Bu protokol, düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerini türetme olmadan izole etmek için iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon yöntemini tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare dışkısından kısa zincirli yağ asitlerinin iki fazlı asit-çözücü yöntemiyle ekstraksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Bu makale, düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA'ların) iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon stratejisi kullanılarak çıkarılması için bir protokolü açıklar. Yöntem, yaklaşık 20–50 mg bireysel dışkı girişleri için tasarlanmıştır ve derivatizasyon olmadan faz ayrımı sağlamak için seyreltilmiş hidroklorik asit ve etil asetat kullanır. Protokol, fekal homojenizasyon, asitlenme, organik çözücü bölmesi ve düşük sıcaklıkta santrifüjasyondan oluşur ve araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan standart laboratuvar ekipmanlarıyla gerçekleştirilebilir. Ekstraksiyondan sonra, SCFA'lar rutin gaz kromatografisi tabanlı platformlarla aşağı akış analizi için uygundur. Protokolün başarılı yürütülmesi, bireysel fare örneklerinden elde edilen asetat, propionat ve bütirat gibi büyük dışkı SCFA'larında gösterildiği gibi, arka plan gürültüsünün üzerindeki karakteristik tutma sürelerinde açıkça çözülmüş SCFA zirvelerinin tespit edilmesiyle gösterilir. Bu protokol, sınırlı örnek materyalden fekal SCFA çıkarımı için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlayarak rutin analitik iş akışlarıyla uyumluluğu korurken küçük hayvan çalışmalarında yaygın bir prosedür sorununu ele alır.
Giriş
Bu protokol, rutin gaz kromatografisi (GC) tabanlı analizle uyumlu bir formatta düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA) çıkarılmasını sağlamak için geliştirilmiştir. SCFA'lar, sindirilemeyen diyet liflerinin fermentasyonu yoluyla bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen ve altiden az karbon atomu bulunan uçucu organik yağ asitleridir. Bu metabolitlerin bireysel farelerden nicelendirilmesi, dışkı materyalinin sınırlı olduğu ve örneklerin davranışsal, metabolik veya fizyolojikfenotipler 2,3,4,5,6 ile ilişkilendirildiği küçük hayvan çalışmala....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, ABD'deki Hayvanlar Daimi Komitesi, kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için tasarlanmış önceki hayvan protokolünü onayladı. Bu protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergeleri ve düzenlemelerine uygundur. Bu el yazması, ARRIVE yönergelerine göre oluşturulmuştur. Protokol diyagramı Şekil 1'de gösterilmekte ve gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki protokol, alındıkları dışkı örneklerinin sayısına karşılık gelen 120 μL'lik ekstra SCFA aliquotları vermiştir. Çıkarma protokolünün başarılı yürütülmesi, karakteristik tutma sürelerinde sinyal yoğunluğu arka plan gürültüsünün üzerinde belirgin şekilde çözülmüş SCFA zirvelerinin varlığıyla gösterilir. Tarif edildiği gibi uygulandığında, protokol numuneler arasında sonraki nicel karşılaştırma için uygun fekal SCFA profilleri sağlar. Sekiz SCFA'yı nicelikleştirdik: asetik asit, p.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, küçük hacimli fare dışkı örneklerinden SCFA'ların verimli ve tekrarlanabilir şekilde çıkarılmasını sağlayan birkaç kritik adım içerir. Protokol, SCFA'ların düşük moleküler ağırlıklı, zayıf organik asitler olarak fizikokimyasal özelliklerine göre özelleştirilmiş seyreltilmiş hidroklorik asit ve etil asetat hacimlerinde tanımlanmış hacimlerde iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon sistemi kullanır. Asitleşme, SCFA'ları protonlanmış formlarına dönüştürür; bu da fekal matriksle iyon.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Yiying Zhang'a verilen R21AG065606 ve R21AG08176 aracılığıyla bu çalışmaya sağlanan finansman desteğini, ayrıca Borten Ailesi Vakfı ve Tang Ailesi'nin Yiying Zhang'a yaptığı bağış desteğini minnettarlıkla takdir ediyoruz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Santrifüj | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Mikrosantrifüj" |
| Santrifüj tüpleri | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mikrotüp Standı | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Etil asetat | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Sınıfı, ≥99.5% |
| Yeşil havaneli | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Sertifikalı (10 N, stok solüsyon); kullanım için 0.5 M'ye seyreltildi |
| 1000 μL pipet | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL pipet uçları | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Etanol | Fisher Scientific | BP82011 | Moleküler Biyoloji Sınıfı, %70 çözelti |
| 200 μL pipet | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL pipet uçları | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Cımbız | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vorteks | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Minyatür Vortex Mikseri, Mor Kupa" |
Kaynaklar
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
