Yeşil Alga Tetraspora Sp. CU2551'den Antimikrobiyal Proteinin Arıtılması ve Tanımlanması

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeşil Alga Tetraspora Sp. CU2551'den Antimikrobiyal Proteinin Arıtılması ve Tanımlanması

329 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70066

⸱

17 Şubat 2026

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

Bu makalede

Özet

Bu protokol, protein ekstraksiyon tamponlarının optimizasyonu, alg hücre bozulması, iyon değişim kromatografisiyle protein fraksiyonasyonu, SDS-PAGE ile protein ayrılması ve antimikrobiyal aktivite testleri dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle sağlam antimikrobiyal proteinlerin araştırılması için bir iş akışını tanımlar. Aktif protein daha sonra LC-MS/MALDI-TOF analiziyle doğrulandı ve tanımlandı.

Özet

Antimikrobiyal direnç (AMR), artan küresel bir sağlık tehdidi olup, yeni antimikrobiyal ajanların keşfini gerektirmektedir. Alglerden türetilen proteinler ve peptitler, biyoaktif potansiyelleriyle giderek daha fazla ilgi görmektedir; ancak yeşil alglerde, özellikle Tetraspora sp. CU2551'de antimikrobiyal peptipllerin (AMP) incelenmesi için standart protokoller sınırlı kalmaktadır. Bu protokol, yeşil alg Tetraspora sp. CU2551'den antimikrobiyal sağlam proteinlerin izolasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu için adım adım bir iş akışını tanımlar. Bu süreç, optimize edilmiş protein ekstraksiyonu, kromatografik fraksiyonlama, elektroforetik ayrım, antimikrobiyal aktivite taraması ve protein tanımlamasını entegre eder. Protein ekstraksiyon koşulları öncelikle tampon bileşenlerinden kaynaklanan arka plan inhibitör etkilerini azaltmak için optimize edilir. Aktif peptidin kimliği bilinmediğinde, farklı iyon değişim reçineleri arasında protein bağlanmasını değerlendirmek ve uygun bir arıtma matrisi seçimini yönlendirmek için bir pull-down testi uygulanır. DEAE-Sefaroz iyon değişim kromatografisi, antimikrobiyal protein fraksiyonlarını zenginleştirmek için uygun bir yöntemdir. Tüm fraksiyonlar antimikrobiyal aktivite açısından sistematik olarak değerlendirilir ve SDS-PAGE tarafından analiz edilir. En yüksek antimikrobiyal aktiviteye karşılık gelen protein bandı ve belirgin bir elektroforetik profil çıkarılır ve protein tanımlaması için LC-MS/MALDI-TOF analizine tabi tutulur. İş akışı, halka açık biyoinformatik araçlar kullanılarak antimikrobiyal peptid ile ilgili özellikleri tahmin etmek için in silico analizlerle tamamlanır. Bu protokol, antimikrobiyal protein keşfi için çok yönlü bir çerçeve sağlar ve diğer alg türlerine ve ilgili biyoteknolojik uygulamalara kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Antimikrobiyal direnç (AMR), artan küresel bir sağlık^{sorununu temsil eder 1} ve doğal kaynaklardan yeni antimikrobiyal ajanların belirlenmesi için devam eden stratejilerin önemini vurgular. Alglerden elde edilen proteinler ve peptitlerin antimikrobiyal özellikleri^{üzerine araştırmalar artsa da,} ^2,3. Çoğu çalışma, peptid veya hidrolizat temelli yaklaşımlara^{odaklanır 4} ve tüm alg proteinlerinin etkinliğini korumak ve değerlendirmek için standartlaştırılmış yöntemler^{sınırlıdır 5}. Bu makale, yeşil alg Tetraspora sp. CU2551'den sağlam proteinlerin antimikrobiyal aktivite açısından izole edilmesi, arındırılması ve değerlendirilmesi için bir yöntemi tanımlar.

