebilir bir platform geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, 11 SBN beyin bölgesine dağılmış 22 tanımlanmış sinir popülasyonundan kalsiyum aktivitesinin iki renkli fotometri kaydını ve çekirdek akumbensindeki dopamin dalgalanmalarının GPCR-aktivasyon temelli DA sensörü (GRAB-DA1m)33 ile ölçümlerini yaptık (Tablo 1). Bu protokol (Şekil 1), özelleştirilmiş çoklu fiber dizilerinin inşası, birden fazla derin beyin bölgesini hedeflemek için cerrahi prosedürler, çift kalsiyum göstergelerinin (GCaMP39 ve RCaMP40) ifade edilmesi için viral dağıtım stratejileri, ticari olarak mevcut CMOS kamera tabanlı fiber fotometri sistemi kullanılarak veri toplama, kalite kontrol yöntemleri ve gürültü düzeltme ile sinyal standartlaştırması için ön işleme boru hattını detaylandırmaktadır. Önemli olarak, ön işleme boru hattımız, hareket artefaktı düzeltme yapmamıza olanak tanıyan izosbestik kontrol dalga boyu kayıtlarını içeriyor. Hareket artefaktlarını düzeltmek için regresyon tabanlıbir yaklaşım uygularız 41, böylece binmek veya dövüşmek gibi güçlü sosyal davranışlarda sinyal sakatliliğini sağlıyoruz. Özel çok lifli fotometri yöntemimiz, hem proksimal hem de distal derin beyin yapılarında dağılmış aktiviteyi aynı anda izleyip genetik hedefleme yoluyla kayıtların hücre tipi özgüllüğünükoruyabildiği için, derin beyin, büyük ölçekli beyin ağlarında sinirsel aktivite dinamiklerini kaydetmek için alternatif yaklaşımlara göre önemli avantajlar sunar.

Bu protokol, özellikle genetik olarak tanımlanmış hücre tipleri arasında ağ düzeyinde dinamikleri araştırırken veya nöromodülatör salınımını sinirsel aktiviteyle birlikte takip ederken, serbest davranan hayvanlarda mekânsal olarak dağılmış subkortikal beyin bölgelerinden (≥4 site) eşzamanlı kayıtlar gerektiren deneyler için en uygun şekilde uygundur. Bu yaklaşım, özellikle hareketli hareketleri (örneğin, sosyal etkileşimler) içeren doğal davranışları incelemek için değerlidir; burada hareket artefaktı düzeltme boru hattımız sinyal doğruluğunu sağlar. Ancak, tek hücre çözünürlüğü, somatik ve aksonal sinyaller arasındaki ayrım veya yüzeysel kortikal bölgelerden kayıtlar arayan araştırmacılar, alternatif yaklaşımları (örneğin minyatür mikroskopi, Nöropikseller veya geniş alan görüntüleme) daha uygun bulabilirler. Temel pratik hususlar arasında cerrahi karmaşıklık, özel çoklu fiber dizi üretimi ihtiyacı ve gerekli malzeme altyapısının (3D baskı yetenekleri, fiber optik araçlar) oluşturulması yer alır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol, 8–25 haftalık yetişkin farelerle test edilip doğrulandı. Fareler, 12 saatlik ters koyu ışık döngüsünde 21–26 °C ve %30-%70 nemde barındırıldı (KAPALı: 10:00; SAAT: 22:00). Deneyler yalnızca öznel aktif (karanlık) aşamada gerçekleşti. Yiyecek ve su ima edilirdi. Tüm hayvan prosedürleri Princeton Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri standartlarına uygundu.

1. Çok Fiber Dizi ve Patchcord Üretimi (Şekil 1A)

