Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Merkezi Sinir Sistemi Patogenlerinin Tespiti İçin Beyin Omurilik Sıvısının Metagenomik Yeni Nesil Dizilemesi

292 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

17 Nisan 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

Bu makalede

Özet

Bu araştırma protokolü, beyin omurilik sıvısının metagenomik yeni nesil dizileme (mNGS) için optimize edilmiş bir iş akışını ortaya koyuyor. Düşük biyokütleli örneklere özgü zorlukları ele alarak, yöntem çeşitli kaynak ortamlarında sağlam patojen tespitini sağlar ve nöroenfeksiyon hastalık araştırma uygulamaları için çok yönlü bir temel sağlar.

Özet

Metagenomik yeni nesil dizileme (mNGS), klinik ve araştırma ortamlarında tarafsız patojen tespiti ve konak transkripsiyonel profilleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Merkezi sinir sistemi (MSS) enfeksiyonlarının teşhisindeki faydası giderek daha fazla kabul edilse de, beyinomurilik sıvısı (CSF) örnekleri, düşük nükleik asit bolluğu ve bozulmaya yatkınlığı nedeniyle benzersiz zorluklar yaratmaktadır. Bu çalışma, CSF mNGS'ye göre optimize edilmiş Illumina dizileme platformları için optimize edilmiş bir araştırma tabanlı protokol sunmaktadır; örnek işleme, nükleik asit çıkarımı, kütüphane hazırlığı, dizileme ve biyoinformatik analizi kapsamaktadır. Yüksek ve düşük kaynak ortamlarına uyarlanabilir kalite kontrol yaklaşımları da sunulur; bunlar arasında kapiller elektroforeze alternatifler de bulunur. Bu çalışma, protokolün sağlamlığını iki temsilci grup aracılığıyla gösteriyor: yüksek derinlikli, NovaSeq tabanlı iş akışı ve maliyet bilincine dayalı NextSeq tabanlı iş akışı. Bu kohortlarda, vakaların %50'sinden fazlasında patojenler tespit edildi ve bu da yöntemin kaynak kısıtlı adaptasyonlara rağmen tanısal potansiyelini vurguladı. Bu protokol, tekrarlanabilir CSF mNGS'lerini kolaylaştırır ve nöroenfeksiyon hastalık araştırmaları ve tanısında çeşitli uygulamalar için temel sağlar.

Giriş

Metagenomik yeni nesil dizileme (mNGS), belirli bir çevresel veya konak örneği içinde geniş bir nükleik asit spektrumunun tespit edilmesini sağlayan giderek daha fazla kullanılan bir molekülertekniktir 1. Bir örnek içindeki genetik materyalin büyük çoğunluğunu amplifikasyon ve dizileme yoluyla mNGS, mevcut olabilecek spesifik mikroorganizmalar hakkında önceden önyargılı bir hipotezi gerektirmez. mNGS, nadir patojenlerin veya atipikenfeksiyon hastalıklarının 1,2,3 belirtilerinin tespiti gibi çeşitli klinik ortamlarda tanı aracı olarak faydalı olduğunu göstermiştir. Ayrıca, konak transkripsiyon profili mNGS testiyle oluşturulan RNA dizileme verileriyle de yakalanır ve bu da araştırmacıların çeşitli hastalık durumlarına karşı konak bağışıklık yanıtını daha iyi anlamalarınısağlar 4. mNGS'nin geniş klinik ve araştırma bağlamlarına uygulanabilirliği ile son on yıllarda jenerik dizileme maliyetindeki dramatik düşüş, bu teknolojinin kullanımında büyük bir artışa yolaçmıştır 5.

Özellikle, mNGS, merkezi sinir sistemi (CNS) enfeksiyonlarının tespitinde umut vaat ettiğini göstermiştir; bu enfeksiyonların teşhisi hâlâzordur 2,6,7. Klinik mNGS testlerinin başlamasından önce, Kaliforniya Ensefalit Projesi eyalet genelinde ensefalit nedenlerini incelemiş ve moleküler testlerin genişletilmiş paneli ve ayrıntılı klinik değerlendirme kullanılmasına rağmen vakaların yarısından fazlasının teşhis edilmediğinibulmuştur. 8. Şimdi, yirmi yıldan fazla bir süre sonra, klinik olarak doğrulanmış bir serebroomurilik sıvısı (CSF) mNGS testi, yedi yıl boyunca şüpheli CNS enfeksiyonu olan hastaların yaklaşık %15'inde CSF'de patojenik organizmaların bulunduğunutespit etti. Ayrıca, onaylanmış enfeksiyon tanısı olan hastalar arasında beşte biri yalnızca bu klinik CSF mNGS testiyle teşhis edildi ve bu da bu test yaklaşımının faydasınıvurgulamaktadır 7. Ayrıca, çalışmalar mNGStesti 9,10,11 ile üretilen konak transkriptomu temelinde çeşitli CNS enfeksiyonlarının olasılığını tahmin etme potansiyelini de göstermiştir.