Protokol, tüm proteinlerin çıkarılması, iyon değişim kromatografisiyle fraksiyonlanma, antibakteriyel özelliklerin değerlendirilmesi, jel bazlı protein ayrımı, kütle spektrometrisiyle protein tanımlaması ve in silico tekniklerle antimikrobiyal peptitlerin tahmin edilmesini içeren adım adım bir süreci özetlemektedir. Antibakteriyel ajanların etkinliği, tipik Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriyel suşlar üzerinde standart agar difüzyonu ve sıvı büyüme engelleme^{testleri kullanılarak değerlendirilir} ^4,6. Bu yaklaşım, tanımlanmış antimikrobiyal aktivitenin belirli protein fraksiyonları veya elektroforetik bantlarla bağlantısını sağlar; yalnızca sindirilmiş peptid karışımlarına veya antimikrobiyal proteinleri veya kanonik veritabanı^{tanımları dışındaki} AMP benzeri dizileri tanımlayamayabilecek hesaplamalı tahminlere dayanmak yerine^.

Bu protokole uymak, okuyucuların potansiyel antimikrobiyal protein dizilerini içeren biyoaktif protein fraksiyonlarını güvenilir şekilde elde etmelerini sağlar; bu fraksiyonlar gelecekte doğrulama ve fonksiyonel değerlendirme için uygundur. Temsilci bulgular, hem bilinen hem de bilinmeyen protein adaylarını içeren biyoaktif fraksiyonların tanımlandığını göstermektedir. Bu protokol, alglerden ve diğer biyolojik kaynaklardan elde edilen sağlam proteinlerden antimikrobiyal maddeleri tanımlamak için çok yönlü ve pratik bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada insan katılımcılar, hayvanlar veya omurgalı bireyler yer almadı. Tüm deneysel prosedürler, Tayland'daki King Mongkut Teknoloji Enstitüsü Ladkrabang (KMITL) Fen Fakültesi'nin kurumsal biyogüvenlik ve araştırma etik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm mikrobiyal deneyler, DSÖ ve ulusal biyogüvenlik^{standardı 9'a} uygun olarak Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) laboratuvar koşullarında gerçekleştirilmiştir.

Tüm deneysel işlemler boyunca laboratuvar önlükleri, eldivenler ve yüz maskeleri dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Kimyasal ve gümüş içeren atıkları, lisanslı bir atık yönetim şirketine göndermeden önce kurumsal tehlikeli atık yönetimi yönergelerine göre toplayıp bertaraf edin.

Sodyum dodesil sülfat, β-merkaptoetanol ve formaldehit içeren gümüş boyama reaktifleri dahil olmak üzere tehlikeli kimyasalların konsantre stok çözeltilerini kimyasal bir duman başlıkta hazırlayın. Laboratuvar tezgahında düşük çalışma konsantrasyonları ve küçük hacimlerle standart laboratuvar güvenlik uygulamalarına uygun olarak deneyler yapmak.

1. Alg kültürü

NOT: Alg yetiştiriciliği boyunca aseptik koşulları koruyun.

Başlangıç kültürü hazırlığı
1. Steril TAP ortamı (pH 7.0)¹⁰ hazırlayın ve 150 mL'yi steril 500 mL Erlenmeyer şişelerine dağıtın.
2. Ortamı, Tetraspora sp. CU2551'in gece boyunca %1 (v/v) inokulum kültürüyle aseptik teknikle Sınıf I biyogüvenlik kabininde aşılayın.
3. Kültürleri ışıkla donatılmış bir sarsıntı kuluçkasında 35 °C, 120 rpm ve 45,9 μmol/^{m 2}/s sıcaklıkta 48 saat boyunca kuluçka yapın. Ölçekli kültür için tam yetişkin kültürü bir başlangıç olarak kullanın.
Ölçeklendirme kültürü ve hücre hasadı
1. 25 mL başlatıcı kültürünü 275 mL taze, steril TAP ortamına aktarın. Kültürleri aynı koşullarda 48 saat kuluçka altına alın.
2. Alg hücrelerini 3.800 × g'de 25 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle hasat edin.
3. Hücre peletlerini steril damıtılmış suyla bir kez yıkayın ve tekrar 3.800 × g sıcaklığında 25 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
4. Süpernatantı tamamen çıkarın ve alg hücresi pelletlerini −20 °C'de depolayın, ta ki daha fazla işlem yapılana kadar.

