Ultraviyole A-indüklenen cilt fotoyaşlanma modellerinde dönüşümlü büyüme faktörü beta 1/smad sinyalinin Honokiol düzenlenmesini inceleme protokolü

Özet

Bu protokol, honokiol'ün insan dermal fibroblastlarında ve fare derisinde UVA kaynaklı foto-yaşlanmayı, TGF-β1/Smad yolunu aktive ederek MMP ekspresyonunu azaltıp azaltmadığını araştırır.

Özet

Magnolia officinalis'ten türetilen önemli bir bileşen olan Honokiol (HNK), cilt hastalıklarını tedavi etme potansiyeline sahiptir. Şu anda, HNK'nin Ultraviyole A (UVA) kaynaklı ciltteki fotohasar üzerindeki etkisi ve etki mekanizması belirsizdir. UVA indüksiyonuyla HDF hücreleri ve tüysüz fare derisi için foto-yaşlanma hasar modeli oluşturuldu. HNK'nin normal HDF hücrelerinin ve UVA kaynaklı HDF hücrelerinin yaşamlılığı üzerindeki etkisi, Hücre yaşamlılık testi ile incelendi. HDF hücrelerindeki SOD, GSH, CAT ve MDA seviyeleri farklı kitlerle ölçüldü, ROS seviyeleri ise DCFH-DA ve Dihydroethidium kullanılarak ölçüldü. SA-β-galaktosidaz ve TUNEL boyama, HDF hücrelerinde yaşlanma ve apoptozu tespit etti ve akış sitometrisi hücre döngüsünün ilerlemesini değerlendirdi. Ciltteki histopatolojik hasar, patolojik boyama yoluyla değerlendirildi. Ayrıca, immünoflüoresans ve Western blot, Ki67, kollagen, matriks metalloproteinaz (MMP) ve TGF-β1/Smad yolu ilişkili protein seviyelerini değerlendirmek için kullanıldı. HNK (2,5-10 μM) tedavisi, normal HDF hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etki yaratmadı ancak UVA kaynaklı HDF hücre hasarını azaltarak oksidatif stresi ve apoptozu azalttı. UVA, HDF hücrelerinin yaşlanmasını tetikledi, S-faz durmasını indükledi, Ki67'yi azalttı, kolajen içeriğini azalttı ve MMP ekspresyonunu artırdı; HNK ise bu UVA kaynaklı anormallikleri etkili bir şekilde azalttı. Ayrıca, UVA fare derisinde daha derin kırışıklıklara, su ve kolajen içeriğinin azalmasına ve epitel kalınlığının artmasına neden olurken, HNK'nin deri altı enjeksiyonu cilt dokusundaki patolojik hasarı azaltmış ve su ile kolajen içeriğini artırmıştır. Ayrıca, HNK TGF-β1/Smad yolunu aktive etti ve TGF-β1 inhibitörü SB431542 HDF hücrelerinde foto-yaşlanma hasarına karşı HNK'nin koruyucu etkisini zayıflattı. Sonuç olarak, HNK, TGF-β1/Smad yolunun aktivasyonu yoluyla MMP ekspresyonunu azaltarak foto-yaşlanma hasarını azaltma potansiyeline sahiptir; böylece HDF hücrelerinde ve fare derisinde UVA kaynaklı foto-yaşlanmanı inhibe eder.

