Tanshinone-IIA, IL-33/ST-2 sinyal değişiklikleriyle infarktüs sonrası miyokard fibrozunun zayıflamasını aracılı olarak sıçan epikardiyal yağ dokusunda değiştiriyor

Özet

Bu çalışma, Tanshinone IIA'nın (Tan IIA) muhtemelen IL-33/ST2 modülasyonu yoluyla miyokard sonrası enfarktüsü fibrozisi azalttığını göstermektedir; bu, hayvan modelleri ve moleküler kenetlenme ile gösterilmiştir ve ELISA ile Western Blot tarafından doğrulanmıştır.

Özet

Miyokard enfarktüsü (MI), koroner arter hastalığının ağır bir formu olup, genellikle kardiyak işlev bozukluğu ve kalp yetmezliğine önemli katkı sağlayan miyokardiyal fibrozla sonuçlanır. Epikardiyal yağ dokusu (EAT), kalp fonksiyonunun sitokin aracılı modülasyonu yoluyla kardiyovasküler patolojide giderek daha fazla rol oynamaktadır. Salvia miltiorrhiza'dan türetilen lipofilik bir bileşik olan Tanshinone IIA (TanIIA) anti-inflamatuar, antioksidan ve anti-fibrotik özellikler sergiler. Bu çalışma, TanIIA'nın MI sonrası miyokard fibrozisini zayıflatmadaki terapötik potansiyelini değerlendirmeyi ve in vivo deneyler ile in silico analizleri birleştiren bütünleyici bir yaklaşımla temel mekanizmalarını keşfetmeyi amaçladı. Bir fare MI modeli oluşturuldu ve interleukin-33/büyüme uyarısı gen 2 (IL-33/ST2) sinyal yolunun temel bileşenlerine TanIIA bağlanmasını değerlendirmek için moleküler kenetlenme uygulandı. Sonuçlarımız, TanIIA tedavisinin kalp fonksiyonunu önemli ölçüde artırdığını, histolojik hasarı azalttığını ve miyokardiyal fibrozu azalttığını, ayrıca serum seviyelerinde N-terminal pro-beyin natriüretik peptid (NT-proBNP) ve yüksek duyarlılıklı kardiyak troponin I (hs-cTnI) seviyelerinin azaldığını gösterdi. TanIIA ayrıca serum, miyokard ve EAT'deki inflamatuar yanıtları ve oksidatif stresi zayıflatmıştır. Mekanik olarak, TanIIA IL-33 ve ST2 ekspresyonunu aşağı regule etti, miyeloid farklılaşma faktörü 88 (MyD88)/nükleer faktör kappa-B (NF-κB) yolunu baskıladı ve dönüşümlü büyüme faktörü-β1 (TGF-β1) seviyelerini azalttı. In silico analizler, TanIIA'nın IL-33, ST2, MyD88 ve NF-κB p65 için güçlü bağlanma eğilimleri sergilediğini, ST2 için en stabil etkileşimin öngörüldüğünü ortaya koydu. Bu bulgular toplamda, TanIIA'nın EAT ile ilişkili iltihabı ve oksidatif stresi modüle ederek MI kaynaklı miyokard fibrozisini, muhtemelen IL-33/ST2 ekseninin çoklu hedefli inhibisyonu yoluyla hafiflettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, TanIIA'yı enfarktasyon sonrası miyokard fibrozisinin tedavisinde umut vadeden bir terapötik aday olarak desteklemektedir.