2. Lizin tamponu formülasyonu ve arka plan inhibisyon taraması

DIKKAT: SDS ve β-merkaptoetanol ile kauçuk veya nitril eldivenlerle kullanın. Konsantre β-merkaptoetanol şişesini kimyasal bir buharlı kapsüllü kapsüllü içinde açın.

Liz tamponu hazırlığı
1. 10 mM Tris-HCl (pH 9.0) %0.1 w/v SDS ile desteklenen referans liz^{tamponu 11'i} ve 38 mM β-merkaptoetanol ile desteklenmiştir.
  NOT: Kritik adım: SDS ve β-merkaptoetanol konsantrasyonlarını optimize ederek yanlış pozitif antimikrobiyal aktiviteyi önlemek.
2. Sodyum dodesil sülfat (SDS) (0, 0,01, 0,05 veya %0,1 w/v) ve β-merkaptoetanol (0, 0,5, 1 veya 2 mM) değişken ederek tam faktoryal tampon setleri hazırlanarak 16 formülasyon oluşturulur.
  NOT: Test edilen tüm lizis tamponu formülasyonlarının bileşimleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Kullanımdan hemen önce β-merkaptoetanol ekleyin.
Arka plan antimikrobiyal tarama
1. No. 42 Whatman kağıdından 6 mm diskleri hazırlamak için kağıt deliği kullanın. Her lizin tamponu formülasyonundan 5 μL kağıt diske uygulanır ve CLSI yönergelerine göre disk difüzyon^{testleri yapılır 6}. Test plakalarını 37 °C'de 20 saat boyunca kuluçka yapın ve inhibisyon bölgelerini değerlendirin.
  1. Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 ve Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370 ile test edilen formülasyonlar.
2. Sonraki protein ekstraksiyonu için inhibitör aktivite göstermeyen formülasyonu seçin.

3. Protein Ekstraksiyonu

NOT: Sonikasyon ve santrifüjleme sırasında örnekleri düşük sıcaklıkta tutun.

Donmuş alg pelletleri (1.2.5. adımdan itibaren) 37 °C'de eritin ve −20 °C'de tekrar dondurun. Donma-erime döngülerini (-20 °C / 37 °C) 3 kez tekrarlayın.
Optimal lizis tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, %0.01 SDS, 2 mM β-merkaptoetanol) 5 mL nihai hacme ekleyin ve numuneleri sonraki işleme boyunca buz üzerinde tutun. Hücreleri sonikasyonla bozun (25 kHz, 500 W, %40 genlik, 1 s açık/kapalı, 5 dakika).
Üreticinin talimatlarına göre Proteaz İnhibitörü Kokteyli ekleyin ve nazikçe karıştırın.
Santrifüj, 4 °C'de 15 dakika boyunca 3.800 × g üzerinde lizatlanır ve üst proteini ham protein özeti olarak toplar.
Ekstraktları 10.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle geçirerek temizleyin. Üst kısımları 4 °C'de topla ve depola.