Giriş

Cilt yaşlanma süreci karmaşıktır ve iki ana forma ayrılır: doğal yaşlanma ve^{foto-yaşlanma 1}. Çalışmalar, cilt yaşlanmasının %80 ila %90'ının çevredeki dışsal faktörlerden (örneğin, ultraviyole ışınları, hava kirliliği) kaynaklandığını göstermektedir; bunların arasında uzun süreli ultraviyole radyasyonu kaynaklı foto-yaşlanma en ciddi^{etkilere sahiptir 2,3}. Ultraviyole radyasyon UVC, UVB ve UVA olarak ikiye ayrılır. UVC ozon tabakasını nüfuz edemediğinden, foto-yaşlanma üzerine yapılan güncel araştırmalar UVA (320-400 nm) ve UVB (280-320 nm)^4,5,6 üzerine odaklanmaktadır. UVB ile karşılaştırıldığında, UVA daha düşük enerjiye sahiptir, ancak daha nüfuz eder, epidermisten geçer ve dermisin derinlerine kadar ilerler; bu da ciddi cilt yaşlanmasının önemli bir^nedenidir. Önceki çalışmalar, HaCaT hücrelerine 57 mJ/^{cm 2} UVB ve 20 J/^{cm 2} UVA ışınının neden olduğu hasarın karşılaştırılabilir^{olduğunu göstermiştir 8}. Cilt foto-yaşlanması, cildin fonksiyonu ve yapısında değişikliklere yol açar; özellikle cilt yüzeyi dokusunun sarkması, kırışıklıkların derinleşmesi, kollajen kaybı ve çıplak gözle görülebilen gri cilt renginin ortaya çıkması şeklinde ortaya çıkar; Ağır vakalarda, çeşitli iyi huylu ve kanser önleyici lezyonlar ve tümörler meydana^{gelebilir 9,10}. Yaşlanma ve anti-aging üzerine yapılan araştırmaların artmasıyla birlikte, fotoyaşlanmanın sağlık riskleri dünya çapında en önemli sağlık sorunlarından biri haline gelmiştir. Bu nedenle, UVA kaynaklı foto-yaşlanma hasarının altında yatan patofizyolojik süreçlerin araştırılması ve tedavisi için yeni terapötik seçenekler geliştirilmesi çok önemlidir.

Magnolia officinalis'ten, geleneksel Çin tıbbi bitkisinden çıkarılan Honokiol (HNK), kimyasal formülü C₁₈H_{18O 2}¹¹ olan önemli bir biyoaktif bileşiktir. HNK çeşitli farmakolojik aktiviteler gösterir ve fenolik hidroksil grubu oksidasyona karşı yüksek hassastır; güçlü antioksidan ve serbest radikal toplama etkilerine sahiptir¹². Buna ek olarak, HNK'nin antibakteriyel, anti-inflamatuar, antiviral, antitümör, antidepresan, nöroprotektif ve anti-prematur yumurtalık yetmezliği farmakolojik^{etkileri vardır} 13,14,15,16. Oral HNK'nın hayvan çalışmaları ve klinik çalışmalarda esasen güvenli olduğu belirlenmiş ve herhangi bir belirgin yan etki tespit^{edilmemiştir} 17,18,19. Son çalışmalar, HNK'nin UVB kaynaklı cilt^{kanserini önlediğini ve} UVB kaynaklı cilt inflamatuar yanıtını ve DNA hipermetilasyonunu^{inhibe ettiğini ortaya koymuştur;} bu da cilt hastalıklarının tedavisinde potansiyel kullanımını önermektedir. Vitamin C ve resveratrol gibi yaygın kullanılan foto-yaşlanma karşıtı ajanlarla karşılaştırıldığında, HNK kendine özgü ve üstün özelliklere sahiptir: lipofil yapısı, hidrofilik C^{vitamini 22'den} daha iyi deri geçirgenliği sağlar; ve resveratrol^23'e göre daha yüksek fotostabilite ve in vivo biyoyararlanılım sergiler. Bu preklinik bulgular, HNK'nin ultraviyole kaynaklı cilt fotohasarına karşı cilt bakım ürünleri ve klinik müdahaleler için güvenli ve etkili bir translasyon potansiyeline sahip olduğu fikrini desteklemektedir. Ancak, HNK tedavisinin UVA'nın neden olduğu cilt foto-yaşlanma hasarı üzerindeki etkisi henüz bildirilmemiştir.