  1. Patchcord üret (Şekil 2A).
    1. 12 fiber dallanan bir yama kablo edinin ve verilen patchcord konnektörünü ve stereotaktik sondaj aksesuarlarını (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3) reçine kullanarak (çekme dayanımı: 8,7 kilopound/inç kare [ksi], e-modül: 377 ksi, ısı sapma: 138 °F, uzalma: %8) ile bastırın.
    2. Verilen parlatma diskini (Ek Dosya 4) 2 inç çapında paslanmaz çelik çubuktan oluşturun ve puck'un ortasına çoklu fiber dizinin boyutunda bir kesik ekleyin.
    3. Fazla reçineyi 1.22 mm x 11mm ölçümlerindeki matkap ucu ile çoklu fiber dizisindeki dowel pin deliklerinden manuel olarak temizleyin. Hassas 3D baskıda bile, dübel pin delikleri dübelin geçemeyeceği için biraz fazla küçüktür.
    4. Fiber deliklerinden delin.
      1. Stereotaktik delme aksesuarındaki tüm 4 pinli deliğe alaşım çelik dübel pinleri (1,19 mm x 12,7 mm) yerleştirin ve patchcord konnektörünü alt tarafı yukarı olarak stereotaktik delme aksesuarına yerleştirin; çubel pinleri çoklu fiber dizinin dowel pin deliklerinden geçiyor.
      2. M4 boyutu set vidalarını dişli vida deliklerinde sıkın, yama kablosu konnektörünü yerinde sabitleyin ve stereotaktik delme aksesuarını stereotaktik çerçeveye sabitleyin.
      3. Stereotaktik matkaba 0,25 mm x 5,5 mm ölçülerinde bir matkap ucu yerleştirin ve matkapı stereotaktik çerçeveye monte edin. Bu matkap ucu kullanılarak, çoklu fiber dizinin yaw, pitch ve roll noktalarını maksimum sapma toleransı ±0.03 mm ile düzleştirin.
        NOT: 3D baskının en ön ve arka pozisyonlarında yaw ve pitch düzleştirin, çoklu fiber dizinin dört köşesinde düzleştirin.
      4. 3D basılmış fiber deliklerinden birinin üzerinde merkez matkap yapın ve stereotaktik çerçeve X/Y koordinatlarını ilgili beyin bölgesinin ML (X) ve AP (Y) koordinatlarına ayarlayın (Tablo 1). Matkabı, ön dübel piminin deliğinin üzerinde ortalamak için stereotaktik çerçevedeki yeni (0, 0) koordinatlara hareket ettirin.
      5. 0,25 mm x 5,5 mm ölçülerindeki sondaj ucunu kullanarak her bir fiber deliği stereotaktik olarak tanımlanmış koordinatlarda 5,5 mm derinliğe kadar delebilirsiniz (Tablo 1).
        NOT: Stereotaktik çerçeveden multifiber diziyi çıkarmadan önce tüm deliklerin tamamen temizlendiğinden emin olmak için uzun bir fazla fiber parçası kullanın. Bu, çoklu fiber dizinin delikleri temizlemek için düzleştirilmesi ve delinmesi gereken sayısını sınırlar.
    5. Patchcord konnektörünü ve dallanan patchcord'u birleştirin
      1. Patchcord liflerinin >10 cm'sini açığa çıkarın. Lifleri eşit uzunlukta olmak için lif yazıcı ile kesin. Sonra, patchcord üzerindeki 12 lifin etrafına 3/16" ve 5/16" sıcak büzülme borulardan oluşan tek bir parça yerleştirin.
        NOT: Boru konnektöre yapıştırıldıktan sonra açıkta kalan lifleri koruyacaktır.
      2. Her fiberi, patchcord konnektöründeki bir delikten birine yerleştirin, böylece alt yüzeyde yaklaşık 0,3 mm fiber açıkta kalır. Tüm lifler yerleştirildikten sonra, patchcord konnektörünün üst yüzeyine 21–27 G iğne ucu kullanarak lifleri yerinde sabitlemek için süper yapıştırıcı uygulayın.
      3. Patchcord konnektörünün üst yüzeyine 0,5–1 cm yüksekliğinde piramit şeklinde epoksi uygulayın. Epoksinin liflerin yerleştirildiği üst yüzey dışında hiçbir alanı kaplamadığından emin olun. Epoksinin gece boyunca oda sıcaklığında kürlenmesine izin verin.
      4. En düşük ayarda ısı tabancası kullanarak ısı büzme borusunu epoksi ve üzerindeki açıkta bulunan lif üzerinde (<3–5 cm) küçültün.
        NOT: Bunu yaparken ısıcık boruya dokunmaktan kaçının, böylece yanıklar önlenir.
      5. Kalan açıkta kalan liflerin uzunluğuna kadar iç çapı 3 mm olan yumuşak plastik boru kesin, borunun kenarı boyunca yarık kesin ve kalan açıkta kalan lifi borunun içine yerleştirin.
      6. Şeffaf boru şeffaf bir işaretleyiciyle boyanın, liflerin artık görünmemesini sağlamak için şeffaf siyah bir işaretleyici ile boyanın, görüntüleme deneyleri sırasında açıkta kalan lifin ışığını en aza indirin.
    6. Patchcord'u parlat.
      1. Patchcord konnektörünü alt yüzeyi özel cila pıçağında sabitleyin. Patchcord konnektörünü 6 μm, 3 μm, 1 μm ve ardından 0.01 μm kumlu parlatma levhaları ile sonsuzluk sembolü/levhası şeklinde 10–20 hareketle parlatın. 1 μm ve 0.01 μm grit levhalar için, cilalamadan önce 5 damla damıtılmış su koyun.
      2. Fazla damıtılmış suyu temizlemek için konnektörün yüzeyini silin. Patchcord konnektörünün cilalı yüzey tarafında fiber lekeleri veya çatlakları parlak alan mikroskobu ile kontrol edin ve varsa tekrar cila yapın.
    7. Patchcord çıkışını kontrol et.
      1. Patchcord'un Sub-minyatür versiyon A (SMA) konnektör ucunu CMOS kamera tabanlı fiber fotometri görüntüleme sistemine bağlayın. Görsel kodlama yazılımı kullanarak, fotometri görüntüleme sisteminin kılavuzunu takip edin ve CMOS kamerayı patchcord'un SMA ucuna odaklayın.
        NOT: Kılavuz, yazılım güncellemeleriyle uyumlu hale gelmek için düzenli olarak güncellenir. Fotometri sisteminin görsel kodu yeni yazılım sürümleriyle sık sık değiştiği için, bu kılavuz mevcut yazılım sürümleri için en güncel bilgileri içerir.
      2. Optik güç ölçerle %20 güçte 470 nm patchcord çıkışını ölçün. Patchcord çıkışı 2.5 mW < ise 1.1.7 adımını tekrarlayın.
  2. Çok Fiber Dizisi Üret.
    1. Verilen çoklu fiber diziyi (Ek Dosya 5, Ek Dosya 6) reçine ile adım 1.1.1'de tanımlanan teknik özelliklerle yazdırın.
    2. Çok fiber diziyi hazırlayın.
      1. M0.6 Pirinç Altıgen somunları, çoklu fiber dizinin yan köşelerindeki dört yuvadan her birine yerleştirin ve altıgen somun deliğini açıklığın ortasına hizalasın.
      2. Her altıgen somun yuvasının yanından 21–27 G iğne ucu ile bir damla süper yapıştırıcı uygulayın, gerekirse takviye için ek damlalar ekleyin. Yapıştırıcıyı oda sıcaklığında 5 dakika kurutmadan sonra bir sonraki adıma geçin.
      3. Multifiber dizinin yanlarındaki yapıştırıcıyı jilet bıçağıyla tıraş edin ki cila pıçağına uyduğundan emin olun.
      4. Fazla süper yapıştırıcı çoklu fiber dizinin yüzey tarafında kuruyorduysa, çok lifli dizinin yüzeyini özel cila diski ve 30 μm kumlu parlatma levhalarıyla parlatın, yapıştırıcı çıkarılana ve çoklu fiber dizisi düz olana kadar.
      5. Fazla reçineyi çoklu fiber dizideki dübel pin deliklerinden 1.22 mm bir matkap ucu ile manuel olarak temizleyin.
    3. Fiber delikleri açın (Şekil 2B-C).
      1. Stereotaktik sondaj aksesuarındaki tüm 4 pimli deliğe alaşım çelik dübel pinleri (1,19 mm x 12,7 mm) yerleştirin ve çoklu fiber diziyi yüzey tarafına (düz taraf) yukarı doğru stereotaktik sondaj aksesuarına yerleştirin; dübel pinleri ise çoklu fiber dizinin dübel pimi deliklerinden geçebilir.
      2. 1.4.2 – 1.4.5 adımını tekrarlayın.
    4. Çok lifli dizide lifleri hazırlayın.
      1. 200 μm, 0.39 NA optik fiber bir kesitten plastik kılıfı, fiber soyucu ile soyun. Lifi etanol ile temizleyin.
      2. Lifleri bir lif kesici kullanarak ~3–5 cm uzunluğunda kesimlere ayırın. Bu bölümleri lif yazıcı ile ikiye bölmek için daha da iyi olur. Kesilmiş kesitlerin en az bir ucunun çatlak veya lekesiz olduğundan emin olmak için parlak alan mikroskobu kullanın. Sadece en az bir ucu lekesiz olan lifler kullanın.
      3. En az 15 mm uzunluğunda hassas bir cetveli parlak alan mikroskobunun altına bantlayın. Lifin lekesiz tarafını cetvelin 0 mm konumuna yerleştirin (Şekil 2D). Her hedef bölge için lifleri istenen uzunlukta kesin (Tablo 1).
        NOT: Fiber uzunluğu, en derin lif için stereotaktik D/V koordinatına 6 mm ekleyerek ve ardından tüm lifler için bu değerin D/V koordinatı ile en derin lifin D/V koordinatı arasındaki farka uydurulması ile ayarlanarak hesaplanır.
    5. Fiberleri çoklu fiber dizisine yerleştirin.
      1. Multifiber diziyi üretim tutucusuna yüzeyi aşağı konumda yerleştirin. Parçayı dübel pinleriyle hizalayıp sabitleyin.
      2. Lif uzunluğunu siteye göre eşleştirin (Tablo 1) ve bölünmüş lifleri çoklu lif dizisinde uygun deliklere yerleştirin, lekesiz taraf yukarı bakacak şekilde yerleştirilin. Bir sonraki adımdan önce tüm liflerin tamamen içeri itildiğinden emin olun.
      3. Tüm lifleri yerine yapıştırmak için 21–27 G iğne ucu ile süper yapıştırıcı uygulayın. Yapıştırıcının oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca hareket etmesine izin verin, sonra devam edin.
    6. Çok lifli diziyi yüzey yüzü aşağı olarak 1.1.6 adımını tekrarlayarak parlatın (Şekil 2E).
    7. Çok fiber dizi verimliliğini kontrol edin.
      1. Çok lifli dizinin cilalı yüzeyini etanol ile temizleyin ve ardından indeks eşleştirme jeli uygulayın. Patchcord konnektörüne 4 dübel pimi takın ve çoklu fiber diziyi G5 sürücü vidaları ve ilgili tornavida ile ona sabitleyin (Şekil 2F).
      2. Bir powermetre kullanarak çoklu fiber dizisinden 470 nm ve 560 nm LED emisyonunu ölçün. Verimliliği şu değerlerle hesaplayın:
        figure-protocol-1
      3. Verimlilik %<75 ise, 1.2.7.1–1.2.7.2 adımlarını tekrarlayın.
        NOT: Yeniden cilalama verimliliği artırmazsa ve liflerde herhangi bir leke yoksa, çoklu fiber dizisindeki liflerin patchcord konnektörüne hizasız olması mümkün.
    8. Kullanıma çok fiber diziyi hazırlayın (Şekil 2G).
      1. Çok fiber dizideki deliklere 4 dübel pimi yerleştirin. Dübel pinlerinin çoklu fiber dizinin beyin tarafından 1 mm'den fazla dışarı çıkmadığından emin olun.
      2. Süper yapıştırıcı beyin tarafına dübel pinlerine yerleştirin. Yapıştırıcıyı oda sıcaklığında en az 10 dakika kurutmaya bırakın, sonra multifiber dizisini kullanın.

