Method Article

Fusesans İzleyicilerle Fare Diş Etili Epitelyal Bariyerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

DOI:

10.3791/70085

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, fırın diş eti epitel bariyerinin bütünlüğünü nicel olarak değerlendirmek için standart bir yaklaşım sağlamaktır; diş eti yüzeyine farklı moleküler boyutlarda floresans etiketli dekstransları in vivo uygulanarak ve ardından tek foton mikroskopi sistemiyle ex vivo görüntüleme uygulanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş eti epitelyal bariyer, ağız bağışıklığı ve homeostazda kritik bir ön savunma görevi görür. Sağlam bir epitel bariyer, zararlı maddelerin ağız ortamından girmesini etkili bir şekilde engellerken, bu sorunun bozulması, periodontit ve ağız liken planus gibi hastalıkların patogeneziyle yakından ilişkilidir. Burada, farelerde diş eti epitel bariyerinin bütünlüğünü değerlendirmek için topikal uygulamaya dayalı bir yöntem oluşturduk. İlk olarak, farklı moleküler ağırlıklara (40 veya 70 kDa) sahip floresan etiketli dekstransların karışımı, %2 sodyum karboksimetilselülozda molyar bölgenin labial diş yüzeyine topikal olarak uygulandı. 30 dakikalık kuluçka döneminden sonra, maksilla diseksiye edilip tek foton mikroskopi sistemi kullanılarak hemen görüntüleme için özel bir tutucuya sabitlendi. Bu yaklaşım, epitel katmanları boyunca farklı boyutlarda izleyicilerin görselleştirilmesi ve nicelendirilmesini sağlar ve ağız iltihabı, yara iyileşmesi ve hastalık modellemesi çalışmalarına uygulanabilir diş eti epitel bariyerinin işlevsel bir okumasını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş eti epitelyal bariyer, ağız boşluğunda kritik bir savunma arayüzü oluşturur; madde taşınımını seçici şekilde düzenleyerek doku bütünlüğünü korur ve mikrobiyalinvaziyanı önler. Sıkı bağlantı kompleksleriyle birbirine bağlı tabakalı skuamöz epitelden oluşan bu dinamik yapı, mikroorganizmaların, makromoleküllerin ve çözüntüğlerin seçici olmayan penetrasyonunu kısıtlamak için parasellüler geçirgenliği hassas şekildekontrol eder 2. Birçok faktör diş eti bariyerinin bütünlüğünü tehlikeye atabilir. Ağız boşluğu, insan vücudundaki en çeşitli ikinci mikrobiyal topluluğa ev sahipliği yapar; 700'den fazla bakteriyel türün diş yüzeylerini, diş etleri çatlaklarını ve ağızmukozasını kolonileştirerek 3,4. Diş eti dokularını kaplayan epitel hücreleri bu yoğun mikrobiyal ortama sürekli maruzkalır 5.

Periodontal patojenler (örneğin, Porphyromonas gingivalis) tarafından salgılanan virülans faktörlerin, lipopolisakkaritler de dahil olmak üzere, epitel bariyer fonksiyonunu bozduğu ve böylece diş eti dokularında iltihablı yanıtları tetiklediği ve patolojik ilerlemeyitetiklediği gösterilmiştir 6,7. İnflamatuar aracılar ve mekanik stres faktörleri, bariyer işlevsizliğini daha da kötüleştirerek ağız hastalıklarına yatkınlığıartırır 8. Oral probiyotikler, diş eti epitelyal bariyerinin stabilitesini teşvik ederek periodontal hastalığı önlemeye yardımcı olabilir. Buna rağmen, mikroorganizmalar ile diş eti epitel hücreleri arasındaki bariyer fonksiyonunu modüle etmekte biyolojik etkileşimler büyük ölçüde açıklanmamıştır. Bu nedenle, epitel bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için güvenilir yöntemlerin geliştirilmesi son derece önemlidir.