4. Antimikrobiyal aktivite değerlendirmesi

Disk difüzyon testleri
1. Patojenik bakterilerin (Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 ve Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370) besin agarında 37 °C'de, 16-18 saat boyunca kültürlenmiştir.
2. Steril bir alüminyum halka kullanarak, kolonileri agar yüzeylerinden kazıyıp %0,9 (w/v) NaCl ile yeniden süzülür. Bakteriyel süspansiyonları 0.5 McFarland standardına ayarlayın ve Mueller-Hinton agar plakalarına eşit şekilde süpürün.
3. Aşılanmış agar yüzeylerine steril kağıt diskler yerleştirilir ve 5 μL test örneği uygulanır. Plakaları 37 °C'de 16-20 saat boyunca kuluçka yapın ve Vernier kaliperiyle inhibisyon bölgelerini ölçün.
  NOT: Tüm diskler arasında eşit aralık kalın.
MIC ve MBC belirlemesi
1. 2 × 10⁶ CFU/mL ile 4x Mueller-Hinton çorbasında bakteriyel süspansiyonlar hazırlayın.
2. Bakteriyel süspansiyonlardan 50 μL ve seri seyreltilmiş protein örneklerinden 100 μL pipetleyin ve tüm kuyuları 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.5) kullanarak 200 μL nihai hacme ayarlayın.
3. Pozitif kontrol olarak 5 μL streptomisin (50 μg) kullanın. Negatif kontrol olarak 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) ve %0,9 (w/v) NaCl kullanın.
4. Plakaları 37 °C'de 20 saat kuluçka yapın ve MIC'i görünür bakteriyel büyüme olmayan en düşük konsantrasyon olarak belirleyin.
5. MBC'yi belirlemek için şeffaf kuyulardan Mueller-Hinton agara plaka alikotları yapılır.
Bakteriyel büyüme eğrisinin belirlenmesi
1. 2x Mueller-Hinton çorbasında 1 × 10⁶ CFU/mL ile bakteriyel süspansiyonlar hazırlayın.
2. 100 μL bakteriyel kültürünü 100 μL protein örneği ile 96 kuyu açıklığında 37 °C'de 20 saat boyunca kuluçka altına alın.
3. Pozitif kontrol olarak 5 μL streptomisin (50 μg) kullanın. Kontrol amaçlı steril damıtılmış su, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 500 mM NaCl 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) kullanın.
4. OD₆₀₀ ölçümünü her 30 dakikada bir mikroplaka okuyucu ile yörüngesel aralıklı sallanma ile ölçün (ölçümden 2 dakika önce).
5. Büyüme eğrilerini ve belirli büyüme oranlarını hesaplayın.
  NOT: Yüksek protein konsantrasyonları optik yoğunluk ölçümlerini etkileyebilir.

5. Pull-down testi ve protein arıtma

Pull-down testi
1. DEAE-Sefaroz reçinesini 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 8.0) veya CM-Sefaroz reçinesini 10 mM Fosfat tamponu (pH 7.0) ile dengeleyin.
2. 100 μL dengelenmiş reçine ile 500 μL ham protein ekstraktı karıştırın, ardından 100 μL dengeleme tamponu eklenin (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 DEAE; 10 mM fosfat tamponu, pH 7.0 CM). Nazik inversiyonla kuluçka yapın (10 ters çevirme).
3. Kısa bir süre santrifüj yapın, süpernatantı toplayın ve disk difüzyon testiyle antimikrobiyal aktiviteyi değerlendirin.
4. Çalışan reçineyi (DEAE-Sepharose) seçin. pH optimizasyonu için, reçineyi pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 veya 9.0 seviyelerinde 10 mM Tris-HCl ile dengeleyin ve 5.1.1-5.1.3 adımlarını takip edin.
5. İyon değişim kromatografisi için antimikrobiyal aktivite gösteren pH koşulunu seçin.
İyon değişim kromatografisi tabanlı protein arıtma
1. DEAE-Sefaroz reçinesini cam kromatografi kolonuna (16 mL yatak hacmi) paketleyin ve 10 sütun hacmi için 25 °C'de 10 mM Tris-HCl tamponu (pH 7.5) ile dengeleyin.
2. 8 mL/dakika akış hızında 15 mL ham protein ekstraktı (bölüm 3.6) yükleyin.
3. Kolonu dengeleme tamponu ile yıkayarak 280 nm'de absorbans 0.05'in altına düşene kadar.
4. Bağlı proteinleri, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) üzerinde 500 mL üzerinde 8 mL/dakika hızında doğrusal 0-500 mM NaCl gradyanı kullanarak elyutla.
5. 5 mL fraksiyon toplayın, 280 ve 220 nm'de absorbansı izleyin ve fraksiyonları buzda tutun. Fraksiyonları antimikrobiyal tarama ve protein analizine kadar 4 °C'de saklayın.

6. SDS-PAGE ve gümüş boyama

NOT: Kimyasal bir duman kapasosunda gümüş leke çözeltileri hazırlayın ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Tüm çözümleri taze hazırlayın.

Protein fraksiyonlarını %12 SDS-PAGE¹² ile ayırın ve bantları gümüş^{boyama ile görselleştirin 13}.
Hedef protein bantlarını tahrip eder ve MALDI-TOF MS analizine örnekler gönderir.
Proteinleri NCBInr ile veritabanı aramasıyla tanımlayın.