Giriş

Miyokard enfarktüsü, patolojik olarak uzun süren iskemi nedeniyle kardiyomiyosit ölümü olarak tanımlanır ve hayatı tehdit eden kardiyovasküler bir olay^{olarak devam eder 1}. Reperfüzyon stratejileri ve farmakoterapideki önemli ilerlemelere rağmen, MI dünya çapında hastalık ve ölüm nedenlerinden biri olmaya ^{devam etmektedir} 2,3,4,5,6. MI'nin önemli patofizyolojik etkilerinden biri, miyokard fibrozisidir; bu, ekstrasellüler matris proteinlerinin aşırı birikimidir ve sonraki olumsuz klinik sonuçların başlıca^{belirleyicisidir 7}. Bu fibrotik skar, ventrikül duvar yırtılmasını önlemek için hayati öneme sahip olmakla birlikte, genellikle karmaşık inflamatuar ve hücrelerarası sinyal yolları 5,7,8,9,10 tarafından başlatılan uyumsuz bir onarım sürecine dönüşür. Fonksiyonel miyokardiyumun yerine kasılmasız skar dokusu getirilerek, maladaptif fibroz artan ventriküler sertlik, ilerleyici kalp disfonksiyonu ve nihayetinde kalp^{yetmezliğine yol açar 9,11}. Bu nedenle, enfarktüs sonrası fibrozisi özellikle hedef alan ve hafifleyen yeni farmakolojik tedavilerin araştırılması, uzun vadeli hasta morbiditesi ve mortalitesini iyileştirmek için kritik bir terapötik hedeftir.

Salvia miltiorrhiza (Danshen), geleneksel bir Çin tıbbı ve çeşitli preparatları, kardiyovasküler hastalıkların yönetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Başlıca lipofilik bileşeni olan Tanshinone IIA, anti-aterosklerotik, anti-miyokardiyal iskemik ve antioksidan etkiler dahil olmak üzere birçok kardiyoprotektif etkiye^sahiptir 12,13,14,15. Mekanik olarak, TanIIA anti-inflamatuar ve anti-fibrotik etkilerini çeşitli sinyal yollarını^{modüle ederek uygular (}13,14,15,16,17). Özellikle, TanIIA'nın doğrudan adipositleri hedef aldığı, onların inflamatuar yanıtlarını bastırdığı ve böylece hücresel işlev bozukluğunu iyileştirdiği^{gösterilmiştir 18}. Ancak, TanIIA'nın bu koruyucu etkilerinin epikardiyal yağ dokusuna da yayılıp ulaşmadığı henüz netleşmeye hak kazanmamaktadır.

Epikardiyal yağ dokusu, benzersiz bir visseral yağ deposu olup, koroner arter hastalığı (CAD), atriyal fibrilasyon (AF) ve kalp yetmezliğinin patogenezinde güçlü bir rol oynar. Anatomik olarak miyokardiyum ile epikardiumun visseral tabakası arasında yer alan EAT, arada fasyal tabaka olmadan doğrudan parakrin iletişimi kolaylaştırır ve bitişik kardiyak^yapılar 19,20,21,22 ile doğrudan parakrin iletişimi sağlar. Fizyolojik durumunda, EAT kardiyoprotektif olup, metabolik destek sağlar ve anti-inflamatuar ve antioksidant^adipokinler 20,21,23,24,25,26 salgılar. Buna karşılık, patolojik durumlarda EAT, olumsuz kalp remodelasyonuna yol açan pro-inflamatuar, prooksidatif ve pro-fibrotik aracıların kaynağı^{haline gelir} 27,28,29,30. Sonuç olarak, TanIIA'nın epikardiyal yağdaki inflamatuar yanıtları ve oksidatif stresi zayıflatarak miyokard fibrozisini inhibiye edebileceği hipotezi formüle edildi; bu da potansiyel olarak yeni bir sinyal yolu yoluyla gerçekleşti.