Yüksek çözünürlüklü ve yerleşik tespit sistemi ile tanınan tek fotonlu lazer taramalı mikroskopi, ex vivo doku örneklerinin incelenmesinde özellikle değerli olmuştur10. İleri görüntüleme yöntemleri, diş eti bariyeri özelliklerinin değerlendirilmesini önemli ölçüde iyileştirir. Diş eti dokularının yüzeysel yapısı, epitel hücrelerinin yüzeyden yaklaşık 100 μm yükseklikte bulunması, bu tür görüntüleme yaklaşımları için ideal bir tercih haline gelir. Araştırmamız, farklı moleküler ağırlıklara sahip floresans etiketli dekstransları parasellüler geçirgenlik izleyicileri olarak kullanan ex vivo bir değerlendirme tekniği oluşturmuştur. Tek fotonlu lazer taramalı mikroskopiyle birleşen bu yöntem, diş eti epitelyal bariyer fonksiyonunun doğru nicelendirilmesini sağlar ve periodontal hastalık mekanizmaları ile potansiyel terapötik müdahaleler hakkında içgörüler sağlar.

Bu çalışmada oluşturulan protokol, yerel jel bazlı iz bırakma ile üç boyutlu ex vivo görüntülemeyi birleştirmek, diş eti epitel bariyerini değerlendirmedeki benzersiz zorlukları ele almak için özel olarak optimize edilmiştir. Birincisi, mevcut intravenöz iz enjeksiyon yaklaşımları (Tablo 1), lokal küçük epitel bölgelerinin dış etkenlere geçirgenliğinikesin olarak değerlendiremiyor 11. İkinci olarak, geleneksel histolojik yaklaşımlar dekalsifikasyon ve kesitleme gerektirir; bu da doku mimarisini bozar ve emek yoğun ve zamanalıcıdır 12,13,14. Buna karşılık, protokolümüz karmaşık yerel yüzeyde etkili iz tutma sağlamak için yüksek yapışkan bir jel kullanır. Ayrıca, 3D görüntü sayesinde, iz izleyici penetrasyon derinliği ve diş eti epitelinde dağılımının kesin ve yıkıcı olmayan nicelendirilmesini sağlar ve böylece dokunun mekansal mimarisi tamamen korunur. Sonuç olarak, bu yöntem özellikle karmaşık ve sınırlı ağız ortamında diş epitelyal bariyer fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü uzaylı-zamansal değerlendirmesi için uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler, Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (NIH Yayın No. 85-23, revize 1996) uygun olmuştur. Süreç sırasında, deneysel hayvanlar acı ve rahatsızlıklarını en aza indirmek için özenle tedavi edildi.

Fare diş eti epitelinde in vivo geçirgenlik değerlendirmesi için yapılan her çalışma adımının detayları aşağıda açıklanmıştır (Şekil 1A). Burada, hem ligasyon hem de Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) kaynaklı fare periodontitis modellerinde epitel bariyer fonksiyonunun tespit edilmesine dair bir örnek sunduk. Tüm personel laboratuvar hayvan refahı ve aseptik teknik konularında kapsamlı eğitim aldı.