Ancak, bu umut vadeden tekniğin erişilebilirliği, CSF örnek işleme ve işlemeye özgü zorluklar nedeniyle sınırlıdır. Özellikle, CSF DNA ve RNA miktarı genellikle kütüphane hazırlamakitleri 12,13 tarafından belirtilen minimum miktardan daha düşüktür. Nükleik asit kalitesi de optimal olmayan olabilir, çünkü klinik amaçlarla toplanan CSF örnekleri genellikle DNA ve RNAların aktif kalabileceği sıcaklıklardasaklanır 14. Bu makale, Illumina dizileme platformları için araştırma temelli bir CSF mNGS protokolünü tanımlıyor ve patojen tespiti için kullanılabilir veri oluşturma olasılığını en üst düzeye çıkarmak amacıyla optimize edilmiş (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, UCSF Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan çalışmalar kapsamında toplanan örnekler kullanılarak geliştirildi ve test edildi.

figure-protocol-1
Şekil 1: Beyinomurilik sıvısı (CSF) metagenomik yeni nesil dizileme (mNGS) örnek işleme ve patojen tespiti için analitik iş akışı. Bu diyagram, CSF mNGS ıslak laboratuvarı ve biyoinformatik yollarındaki temel adımları göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

1. CSF örnek işleme konuları

NOT: MNGS sonuçları, BOĞS kütüphanesi hazırlığı toplama sırasında gerçekleşiyorsa veya CSF örnekleri sıvı azotta snap-dondurma yoluyla saklanıp -80 °C15 sıcaklığında uzun süreli saklanıyorsa en iyisidir. Alternatif olarak, örnek toplama sırasında DNA/RNA kalkanı gibi koruyucu çözümlerin kullanılması, oda sıcaklığında daha uzun süre saklanmasına olanaktanıyabilir 16,17. Bu, soğuk zincirin güvenilirliğiyle ilgili endişeler yaşandığında tercih edilebilir. Ayrıca, gereksiz donma-erime döngülerinden kaçınmak da nükleik asit bütünlüğünün korunmasına yardımcı olabilir ve CSF örnekleri için birden fazla analitik iş akışı bekleniyorsa, toplama sırasında örneklerin önceden alınması tavsiyeedilebilir (18,19).

2. CSF nüklein asidinin ekstraksiyonu

DIKKAT: Enfeksiyon organizmalarının bulaşma riskini azaltmak için uygun bir biyogüvenlik seviyesindeki dolapta eldiven ve laboratuvar önlüğü ile hareket edin. Reaktifler yutulduğunda, solulursa veya ciltle temas ettiğinde zararlıdır. Kullanılmış malzemeleri yerel düzenlemelere uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.

  1. Quick-DNA/RNA Kiti genellikle düşük nükleik asit bolluğuna sahip örnekler için iyi çalışır.
  2. CSF örnekleri buz üzerinde çözülür, ardından her örnekten 100 μL–1 mL 1,5 mL tüpe aktarılır ve 16.000 x g hassasiyette, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapılır.
  3. Süpernatantı dikkatlice pipetleyin, genellikle çıplak gözle görünmez olan peleti ve 100 μL süpernatantı bırakın.
  4. Kalan 100 μL süpernatant ve pellete 100 μL DNA/RNA Shield ekleyin ve pipet iyice karıştırın.
  5. Sonra, 600 μL DNA/RNA lizin tamponu ekleyip çözelti homojen olana kadar pipet karıştırın.
  6. Üreticinin Ek Ekler A'da tanımladığı DNA/RNA çıkarma protokolünün geri kalanını, CSF'ye özgü aşağıdaki önemli değişikliklerle takip edin:
    1. Tüm santrifüj adımlarını maksimum hızda (~21.000 x g) 1 dakika boyunca gerçekleştirin, son DNA/RNA yıkama adımı hariç, ki bu adım maksimum hızda 3 dakika çalışmalı.
    2. Örneği sütun matrisine doğrudan 25 μL yerine 22 μL (25 μL yerine) nükleazsız su ekleyerek elüasyon yapın, ardından oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka yapın. Daha yüksek hacim genellikle kolondan daha fazla toplam nükleik asit elüasyonuna yol açar.
    3. Elusyondan sonra, akışı tekrar kolon matrisine pipet ile gönderin ve maksimum hızda bir dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Numuneyi yeni bir 1,5 mL depolama tüpüne aktarın ve ya hemen kütüphane hazırlığına geçin ya da -80 °C'de depolayın.