IL-1^{sitokinler 31} familyasına ait olan interlökin-33, kardiyovasküler sistemde güçlü anti-hipertrofik ve anti-fibrotik özellikleriyle^{tanınır 25}. Biyolojik etkileri, iki izoformda bulunan ayrı bir reseptör kompleksi olan ST2 aracılığıyla aracılık edilir: sinyal başlatan bir transmembran reseptörü (ST2L) ve IL-33^32'yi tutan çözünür bir aldatıcı reseptör (sST2). Klinik olarak, serum sST2 seviyeleri miyokard enfarktüsü (MI) sonrası akut şekilde yükseltilmiş olup, kalp yetmezliği ve miyokarditte olumsuz sonuçlar için güçlü bir prognostik belirteç^{olarak hizmet vermektedir} 33,34,35,36. Kanonik IL-33/ST2L sinyal zinciri, adaptör protein MyD88'in işe alınmasını ve ardından TRAF6'nın aktivasyonunu içerir; bu da NF-κB inhibitörü (IκB)'nin fosforilasyonu ve bozulmasına, ardından NF-κB 37,38'in nükleer translokasyonuna yol açar. Bu yol, diğer önemli inflamatuar sitokinlerle karmaşık bir şekilde bağlantılıdır; örneğin, IL-33/MyD88 sinyalizasyonu, anti-inflamatuar sitokin IL-10^39'un salgılanmasını teşvik edebilirken, pro-inflamatuar sitokin TNF-α ise NF-κB'yi aktive ederek IL-33 ekspresyonunu ^40,41'i indükleyerek inflamatuar yanıtı artırabilir. Önemli olarak, hem IL-33 hem de ST2 yağ dokusunda eksprese edilir ve burada yerel anti-inflamatuar etkiler yarattıkları^{düşünülmektedir} 31,42,43. Ancak, TanIIA'nın kardiyoprotektif etkilerinin IL-33/ST2 ekseninin modülasyonunu içerip içermediği henüz araştırılmamıştır.

Bu nedenle, bu çalışma, TanIIA'nın IL-33/ST2 yolunun modülasyonu yoluyla epikardiyal yağ dokusundan kaynaklanan iltihap ve oksidatif stresi hafifleterek miyokard fibrozunu önlediği temel hipotezini test etmek için tasarlanmıştır. Özellikle, bu terapötik etkinin TanIIA'nın bu sinyal zincirindeki ana proteinlerle doğrudan çok hedefli etkileşimiyle yönlendirildiğini varsaydık. Bunu doğrulamak için çift yönlü bir yaklaşım benimsedik. İlk olarak, TanIIA'nın olumsuz kalp remodelasyonunu zayıflatmadaki in vivo etkinliğini doğrulamak için miyokard enfarktüsü fare modeli kullanıldı. İkinci olarak, bu gözlemlere doğrudan moleküler bir temel sağlamak amacıyla, TanIIA'nın yolun dört ana düğümüne—IL-33, ST2, MyD88 ve NF-κB p65—potansiyel bağlanmasını karakterize etmek için hesaplamalı kenetlenme kullanıldı. Bu çalışma, doku seviyesinden belirli moleküler bağlanma olaylarına kadar olan mekanizmayı inceleyerek, TanIIA'nın kardiyoprotektif etkileri için yeni bir mekanistik çerçeve oluşturmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler ve hayvan refahı uygulamaları, Jiangxi Çin Tıp Üniversitesi Etik Hayvan Komitesi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Etik Yönetmelikleri'ne sıkı sıkıya uygun şekilde yürütüldü (No. JZLLSC2023-0702), Çin'de bulundu.

Moleküler kenetlenme simülasyonları
TanIIA ile IL-33, ST2L, MyD88 ve NF-κB p65 arasındaki doğrudan etkileşimleri incelemek için in silico moleküler kenetlenme yaklaşımı uygulandı. TanIIA'nın 3D koordinatları PubChem veritabanından alındı ve ilk SDF dosyası daha sonra PDB formatına dönüştürüldü. IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) ve NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) kristal yapısı protein veri bankasından alınmıştır. Reseptörün ilk işlemesi PyMOL'da (v2.3.4) gerçekleştirildi; burada su molekülleri ve orijinal ligandlar çıkarıldı, ardından AutoDockTools'ta hidrojen ekleme ve yük ataması için ek hazırlık yapıldı. Her iki molekül de sonunda PDBQT formatına dönüştürüldü. AutoDock Vina (v1.1.2), aktif siteye merkezlenmiş tanımlanmış bir ızgara kutusunda kenetlenme simülasyonunu gerçekleştirmek için kullanıldı. Optimal bağlanma pozisyonu en düşük bağlanma enerjisine göre seçildi ve ayrıntılı etkileşimler PLIP web aracı kullanılarak belirlendi. Son kenetlenmiş konformasyon PyMOL (v2.3.4) kullanılarak görselleştirildi.