1. Hayvan yönetimi

  1. Çalışma boyunca, standart spesifik patojensiz (SPF) koşullarda 12 saat ışık/karanlık döngüyle evcil hayvanlar edinilir ve libitum olarak yiyecek ve su sağlanır.
  2. Anestezik ve izleyicilerin hazırlanması ve uygulanması
    1. Protokol boyunca steril koşulları koruyun ve aletleri %75 etanol ile temizlenmiş kullanın.
    2. Deney için 8-10 haftalık olgun yetişkin yaş grubunda erkek vahşi tip (WT) C57BL/6J fareleri kullanın. Fareleri üç gruba ayırın: bir kontrol grubu (tedavi edilmemiş) ve iki deneysel grup (ligasyon ve P. gingivalis kaynaklı fare periodontitleri modelleri).
      NOT: Gruplamada, benzer vücut ağırlığı ve haftalık yaşa sahip fareler seçilmelidir; böylece yaş ve ağırlığın diş eti epitelyal geçirgenliği üzerindeki etkisi azaltılmalıdır. Ligasyon kaynaklı ve P. gingivalis'e bağlı fare periodontitis modelleri, periodontitin yaygın olarak kullanılan fare modellerini temsil eder. Detaylı modelleme protokolleri için, ligasyon kaynaklı15 ve P. gingivalis kaynaklı 16 fare periodontitli modelleri üzerine literatürü inceleyebilirsiniz.
    3. Örtüşmeyen spektrumlara sahip floresan izleyicileri seçin, örneğin FITC etiketli dextran (40 kDa; FD40) ve rodamin B etiketli dekstran (70 kDa; RD70), karşılık gelen FITC ve rodamin filtreleriyle belirgin sinyal algılamasını sağlamak için kullanılır.
    4. İzleyicileri seyrelt. Bu protokolü takip etmek için, FD40 (1 g/L) ve RD70 (1 g/L) karışımını %2 karboksimetilselüloz jeliyle karıştırın ve 4 °C'de saklayın.
    5. Fareleri anestezi etmek için intraperitoneal olarak %1,25 tribromoetanol (200 mg/kg vücut ağırlığı, 15-17 μL/g vücut ağırlığı) enjekte edilir.
      NOT: Tribromoetanol çözeltileri ışığa duyarlıdır. Tert-amil alkol, yanıcı, uçucu ve tahriş edici organik bir çözücüdür. Hazırlık, kullanım ve uygulama ile ilgili tüm işlemler, kimyasal bir buhar davlumbazında veya aşırı iyi havalandırılan bir alanda, herhangi bir ateşleme kaynağından tamamen uzakta yapılmalıdır. Personel, eldivenler, kimyasal sıçrama gözlüğü ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymek zorundadır. Atık bertarafı: Atık tribromoetanol çözeltisi, tert-amil alkol ve tüm kirlenmiş malzemeler (örneğin şırıngalar, pipet uçları, eldivenler) kurumunuzun Çevre Sağlığı ve Güvenliği (EHS) yönetmelikleri ve protokollerine sıkı sıkıya uygun olarak tehlikeli kimyasal atık olarak toplanmalı ve bertaraf edilmelidir.
  3. Anestezi sırasında, geri besleme kontrollü ısıtma pediyle çekirdek vücut sıcaklığını 37 ± 0.5 °C arasında tutun. Kornea kurumasını önlemek için eritromisin göz merhemi uygulayın.
    NOT: Çalışma boyunca tüm hayvanlara uygun bakım sağlanır.
  4. Cerrahi işlemleri takip ederek, hayvanların tek sıcak ve sessiz bir iyileşme kafesinde tamamen ambulatör hale gelmesini sağlayın. Hayvanları günde iki kez, 48 saat boyunca izleyin ve ancak tam iyileşmeden sonra, normal duruş, aktivite ve beslenme davranışına göre ev kafesine yeniden yerleştirin.
  5. Ağız boşluğunu ağzı gagıyla açık tutun ve farklı moleküler ağırlıklara sahip iki veya daha fazla parasellüler geçirgenlik izleyicisinden oluşan 5 μL ile 50 μL arasında karışımı farklı moleküler ağırlıklara sahip bir karışımı molyar bölgenin labial diş yüzeyine uygulanır (Şekil 1B). 30 dakika bırakın. Hayvan karışımı yutarsa, tekrar uygulayın.
  6. Maksilla izolasyonu
    1. Geçirgenlik izleyicilerinin 30 dakika sürdüğünden sonra, fareleri karton üzerine sabitleyin, sırtüstü pozisyona yerleştirin ve uzuvlarını bantlayın.
    2. Fiksasyondan sonra ağız boşluğunu açarak maksillayı izole edersiniz. Çevredeki dokuları nazikçe temizleyin ve örneği PBS ile iyice durulayın.
    3. Maksillayı cam bir sürgü üzerine yerleştirin; modelleme kilini her iki tarafına yerleştirerek numunenin üzerine güvenli bir örtü montajı sağlanır.

2. Tek foton mikroskop kurulumu

  1. Diseksiyon edilen fare maksillasını özel tasarlanmış numune tutucuya dikkatlice yerleştirin, böylece görüntüleme için stabil bir konum sağlansın.
  2. 25×/NA 1.0 suya batma hedefiyle donatılmış dik tek foton mikroskop ile görüntü alın, maksillanın altındaki monte destek bölgesine odaklanın.
    NOT: İzleyici jel çıkarıldıktan hemen sonra floresans sinyalleri görünür olmalıdır.