2. Cerrahi (Şekil 1B)

  1. Cerrahi alan ve aletler hazırlayın.
    1. Aseptik çalışma alanı sağlamak için temiz stereotaktik çerçeve.
    2. Steril, emilebilir dikiş edinin.
    3. Bir çift ince forseps, ince makas ve iki bulldog kelepçesi otoklav yapın.
    4. Buharlaştırıcının izofluran ile dolu olduğundan emin olun. İzoforurans, vakum ve oksijen hatları için boruların buharlaştırıcıya, indüksiyon odasına ve stereotaktik çerçevenin burun konisine sıkıca bağlı olduğundan emin olun.
  2. jRCaMP1b, GCaMP6f ve GRAB-DA1m adeno-ilişkili virüsleri edinin.
    DIKKAT: Virüslerle ilgilenirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyin.
    1. Virüsleri gerekirse mililitrede 1x10-13 ile 4x10-13 parça arasında çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
    2. JRCaMP1b ve GCaMP6f adeno-ilişkili virüslerden 1:1 karışımı hazırlayın.
    3. 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f viral karışımı ve GRAB-DA1m virüsünden bir aliquot buzun üzerine koyarak sıcaklık 4 °C'de tutulur.
  3. Anestezi başlatın.
    1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve odanın kapısını kapatın. Buharlaştırıcıya oksijen akışını 1 L/dakika ile başlatın.
    2. Gaz akışını indüksiyon odasına yönlendirin ve vakum hattını açın, böylece fazla gazı odadan çıkarabilirsiniz. Buharlaştırıcıyı %3 – %5 arasında izofluran konsantrasyonuna ayarlayın.
  4. Fareyi stereotaktik çerçeveye aktar.
    1. Farenin nefesi 1 nefes/s'ye yavaşladığında, fareyi stereotaktik çerçeveye taşıyın. Farenin ön kesici dişlerini burun konusunun ağızlığındaki yuvaya takın ve burun konisini farenin burnunun üzerine sıkıştırın.
    2. Gaz akışını stereotaktik çerçeveye geçirin, izofluran konsantrasyonu %1–2 olarak ayarlanarak anesteziyi sürdürmek için. Burun konisinden gaz çıkarmak için vakum hattını değiştirin.
      NOT: Ameliyat boyunca farenin nefesini izleyin ve derin anestezi sürdürmek için izofluran konsantrasyonunu gerektiği gibi ayarlayın; solun hızı 1 nefes/s. Derin anestezi, ameliyat boyunca periyodik olarak farenin parmak sıkışmasına tepki vermediğinden emin olarak doğrulanmalıdır.
    3. Isıtma sistemini vücut sıcaklığını 35 °C tutarak ayarlayın ve farenin gözlerinin kurumasını önlemek için optik merhem uygulayın.
    4. Stereotaktik kulak çubukları takın, böylece kafatasının her iki yanında, hafifçe dorsal ve kulak kanallarının önüne doğru itilsin. Kulak çubuklarını sıkın ve farenin kafatasının yerinde sabitlenmesini sağlayarak farenin başının üstüne nazik bir baskı uygulayarak kontrol edin.
  5. Saç derisini kesiye hazırlayın.
    1. Farenin başının üstündeki tüyleri kısa hale getirene kadar kesin veya tıraş edin. Tüy çıkarma jeli farenin başının üstüne sürün ve yaklaşık bir dakika bekletin. Kalan jeli temiz bir pamuk çubukla çıkarın.
    2. 2.5.1 prosedürünü gerekirse tekrarlayın, ta ki başın üstündeki tüm tüyler temizlenene kadar.
    3. Başın üstündeki cildi, pamuklu çubuklarla betadin (%10 povidon-iyot çözeltisi) ve ardından %70 etanol solüsyesi uygulayarak dezenfekte edin.
  6. Kafatasını ortaya çıkar.
    1. Kafatasının orta hattı boyunca, lambda'nın hafifçe arkasından rostral rhinal venin hafifçe önüne kadar uzanan bir kesi kesin.
      NOT: Rhostral rhinal vein, koku bulb ile prefrontal korteks arasında beynin dorsal yüzeyinde yer alan kan damarıdır.
    2. Bu kesiyin yanlarındaki tıraş edilmiş deriyi kesip çıkarın; böylece paretal kemikleri, intraparietal kemiğin ön ucunu ve burun kemiklerinin rostral rhinal venin önündeki kısmını ortaya çıkaran gözyaşı damlası şeklinde bir kesik oluşturun (Şekil 2H).
    3. Kafatası yüzeyini %0,9 tuzlu çözelti ve temiz bir pamuk çubukla nazikçe temizleyin.
  7. Katasını yerle bir et.
    1. Rostral rhinal venin sagital dikişle birleştiği yeri bulun. Bu noktayı steril bir bistüri bıçağı ile işaretleyin.
    2. #92 karbid matkap ucunu stereotaktik matkaba yerleştirin ve matkabı stereotaktik şasiye monte edin. Stereotaktik manipülatörü kullanarak matkapın ucunu işaretlenmiş noktada kafatası yüzeyine yerleştirin ve matkapın X, Y ve Z koordinatlarını sıfırlayın.
    3. Belirgin noktada Z derinliği ve arka kısmında -8,25 mm ölçülerek kafatasının düz eğimi. İşaretlenmiş nokta ile -8.25 arka pozisyon arasındaki lateral mesafeyi ölçerek kafatasının yaw'ını düzleştirin. Iz derinliğini orta çizgiden ±2,0–2,5 mm ve işaretlenen noktaya göre -2,0, -4,5 ve -7,0 mm pozisyonlarda ölçerek düzleştirin.
  8. Kraniotomi ve duratomi yapın.
    1. Matkap ucunu #76 veya #78 karbid matkap ucu ile değiştirin. Matkapı, sagital dikiş, rostral rhenal ven ve kafatası yüzeyinin birleşim noktasındaki işaretli konumda sıfırlayın.
    2. Matkapi her beyin bölgesinin A/P ve M/L koordinatlarına taşıyın (Tablo 1). Her bölgede bir kraniotomi açın ve her kraniotomide 27G veya daha küçük boş şırınga ucu kullanarak dura mater'i dikkatlice çıkarın.
  9. Virüsü enjekte edin.
    1. Cam mikropipetleri uçlarının en az 7 mm inceleceği ve ucu 10–30 μm aralığında açılacak şekilde çekin.
      NOT: Sonraki adımlardan herhangi birinden sonra mikropipette herhangi bir hava kabarcığı varsa 2.9.2–2.9.12 adımlarını yeniden başlatın.
    2. Boş cam mikropipet ucunu mineral yağla doldurun. Mikropipet ucunu nanolitre enjektöre takın ve sabitleyin. Nanolitre enjektör arayüzünü kullanarak mikropipetten mümkün olduğunca çok mineral yağı dışarı atabilirsiniz.
    3. Nanolitre enjektörünü stereotaktik çerçeveye monte edin. Parafin mumu levhasından küçük bir parça kesin ve farenin başına yerleştirin.
    4. jRCaMP1b:GCaMP6f virüs karışımından 1 μL pipetini parafin mumuna koyun. Nanolitre enjektörün ucunu aşağı indirin ki cam mikropipet ucu virüs karışımında olsun ve enjektör arayüzü aracılığıyla mikropipeti virüsle doldurun.
    5. 2.9.4'ü tekrar et, kullanılacak tüm virüs nanolitre enjektöre aktarılana kadar (Tablo 1). Parafin balmumunu çıkarıp biyolojik tehlike amaçlı bir atık konteynerine atın.
    6. Enjektör mikropipet ucu, sagital dikiş, rostral rhinal ven ve kafatası yüzeyinin birleşimindeki işaretli konumda sıfırlayın.
    7. En ventral ve en dorsal enjeksiyon bölgesinden başlayarak (Tablo 1), mikropipet ucunu her bölgeye hareket ettirin, beyin yüzeyine değecek şekilde indirin ve stereotaktik çerçevedeki Z pozisyonunu sıfırlayın.
    8. Her bölgede, mikropipet ucu beyne, enjeksiyon bölgesine göre ventral 0,1 mm hale getirilebilmesine kadar indirin. Sonra, mikropipet ucunu son enjeksiyon yerine 0,1 mm yukarı kaldırın. Çevredeki dokunun mikropipet ucunun etrafında 30 saniye boyunca yerleşmesine izin verin.
    9. Nanolitre enjektör arayüzü kullanılarak, 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f virüs karışımından 300 nL enjeksiyon işlemi 1–2 nL/s hızda enjekte edilerek karışımı mevcut enjeksiyon noktasına dağıtılır.
    10. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra mikropipet ucu enjeksiyon bölgesinde en az 5 dakika kalmalıdır. Mikropipet ucunu yavaşça beyinden çıkararak virüsün enjeksiyon yolu boyunca dorsal yayılma riskini azaltın.
    11. Her bölgeye 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f viral karışımı enjekte edildikten sonra, nanolitre enjeksiyon arayüzünü kullanarak nanolitre enjektörün pistonunu orijinal konumuna geri döndürülür. Mikropipeti çıkarın ve biyolojik tehlike içeren keskin atık konteynerine atın.
    12. Gerekirse, GRAB-DA1m ekspresyonu hedeflenen her beyin bölgesi için 2.9.2–2.9.11 adımlarını tekrarlayın. Her hedeflenen bölgede, virüs karışımı için kullanılan 300 nL yerine 150 nL enjekte edilir.
  10. Implant çok fiber dizisi.
    1. Çok lifli diziyi implantasyon sırasında stabil tutmak için dübel pinleriyle tutabilen herhangi bir bağlantı kullanılarak çok lifli diziyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin (Şekil 2I).
    2. Çok lifli dizinin konumunu, her lifin ilgili kraniotominin merkezine hizalanacak şekilde ve en uzun lifin beyin yüzeyinde duracağı şekilde ayarlayın. Stereotaktik manipülatörü bu konuma sıfırlayın ve çok lifli diziyi yavaşça en derin virüs enjeksiyonunun D/V konumunun 0,25 mm üzerinde olacak kadar indirin (Tablo 1, Şekil 2J).
    3. Soğuk bir karıştırma kabını buzun üzerine koyun ve üzerine 1 kepçe çimento tozu, 4 damla sıvı baz ve 1 damla katalizör ekleyin. 20 saniye karıştır.
      NOT: Bu adımı sıvı çimento kullanıldığında ve daha fazlası gerektiğinde tekrarlayın.
    4. Sıvı çimentoyu çoklu lif dizisi ile kafatası arasındaki boşluğa aktarmak için bir şırınge ve 23–31 G iğne kullanın.
    5. Sıvı çimento uygulayın, ince plastik aplikatör veya şırınga iğnesi kullanarak çoklu fiber dizinin dört tarafını tamamen kaplayın ve kafatasından piramit şeklinde bir şekil oluşturun (Şekil 2K). Çimento en az 15 dakika kurutuldu.
    6. Kesi boyunca deriyi birbirine dikerek kafatasının açığa çıkmamasını sağlayın.
  11. Farenin toparlanmasına izin verin.
    1. İzofluran konsantrasyonunu 0'a indirin.
    2. Fareyi stereotaktik çerçeveden ısıtma pedine aktarın ve fareyi tekrar kafese aktarmadan önce uyanık ve dolaşmasını bekleyin.
    3. Deneylere başlamadan önce farenin en az iki hafta iyileşmesine izin verin.