Hayvanlar
Erkek Sprague-Dawley (SD) fareleri, SPF sınıfı, 6 haftalık ve 200 ± 20g ağırlığında (sertifika numarası SCXK(Su)2023-0009). Fareler, 12 saatlik ışık/karanlık döngü ve 22 °C ile 2 °C arasında sıcaklık ± standart koşullar altında tutuldu. Deney sırasında hayvanlara hem yiyecek hem de suya sınırsız erişim izni verildi.

Deneysel protokol
Sol ön iniş (LAD) koroner arterinin bağlanmasıyla miyokard enfarktüsü için bir fare modeli oluşturuldu. Sahte ameliyat edilen fareler aynı cerrahi işlemleri LAD ligasyonu olmadan geçirdi. Kısa süreliğine, sıçanlar %1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edildi, ardından endotrakeal entübasyon ve ventilasyon yapıldı. Kalbi açığa çıkarmak için sol torakotomi yapıldı. LAD daha sonra 4-0 emilemez bir dikiş ile bağlandı. Başarılı MI indüksiyonu, sürekli elektrokardiyogramda ST-segment yükseltilmesi ve sol ventriküler ön duvarın görünür şekilde beyazlanması ile doğrulandı. Ameliyattan sonra, sıçanlara üç gün boyunca sefoxitin sodyum (200 mg/kg/gün, i.p.) verildi. Ameliyattan yirmi dört saat sonra, hayatta kalan fareler rastgele altı gruba (n = 10 grup başına yerleştirildi):

Sahte grup: intraperitoneal salin enjeksiyonları aldı (1 mL·^kg-1·^gün-1).

MI grubu: intraperitoneal salin enjeksiyonları aldı (1 mL·^kg-1·^gün-1).

TanIIA-L grubu (düşük doz): intraperitoneal TanIIA enjeksiyonları aldı (7.5 mg^·kg-1·^gün-1).

TanIIA-M grubu (orta doz): intraperitoneal TanIIA enjeksiyonları aldı (15 mg^·kg-1·^gün-1).

TanIIA-H grubu (yüksek doz): intraperitoneal TanIIA enjeksiyonları aldı (30 mg·^kg-1·^gün-1).

XST grubu (pozitif kontrol): oral dozda valsartan (30 mg^·kg-1·^gün-1) alındı.

Tüm tedaviler 28 gün ardışık olarak günlük olarak uygulandı. TanIIA ve XST dozları, önceki çalışmalar ve ön yayımlanmamış verilerimiz^44,45 temelinde seçildi.

Elektrokardiyogram (EKG) ve ekokardiyografi
28 günlük tedaviden sonra, kalp fonksiyonu transtorasik ekokardiyografi ile değerlendirildi. %2 izofloran anestezisi altında (hareket modu), sol ventriküler son diyastolik/sistolik çapları (LVIDd/s) belirlemek için M-mod görüntüleri alındı. Sol ventriküler ejeksiyon fraksiyonu (LVEF) ve fraksiyonel kısaltma (LVFS) daha sonra ortalama üç ardışık kardiyak döngüsünden hesaplandı. Ayrıca, ameliyat öncesi, ligasyon sonrası 15 dakika ve deneysel son noktada kardiyak elektriksel aktivite izlemek için elektrokardiyogramlar kaydedildi.

Örnekleme ve 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama
Karın aortundan gelen kan, 1370 × g ile 15 dakika boyunca santrifüjlenerek serum izole edildi ve serum -80 °C'de depolandı. Kalp ve epikardiyal yağ dokusu hızla çıkarılıp tartıldı. Moleküler analizler için, EAT ve enfarkt sınır bölgesi dokuları sıvı azotta snap-dondurularak -80 °C'de depolandı. Diğer doku örnekleri histolojik inceleme için %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Ayrıca, seçilen kalpler -20 °C'de donduruldu, kesitlendi ve enfarkt boyutunu değerlendirmek için TTC ile boyandı. Malzemeler ve hayvan dokuları laboratuvar güvenlik düzenlemelerine uygun olarak kullanılır ve işlenir.