7. Antimikrobiyal peptid tahmini

NCBInr analizinden aday protein dizilerini alın.
Kamuya açık AMP tahmin araçları (örneğin, DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4) ve veri tabanları kullanılarak antimikrobiyal potansiyeli değerlendirin.
Antimikrobiyal olasılık puanları, tahmini sınıflandırma ve fizikokimyasal özellikler (net yük, hidrofobik kalıntı içeriği, GRAVY indeksi [ExPASy ProtParam] ve amfipatisite) dahil olmak üzere tahmin çıktılarını çıkarın.
Platformlar arasında hesaplama sonuçlarını entegre ederek aday antimikrobiyal proteinleri önceliklendirerek sonraki doğrulama için önceliklendirilin.
NOT: In silico tahminler aday seçimini destekler ve antimikrobiyal peptitlerin kesin sınıflandırılmasını sağlamaz.

8. İstatistiksel test

Tüm deneyleri biyolojik üçlü olarak yapın. Verileri tek yönlü ANOVA ile analiz edin, ardından Duncan'ın çoklu aralık testi veya uygun sonradan analiz işlemlerini %95 güven seviyesinde yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Optimize edilmiş protein ekstraksiyonu, iyon değişimi fraksiyonasyonu, antimikrobiyal tarama ve protein tanımlamasını entegre eden gelişmiş sağlam protein tabanlı iş akışı, Tetraspora sp. CU2551'den biyoaktif protein fraksiyonlarının tespit edilmesini başarıyla mümkün kıldı. Bu protokol, doğal protein bütünlüğünü koruyarak arka plan artefaktlarını en aza indirmek için tasarlanmıştır ve antimikrobiyal aktivitenin tanımlanmış kromatografik fraksiyonlar ve elektroforetik bantlarla ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolle güvenilir antimikrobiyal okumalar elde etmek için, özellikle protein çıkarımı ve erken biyoaktivite taraması sırasında birkaç kritik adım dikkatlice kontrol edilmelidir. Lizin tamponunun optimize edilmesi gereklidir, çünkü tampon bileşenlerinden arka plan inhibisyonu, antimikrobiyal protein taramasında sık sık yanlış pozitif sonuçlar veren bir kaynaktır. Orijinal tampon^{formülasyonu 11} ile gözlemlenen antimikrobiyal aktivite bu sorunu vurgulamaktadır;...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, C. Maneeruttanarungroj'a (RA/TA-2566-M-013) sağlanan King Mongkut's Institute of Technology Institute Ladkrabang'dan ve King Mongkut'un Ladkrabang Teknoloji Enstitüsü'nden Y. Tonawut'a (KREF016329) verilen araştırma hibeleriyle desteklendi. Kütle spektrometrik analizi, Mahidol Üniversitesi Tıp Teknolojisi Fakültesi, Proteomik Hizmet Birimi tarafından gerçekleştirildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Akrilamid/Bis-akrilamid Çözeltisi	Bio-Rad Laboratuvarları	1610156	SDS-PAGE jel hazırlama için Kategori: Kimyasal.
Alkol Lambası / Bunsen Brüleri	Çeşitli	—	Aseptik teknik için Kategori: Enstrüman
AMPScanner	George Mason Üniversitesi (Veltri ve ark.)	—	Derin öğrenme tabanlı AMP tahmin aracı Kategori: Yazılım / Veritabanı