3. Çok Siteli, İki Renkli Kalsiyum Görüntüleme (Şekil 1C)

  1. Veri Toplama Cihazını (DAQ) yapılandırmak.
    1. GND'yi Ch7 portunun üzerindeki AGND portuna elektrik kablosu ile bağlayın.
    2. DIO0'ı elektrik kablosu ile Ch0 portuna bağlayın.
  2. Fotometri sistemini DAQ'ya bağlayın.
    1. Split BNC kablosunun Baby Neill Constant (BNC) konnektör ucunu (bir uçta BNC konnektörü, diğer uçta kırmızı ve siyah elektrik kabloları) fotometri sisteminin giriş portuna takın. Başka bir bölünmüş BNC kablosunun BNC konnektörü ucunu fotometri sistemindeki çıkış portuna takın.
    2. Fotometri sisteminin giriş portuna bağlı bölünmüş BNC kablosunu alıp kırmızı kablo ucunu DAQ'daki DIO1 portuna bağlayın. Fotometri sisteminin çıkış portuna bağlı bölünmüş BNC kablosunu alın ve kırmızı kablo ucunu DAQ'daki Ch1 portuna bağlayın.
    3. Her iki split BNC kablosundan gelen siyah toprak kablolarını DAQ GND portuna bağlayın.
  3. Davranış ve fotometri kameralarını senkronize edin.
    1. Birden fazla davranış kamerasını birden fazla açıdan eşzamanlı olarak kaydetmek için zincirleyin.
      1. Birincil davranış kamerasının opto-izole çıkışını (pin 4, beyaz kablo) ikincil kameranın izole edilmemiş girişine (pin 1, yeşil tel) 3.3 KΩ dirençle bağlayın. Ana kameranın 3.3 V çıkışını (pin 3, kırmızı kablo) aynı 3.3 KΩ direncine ve DAQ'daki Ch2'ye bağlayın.
      2. Her ikincil kameranın opto-izole çıkışını 3.3 KΩ direnç kullanarak 3.3 V çıkışına bağlayın.
      3. Birincil kameranın topraklamasını (pin 6, kahverengi kablo) her ikincil kameranın topraklamasına bağlayın. Tüm kamera topraklama kablolarını Ch2 portunun üzerindeki DAQ AGND portuna ve fotometri sisteminin çıkış topraklarına bağlayın.
  4. İlgili görüntüleme yazılımıyla davranış kamerası ayarlarını yapılandırın.
    1. "Erişim Kare Hızı"nı 45 Hz ve kazancı 1'e ayarlayın.
    2. Pozlama süresini 2998 μs, pozlama alt sınırı 100 μs ve pozlama üst sınırını 150000 μs olarak ayarlayın.
      NOT: "Edinim Kare Hızı" gerçek kare hızı olmayabilir. Maruz kalma süresi ve istenen veri bant genişliğine bağlı olarak, bu değerin nihai görüntüleme frekansından daha yüksek ayarlanması gerekebilir. Gerekirse, "Alınan Kare Hızı"nı gösterilen "Sonuç Kare Hızı"nın 40 Hz olacak şekilde ayarlayın.
  5. DAQ yazılımını yapılandırın (Ek Dosya 7).
    1. DAQ yazılımında DAQ'yu 'Cihaz' olarak ekleyin ve 'Yapılandırma Paneli'ne geçin.
    2. 'Kanallar' sekmesinde, 'Analog Giriş' altında 0–2 kanallarını etkinleştirin. 'Digital' altından kanal 0'ı etkinleştirin.
      NOT: Ch0, geçişli-transitör mantığı (TTL) sinyali, Ch1 fotometri sistemi, Ch2 ise zincirli kameralara karşılık gelir.
    3. 'Analog Giriş' altında, kanal 0 "TTL", kanal 1 "Photometry_system" ve kanal 2 "Behavior_cameras" olarak adlandırılır; bu "Transitor-Transistor Logic" anlamına gelir. 'Dijital' bölümünde kanal 0 "TTL_trigger" olarak adlandırılın.
    4. 'Tetikleyiciler' sekmesinde tetikleyicileri manuel olarak ayarlayın. 'Örnekleme Hızları' sekmesinde örnekleme hızını 350 Hz'e ayarlayın.
    5. 'Display Panel'e geçin ve 'Strip', 'Scalar' ve 'Output' pencerelerini grafik kullanıcı arayüzüne yerleştirin.
  6. Fotometri sistem yazılımını yapılandırın (Ek Dosya 8).
    1. Görsel kodlama yazılımında kayıtları tetiklemek için 5 V TTL darbesini kabul edecek bir iş akışı geliştirin ve her kare için zaman damgası, her fiber için kırmızı ve yeşil kanallar için floresan emisyonları ile ham video fotometri sistem kılavuzunda belirtildiği gibi kaydedilsin.
    2. İş akışında fotometri sistemi için düğüm kullanılarak, sistemin 120 Hz'de 560, 470 ve 415 nm LED'in dönüşümlü karelerini kaydedecek şekilde ayarlandığından emin olun; bu çerçeve 40 Hz fonksiyonel bir kare hızıdır.
      NOT: Bu zaman bölmeli çoklama (TDM) yaklaşımı, GCaMP ve RCaMP arasındaki spektral örtüşmeyi zamansal olarak ayırarak uyarmalarını ele alır ve her göstergenin ardışık çerçeveler arasında bağımsız olarak uyarılmasını sağlar. Burada kullanılan kayıt sistemi, optimize edilmiş bant geçişli emisyon filtreleri (yeşil kanal: 500–530 nm; kırmızı kanal: >580 nm uzun geçim) kullanır; bu filtreler, tespit edilen fotonları ağırlıklı olarak her gösterge tarafından yayılan dalga boylarıyla sınırlayarak spektral çapraz konuşmayı daha da minimize eder. 415 nm izosbestik dalga boyu hem GCaMP hem de RCaMP'yi eşit şekilde uyarır ancak minimal kalsiyuma bağlı floresan değişiklikleri üreterek hareket artefaktı kontrol sinyali sağlar. TDM uyarımı ve spektral filtreleme birlikte, 470 nm karelerin ağırlıklı olarak GCaMP aktivitesini yakalamasını (Şekil 3A), 560 nm karelerin ağırlıklı olarak RCaMP aktivitesini yakalamasını (Şekil 3B) ve 415 nm karelerin hareket düzeltmesi için kalsiyumdan bağımsız referans sinyalleri sağlamasını sağlar.
  7. In vivo fotometri kayıtları yapın.
    1. Adım 2'de belirtildiği gibi viral enjeksiyon ve çoklu fiber dizi implantasyonu geçirmiş fareyi alın.
    2. Patchcord ve implante edilmiş çoklu fiber dizinin bağlantı yüzeylerini etanol ve pamuklu çubukla temizleyin. Fotometri sistemi için görsel kodlama iş akışında düğüm ve bir fotometre kullanılarak, 415, 470 ve 560 LED güç seviyelerinin her birini patchcord'dan yaklaşık 1.2 mW aydınlatma çıkaracak şekilde ayarlayın.
    3. Patchcord'un bağlantı yüzeyine indeks eşleştirme jeli uygulayın. Yama kablosunu, fare tarafından implante edilen çoklu fiber dizisine dizinin dübel pinleriyle hizala, yama ipini implante edilmiş çok lifli dizinin yüzeyiyle hizalana kadar aşağı kaydırın.
    4. Patchcord vidalarını sıkarak multifiber diziyi patchcord'a sabitleyin. Farenin deneylere başlamadan önce alışkanlık yapmasına izin verin (Şekil 2L–M).
    5. Dosya adlarını ayarlayın.
      1. Her davranış kamerası için, kırmızı daire 'kaydet' düğmesine basarak davranış kamerası kayıt yazılımında kayıt penceresini açabilir ve dosya adını belirtir.
      2. DAQ yazılım programını açın, dişli düğmesine tıklayın ve 'loging options'a gidin, dosya adını belirtin.
      3. Dosya adını belirtmek için fotometri sistemi görsel kodlama iş akışındaki 'PhotometryWriter' düğümüne tıklayın.
    6. Davranış kamerası yazılımı kayıt pencerelerinde, her kamera için 'kayda başla' seçeneğine tıklayın. Sonra, fotometri sistemi görsel kodlama iş akışında oynatma düğmesine basın ve DAQ yazılımında kayd tuşuna basın.
    7. Tüm kameralar arasında senkron kayıt yapmaya başlamak için TTL anahtarına tıklayın.
    8. Kayıt bitti.
      1. Senkron kamera kayıtlarını sonlandırmak için TTL anahtarına tıklayın
      2. Fotometri sistemi için görsel kodlama iş akışında dur düğmesine basın, davranış kamerası yazılımı kayıt pencerelerinde "kaydı durdur" seçeneğini kullanın.
    9. 3.7.5–3.7.8 adımlarını deneylerin sonuna kadar tekrarlayın ve fareyi kesin.
      NOT: Deneylerin ardından, fotometri ve davranış kamerası veri akışları, DAQ yazılımının çıktısı kullanılarak özel kodla hizalanabilir. Özellikle, (1) TTL voltajındaki değişim, TTL başlangıç ve kayma zamanını gösterir, (2) davranış kamerası voltajındaki değişiklikler, kamera deklanşörünün her davranış video karesini yakalamak için açılıp kapandığı anı gösterir ve (3) DAQ'da kaydedilen fotometri sistemi voltajındaki ilk değişim, TTL başlangıç zamanına ve fotometri kamera zaman damgalarının fotometrik kamera zaman damgalarını görsel kodlama yazılımından çıkarmasıyla karşılaştırılabilir.