3. Maksilla görüntüleme

  1. Maksilla içindeki ikinci azı daşının bukkal yüzeyinde ilgi çekici bölgeyi seçtikten sonra hemen görüntülemeye başlayın.
  2. Üç boyutlu (3D) yeniden yapılandırma için, maksilla diş yüzeyinden 100-200 μm derinliğe kadar 1 μm adım boyutunda Z-yığını görüntüleri alın.
  3. Maksillada epitel bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için Z serisi görüntüleme yapılabilir. Referans edilen yazılımda yazılım parametrelerini aşağıdaki şekilde yapılandırın:
    1. Dosya menüsünde yeni bir klasör oluşturun ve veri seti için tanımlayıcı bir isim atayın.
    2. Acquisition sekmesi altında, XY formatını 512 × 512 olarak 0.99 μm/piksel çözünürlükte ayarlayın.
    3. Zoom faktörünü 1'e ayarlayın.
    4. Uyarılma dalga boylarını 488 nm (FD40) ve 561 nm (RD70) olarak ayarlayın; emisyon pencereleri sırasıyla 500-550 nm ve 570-620 nm arasındadır.
      NOT: Kazanç değerleri sırasıyla 50 (488 nm) ve 60 (561 nm) olarak ayarlandı.
    5. Z serisi ve 3D görüntüleme için ND Acquisition modunu seçin. Z-step'i 1 μm olarak ayarlayın (gerekirse ayarlayın).
  4. Parametreler konfigure edildikten sonra, görüntüleme penceresinde hem bireysel hem de birleşmiş floresan kanallarında diş eti alanını görselleştirmek için Canlı modunu seçin.
  5. Parametre yapılandırmasından sonra edinmeye başlamak için Şimdi Çalıştır seçeneğine tıklayın.

4. Geçirgenlik ölçümü

  1. FD40 ve RD70'in floresans yoğunluğunu farklı kanallara böl. Arka plan çıkarma zorunluluğu yoktur; Z ekseni dilimlerini birleştirin. Sonra, geçirgenliği değerlendirmek ve epitel bariyer fonksiyonunu belirtmek için floresans yoğunluğunu hesaplamak için ImageJ yazılımını kullanın.
    1. Dosya seçeneğine tıklayın ve tek foton mikroskopu altında çekilen maksilla fotoğrafını açmak için Aç seçeneğini seçin.
    2. Görsel menüsüne gidin ve analiz için görüntü türünü 8-bit formatına değiştirin.
      NOT: Floresan mikroskopları ve konfokal sistemlerle alınan görüntüler genellikle RGB formatındadır ve floresans yoğunluğu ölçümü için doğrudan kullanılamaz. Bunlar ayrı kanallara bölünmeli veya tek renkli görseller doğrudan içe aktarılmalıdır.
    3. Analiz menüsünü açın, Ölçümleri Ayarlayın ve Alan, Ortalama ve IntDen'i kontrol edin. Onay için OK tuşuna tıklayın.
    4. Analiz edilecek kanalı seçin ve eşiği ayarlayın: Görüntü | Ayarlan | Eşik. Sistem, genellikle seçilmiş bölgeleri belirtmek için Kırmızı kullanan varsayılan değer ve algoritmayı otomatik olarak uygular.
      NOT: Floresan görüntüler genellikle siyah arka plana sahip olduğundan, Koyu Arka Plan seçeneğini de seçin.
    5. Ölçüm parametrelerini ayarlayın: Analiz et'e gidin ve Ölçümleri Set'i seçin. Diyalog kutusunda, Ortalama gri değeri ve Eşik ile sınır işaretlerini işaretleyin. Son olarak, Tamam'a tıklayın.
      NOT: Görüntü etiketini işaretlemek önerilir, böylece görüntü adı sonuçlar tablosunda görünsün, böylece deneysel grubu tanımlamak daha kolay olur.
    6. Ölçüm yapın: Serbest El Seçimleri aracını seçin. İmleci kullanarak diş eti dokusu tarafındaki floresan sinyal bölgesinin konturunu manuel ve hassas şekilde takip edin. Analiz Et'e tıklayın | Ölç. Sonuç tablosu görünecek, burada IntDen floresans yoğunluğunu temsil eder.
  2. Sonuçları hesaplamalar için bir elektronik tabloya kopyalayın ve grafik için içe aktarın.
  3. İlaçılı Flüoresans Yoğunluğunun Hesaplanması: İlk olarak, kontrol grubunun ortalama floresans yoğunluğunu hesaplayın. Sonra, her deneysel grubun floresans yoğunluk değerini kontrol grubu ortalamasına bölerek göreceli floresans yoğunluğunu elde edersiniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart protokole göre, diş dokularını içeren fare maksillası özel tasarlanmış bir tutucuya monte edilmiştir (Şekil 1C). Mikroskobik inceleme, diş eti etinde yeşil (FD40) ve kırmızı (FD70) floresan sinyalleri ortaya koydu ve epitel bariyeri boyunca iz geçiriciliği gösterdi. Göz merceğinin altındaki ilgi alanı belirlendikten sonra, yazılım kullanılarak görüntüler alındı. Kontrol grubunda, her iki floresan izleyici büyük ölçüde diş eti yüzeyiyle sınırlıydı. A...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş eti epitel, bakteriyel istilaya karşı temel bir fiziksel bariyer olarak hizmet ederken, ağız mikroorganizmaları ya virülans faktörleriyle bariyerin bütünlüğünü bozarak ya da korumasını teşvik ederek çift düzenleyici kapasite sergiler. Bu biyolojik etkileşimler nihayetinde doku homeostazını veya hastalık ilerlemesinibelirler 17,18. Bu temel üzerine inşa ederek, bu mekanizmaları daha fazla incelemek için yenilikçi bir metodoloj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklendi (32030010, 31972908, 81991500, 81991502 hibeleri).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40 kDa FITC-labeled dextranSigma Aldrich78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextranSigma AldrichR9379
Blunt tissue separation nickelBejinghuabo CompanyNZW28
karboksimetilselülozMREDAM049898
Tek kullanımlık steril şırıngaZhiyu Company1 mL
ImageJ yazılımıNational Institutes of Health
MikrotüplerAxygenMCT-150-C1.5 mL
NIS-Elements AR Görüntü YazılımıNikon
Fosfat tamponlu salin 1xServicebioG4207-500
Tek foton mikroskobu Nikon A1 MP+Nikon
Dokunun makasBejinghuabo CompanyM286-05