Antimikrobiyal Peptit Tahmin Araçları (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	Çeşitli akademik kaynaklar	—	In silico AMP analizi Kategori: Yazılım / Veritabanı
APD3	Wang Laboratuvarı, Nebraska Üniversitesi	—	Antimikrobiyal Peptit Veritabanı Kategori: Yazılım / Veritabanı
Otoklav	Tomy	—	Medya ve malzemelerin sterilizasyonu Kategori: Cihaz
Biyogüvenlik Kabini Sınıf I/II	Çeşitli	—	Aseptik taşıma Kategori: Enstrüman
BioTool 2.0	Bruker Daltonics	—	MS spektrumları ve peptitlerini görselleştirme aracı Kategori: Yazılım
Bradford Reagenti	Merck	B6916	Protein nicelik Kategori: Kimyasal
CAMPR4	Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay	—	Antimikrobiyal peptitler koleksiyonu Kategori: Yazılım / Veritabanı
Santrifüj, Eppendorf 5415R Soğutmalı Mikrosantrifüj	Eppendorf	—	Mikrosantrifüjleme Kategori: Cihaz
Santrifüj, Termo Bilimsel Megafüj 8R	Thermo Fisher Scientific	—	Büyük hacimli santrifüjleme Kategori: Enstrüman
Kromatografi Sütunu (Cam)	Çeşitli	—	İyon değişim kromatografisi Kategori: Cam Takımları
CM-Sefaroz Reçine	Merck	CEF100	Katyon değişim reçinesi Kategori: Kimyasal (Reçine)
Pamuk Çubuk	Çeşitli	—	Bakteriyel aşılama Kategori: Plastik eşyalar
Kuvette, Kuvars	Hellma Analytics	—	UV spektrotometri Kategori: Cam eşyaları
DBAASP	Biyoorganik Kimya Enstitüsü (Rusya)	—	Antimikrobiyal aktivite ve peptit yapıları veritabanı Kategori: Yazılım / Veritabanı
DEAE-Sefaroz Reçine	Merck	DEFF100	Anyon-değişim reçinesi Kategori: Kimyasal (Reçine)
Erlenmeyer Şişesi, 100 mL	Çeşitli	—	Alg yetiştiriciliği Kategori: Cam eşyaları
Erlenmeyer Şişesi, 500 mL	Çeşitli	—	Alg yetiştiriciliği Kategori: Cam eşyaları
Escherichia coli TISTR 074	TISTR, Tayland	—	Test mikroorganizması Kategori: Biyolojik materyal
ExPASy ProtParam	İsviçre Biyoinformatik Enstitüsü	—	Proteinlerin fizikokimyasal özelliklerini hesaplamak için çevrimiçi araç Kategori: Yazılım / Veritabanı
Formaldehit	Merck	1.04002	Gümüş boyama Kategori: Kimyasal.
Dondurucu (-20 derece ve derece; C)	Çeşitli	—	Numune depolama Kategori: Enstrüman
Jel Elektroforez Sistemi (Mini-PROTEAN Tetra)	Bio-Rad Laboratuvarları	—	SDS-PAGE Kategori: Enstrüman
Cam Test Tüpü (16 & Kez; 150 mm)	Pyrex / Duran	—	Örnek Taşıma Kategori: Cam Eşyaları
Eldiven, Nitril	Çeşitli	—	Kişisel koruma Kategori: Plastik eşyalar
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)	Thermo Fisher Scientific	87786	Proteaz inhibisyonu Kategori: Kimyasal
Kuluçka makinesi	Çeşitli	—	Bakteriyel kültür Kategori: Cihaz
Kuluçka Makinesi Shaker	Çeşitli	—	Alg kültürü Kategori: Enstrüman
Aşılama döngüsü	Herhangi bir laboratuvar tedarikçisi	—	Mikrobiyal transfer Kategori: Tüketilebilir
KCl	Merck	P5405	Tampon hazırlığı Kategori: Kimyasal
