Bu protokol, düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerini türetme olmadan izole etmek için iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon yöntemini tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare dışkısından kısa zincirli yağ asitlerinin iki fazlı asit-çözücü yöntemiyle ekstraksiyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Bu makale, düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA'ların) iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon stratejisi kullanılarak çıkarılması için bir protokolü açıklar. Yöntem, yaklaşık 20–50 mg bireysel dışkı girişleri için tasarlanmıştır ve derivatizasyon olmadan faz ayrımı sağlamak için seyreltilmiş hidroklorik asit ve etil asetat kullanır. Protokol, fekal homojenizasyon, asitlenme, organik çözücü bölmesi ve düşük sıcaklıkta santrifüjasyondan oluşur ve araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan standart laboratuvar ekipmanlarıyla gerçekleştirilebilir. Ekstraksiyondan sonra, SCFA'lar rutin gaz kromatografisi tabanlı platformlarla aşağı akış analizi için uygundur. Protokolün başarılı yürütülmesi, bireysel fare örneklerinden elde edilen asetat, propionat ve bütirat gibi büyük dışkı SCFA'larında gösterildiği gibi, arka plan gürültüsünün üzerindeki karakteristik tutma sürelerinde açıkça çözülmüş SCFA zirvelerinin tespit edilmesiyle gösterilir. Bu protokol, sınırlı örnek materyalden fekal SCFA çıkarımı için standartlaştırılmış bir iş akışı sağlayarak rutin analitik iş akışlarıyla uyumluluğu korurken küçük hayvan çalışmalarında yaygın bir prosedür sorununu ele alır.
Giriş
Bu protokol, rutin gaz kromatografisi (GC) tabanlı analizle uyumlu bir formatta düşük girdili fare dışkı örneklerinden kısa zincirli yağ asitlerinin (SCFA) çıkarılmasını sağlamak için geliştirilmiştir. SCFA'lar, sindirilemeyen diyet liflerinin fermentasyonu yoluyla bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen ve altiden az karbon atomu bulunan uçucu organik yağ asitleridir. Bu metabolitlerin bireysel farelerden nicelendirilmesi, dışkı materyalinin sınırlı olduğu ve örneklerin davranışsal, metabolik veya fizyolojikfenotipler 2,3,4,5,6 ile ilişkilendirildiği küçük hayvan çalışmalarında sıklıkla gereklidir. Bu nedenle, hayvan başına SCFA ölçümlerine dayanan deneysel tasarımları desteklemek için pratik ve düşük girdili bir çıkarma iş akışı gereklidir.
Mevcut fekal SCFA analizi yaklaşımları birkaç metodolojik kısıtlama sunar. Dışkı örneklerindeki SCFA'ların nicelendirilmesi, volatilite, düşük bolluk ve biyolojik matrislerin karmaşıklığı nedeniyle analitik olarakzordur 7. Standart iş akışları genellikle türevleşme adımları, büyük örnek hacimleri ve otomatik sıvı işleme, özel homojenleştirme platformları veya katı faz çıkarmakolonları 8,9,10,11 gibi özel ekipmanlar gerektirir. Bu gereksinimler, özellikle hayvan başına dışkı çıkışının minimum olduğu ve boylamasına veya genotipe özgü örnekleme yaygın olduğu fare çalışmalarında erişilebilirliği ve ölçeklenebilirliğisınırlayabilir 12,13,14. Sonuç olarak, küçük dışkı girdilerinden SCFA çıkarımını türevizasyon olmadan mümkün kılan ve standart gaz kromatografisi iş akışlarıyla uyumlu kalan protokoller için metodolojik bir boşluk kalmaktadır.
Burada açıklanan protokol, bu boşluğu seyreltilmiş hidroklorik asit ve etil asetat kullanarak iki fazlı asit–çözücü ekstraksiyon stratejisi kullanarak kapatır. İş akışı, dışkı homojenizasyonu, asitlenme, organik çözücü bölmesi ve düşük sıcaklık santrifüjasyondan oluşur ve küçük dışkı girdi kütleleriyle çalışacak şekilde tasarlanmıştır. Ek kimyasal modifikasyon adımları veya özel numune hazırlama platformları gerektiren türev tabanlı iş akışlarının aksine, bu protokol standart laboratuvar ekipmanlarıyla rutin GC tabanlı analizle uyumlu formatta SCFA'ların doğrudan çıkarılmasınısağlar 2.