4. Veri İşleme (Şekil 1D, Ek Dosya 9)

  1. Kalsiyum görüntüleme verilerini ön işleme.
    1. Kalsiyum görüntüleme verilerinin çerçevelerini de-interleave ederek 415 nm, 470 nm ve 560 nm LED'lere yanıt olarak kaydedilen ayrı sinyal akışları oluşturuldu.
    2. Temel kaymayı düzeltmek için Adaptif Iterativ Yeniden Ağırlıklı Cezalandırılmış En Küçük Kare algoritmasını (airPLS)44 kullanın.
    3. Hesaplama ΔF/F şunları kullanarak:
      figure-protocol-2
      NOT: Başlangıç dönemi, deneysel manipülasyondan önce (örneğin, sosyal partner tanıtmadan önce) istikrarlı bir dönem olmalıdır. Eğer başlangıç dönemi çok kısaysa (<2–3 dakika) veya hareket artefaktlarıyla kirlenmiş olabilecek büyük dalgalanmalar gösterirse, kısıtlı bir başlangıç dönemi yerine tüm oturum boyunca ortalama floresans kullanarak normalleştirmeyi düşünün.
  2. Hareket artefaktları için doğru (Şekil 4A).
    1. Regresyon tabanlı bir yaklaşım kullanın, ancak alternatif yöntemler uygundur (bkz. Tablo 2)
    2. Z-skoru ΔF/F sinyalleri, sinyal büyüklüğünü bölgeler arasında normalleştirmek için medyan kullanarak:
      figure-protocol-3
    3. L1 düzenlileştirme ile Lasso regresyonunu uygulayın. Lasso (En Küçük Mutlak Küçülme ve Seçim Operatörü), bilicilik yaratmayan tahmincilerin katsayılarını sıfıra doğru küçülterek otomatik özellik seçimi gerçekleştirir.
      1. Düzenleme parametreleri üzerinde ızgara araması yapın (α = 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100). Grid araması, model karmaşıklığı ile aşırı uyum arasındaki optimal dengeyi belirler. Bu adım, standart makine öğrenimi kütüphanelerinde bulunan çapraz doğrulama rutinleri kullanılarak (örneğin, Python'da scikit-learn) tamamen otomatikleştirilebilir.
      2. Çift renkli fotometri (önerilen yaklaşımımız) için, 12 kayıt bölgesi boyunca mevcut tüm 415 nm izosbestik kontrol kanallarını tahmin edici olarak kullanın (gerekçe için Şekil 4B–C ve Sonuçlara bakınız). Tek renkli fotometri için (sadece GCaMP veya sadece RCaMP), tahmin matrisi yalnızca düzeltilen kalsiyum sinyaliyle aynı liften gelen izosbestik sinyalle sınırlandırın.
      3. Tahmin edilen ve gözlemlenen sinyal arasındaki ortalama kare hatasını en aza indiren modeli seçin.
    4. Sinyalden tahmin edilen hareket bileşenini çıkararak düzeltilmiş aktivite elde edin.
  3. Sinyali 725 ms pencereli Savitzky-Golay filtresi ile yumuşatabilirsiniz.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aynı anda 12 SBN beyin bölgesinden kayıt yapmak için, yukarıdaki protokolü takip ederek özelleştirilebilir bir multifiber dizisi oluşturduk. Ameliyattan iyileşmenin ardından fareler sosyal etkileşim sırasında kaydedildi (Şekil 5). Tüm deneylerde, erkek CD1 deneği farelerinin ev kafeslerinde erkek Balb/c fareleriyle etkileşime girmesine izin verildi. Vgat-Cre farelerinde GABAerjik nöronlarda 11 SBN beyin bölgesinde Cre'ye bağımlı bir şekilde jRCaMP1b40'ı, aynı beyin bölgelerinde GABAergik olmayan hücrelerde Cre-dışlayıcışekilde 45 ile GCaMP6f39'u ve Nucleus accumbens42'de GRAB-DA1m33'ü kullandık (Tablo 1). Lif hedeflemesinin histolojik doğruluğu öncekiyayınlarımızda bulunabilir 42,43. Burada, hareket eserliği düzeltmesi için farklı yöntemlerin performansını test etmeye çalıştık. Özellikle, (1) yalnızca bir medyan filtre; (2) Sadece aynı lifli izosbestik sinyaller kullanılarak L1 düzenleme ile lasso regresyonu (tek tahminci yaklaşımı)11 ve (3) Tüm liflerden izosbestik sinyalleri tahmin olarak kullanan lasso regresyonu, çok öngörücü yaklaşımı)41,42 (Şekil 4A). Kritik olarak, Lasso tabanlı yöntemler, izosbestik frekans (415 nm) LED'e yanıt olarak üretilen aktiviteden bağımsız floresan sinyal kullanarak ham sinyali düzeltirken, medyan filtre düzgünleştirme aktiviteden bağımsız sinyali dikkate almaz.