Histolojik muayene
Histopatolojik değerlendirme için, parafin kesitlerine miyokard morfolojisi gözlemlenmek amacıyla hematoksilin ve eosin (H&E) boyama uygulandı. Masson'ın trikrom boyaması, miyokard fibrozisinin kapsamını ve epikardiyal adipositlerin boyutunu değerlendirmek için kullanıldı; kollajen hacim fraksiyonu (CVF) nicelendirildi. Ayrıca, infarktsız bölgede tip I ile tip III kollajen oranı picrosirius kırmızı (PSR) boyama ile belirlendi. Tüm bölümler nicel analiz için dijital olarak tarandı.

İmmünohistokimya
Parafinle gömülü miyokard kesitleri deparafinize edilip yeniden nemlendirilmiştir. Antijen alımı, sitrat tamponu (pH 6.0) kullanılarak gerçekleştirildi. Kesitler %3 BSA ile bloklandı, ardından 4 °C'de gece boyunca kolajen I, kolajen III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 ve TGF-β1 ile primer antikorlarla inkübe edildi. Daha sonra, bölümler HRP etiketli ikincil bir antikor ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. Boyama DAB ile görselleştirildi ve çekirdekler hematoksilin ile karşı boyandı. Görüntüler dijital tarayıcı kullanılarak yakalandı ve pozitif boyamanın entegre optik yoğunluğunu (IOD) nicelendirmek için görüntü analiz yazılımıyla analiz edildi.

Enzimle bağlantılı immünosorbent testi
hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 ve ST2 konsantrasyonları serum örneklerinde nicelendirildi. Ayrıca, serum, miyokard homojenatları ve epikardiyal yağ dokusu lizatlarında IL-10 ve TNF-α seviyeleri ölçüldü. Tüm testler, üreticinin protokollerine göre ticari olarak mevcut enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitleri kullanılarak gerçekleştirildi.

Western blotting
Toplam protein doku homojenatlarından çıkarıldı ve konsantrasyonlar bicinchoninic acid (BCA) testiyle belirlendi. Eşit miktarda protein, sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılarak poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarıldı. %5 yağsız sütle bloke edildikten sonra, membranlar gece boyunca 4 °C'de IL-10, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 ve GAPDH (1:1000) antikorlarıyla inkübe edildi. Daha sonra, zarlar HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikor (1:5000) ile kuluçka yapıldı ve ECL reaktifi kullanılarak görselleştirildi. Bant yoğunlukları yazılımla nicel olarak ölçüldü ve protein seviyeleri dahili kontrol olarak GAPDH'ye normalize edildi.

İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler tıbbi istatistik yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veri, ortalamanın ortalama ± standart hatası olarak sunulur. İki bağımsız grup arasındaki karşılaştırmalar için bir t-testi kullanıldı. Birden fazla grup durumunda, ya tek veya iki taraflı ANOVA ve ardından Tukey sonrası testi uygulanıyordu. Tüm analizler için P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Miyokard enfarktüsü olan sıçanlarda TanIIA'nın kalp fonksiyonu üzerindeki etkileri (Şekil 1)
Sağlık durumu ve vücut ağırlığı değişiklikleri: MI grubundaki fareler genel durumları kötüleşmiş, karın şişmesi ile devam ederken, TanIIA gruplarındaki fareler sağlık durumu iyileşmiş, artan yiyecek ve su tüketimi ile artan aktivite göstermiştir. 4 hafta sonra, TanIIA grubundaki fareler arasında MI grubundakilere ...