MALDI-TOF Kütle Spektrometresi (Refleks IV)	Bruker Daltonics	—	Protein tanımlama Kategori: Cihaz
MASKOT	Matris Bilimi	—	MS verileri üzerinden protein tanımlama arama motoru Kategori: Yazılım / Veritabanı
MASKOT 2.2	Matris Bilimi	—	Protein tanımlama Kategori: Yazılım
Ölçüm Silindiri	Pyrex	—	Hacim ölçümü Kategori: Cam eşyaları
Mikrosantrifüj Tüpü (1.5 mL)	-	—	Numune işleme Kategori: Plastik eşyalar
Mikrosantrifüj Tüpü (2.0 mL)	-	—	Numune işleme Kategori: Plastik eşyalar
Mikropipet (100&ntir; 1000 µ L)	-	—	Sıvı taşıma Kategori: Enstrüman
Mikropipet (1&ntir; 10 µ L)	-	—	Sıvı taşıma Kategori: Enstrüman
Mikropipet (1&ntir; 5 µ L)	-	—	Sıvı taşıma Kategori: Enstrüman
Mikropipet (1&ntir; 5 mL)	-	—	Sıvı taşıma Kategori: Enstrüman
Mikropipet (20&ntir; 200 µ L)	-	—	Sıvı taşıma Kategori: Enstrüman
Microplate Reader	BioTek	—	OD600 ölçüm Kategori: Cihaz
Mueller– Hinton Agar/Bulurbalığı	Çeşitli	—	Antimikrobiyal testler Kategori: Ortam
Nanodrop / Biodrop Spektrofotometre	Çeşitli	—	Protein ölçümü Kategori: Cihaz
NCBInr veritabanı	Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi	—	Yedeksiz protein veritabanı Kategori: Yazılım / Veritabanı
Besin Agarı	-	—	Bakteriyel kültür Kategori: Ortam
Kağıt Disk (6 mm)	Whatman No.42	—	Disk difüzyon testi Kategori: Plastik ürünler
Petri Kabı	Çeşitli	—	Mikrobiyal kültür Kategori: Plastik eşyalar
pH Ölçer	Mettler Toledo	—	pH ayarlaması Kategori: Cihaz
Fosfat Tamponu (10 mM, pH 7.0)	-	—	Kromatografi tamponu Kategori: Tampon
Probe Sonicator (VCX500)	Sonics & Malzemeler Inc.	—	Hücre bozulması 500 W, 20 kHz, prob ile Kategori: Enstrüman
Buzdolabı (4 derece ve derece; C)	Çeşitli	—	Numune depolama Kategori: Enstrüman
Gümüş Nitrat	Sisco Araştırma Laboratuvarları	94118	Gümüş boyama Kategori: Kimyasal.
Sodyum Klorür (NaCl)	Merck	S9888	Elution tamponu Kategori: Kimyasal
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)	Bio-Rad Laboratuvarları	11667289001	Liz ve PAGE Kategorisi: Kimyasallar
Spektrofotometre	Shimadzu	—	Soğurma ölçümü Kategori: Cihaz
Spin-down Santrifüj	Eppendorf	—	Hızlı santrifüjleme Kategori: Enstrüman
Staphylococcus aureus TISTR 746	TISTR, Tayland	—	Test mikroorganizması Kategori: Biyolojik materyal
Streptomisin	Merck	S9137-25G	Pozitif kontrol Kategori: Kimyasal
Tetraspora sp. CU2551	KMITL Kültür Koleksiyonu	—	Alg suşu Kategori: Biyolojik materyal
Tris Asetat Fosfat (TAP) Ortamı	-	—	Alg kültürü Kategori: Ortam
Tris-HÇL	Merck	—	Tampon hazırlığı Kategori: Buffer
Vernier Kaliperi	Çeşitli	—	Bölge ölçümü Kategori: Cihaz
Su Banyosu	Çeşitli	—	Sıcaklık kontrolü Kategori: Enstrüman
XMASS	Bruker Daltonics	—	MALDI-TOF kütle spektrometrisi yazılımı Kategori: Yazılım
α-Siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA)	Bruker Daltonics	—	MALDI matris Kategori: Kimyasal