3. CSF RNA kütüphanesi hazırlığı

DIKKAT: Uygun bir biyogüvenlik dolabında, eldiven ve laboratuvar önlüğü takarak hareket edin. Reaktifler yutulduğunda, solulursa veya ciltle temas ettiğinde zararlıdır. Kullanılmış malzemeleri yerel düzenlemelere uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.

NOT: Başlamadan önce önemli hususlar: rRNA tükenmesi mRNA izolasyonu için poliadenilasyon zenginleştirmesine tercih edilir; çünkü rRNA tükenmesi ek boncuk temizliği adımları gerektirmez (bu da kullanılabilir mRNA verimini azaltabilir) ve bazı nöroinvaziv RNA virüs transkripsiyonlarında poliadenilasyon yoktur. ERCC (External RNA control consortium) RNA Spike-In kalite kontrol ölçümü olarak eklenebilir, ancak bu kesinlikle gerekli değildir. Eğer RNA ekstraksiyondan sonra -80 °C'de depolanmışsa, başlamadan önce buzda çözülür.

  1. RNA parçalanması ve astarlama: Pipetle polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde şunları karıştırın: 3,5 μL RNA örneği, 0,5 μL 1:2500 seyreltilmiş ERCC spike-in, 4 μL birinci iplik reaksiyon tamponu (5 kat), 1 μL rastgele primer ve 1 μL 1:100 seyreltilmiş rRNA (Materyal Tablosu). Termosikleterde, ısıtılan kapağı 105 °C'ye ayarlayın ve örnekleri 75 °C'de 2 dakika, 70 °C'de 2 dakika, 65 °C'de 2 dakika, 60 °C'de 2 dakika, 5 dakika 55 °C, 5 dakika 37 °C ve 5 dakika 25 °C'de kuluçka yapın.
  2. Birinci iplik cDNA sentezi: Pipet, parçalanmış ve astarlanmış RNA'yı (10 μL) 8 μL nükleazsız su ve 2 μL birinci iplik sentez enzim karışımı ile karıştırır. Bir termosikleterde, ısıtılan kapağı 105 °C'ye ayarlayın ve örnekleri 25 °C'de 10 dakika, 42 °C'de 15 dakika ve 70 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
  3. İkinci zincir cDNA sentezi: Pipet, birinci iplikli sentezlenmiş DNA'yı (20 μL) 8 μL ikinci zincir sentez reaksiyon tamponu, 4 μL ikinci iplik sentez enzim karışımı ve 48 μL nükleaz içermeyen su ile karıştırın. Bir termosikleterde, örnekleri 16 °C'de 1 saat kuluçkaya geçirin, ısıtılmış kapak kapalı halde.
  4. SPRI manyetik boncuklarının 1,8x oranı (144 μL) kullanılarak manyetik boncuk arıtması (Ek Ekler B) gerçekleştirilir. 53 μL nükleazsız suya elülasyon yapın ve son üst yüzeyin (arıtılmış çift iplikli cDNA içeren) 50 μL'sini temiz, nükleazsız bir PCR tüpüne aktarın. Bu noktada, gerekirse örnekler gece boyunca -20 °C'de güvenli bir şekilde dondurulabilir.
  5. cDNA kütüphanesi son hazırlığı: Örnek gece boyunca -20 °C'de saklandıysa, yeniden başlatmadan önce buzda çözülür. Pipet, saflaştırılmış ds-cDNA'yı (50 μL) 7 μL son hazırlık reaksiyon tamponu ve 3 μL son hazırlık enzim karışımı ile karıştırın.
  6. Termosikleterde, örnekleri 20 °C'de 30 dakika ve 65 °C'de 30 dakika boyunca kuluçkalayın, ısıtılmış kapağı kapalı halde.
  7. Adaptör ligasyonu (bu adımı buz üzerinde gerçekleştirin): Nükleaz içermeyen suda 1:100 derecesinde bir adaptör seyreltmesi oluşturun. Son hazırlık reaksiyon karışımını (60 μL) 30 μL ligasyon master karışımı, 1 μL ligasyon artırıcı ve 2.5 μL 1:100 seyreltilmiş adaptör içeren bir tüpte pipetleyin. Adaptörün ayrı ayrı eklendiğinden emin olun (örneğin, ligasyon master karışımı veya ligasyon güçlendiricisi ile önceden karıştırılmamış) ki adaptör dimer oluşumunu önleyin.
  8. Bir termosikleterde, örnekleri ısıtılmış kapağı kapalı olarak 20 °C'de 15 dakika kuluçka edin.
  9. Hemen manyetik boncuk arıtmasına (Ek Ek 2) geçerek 0,9x SPRI manyetik boncuk oranı (87 μL) kullanılır.
  10. 17 μL nükleazsız suya elut edin ve son süpernatantın 15 μL'sini temiz, nükleaz içermeyen bir PCR tüpüne aktarın
  11. Barkodlama PCR: Saflaştırılmış, adaptör ligasyonlu cDNA'yı (15 μL) 3 μL USER enzimi, 25 μL Q5 Master Mix ve 10 μL benzersiz barkodlu primerlerle bir tüpe içine pipetleyin. Bir termosikleterde, ısıtılan kapağı 105 °C'ye ayarlayın, örnekleri 37 °C'de 15 dakika, ardından 98 °C'de 30 saniye kuluçka yapın ve ardından 10 saniye 98 °C, 75 saniye 65 °C ile 19 döngü yapın. PCR'yi 65 °C'de 5 dakika kuluçka geçirerek tamamlayın.
  12. 0,8x manyetik boncuk oranı (43 μL) kullanılarak nihai manyetik boncuk arıtması gerçekleştirilir. 23 μL nükleazsız suya elüasyon yapın ve son boncuk ayırma adımından sonra 20 μL temiz, nükleazsız bir PCR tüpüne aktarılır. Bu noktada, gerekirse örnekler gece boyunca -20 °C'de güvenli bir şekilde dondurulabilir.