Tartışma

Bu çalışma, Miyokard enfarktüsü sonrası TanIIA'nın miyokard fibrozisi üzerindeki etkilerini ve bunun altında yatan mekanizmaları araştırmaktadır. Birincil bulgular şunlardır: (1) TanIIA, olumsuz kalp remodelasyonunu azaltır ve kardiyak fibrozisi inhibre ederek kalp fonksiyonunu iyileştirir. (2) TanIIA'nın, epikardiyal yağda inflamatuar yanıtları ve oksidatif stresi zayıflatarak miyokard fibrozisini inhibe ettiği bulunmuştur. (3) TanIIA, IL-33/ST2 sinyal yolu aracılığıyla antifibrotik etk...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BCA Protein Nicelik Kiti	Thermo Fisher Şirketi	PICPI23223
CAT kiti	Şanghay Enzim Bağlantı Biyoteknolojisi	202211202
Kolajen I antikor	Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd	GB114197
Kolajen III antikoru	Shenyang Wanleibio Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	WL03186
GAPDH antikoru	Hücre Sinyal Teknolojisi Şirketi	#5174
GraphPad Prizması	GraphPad Yazılım Şirketi	sürüm 9.0
GSH kiti	Şanghay Enzim Bağlantı Biyoteknolojisi	202211131
H& E boyama çözeltisi	Pekin Solarbio Teknoloji Şirketi, Ltd	H8070; G1100
HRP etiketli keçi anti-tavşan IgG antikoru	Pekin Solarbio Teknoloji Şirketi, Ltd	SE134
Hs-cTnI  Kit	Şanghay Yuanjie Biyoteknoloji A.Ş., Ltd	20220808
IL-10 antikoru	Shenyang Wanleibio Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	WL03088
IL-10  Kit	Şanghay Yuanjie Biyoteknoloji A.Ş., Ltd	202211172
IL-33  Kit	Şanghay Yuanjie Biyoteknoloji A.Ş., Ltd	202211192
IL-33 antikoru	Shenyang Wanleibio Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	WL04438
ImageJ yazılımı	Ulusal Sağlık Enstitüleri	versiyon Fiji
Image-Pro	Media Sibernetik, ABD	sürüm 6.0
Erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları	Jiangsu Jicui Yaokang Biyoteknoloji A., Ltd	SCXK(Su)2023-0009
Masson boyama kiti	Wuhan Bolf Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	20221218
MDA kiti	Şanghay Enzim Bağlantı Biyoteknolojisi	202211171
MyD88 antikoru	Shenyang Wanleibio Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	WL02494
NT-proBNP  Kit	Şanghay Yuanjie Biyoteknoloji A.Ş., Ltd	20220805
Nükleer faktör kappa-B(NF-κ B)(p65) antikor	Abmart Şirketi	TP56372
Open Babel	Açık kaynak kimya-formatik araç seti projesi	version 2.3.2
Poliviniliden florür (PVDF) zarları	Merck Millipore	R9M2784
PSR çözümü	Pekin Solarbio Teknoloji Şirketi, Ltd	G1472
SOD kiti	Şanghay Enzim Bağlantı Biyoteknolojisi	202211201
ST2 antikor	Proteintech Group Corporation	11920-1-AP
ST2 kiti	Şanghay Yuanjie Biyoteknoloji A.Ş., Ltd	202211183
İstatistiksel Ürün ve Hizmet Çözümleri (SPSS)	IBM Şirketi	sürüm 26.0
Sülfotanshinon Sodyum Enjeksiyonu	Şanghay İlaç İlk Biyokimyasal İlaç Şirketi, Ltd	2012303
Süper hassas ECL lüminesans reaktifi	Dalian Meilun Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	MA0186
TGF-β 1 antikor	ABclonal Corporation	A2124
Titanvin Valsartan Kapsülü	Hunan Qianjin Xiangjiang İlaç Şirketi, Ltd	211120
TNF-α   Kit	Şanghay Yuanjie Biyoteknoloji A.Ş., Ltd	202211202
TNF-α Antikor	Shenyang Wanleibio Biyoteknoloji Şirketi, Ltd	WL01581
TTC çözümü	Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd	20210620
Ultra yüksek çözünürlüklü küçük hayvan ultrason görüntüleme sistemi	VEVOcompany	Vevo 2100