Bu yöntem, özellikle bireysel düzeyde ölçümler gerektiğinde veya örnek bulunabilirliği deneysel tasarımı kısıtladığında, sınırlı miktarda fare dışkısından SCFA ekstraksiyonu gerektiren çalışmalar için tasarlanmıştır. Dışkı örneklerinde yaygın SCFA'ların (C2–C6) GC tabanlı analizi için uygundur, ancak türevleşmeye bağlı tespit, GC hassasiyetinin ötesinde ultra-iz niceliklendirme veya sistemik SCFA konsantrasyonlarının değerlendirilmesi gerektiren uygulamalar için tasarlanmamıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, ABD'deki Hayvanlar Daimi Komitesi, kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için tasarlanmış önceki hayvan protokolünü onayladı. Bu protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergeleri ve düzenlemelerine uygundur. Bu el yazması, ARRIVE yönergelerine göre oluşturulmuştur. Protokol diyagramı Şekil 1'de gösterilmekte ve gerekli malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
Şekil 1: Protokol diyagramı. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
1. Dışkı örneği toplama ve hazırlama
- Ayrı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde taze dışkı (~30 mg) örnekleri toplayın. SCFA konsantrasyonlarının doğru normalizasyonu için her örnek için tam dışkı giriş kütlesini kaydedin.
NOT: Her örnek için temiz şişeler, eldivenler ve cımbız alındığından emin olun. Tüm cam eşyaları ve aletler kullanılmadan önce otomatik olarak kullanılmalıdır. Bu protokol, örnek başına yaklaşık 20–50 mg olan dışkı giriş kütleleri için doğrulanmış olup, ~30 mg temsili bir girdi olarak kullanılmıştır. Ekstraksiyon hacimleri bu aralıkta sabit tutulur. - Örneklere karşılık gelen gerekli sayıda santrifüj şişesini yerleştirin ve etiketleyin.
- Sulandırılmış hidroklorik asit (0,5 M; pH 1–2) ultrasaf suya yavaşça konsantre HCl (12 M, ACS reaktif derecesi) eklenerek hazırlanır.
DIKKAT: HCl aşındırıcıdır; Derde, gözlerde ve solunum yollarında ciddi yanıklara yol açabilir. Soluması tehlikeli. - Numuneleri oda sıcaklığında 30–45 dakika veya tamamen eritilene kadar eritin.
2. Numune homojenizasyonu ve asitleşme
- Her santrifüj şişesine 255 μL 0,5 M HCl çözeltisi ekleyin.
- Yeni bir şişe alıp cımbız temizlemek için %70 etanol ile doldurun. Cımbızları etanole batırarak temizleyin ve ardından temiz bir kağıt havluyla kurutun.
DIKKAT: Etanol yanıcıdır ve cilt ile gözleri tahriş edebilir; Buharların solulması baş dönmesine neden olabilir. - Pestle'ler için bir etanol banyosu kurun; bir kaba koyup kabı %70 etanol ile doldurun, tüm havalar tamamen suya batana kadar.
- Örnek kutusundan doğru örneği alın. Şişenin kapağını çıkarın ve bir örnek (~ 30 mg) dışkı çıkarın.
- Dışkı örneklerini ilgili santrifüj şişelerine yerleştirin.
- Tüm örnekler doğru santrifüj şişelerine yerleştirildikten sonra, etanol banyosundan bir havanı çıkarın. Havayı temiz bir kağıt havluyla kurutun.
NOT: Her örnek için yeni bir havacı kullanın. - Pestle'ları kullanarak dışkı örneklerini doğru şekilde ezip çözebilirsiniz, bkz. Şekil 2. Dışkı örneği, görünür katı parçalar olmadan görsel olarak homojen bir süspansiyon elde edilene kadar öğütülür.
Şekil 2: Dışkı örneklerinin bir tokma ile öğütülmesi. Taze toplanan dışkı, SCFA analizi için eşit bir kıvam sağlamak üzere öğütülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
- Kullanılmış havacıları daha sonra yıkanmak üzere boş bir kutuya koyun.
- Örnekleri, tüpler sıkıca kapalı şekilde maksimum hızda 10 saniye boyunca darbe tipi vorteks mikseri ile girdablandırın.
NOT: Santrifüj şişelerinin sıkıca kapalı olduğundan emin olun, böylece karışım dökülmesin.
3. SCFA ekstraksiyonu ve faz ayrımı
- Örnekleri 16.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle yapın, böylece santrifüjün doğru dengelenmesini sağlar.
- Santrifüj başlattıktan sonra, örneklere uygun yeni santrifüj şişelerini etiketleyin. Santrifüj tamamlandıktan sonra örnekleri santrifüjden çıkarın.
- 200 μL pipetini 120 μL'ye ayarlayın. Santrifüjlemeden sonra 120 μL sulu süpernatantı dikkatlice toplayın, böylece pelletin rahatsız edilmesini önleyin. Süpernatantı yeni etiketlenmiş santrifüj şişelerine aktarın ve pelleti atın.
- Yeni etiketlenmiş şişelere üst sıvı ile eşit miktarda (120 μL) etil asetat ekleyin. Bunu tüm örnekler için tekrarlayın.
DIKKAT: Etil asetat yanıcıdır ve cildi, gözleri ve solunum sistemini tahriş edebilir. Buhar solumaktan ve uzun süreli temastan kaçının. - Numuneleri tekrar santrifüja getirin. Santrifüjün düzgün dengeli olduğundan ve rotor kapağının güvenli olduğundan emin olun. 2.374 × g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca spin yapın.