4. CSF DNA kütüphanesi hazırlığı

DIKKAT: Eldiven ve laboratuvar önlüğüyle uygun bir biyogüvenlik seviyesindeki dolapta çalışın. Reaktifler yutulduğunda, solulursa veya ciltle temas ettiğinde zararlıdır. Kullanılmış malzemeleri yerel düzenlemelere uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.

  1. Çıkarılan DNA gece boyunca -20 °C'de depolandıysa, yeniden başlatmadan önce buzda çözülür.
  2. DNA parçalanması ve son hazırlık: Birinci iplik reaksiyon tamponunu girdap ve pipet karışımı ile iyice karıştırarak çökeltiyi yeniden süzüldürmek için karıştırın. Pipet karışımı 3,5 μL çıkarılmış DNA, 22,5 μL nükleaz içermeyen su, 7 μL birinci iplik reaksiyon tamponu ve 2 μL birinci iplik enzim karışımı.
  3. Termosiklette ısıtılan kapağı 105 °C'ye ayarlayın ve örnekleri 37 °C'de 5 dakika, ardından 65 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  4. Adaptör ligasyonu ve barkodlama PCR süreci, DNA ve RNA kütüphaneleri için aynıdır. "CSF RNA Kütüphanesi Hazırlığı"nın 7–10. bölümlerini, parçalanmış ve uçtan hazırlanmış DNA ile tekrarlayarak DNA kütüphanesi hazırlığını tamamlayın.