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Study on the protection of gingival epithelial barrier by interleukin-22 through regulating microbiota and E-cadherin expression. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 59 (7), 653-662 (2024).
  2. Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. J Dent Educ. 66 (4), 564-574 (2002).
  3. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  4. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
  5. Meyle, J., Chapple, I. Molecular aspects of the pathogenesis of periodontitis. Periodontol 2000. 69 (1), 7-17 (2015).
  6. Oriuchi, M., et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide damages mucosal barrier to promote gastritis-associated carcinogenesis. Dig Dis Sci. 69 (1), 95-111 (2024).
  7. Takeuchi, H., Nakamura, E., Yamaga, S., Amano, A. Porphyromonas gingivalis infection induces lipopolysaccharide and peptidoglycan penetration through gingival epithelium. Front Oral Health. 3, 845002(2022).
  8. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  9. Chatterjee, A., Bhattacharya, H., Kandwal, A. Probiotics in periodontal health and disease. J Indian Soc Periodontol. 15 (1), 23-28 (2011).
  10. Shin, D., et al. Photon-efficient imaging with a single-photon camera. Nat Commun. 7, 12046(2016).
  11. Yang, X., et al. Targeting endothelial tight junctions to predict and protect thoracic aortic aneurysm and dissection. Eur Heart J. 44 (14), 1248-1261 (2023).
  12. Cai, Y., et al. Foxf1 maintains endothelial barrier function and prevents edema after lung injury. Sci Signal. 9 (424), ra40(2016).
  13. Hou, A., Mohamed Ali, S., Png, E., Hunziker, W., Tong, L. Transglutaminase-2 is critical for corneal epithelial barrier function via positive regulation of claudin-1. Ocul Surf. 28, 155-164 (2023).
  14. Kitsuki, T., et al. Enhanced junctional epithelial permeability in trpv4-deficient mice. J Periodontal Res. 55 (1), 51-60 (2020).
  15. Chen, W., et al. Porphyromonas gingivalis impairs oral epithelial barrier through targeting grhl2. J Dent Res. 98 (10), 1150-1158 (2019).
  16. Lemaitre, M., et al. Periodontal tissue regeneration using syngeneic adipose-derived stromal cells in a mouse model. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 656-665 (2017).
  17. Takahashi, N., et al. Gingival epithelial barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7 (3), e1651158(2019).
  18. Ye, P., Chapple, C. C., Kumar, R. K., Hunter, N. Expression patterns of E-cadherin, involucrin, and connexin gap junction proteins in the lining epithelia of inflamed gingiva. J Pathol. 192 (1), 58-66 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Gingival Epithelial BarrierFluorescent TracersOral ImmunityBarrier IntegrityMouse GingivaSingle Photon MicroscopyDextran TracersOral InflammationWound HealingDisease Modeling

Related Articles