Hareket düzeltmesini iki farklı ölçümle değerlendirdik: mutlak yüksek frekanslı gürültü ve jitter. Yüksek frekanslı gürültü, sinyalin ilk türevinin standart sapması olarak tanımlanmıştır ve bu da hızlı sinyal dalgalanmalarının büyüklüğünü yansıtır. Jitter, sinyalin türevinin varyasyon katsayısı olarak tanımlanmıştır; bu katsayısı, sinyalin türevinin ortalamasına göre çerçeveden kareye sinyal değişkenliğinin büyüklüğünü yansıtır. Her iki Lasso tabanlı yaklaşımın (tek ve çoklu öngörücü) hem yüksek frekanslı gürültüyü hem de jitteri azaltma açısından medyan filtreyi önemli ölçüde geride bıraktığını, çoklu öngörücü düzeltmenin tek tahminci düzeltmeyi biraz daha iyi performans gösterdiğini bulduk (Şekil 4C–D; Yüksek frekanslı gürültü, 18 kayıt oturumunda 23 sinyal için n=414: Kruskal-Wallis testi, H = 501.9420, p < 0.001; Bonferroni düzeltmesiyle yapılan post-hoc Mann-Whitney U testleri: Düzleştirilmiş vs Tek Noktalı Regresyon ***p < 0.001, Düzleştirilmiş vs Çok Noktalı Regresyon***p < 0.001, Tek Siteli vs Çok Siteli **p = 0.0073; Jitter: Kruskal-Wallis testi, H = 495.6685, p < 0.001; Bonferroni düzeltmesiyle yapılan post-hoc Mann-Whitney U testleri: Düzleştirilmiş vs Tek Siteli Regresyon ***p 0.001 <, Düzleştirilmiş vs Çok Siteli Regresyon***p < 0.001, Tek Siteli vs Çok Siteli ***p = 0.0006). Özellikle, çoklu öngörücü yaklaşım (tüm fiber izosbestikleri kullanarak) kırmızı kanal (RCaMP) sinyalleri için faydalar gösterdi: 12 kırmızı sinyalin 5'i, tek tahminci düzeltmesine kıyasla (n = 18 kayıt/bölge) anlamlı şekilde daha düşük kalıntı gürültü gösterdi. Jitter için BNST (t-testi, t = 5.42, ***p < 0.001), POA (t-testi, t = 2.68, *p = 0.011), AH (t-testi, t = 2.66, *p = 0.012) ve PAG (Mann-Whitney U testi, U = 279, ***p < 0.001) çoklu öngörücü üstünlüğü gösterdi. Yüksek frekanslı gürültü için, BNST (Mann-Whitney U testi, U = 285, ***p < 0.001), POA (Mann-Whitney U testi, U = 292, ***p < 0.001), AH (t-testi, t = 7.10, ***p < 0.001), PAG (t-testi, t = 13.72, ***p < 0.001) ve LHb (t-testi, t = 5.47, ***p < 0.001) çoklu öngörücü üstünlüğü gösterdi. Yeşil kanal (GCaMP) sinyalleri, her 12 bölgede iki Lasso yaklaşımı arasında jitter veya yüksek frekanslı gürültü metrikleri açısından anlamlı bir fark göstermedi (tüm p>0.05, tam istatistiksel testler listesi için bkz. Tablo 3). Bu, çift renkli fotometride çapraz izosbestik bilginin dahil edilmesinin kırmızı sinyaller için hareket düzeltmesini iyileştirdiğini gösteriyor; muhtemelen yeşil kanal izosbestikleri daha temiz hareket bilgisi sağladığı için. Bu veriler, izosbest tabanlı regresyon yöntemleriyle hareket artefaktı düzeltmesinin basit filtreleme yaklaşımlarından önemli ölçüde üstün olduğunu ve çok kanallı regresyonun, çift renkli kayıtlar için özel avantajlar sağladığını göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1. Sosyal Davranış Ağı'ndan çok siteli, iki renkli fiber fotometri kullanılarak kayıt yapılıyor. (A) Çok lifli bir dizinin nasıl inşa edileceğine dair şematik temsili. (B) Cerrahi iş akışının şematik temsili. (C) İki renkli kalsiyum görüntüleme deneylerinin şematik temsili. (D) Hareket düzeltmeli sinyal hesaplamak için izosbestik sinyal kullanımı örneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. İmhalat ve cerrahi için temel prosedürlerin görüntüleri. (A) Kayıt için kullanılmaya hazır üretilmiş patchcord. (B) Çok fiber dizisi, 0,25 mm x 5,5 mm ölçümlerindeki matkap ucunun fiber deliğin üzerine yerleştirildiği özel stereotaktik tutucuya yerleştirilir. (C) Tüm fiber delikleri temizlenmiş ve altıgen somunlar yapıştırılmış çok fiber dizi. (D) Bir lif yazıcı ile bir lif parçalamak. (E) Tüm liflerin süper yapıştırılmış ve özel bir parlatma diskine yerleştirildiği çoklu fiber dizisi. (F) Yama kablosu konnektörünün çoklu fiber dizisine nasıl hizalanıp vidalanacağına dair büyütülmüş görünüm. (G) Tam donanımlı çoklu fiber dizili, yerinde yapıştırılmış dübel pinleri. (H) Kafatasını açığa çıkarmak için saç derisi kesisi yapılmış stereotaktik çerçeveye sabitlenmiş fare. (I) Ameliyat sırasında çok lifli diziyi manevra etmek için stereotaktik manipülatöre bağlı üretilmiş çok lifli dizi. (J) Beyne indirilen çoklu fiber dizinin büyütülmüş görüntüsü. (K) Tamamen indirilmiş ve kafatasına diş çimentosu ile sabitlenmiş çok lifli dizi. (L) Kayıt öncesi patchcord'a güvenli şekilde bağlı olan bir hayvanda çok fiber dizisi. (M) Kafesteki hayvanın zoom edilmiş görünümü, yamak kablosu bağlanmış şekilde kayıt öncesi ve/veya kayıt sırasında gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Spektral ayrım. Kalsiyum göstergeleri arasında minimal spektral çapraz konuşmayı gösteren örnek izler. GCaMP6f (mavi) sinyalleri 470 nm uyarılma sırasında güçlü aktivasyon gösterir ancak 560 nm uyarıma karşı önemsiz yanıt gösterir. jRCaMP1b (kırmızı) sinyalleri, 560 nm'den güçlü aktivasyonla ancak 470 nm aydınlatmaya minimum yanıtla ters desen gösterir. (A) Yalnızca 470 nm aydınlatma ile GCaMP6f ve jRCaMP1b sinyallerini aynı anda kaydediyor. (B) (a) ile aynı, ancak sadece 560 nm aydınlatma ile. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Çoklu Fiber Sinyal İşleme için Farklı Yöntemlerin Karşılaştırılması. (A) Fotometri sinyalinin çoklu siteli regresyon tabanlı düzeltmesini gösteren şematik. Bu yaklaşım, mevcut tüm 415nm izosbestik sinyallerin her kalsiyuma bağlı sinyale doğrusal olarak eşlendiği ardışık işleme adımlarını içerir. Tahmin edilen hareket bileşenleri bu sinyalden çıkarılarak faaliyetin nihai okuması elde edilir. güçlü hareket artefaktları bulunan iki sinyalden z-puanlı ΔF/F sinyalleri. (B) Yukarıdan aşağıya: hareket artefaktlarını gösteren aynı fiber/görüntüleme kanalından izosbestik sinyal, yalnızca düzleştirilmiş RCaMP (solda) veya GCaMP (sağda) sinyali (medyan-filtreli, yeşil), aynı fiber/görüntüleme kanalı regresyonla düzeltilmiş sinyal (siyan), çoklu fiber regresyonla düzeltilmiş sinyal (mavi). (C) Sol: Her kaydedilmiş sinyal için ortalama yüksek frekanslı gürültü puanı (n = 21 oturum). Yüksek frekanslı gürültü, her sinyalin ilk türevinin standart sapması olarak hesaplanır. Gürültü skorları 1) temel çizgi düzeltilmiş ancak düzeltilmemiş sinyal (gri), 2) temel çizgi düzeltmeli ve medyan filtreli sinyal (pembe), 3) Savitsky-Golay düzgünleştirme (sian) ile temel ve tek fiber regresyon düzeltilmiş sinyal (mavi) ve 4) temel ve çoklu fiber regresyon düzeltilmiş sinyal Savitsky-Golay yumuşatması (mavi) için gösterilmiştir. Merkez: Yalnızca yumuşatma, tek fiber veya çoklu fiber regresyon kullanılarak çıkarılan gürültünün ortalama yüzdesi, tüm 23 sinyal boyunca toplanmıştır. Çıkarılan gürültü yüzdesi, düzeltme sonucu ortaya çıkan yüksek frekanslı gürültünün ham, temel düzeltilmiş sinyaldeki genel gürültü seviyesine göre oranı olarak hesaplanır. Veriler ortalama ± SEM olarak bildirilmektedir (Kruskal-Wallis testi, H = 501.9420, p < 0.001; post-hoc Mann-Whitney U testleri ve Bonferroni düzeltmesi: Düzleştirilmiş vs Tek Site regresyon ***p < 0.001, Düzleştirilmiş vs Çok Noktalı Regresyon***p < 0.001, Tek Siteli vs Çok Siteli **p = 0.0073). Sağ: Yüksek frekanslı gürültünün tek lifli ve çok lifli regresyon tabanlı düzeltme sonrası istatistiksel olarak farklı olduğu sinyal yüzdesi, sinyal türüne göre ayrılmıştır. 23 sinyalin her biri için, tek noktalı düzeltmeden sonraki gürültü seviyeleri, bağımsız t-testleri (normal dağıtılıyorsa) veya Mann-Whitney U testleri (parametrik olmayan alternatif) kullanılarak çoklu nokta düzeltme sonrası gürültü seviyeleriyle karşılaştırıldı. Mavi segmentler, çoklu nokta düzeltmesinin tek noktalı düzeltmeye göre çok daha düşük gürültü sağladığı sinyalleri gösterir (p < 0.05). Gri segmentler, düzeltme yöntemleri arasında anlamlı bir fark olmayan sinyalleri gösterir. Gökgöbeği segmentleri, tek bir nokta düzeltmesinin önemli ölçüde daha düşük gürültü sağladığı sinyalleri gösterir. E: Vgat- GCaMP6f. DA: GRAB-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) (C) ile aynı ancak her sinyalin varyasyon katsayısının türevi olarak hesaplanan (C) ile aynı ancak çerçeveden kare değişime (jitter) göstermektedir (Kruskal-Wallis testi, H = 495.6685, p < 0.001; post-hoc Mann-Whitney U testleri ve Bonferroni düzeltmesi: Düzleştirilmiş vs Tek Siteli regresyon ***p 0.001 <, Düzleştirilmiş vs Çok Siteli Regresyon***p 0.001 <, Tek Siteli vs Çok Siteli Regresyon ***p = 0.0006). İstatistiksel testlerin ve sonuçların tam listesi için Tablo 3'e bakınız. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Çok amaçlı çift renkli fiber fotometri sergisi. Sosyal davranış sırasında aynı anda kaydedilen birden fazla gösterge tipinden temsil edilen sinyaller (sakin-izinsiz giren testi, davetsiz giriş eposhi). İzler, aynı hayvanda sosyal davranış ağı sitelerinde normalize edilmemiş ve başlangıç çıkarılmış ancak hareket artefaktı düzeltilmemiş GCaMP6f (Cre-negatif nöronlar), jRCaMP1b (GABAerjik Vgat-Cre+ nöronları) ve GRAB-DA1m (çekirdek akumbenlerindeki dopamin sensörü) göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Her hedef alınan Sosyal Davranış Ağı Beyin Bölgesi için Virüs Koordinatları ve Lif Uzunlukları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2. Çok Noktalı Fiber Fotometri için Hareket Eleştiri Düzeltme Yöntemlerinin Karşılaştırılması. Aşağıdaki hareket artefaktı düzeltme yöntemlerinin temel prensipleri, optimal kullanım durumları, avantajları ve sınırlamaları: basit doğrusal regresyon, L1 düzenleyici Lasso regresyonu (çoklu öngörücü yaklaşımla), Bayes üretken modelleme, frekans tabanlı ölçeklendirme ve yinelemeli olarak yeniden ağırlıklandırılmış en küçük kareler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3. Şekil 4'te kullanılan istatistiksel testlerin detayları ve sonuçları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Patchcord konnektör için 3D baskı dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2. 3D deliksiz patchcord konnektör için baskı dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Stereotaktik sondaj aksesuarı için Ek Dosya 3. 3D Baskı Dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4. Özel cila puck planı.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

12 SBN sitesini hedefleyen çok noktalı fotometri dizisi için Ek Dosya 5. 3D baskı dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 6. 3D çoklu noktalı fotometri dizisi için deliklerden uzak, noktaları hedeflemeden baskı dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 7. DAQ yazılımı için DAQ yapılandırma dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 8. Fotometri sistemi için görsel kodlama dosyası.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 9. Protokol Step 4'te ve hareket artefaktı düzeltilmiş karşılaştırmalar için kullanılan Python kodu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lif fotometrisi, serbestçe hareket eden hayvanda derin beyin bölgelerinden veya belirli hücre tiplerinden popülasyon kalsiyum aktivitesini kaydetmek için kullanışlı ve maliyet etkin birtekniktir. Birden fazla beyin bölgesinden aynı anda kayıt yapmak, kullanıcının doğal davranış veya kafa sabit hazırlıklar sırasında bölgeler veya projeksiyonlar arasındaki dinamikleri karşılaştırmasınısağlar 5,7,12. Burada, beynin subkortikal "sosyal davranış ağı" boyunca beynin subkortikal "sosyal davranış ağı" boyunca iki renkte kaydetme yöntemlerini detaylandırıyoruz; özel bir fiber dizisi ve ticari olarak mevcut bir kamera sistemi kullanılıyor. Aşağıda, bu yöntemin uygulanmasındaki kritik adımları, olası değişiklikler ve sorun giderme stratejilerini, mevcut yaklaşımlara kıyasla önemini ve sınırlamalarını ele alıyoruz.

Protokol üç ana aşamadan oluşur. İlk olarak, çoklu fiber dizi ve patchcord üretimi, stereotaktik koordinatlarda özel 3D baskılı parçaların delinmesini gerektirir, ardından fiber yerleştirme, cilalama ve kalite kontrolü ile %≥75 ışık geçirim verimliliği sağlanır. Hassas delme hizalanması (±0,03 mm tolerans) ve kapsamlı parlatma kritik öneme sahiptir. Yaygın arızalar arasında düşük ışık geçirim verimliliği (%<75) ve bloklu fiber delikleri bulunur. Düşük verimlilik genellikle parçalama sırasında oluşan lif lekeleri veya yanlış parlatma nedeniyle oluşur. Çözümler arasında, yerleştirmeden önce her lif ucunun parlak alan mikroskopisiyle lekesiz olduğunu doğrulamak (adım 1.1.6.2), tam kum ilerleyişi ile yeniden cilalama (6 μm → 0.01 μm, adım 1.1.6.1) ve lif bıçak bıçağının keskin olduğundan emin olmak yer alır. Verimliliği artırmak için laboratuvarlar, hassas çeviri aşamaları veya lazer tabanlı kesme sistemleri kullanarak özel lif kesme jigleri gibi iş akışı değişiklikleri uygulayabilirler (adım 1.2.4). Yüksek hassasiyetli sistemlere sahip ticari 3D baskı üreticileri, manuel delme ihtiyacını azaltabilir (adımlar 1.1.3–1.1.4, 1.2.3), ancak boyutsal doğruluk partiler arasında değişebilir.