Kaynaklar

Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
Vasquez-Moscoso, C. A., Merlano, J. A. R., Olivera Gálvez, A., Volcan Almeida, D. Antimicrobial peptides (AMPs) from microalgae as an alternative to conventional antibiotics in aquaculture. Prep Biochem Biotechnol. 55 (1), 26-35 (2025).
Mekhalfi, M., Berteina-Raboin, S. Microalgae, cell factories for antimicrobial peptides: a promising response to antibiotic resistance. Antibiotics. 14 (10), 959(2025).
Singh, L. A., et al. Microalgae-derived antioxidants and antimicrobials: a sustainable approach for natural food preservatives. Front Sustain Food Syst. 9, 1669731(2025).
Wang, X., Ma, S., Kong, F. Microalgae biotechnology: methods and applications. Bioengineering. 11 (10), 965(2024).
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI supplement M100. , 35th ed, Standards Institute Clinical and Laboratory. (2025).
Sun, S. Progress in the identification and design of novel antimicrobial peptides against pathogenic microorganisms. Probiotics Antimicrob Proteins. 17 (2), 918-936 (2025).
Yang, R., et al. Advances in antimicrobial peptides: from mechanistic insights to chemical modifications. Biotechnol Adv. 81, 108570(2025).
Laboratorybiosafety manual. , 4th ed, World Health Organization. (2020).
Bolton, J. Algal culturing techniques. J Exp Mar Biol Ecol. 336, 262-262 (2006).
Tonawut, Y., et al. In silico encrypted peptide from green alga Tetraspora sp. CU2551 showed high antimicrobial activities. Algal Res. 78, 103382(2024).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Oakley, B. R., Kirsch, D. R., Morris, N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 105 (1), 361-363 (1980).
Zhu, Q., et al. Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) on microbial community structure and function in lake-terrestrial ecotones: a simulation experiment. Environ Technol Innov. 34, 103594(2024).
Mattern, K. L., Evans, C. A., Lara, J. C. Selective antibacterial action of 2-mercaptoethanol on propionibacteria in skin cultures. Appl Environ Microbiol. 37 (1), 177-179 (1979).
Click, R. E. Review: 2-mercaptoethanol alteration of in vitro immune functions of species other than murine. J Immunol Methods. 402 (1-2), 1-8 (2014).
Ishak, A., Mazonakis, N., Spernovasilis, N., Akinosoglou, K., Tsioutis, C. Bactericidal versus bacteriostatic antibacterials: clinical significance, differences and synergistic potential in clinical practice. J Antimicrob Chemother. 80 (1), 1-17 (2025).
Vaisbourd, E., et al. Principles of bacteriostatic and bactericidal antibiotics at subinhibitory concentrations. mBio. 16 (11), e0206625(2025).
Marciano, C. L., et al. A comprehensive overview of antimicrobial peptides: broad-spectrum activity, computational approaches, and applications. Antibiotics. 14 (11), 1115(2025).
Lu, Z., et al. Studies on the antibacterial activity of the antimicrobial peptide Mastoparan X against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1552872(2025).
Keeratikunakorn, K., Aunpad, R., Ngamwongsatit, N., Kaeoket, K. The effect of antimicrobial peptide (PA-13) on Escherichia coli carrying antibiotic-resistant genes isolated from boar semen. Antibiotics. 13 (2), 138(2024).
Maneeruttanarungroj, C., Lindblad, P., Incharoensakdi, A. A newly isolated green alga, Tetraspora sp. CU2551, from Thailand with efficient hydrogen production. Int J Hydrogen Energy. 35, 13193-13199 (2010).
Brizuela, C. A., Liu, G., Stokes, J. M., de la Fuente-Nunez, C. AI methods for antimicrobial peptides: progress and challenges. Microb Biotechnol. 18 (1), e70072(2025).
Maccari, G., Di Luca, M., Nifosì, R. In silico design of antimicrobial peptides. Methods Mol Biol. 1268, 195-219 (2015).
Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: classification, design, application and research progress in multiple fields. Front Microbiol. 11, 582779(2020).
Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect Drug Resist. 18, 4385-4426 (2025).
Rivero-Pino, F., Millan-Linares, M. C., Montserrat-de-la-Paz, S. Strengths and limitations of in silico tools to assess physicochemical properties, bioactivity, and bioavailability of food-derived peptides. Trends Food Sci Technol. 138, 433-440 (2023).
Curnutte, J. T., Babior, B. M. Biological defense mechanisms: the effect of bacteria and serum on superoxide production by granulocytes. J Clin Invest. 53 (6), 1662-1672 (1974).
Eleftheriadis, T., Pissas, G., Liakopoulos, V., Stefanidis, I. Cytochrome c as a potentially clinically useful marker of mitochondrial and cellular damage. Front Immunol. 7, 279(2016).
Min, L., Jian-xing, X. Detoxifying function of cytochrome c against oxygen toxicity. Mitochondrion. 7 (1), 13-16 (2007).
Mühlhaus, T., et al. Quantitative shotgun proteomics using a uniform N-labeled standard reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol Cell Proteomics. 10 (9), M110.004739(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Safla t rma Tetraspora CU2551 Protein Ekstraksiyonu yon De i im Kromatografisi Antimikrobiyal Aktivite Taramas SDS PAGE Analizi LC MS Tan mlama Biyoenformatik Analiz