- Santrifüjlemeden sonra, alt sulu faza zarar vermeden üst organik fazdan 120 μL dikkatlice toplayın. Ekstraksiyon edilen SCFA içeren süpernatantı yeni, etiketlenmiş santrifüj şişelerine aktarın.
NOT: Toplanan hacim 120 μL'den az olabilir. Arayüzde emülsiyon varsa, santrifüjasyonu uzatın veya örnekleri buz üzerinde soğutarak net faz ayrımı sağlanana kadar yapın. Dışkı materyali olmadan paralel işlenmiş prosedürel boş örnekler, reaktifler veya işlem yoluyla getirilen SCFA'ların arka plan seviyelerini değerlendirmek için isteğe bağlı bir kalite kontrol adımı olarak dahil edilebilir. - Alt katmanın yanlışlıkla çekilmediğinden emin olmak için önceki şişeleri inceleyin.
NOT: Asit ekleme ve organik çözücü işleme adımları hızla yapılmalı, tüpler mümkün olduğunca kapalı tutularak buharlaşma veya buharlaşma kayıplarını en aza indirmek için yapılmalıdır.
4. Çıkarma işleme ve depolama
- Bir ekstraksiyon kutusunu bulup doğru şekilde etiketleyin, ardından çıkarılan örnekleri içine yerleştirin.
NOT: Numuneler, organik faz toplama sonrası özetler sıkı kapalı tüplerde −20 °C'de 24 saate kadar saklanarak güvenli bir şekilde duraklatılabilir, ardından daha uzun süreli depolama için −80 °C'ye aktarılabilir. - Kutuyu -80 °C sıcaklıkta bir dondurucuya koyarak SCFA analizini bekleyin.
NOT: Hem etil asetat hem de SCFA yüksek uçucu olduğundan, ekstraksiyon edilen örnekler −80 °C'de depolandıktan hemen sonra analiz edilmelidir. Uzun süreli depolama örnek bütünlüğünü tehlikeye atabilir.
5. Gaz kromatografisi analizi
- Ekstraksiyon edilen SCFA'ları, hidrojen, hava ve azot için sırasıyla 30, 300 ve 20 mL/dakika akış hızlarında serbest yağ asidi sabit fazına sahip bir sıvı-silika kapiler kolonu kullanarak GC ile analiz edin. Analiz için organik ekstrakttan 1 μL aliquot enjekte edin.
- Kantsal uygulamalar için, daha önce açıklandığı gibi dahili standartlar ve kalibrasyon prosedürleri (örneğin, 2-etilbütirik asit) dahiledilmek üzere 2.
NOT: Detaylı enstrüman özel ayarlar, referans edilenyöntemler 14'te sağlanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki protokol, alındıkları dışkı örneklerinin sayısına karşılık gelen 120 μL'lik ekstra SCFA aliquotları vermiştir. Çıkarma protokolünün başarılı yürütülmesi, karakteristik tutma sürelerinde sinyal yoğunluğu arka plan gürültüsünün üzerinde belirgin şekilde çözülmüş SCFA zirvelerinin varlığıyla gösterilir. Tarif edildiği gibi uygulandığında, protokol numuneler arasında sonraki nicel karşılaştırma için uygun fekal SCFA profilleri sağlar. Sekiz SCFA'yı nicelikleştirdik: asetik asit, p...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, küçük hacimli fare dışkı örneklerinden SCFA'ların verimli ve tekrarlanabilir şekilde çıkarılmasını sağlayan birkaç kritik adım içerir. Protokol, SCFA'ların düşük moleküler ağırlıklı, zayıf organik asitler olarak fizikokimyasal özelliklerine göre özelleştirilmiş seyreltilmiş hidroklorik asit ve etil asetat hacimlerinde tanımlanmış hacimlerde iki fazlı asit-çözücü ekstraksiyon sistemi kullanır. Asitleşme, SCFA'ları protonlanmış formlarına dönüştürür; bu da fekal matriksle iyon...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Yiying Zhang'a verilen R21AG065606 ve R21AG08176 aracılığıyla bu çalışmaya sağlanan finansman desteğini, ayrıca Borten Ailesi Vakfı ve Tang Ailesi'nin Yiying Zhang'a yaptığı bağış desteğini minnettarlıkla takdir ediyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Santrifüj | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Mikrosantrifüj" |
| Santrifüj tüpleri | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mikrotüp Standı | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Etil asetat | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Sınıfı, ≥99.5% |
| Yeşil havaneli | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Sertifikalı (10 N, stok solüsyon); kullanım için 0.5 M'ye seyreltildi |
| 1000 μL pipet | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL pipet uçları | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Etanol | Fisher Scientific | BP82011 | Moleküler Biyoloji Sınıfı, %70 çözelti |
| 200 μL pipet | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL pipet uçları | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Cımbız | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vorteks | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Minyatür Vortex Mikseri, Mor Kupa" |
Kaynaklar
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