İkinci olarak, cerrahi implantasyon kafatası düzleştirmesini (±0,03 mm tolerans), 11–12 bölgeye viral enjeksiyonları ve çoklu lifli diziye implantasyonu ve ardından çimento fiksasyonunu içerir. Kafatası düzleştirmesi toleransı aştığında hedefleme hassasiyeti zayıflar. Bu, 8,25 mm aralıklı birden fazla ön-arka noktada perde ölçülüğe ve ±2,0–2,5 mm yan pozisyonlarda rulo ölçümüyle, kulak çubuklarının kafatasını tamamen stabilize etmesini sağlayarak azaltılabilir. Virüs enjeksiyon mikropipetlerindeki hava kabarcıkları doğru teslimatı engeller ve mikropipet hazırlamanın yeniden başlatılmasını gerektirir (adım 2.9). Çok lifli dizi implantasyonu sırasında, kafatası yüzeyinden yukarıya doğru çimento piramitler inşa ederek (2.10.3–2.10.5) ve yeterli kuruma süresi (≥15 dakika) ile teması kaçının.

Üçüncü olarak, kayıt ve veri işleme DAQ sistemi ile kamera senkronizasyonu, LED güç kalibrasyonu (0.1 mW çıkış/fiber, 1.2 mW çıkış/12 fiber patchcord) ve izosbest kontrollerle sinyal ön işleme içerir. Burada tanıtılan hareket düzeltme boru hattı, çok kanallı tahminci konfigürasyonları için çok uygundur çünkü bilicilik olmayan tahmincileri otomatik olarak sıfıra doğru küçültür ve yalnızca eser düzeltmesine anlamlı katkıda bulunanları korur. Bu özellik, özellikle çift renkli fotometri için avantajlı kılar: hem kırmızı hem de yeşil kanallardan izosbestik sinyalleri tahmin ediciler olarak dahil ederek, Lasso, gerçek hareket bilgisi taşıyan kanalları seçici olarak kullanır ve yalnızca aynı lif düzeltmesine kıyasla kırmızı kanal (RCaMP) sinyallerinde önemli ölçüde daha iyi gürültü azaltma sağlar (Şekil 4C–D). Lasso en bilgilendirici tahmincileri otomatik olarak tanımladığı için, mevcut tüm izosbestik kanalların girdi olarak kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, Lasso regresyonu, birkaç geçerli düzeltme yönteminden biridir; alternatifler arasında Bayes üreticimodelleme 46, frekans tabanlıölçeklendirme 47 ve yinelemeli olarak yeniden ağırlaştırılmış en küçük kareler (IRLS)48 bulunur; bunların hepsi muhtemelen karşılaştırılabilir eser indirgemesi sağlar; uygulama rehberliği Tablo 2'de sunulmaktadır. Optimize edilmiş ön işlemeye rağmen kalıcı kötü sinyal kalitesi muhtemelen donanım veya cerrahi sorunları gösteriyor ve 1–2. adımlar yeniden gözden geçirilmelidir

Bu prosedürel hususların ötesinde, çift renkli fotometri spektral ayrımla ilgili ek teknik zorluklar getirir. Çift renkli fotometride kritik bir faktör, yeşil ve kırmızı kalsiyum göstergeleri arasındaki spektral örtüşmeyi yönetmektir. GCaMP ve RCaMP emisyon spektrumlarının örtüşmesi nedeniyle spektral çapraz iletişimin tamamen ortadan kaldırılması zor olsa da, aralı LED uyarımıyla (GCaMP için 470 nm, RCaMP için 560 nm, izozbestik 415 nm) ve optimize edilmiş bant geçişli emisyon filtreleriyle zamansal çoklu iletişim yaklaşımımız bu sorunu önemli ölçüde azaltmaktadır. Pratikte, minimum çapraz konuşma gözlemleriz: 470 nm uyarım kırmızı kanalda önemsiz bir aktivite oluştururken, yeşil kanalda 560 nm uyarımda ise tam tersi geçerlidir (Şekil 3). Kalıntı spektral örtüşme konusunda endişeli araştırmacılar, kendi spesifik gösterge kombinasyonlarına göre maksimum spektral ayrımcılığa sahip dar bant geçişli emisyon filtreleri seçerek sistemlerini daha da optimize edebilirler.

Büyük ölçekli sinir kayıtları için diğer yaklaşımlara kıyasla, özel iki renkli çoklu siteli fiber fotometri birçok önemli avantaj sunar. İlk olarak, tek lifli fotometri 1,2,3, günümüz hücredışıkayıtlar 4,6 veya kortikal yüzey görüntülemeyaklaşımları 8,9 yaklaşımları tek veya mekânsal olarak kısıtlanmış beyin bölgeleriyle (örneğin kortikal yüzeyde) sınırlıdırken, burada paylaştığımız özelleştirilebilir 3D baskı tasarımı, 200 μm optik liflerle beynin herhangi bir yerinde 12 beyin bölgesine kadar hedeflenebilmektedir. Karşılaştırma olarak, ticari olarak mevcut çok lifliferrullar 5,7 yalnızca 100 μm fiber optik destekler ve benzer şekilde, ferrule'ün lineer dizisinin doğrudan ventralinde sınırlı bir beyin bölgesi setine sınırlıdır. Belirli beyin bölgelerinden hedefleme ve kayıt ile ilgili olarak, birincil denge lif çapı ile fotometri sisteminin görüş alanı arasındadır. 200 μm liflerle donatılmış 3D baskılı çok fiber diziler, ticari olarak sunulan çok lifli ferrullara kıyasla her sahada daha geniş bir alandan kayıt yapar. Mevcut protokolde, fotometri sisteminin kamera görüş alanı kaydı 200 μm'de 12 optik lifle sınırlandırır. Bu kısıtlama, 60 lif için fiber çapını 100 μm'ye düşürerek veya daha büyük bir kamera objektîfine sahip özel bir fotometri sistemi inşa ederek aşılabilir.