5. Kütüphane kalite kontrolü ve havuzlama

  1. DNA niceleme kiti ve ilgili florometre aracılığıyla örnek kütüphanelerinin konsantrasyonunu nicelikle ölçün. Su kontrollerinin diğer örneklere kıyasla çok daha az (veya ölçülemeyecek) konsantrasyonlara sahip olması gerekir.
  2. Örnek kütüphanesi boyutlarını otomatik bir kapiller elektroforez makinesinde çalıştırarak değerlendirin.
  3. Alternatif olarak, otomatik bir kapiler elektroforez makinesi mevcut değilse, Illumina evrensel primerleriyle PCR reaksiyonu yaparak numunenin 1-2 μL'sini daha da amplifikasyon ve ardından %2 agaroz jel üzerinde nihai ürünün 10 μL'sini elektroforezi gerçekleştirin. Kullanılmış malzemeleri yerel düzenlemelere uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak bertaraf etmelidir.
    NOT: Optimal kütüphane uzunluğu yaklaşık 400–500 baz çiftidir, bu nedenle gelecekteki parçalanma kuluçkaları, kütüphane boyutları istenenden daha büyük veya kısa, buna göre ayarlanmalıdır. Ayrıca, yaklaşık 150 baz çifti uzunluğunda olan ve iki adaptör molekülünün bir insert dizisi olmadan yanlışlıkla birbirine bağlanmasıyla ortaya çıkan adaptör dimerlerin varlığını değerlendirmek kritik öneme sahiptir. Düşük miktarlarda bulunsalar bile, adaptör dimerleri akış hücresinde verimli şekilde kümelenir ve dizilerek dizileme sırasında kullanılabilir okuma oranını azaltır. Bu nedenle, adaptör dimerler varsa, 0,8x SPRI manyetik boncuk oranıyla ek bir manyetik boncuk arıtması gerçekleştirin. (Dikkat çekici bir şey, örneğin >%10'u adaptör dimer ise, adaptör dimerlerinin çoğunu çıkarmak için 2-3 tur manyetik boncuk arıtması gerekebilir).
  4. Aynı dizileme sürecindeki örnekler arasında benzer bir dizileme derinliği sağlamak için, her örnekten eşitmolar büyüklüklerin bir araya getirilmesi gerekir. Eğer kütüphane boyutları tüm örneklerde karşılaştırılabilirse, her RNA kütüphanesinin eşdeğer kütlelerini toplayıp her DNA kütüphanesi için ayrı ayrı tekrarlanın.

6. Sıralama değerlendirmeleri

  1. Toplanan örnekler artık Illumina dizileme cihazlarında dizilemeye hazır. Eğer dizileme merkezi olarak (özel bir dizileme çekirdek tesisi yerine) kendi içinde yapılıyorsa, havuzu reaktif kartuşuna yüklemeden önce grup kütüphanelerini dizileme cihazı talimatlarına göre dikkatlice denatüre ve seyreldin (çoğu Illumina dizileme platformunda tipik konsantrasyon 4 nM'dir).
  2. Illumina akış hücresi için beklenen veri verimini koşudaki çoklanmış örnek sayısına bölerek tahmini dizileme derinliğini hesaplayın.
    NOT: İstenen dizileme derinliğini belirlemek, maliyet, kullanılan dizileme cihazı ve deneyin amaçları gibi birkaç faktöre bağlıdır. Farklı dizileme derinliklerine iki örnek aşağıda Temsilci Sonuçlar bölümünde sunulmaktadır.