Son olarak, bu özelleştirilebilir, iki renkli çok siteli fiber fotometri platformu, 11-12 beyin bölgesi boyunca genetik olarak farklı iki sinir popülasyonunun sinirsel aktivite dinamiklerini uzunlamasına takip etmek için kullanılmıştır. Bir Vgat-cre faresinde SBN popülasyonları arasında Cre-bağımlı RCaMP ve Cre-dışlayıcı GCaMP ile Cre-in/Cre-dışlayıcı strateji kullanılarak, hem agresif deneyim hem de gözlem, gelecekteki savunmacı sosyal etkileşimlerde SBN genelinde ortak aktivite dinamiklerinin yayılmasını teşvik ettiğigösterilmiştir 42. Esr1-cre faresinde aynı viral stratejiyi kullanarak östrojen reseptörü alfa eksprese eden ve ifade etmeyen nöronlardan kaydedilirken, bölgeye özgü sosyal davranış kalıpları SBN genelinde sosyal eylem kodunun hızlı, hormon hassasiyetli yeniden ölçeklenmesiyle ilişkilendirildi ve ev bölgesinde davranışla ilişkili aktiviteyiartırdı 43. Bu davranış ve ağ kodlamadaki bu bölgeye özgü farklılıklar, erkek farelerde dolaşımda olan testosteronu gerektirir. Bu çalışmalar viral yaklaşım ve tek bir Cre hattı kullansa da, gelecekteki çalışmalar bu yöntemleri kesişimsel viral yaklaşımlar, genetik olarak ifade edilen kalsiyum göstergeleri veya nöromodülatör ve nöropeptid sinyallerinin floresan raporlayıcılarıyla genişletebilir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonlama NIH K99MH135212 (E.M.G.'ye), NIH F32MH126562 (E.M.G.'ye), DP2MH126375 (A.L.F.'ye), NIH R01MH126035 (A.L.F.'ye), NYSCF (A.L.F.'ye), Simons Vakfı (SCGB) (A.L.F.'ye), Klingenstein Vakfı (A.L.F.'ye), Alfred P. Sloan Bursu (A.L.F.), McKnight Vakfı (A.L.F.), Allen Enstitüsü (A.L.F). A.L.F., New York Kök Hücre Vakfı Robertson araştırmacısıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
#76 matkap ucuMatkap Uçluğu Şehri#76
#78 matkap ucuMatkap Uçluğu Şehri#78
#92 matkap ucuMatkap Uçluğu Şehri#92
0.01 μ M kumlu parlatma levhalarıThorLabsLFCF2
0,25 mm x 5,5 mm matkap uçlarıMatkap Uçluğu ŞehriÖzel ürün0.25 x 5.5 mm matkap ucu, şirketle iletişime geçti ve üretmeyi söyledim
1 μ M kumlu parlatma levhalarıThorLabsLF1D
12 Fiber-dallanan patchordDorik LensCustomBBP(12)_200/220/3000-0.37
_5m_SMA-12xCL_LAF
200 μ m optik fiberThorLabsFT200UMT
3 μ M kumlu parlatma levhalarıThorLabsLF3D
30 μ M kumlu parlatma levhalarıThorLabsLF30D
6 μ M kumlu parlatma levhalarıThorLabsLF6D
Emilebilir dikişEtikonJ421H
Adaptif Yinelemeli Yeniden Ağırlıklı Cezalandırılmış En Küçük Kare dokümantasyonuGoogleYokhttps://code.google.com/archive/p/airpls/
Alaşım çelik dübel pinlerMcMaster-Carr98381a983
Davranış kameralarıTeledyne FLIRBlackfly S
BonsaiBonsai Yazılım Vakfısürüm 2.9.0
Parlak Alan MikroskobuLeicaES2
Bulldog kelepçeleriFineScienceTools18038-45
DAQÖlçüm HesaplamaMC USB-200 serisi DAQ
DAQ yazılımıÖlçüm HesaplamaDAQami
MatkapKopf InstrumentsModel 1911 Stereotaksik Matkap
Fiber kesiciThorLabsXL411/CLVB
Fiber fotometri sistemiNörofotometriFP3002
Fiber fotometri sistemi kılavuzuNörofotometriYokWeb sayfası barındırma cihazı kılavuzu: https://neurophotometrics.com/documentation
Fiber yazıcıThorLabsS90C
Fiber soyucuThorLabsT10S13
İnce forsepsFineScienceTools11252-00
İnce makasFineScienceTools14084-08
G5 tahrik vidalarıOpen Ephys Üretim SahasıOEPS-7105
G5 tornavidaOpen Ephys Üretim SahasıOEPS-7121
GCaMP6fPNI Viral Nöromühendislik LaboratuvarıEF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DAAddgenehSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Isıtma pediUsta Tıbbi MalzemelerHTP-1500
Isıtma sistemiKent ScientificRT-0515
İzofluranCovetrus29405
jRCaMP1bAddgenepAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
M0.6 Pirinç altıgen somunlarMetricScrews.us21614
Metabağ çimento reaktifleri ve araçlarıParkellS380
MicroFine ABS benzeri reçine 3D baskılarProtoLabsÖzel ürünEk Kod Dosyaları 1-3, 5, 6
Nanolitre enjektörDrummond Bilimsel ŞirketiNanoject IInanolitre enjektör
Parrafin mumu levhalarıAmcorParaFilm M Çok Amaçlı Laboratuvar Filmi
PipetterThermoFisher Scientific4641310N
Parlatma PuckPrinceton Üniversitesi Fizik Bölümü Makine AtölyesiÖzel ürünEk Kod Dosyası 4'e bakınız
Güç ölçerThorLabsPM100D
Puralube optik merhemDechraP1490-1
PythonPython Yazılım VakfıYok
Patchcord için yumuşak plastik boruMcMaster-Carr3774N4
SpinViewTeledyne FLIRversion 1.25.0.52Davranış kameralarını kontrol eden görüntüleme yazılımı
Stereotaktik çerçeveKopf InstrumentsModel 1900
TMAC dokümantasyonuYokYokTMAC kodu: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Stereotaktik çerçeve için boruSaint-GobainE-3603
BuharlaştırıcıKent ScientificVetFlo Buharlaştırıcı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494 (7436), 238-242 (2013).
  2. Adelsberger, H., Zainos, A., Alvarez, M., Romo, R., Konnerth, A. Local domains of motor cortical activity revealed by fiber-optic calcium recordings in behaving nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (1), 463-468 (2014).
  3. Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
  4. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  5. Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
  6. Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: A miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), (2021).
  7. Guo, Z., et al. Neural dynamics in the limbic system during male social behaviors. Neuron. 111 (20), 3288-3306.e4 (2023).
  8. Ma, Y., et al. Wide-field optical mapping of neural activity and brain haemodynamics: considerations and novel approaches. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1705), 20150360(2016).
  9. Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22 (10), 1677-1686 (2019).
  10. Zhou, Z. C., et al. Deep-brain optical recording of neural dynamics during behavior. Neuron. 111 (23), 3716-3738 (2023).
  11. Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. JoVE. (152), e60278(2019).
  12. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
  13. Newman, S. W. The Medial Extended Amygdala in Male Reproductive Behavior A Node in the Mammalian Social Behavior Network. Annals of the New York Academy of Sciences. 877, 242-257 (1999).
  14. Goodson, J. L. The vertebrate social behavior network: Evolutionary themes and variations. Hormones and Behavior. 48 (1), 11-22 (2005).
  15. O’Connell, L. A., Hofmann, H. A. Evolution of a Vertebrate Social Decision-Making Network. Science. 336 (6085), 1154-1157 (2012).
  16. Wu, M. V., Tollkuhn, J. Estrogen receptor alpha is required in GABAergic, but not glutamatergic, neurons to masculinize behavior. Hormones and Behavior. 95, 3-12 (2017).
  17. Moffitt, J. R., et al. spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 362 (6416), eaau5324(2018).
  18. Gegenhuber, B., Wu, M. V., Bronstein, R., Tollkuhn, J. Gene regulation by gonadal hormone receptors underlies brain sex differences. Nature. 606 (7912), 153-159 (2022).
  19. Knoedler, J. R., et al. A functional cellular framework for sex and estrous cycle-dependent gene expression and behavior. Cell. 185 (4), 654-671.e22 (2022).
  20. Musatov, S., Chen, W., Pfaff, D. W., Kaplitt, M. G., Ogawa, S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (27), 10456-10460 (2006).
  21. Lee, H., et al. Scalable control of mounting and attack by Esr1+ neurons in the ventromedial hypothalamus. Nature. 509 (7502), 627-632 (2014).
  22. Hashikawa, K., et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nature Neuroscience. 20 (11), 1580-1590 (2017).
  23. Fang, Y. -Y., Yamaguchi, T., Song, S. C., Tritsch, N. X., Lin, D. A Hypothalamic Midbrain Pathway Essential for Driving Maternal Behaviors. Neuron. 98 (1), 192-207.e10 (2018).
  24. Wei, Y. -C., et al. Medial preoptic area in mice is capable of mediating sexually dimorphic behaviors regardless of gender. Nature Communications. 9 (1), 279(2018).
  25. Yamaguchi, T., Wei, D., Song, S. C., Lim, B., Tritsch, N. X., Lin, D. Posterior amygdala regulates sexual and aggressive behaviors in male mice. Nature Neuroscience. 23 (9), 1111-1124 (2020).
  26. Yang, B., Karigo, T., Anderson, D. J. Transformations of neural representations in a social behaviour network. Nature. , (2022).
  27. Jacobowitz, D. M., O’Donohue, T. L. alpha-Melanocyte stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of rat brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (12), 6300-6304 (1978).
  28. Flanigan, M. E., et al. Orexin signaling in GABAergic lateral habenula neurons modulates aggressive behavior in male mice. Nature Neuroscience. 23 (5), 638-650 (2020).
  29. Bayless, D. W., et al. A neural circuit for male sexual behavior and reward. Cell. 186 (18), 3862-3881.e28 (2023).
  30. Dawson, M., et al. Hypocretin/orexin neurons encode social discrimination and exhibit a sex-dependent necessity for social interaction. Cell Reports. 42 (7), 112815(2023).
  31. Iyilikci, O., et al. Age-specific regulation of sociability by hypothalamic Agrp neurons. bioRxiv. , (2025).
  32. Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), eaat4422(2018).
  33. Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496.e19 (2018).
  34. Sun, F., et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nature Methods. 17 (11), 1156-1166 (2020).
  35. Duffet, L., et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. Nature Methods. 19 (2), 231-241 (2022).
  36. Ino, D., Tanaka, Y., Hibino, H., Nishiyama, M. A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain. Nature Methods. 19 (10), 1286-1294 (2022).
  37. Wang, H., et al. A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors. Science. 382 (6672), eabq8173(2023).
  38. Dong, C., et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nature Neuroscience. 27 (9), 1844-1857 (2024).
  39. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  40. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, e12727(2016).
  41. Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
  42. Iravedra-Garcia, J. M., Guthman, E. M., Cuturela, L., Ocasio-Arce, E. J., Pillow, J. W., Falkner, A. L. Aggression experience and observation promote shared behavioral and neural changes. bioRxiv. , (2024).
  43. Guthman, E. M., Iravedra-Garcia, J. M., Sirrs, L., Le, A., Falkner, A. L. Context rescales a social action code in a hormone-sensitive network. bioRxiv. , (2025).
  44. Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
  45. Saunders, A., Johnson, C. A., Sabatini, B. L. Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and inactivated transgene expression in neurons. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
  46. Creamer, M. S., Chen, K. S., Leifer, A. M., Pillow, J. W. Correcting motion induced fluorescence artifacts in two-channel neural imaging. PLOS Computational Biology. 18 (9), e1010421(2022).
  47. Donka, R. M., Loh, M. K., Konanur, V. R., Roitman, M. F., Roitman, J. D. PASTa: An Open-Source Analysis and Signal Processing Toolbox for Fiber Photometry Data. Current Protocols. 5 (7), e70161(2025).
  48. Keevers, L. J., Jean-Richard-dit-Bressel, P. Obtaining artifact-corrected signals in fiber photometry via isosbestic signals, robust regression, and dF/F calculations. Neurophotonics. 12 (02), (2025).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fiber FotometrisiKalsiyum AktivitesiGenetik Olarak Belirlenmi N ronlarFare Beyni KaydViral TeslimatFloresan ndikat rlerCMOS KameraN ral Pop lasyon G r nt leme

İlgili makaleler