7. Patojen tespiti için veri analizi

  1. Patojen tespiti için metagenomik analiz yapmak amacıyla açık kaynaklı web tabanlı platform Chan Zuckerberg ID'yi (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) kullanın. CZID ayrıca komut satırı arayüzü üzerinden örnek yükleme ve Illumina BaseSpace hesabından CZID'e doğrudan aktarma seçenekleri de içerir. CZID mNGS veri analizinin ayrıntılı bir özeti şu adreste mevcuttur https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. CZID'e giriş yapın, "upload" tuşuna tıklayın, analiz türü için "metagenomics" seçin ve dizileme çalışmasından giriş fastq dosyalarını seçin. Her örnek için örnek adı, örnek türü (CSF) ve nükleotit (RNA veya DNA) dahil olmak üzere gerekli bilgileri girin.
    NOT: Yüklenen dosyalar, düşük kaliteli okumaları ve insan okuma dizilerini kaldırmak için STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq ve GSNAP gibi çeşitli hesaplama araçlarını içeren CZID boru hattı aracılığıyla otomatik işleme sürecinden geçer. Boru hattı, sırasıyla Minimap2 ve DIAMOND yazılım programları aracılığıyla Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) nükleotid (NT) ve protein (NR) veritabanlarını kullanarak filtrelenmiş dizileri hizalayıp birleştirir. Nihai CZID çıktısı, her örnek için NT/NR takson sayılarını ve contig sayılarını (montaj sırasında oluşturulan bitişik, örtüşen segmentler) içerir.
  3. İşlem tamamlandıktan sonra, örneklerin bulunduğu proje klasörüne tıklayın ve özet paneline gidin.
  4. Aşağıya kaydırarak örnek başına okunma sayısını inceleyin (ve kullanılan Illumina akış hücresi ile dizileme sürecinde çoklanan örnek sayısına dayalı beklenen okuma sayısıyla karşılaştırın), kalite kontrol filtresinden geçen okuma yüzdesini ve tekrarlanan sıkıştırma oranını inceleyerek önyargılı PCR aşırı amplifikasyonunu değerlendirin.
  5. Çevresel nüklein asit parçalarının kontaminasyonu - ya CSF numune toplama sürecinde veya ekstraksiyon/kütüphane hazırlığı sırasında - yaygın birdurumdur 20. Bakteriyel, mantar ve parazitik okumaların gerçek pozitif olup olmadığını belirlemek için, normalize okuma sayılarını (milyonda okuma veya rPM) kullanan olası yöntemler değerlendirilebilir:
    1. Arka plan modeli oluşturmak (örneğin, çıkarılmış, hazırlanmış ve dizilenmiş su örnekleri kullanılarak) doğrudan CZID içinde bir arka plan modeli oluşturularak arka plan modeline benzer veya daha düşük rPM'li taksonları filtreleyin (ve bu nedenle muhtemelen kontaminasyonu temsil edebilecek olanlar). Proje klasöründe, her bir su kontrol örneğini kontrol edin ve ardından "arka plan modeli"ne tıklayarak oluşturun. Her örneği analiz ederken, arka plan modelini seçin ve "eşik filtreleri"ne tıklayarak muhtemel kirleticileri filtrelemek için "NTZ Puanı" > 1 (veya daha üzeri) uygulanır.
    2. Önceden belirlenmiş rPM eşikleri kullanın; örneğinrpM örnek > 10*(ortalama rPMkontrolleri) veya log10 (rPMörnekimi) en az 1 log büyük (ortalama rPMtüm kohort) büyük. Öncelikle, proje sayfasında her örneği kontrol ederek, indir seçeneğine tıklayarak ve "Combined Sample Takson Sonuçları" seçerek her örnek için taksona özgü rPM'yi indirin. Ortaya çıkan .csv dosyası, istenildiği gibi R veya Stata gibi istatistiksel yazılımlarla analiz edilebilir.
      NOT: Viral patojenlerin göreceli bolluğu daha düşük olduğundan, bilinen nöroinvaziv potansiyele sahip ve viral genomla uyumlu en az bir okuma olan herhangi bir virüs olumlu sonuç olarak kabul edilmeli (ve ideal olarak tekrarlayan mNGS veya patojen-spesifik klinik testlerle doğrulanmalıdır). Ayrıca, analitik boru hattı, fastq dosyasındaki her okumanın NCBI veritabanındaki en olası referans genomuna hesaplamalı olarak hizalanması gerekir . Sonuç olarak, bazı okumalar belirli bir patojene nispeten spesifik olmayabilir ve teorik olarak CZID'de atanmış spesifik taksona değil, geniş bir organizma yelpazesiyle uyumlu olabilir. Bu risk göz önüne alındığında, pozitif çağrıların manuel onayı, hizalanmanın web tabanlı NCBI BLAST aracı aracılığıyla doğrulanmasıyla yapılmalıdır (bir taksonun özel okumaları, ilgili taksonun yanındaki blast simgesine tıklayarak doğrudan CZID'den NCBI BLAST'a gönderilebilir).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kütüphane kalite kontrolü
DNA/RNA çıkarımından sonra, ekstraksiyon yapılan DNA'nın ölçülen konsantrasyonu genellikle 1–10 ng/μL olarak değişir. Ancak, çıkarılan RNA'nın konsantrasyonu genellikle pg/μL mertebesinde olduğundan, spektrofotometreler tarafından sıklıkla tespit edilemez. Kütüphane hazırlığından sonra, arındırılmış ve amplifike edilmiş cDNA ve DNA kütüphaneleri genellikle sırasıyla 0,5–10 ng/μL ve 10–30 ng/μL konsantrasyonlarında olur. Ş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İstenen dizileme derinliği, kullanılan dizileme platformu ve kalite kontrol ekipmanının bulunabilirliğine bağlı olarak bu protokolde değişiklik gerektirebilecek önemli hususlar vardır. Buna rağmen, burada sunulan iki temsilci kohort, geniş bir deneysel koşullar yelpazesinde güçlü patojen tespitinin mümkün olduğunu göstermektedir. Özellikle, Kohort B, birkaç maliyet tasarrufu önlemine rağmen – sığ derinlikte dizileme, ERCC kontrollerinin hariç tutulması, protokolün küçültülmesi ve kalite ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

M.R.W., Roche/Genentech, Novartis ve Kyverna Therapeutics'ten alakasız araştırma hibeleri alıyor ve Delve Bio Inc.'in kurucusu ve yönetim kurulu üyesidir. Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines ve Indapta Therapeutics'e danışmanlık hizmetleri sunmuştur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Fogarty Uluslararası Merkezi'nin D43TW009343 numaralı fonu kapsamında desteklenmiştir. Son birkaç yılda çeşitli araştırma uygulamaları için mNGS protokollerinin geliştirilmesi ve optimize edilmesine katkıda bulunan Wilson Lab, UCSF ve CZI'deki birçok araştırmacıya teşekkür etmek isteriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.2mL PCR tüp şeridiEppendorf30124359
1.5 mL DNA LoBind TüpleriEppendorf30108051
1.5 mL Güvenli Kilit tüpleriEppendorf30120191
ERCC RNA Spike-In KarışımıThermo Fisher4456740
Yüksek Duyarlılık D1000 ReaktifleriÇevik5067-5585
Invitrogen Collibri Library Amplification Master MixThermo FisherA38539050
Mastercycler x50Thermo Fisher6311000010
NEBNext Illumina için Multipleks OligosNew England Biolabs7335S/L
NEBNext Ultra II DNA Kütüphane Hazırlık KitiNew England BiolabsE7645
NEBNext Ultra II RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti for IlluminaNew England BiolabsE7770
NextSeq 500/550 Yüksek Çıkış Kiti v2.5 (150 döngü)Illumina20024907
NextSeq 550IlluminaKayıt
QIAseq FastSelect -rRNA HMR KitQuiagen334386
Qubit 1X dsDNA Yüksek Duyarlılık Analiz KitiQubitQ33230
Qubit 4 FluorometreThermo FisherN/a
Quick-DNA/RNA Microprep Plus Kit ZymoD7005
TapeStation 4150ÇevikG2992AA

Kaynaklar

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  2. Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
  3. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: the next culture-independent game changer. Front. Microbiol. 8, (2017).
  4. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  5. DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data (2026).
  6. Wilson, M. R., et al. Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing. JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).
  7. Benoit, P., et al. Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections. Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).
  8. Glaser, C. A., et al. In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000. Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).
  9. Ramachandran, P. S., et al. Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 13, 1675(2022).
  10. Xing, Z., et al. Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis. J Transl Med. 22, 583(2024).
  11. Omura, C., et al. 298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections. Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).
  12. Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).
  13. Olausson, J., et al. Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics. Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).
  14. Becskei, A., Rahaman, S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).
  15. Wang, C., Liu, H. Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR. Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).
  16. Cb, T., et al. DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples. Frontiers in microbiology. 13, (2022).
  17. Kazantseva, J., et al. Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies. BMC microbiology. 21 (1), (2021).
  18. Xiaoli, J., et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).
  19. Kellman, B. P., et al. Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing. BMC genomics. 22 (1), (2021).
  20. Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments. Microbiome. 7 (1), 62(2019).
  21. Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation. PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).
  22. Sakiyama, Y., et al. Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis. Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).
  23. Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing. Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).
  24. Sun, J., et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules. Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).
  25. Tan, J. K., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery. Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).
  26. Prasanna, A. kshatha Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).
  27. Marra, P. S., et al. Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).
  28. Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination. Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).
  29. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  30. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Metagenomik SekanslamaPatojen TespitiN kleik Asit EkstraksiyonuK t phane Haz rlamaManyetik Boncuk PurifikasyonuKapiler ElektroforezBiyoinformatik AnalizKonak Transkriptomi i
Merkezi Sinir Sistemi Patogenlerinin Tespiti İçin Beyin Omurilik Sıvısının Metagenomik Yeni Nesil Dizilemesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.