Dönüşüm büyüme faktörü-β1 (TGF-β1), hücre büyümesi ve gelişimi, doku onarımı ve yenilenmesi ile hücrelerin, dokuların ve organların büyümesi ve gelişimi için hayati öneme sahip çok fonksiyonlu bir^{sitokindir 24,25}. TGF-β1'in hücreye öncelikle Smad protein ailesinin üyeleri aracılığıyla sinyal verdiği ve bu da aşağı akış hedef genlerin transkripsiyonunun özel düzenlenmesine yol açtığı gösterilmiştir. TGF-β1 sinyalizasyonu aktive olduğunda, Smad2 ve Smad3 ^26,27'nin fosforilasyonuna yol açar. Son çalışmalar, TGF-β1/Smad yolu ile cilt fibrozisi ile foto-yaşlanma arasında güçlü bir bağlantı olduğunu^{göstermiştir 28,29}. Memelilerde hedef olan rapamisinin, sıçan deri dokularında TGF-β1/Smad yolunu aktive ettiği ve bunun da deri nemini korumak ve deri bariyerini korumak için önemli olan seramidlerin sentezini^{teşvik ettiği bildirilmiştir.} Özellikle, HNK'nin karaciğer yıldız hücrelerinde TGF-β1/Smad yolunu modüle ettiği ve bunun da karaciğer^{fibrozisi 31'i} iyileştirdiği bildirilmiştir. Bu nedenle, UVA kaynaklı foto-yaşlanma yaralanmasının hücresel ve fare modelleri oluşturuldu; HDF hücrelerinde 2,5–10 μM HNK tedavisi ve tüysüz farelerde 5 mg/kg veya 10 mg/kg HNK müdahalesi yapıldı; böylece HNK'nin foto-yaşlanma hasarı üzerindeki etkileri ve TGF-β1/Smad yolunun modülasyonunda potansiyel rolü araştırıldı. Bu çalışma, UVA kaynaklı cilt fotohasarı için yeni terapötik stratejiler geliştirmeyi amaçladı.

Protokol

Tüm hücre kültürü deneyleri, kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak ve Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) laboratuvar koşullarında gerçekleştirilmiştir. Hayvan deneyleri, Çin Halk Kurtuluş Ordusu Ortak Lojistik Destek Gücü 988. Hastanesi Hayvan Etik Komitesi'nin onayından sonra gerçekleştirildi (onay numarası: 2023-089).

Tüm deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve ulusal yönergelere sıkı şekilde uyarak gerçekleştirilmiştir. Deneyin sonunda, fareler sodyum pentobarbital aşırı dozuyla (100 mg/kg, intraperitoneal enjeksiyon) ötenazi edildi. Tüm çabalar barınma, tedavi ve örnekleme işlemlerinde hayvanların acısını en aza indirmek için gösterildi. Protokolde kullanılan reaktifler, kimyasallar, ekipman ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü ve işleme

1. Fibroblast kültür ortamında insan dermal fibroblastları (HDF) kültürlendirin. Kültürleri %5_CO2 içeren doygun nem ortamında 37 °C'de tutun.
2. Kültür ortamını her 3 günde bir değiştirin ve birleştiğinde HDF'yi 1:3 oranında geçiş yapın.
3. HDF'yi UVA lambalarıyla (emisyon spektrumu: 320-400 nm) 5 J/^cm2 dozda ışınlayın.
4. 30 dakikalık UVA ışınından hemen sonra taze ortamla yenileyin. UVA ışınlamasını günde bir kez 8 gün ardışık³² tekrarlayın.
5. HDF'yi 2.5, 5, 10, 20 veya 40 μM HNK ile 24 saat veya 48 saat boyunca doz tarama^{deneylerinde tedavi edin 33}. HDF'yi 24 saat boyunca 2.5, 5 veya 10 μM HNK ile tedavi edin, ardından sonraki deneylerde UVA ışını (5 J/^{cm 2}) uygulanır.
6. HDF'yi 4 saat boyunca 10 μM HNK'ye maruz bırakın, ardından 10 μM TGF-β1 inhibitörü SB431542 ile 24 saat kuluçka yapın ve son olarak HNK+SB431542 grubundaki UVA (5 J/^{cm 2}) ile ışınlanın.

2. Hücre yaşamlılık değerlendirmesi

1. HDF'yi 96 kuyu hücre kültür plakalarına 1×10⁴ hücre/kuyu yoğunluğunda aşılayın.
2. Farklı işlemlerden sonra, her kuyuya 10 μL suda çözünürken tetrazolyum tuzu reaktifi eklenerek her kuyu başına 100 μL nihai hacme ulaşır ve hücreleri 37°C'de karanlıkta 1,5 saat kuluçka altına alın.
3. Hücrelerin OD450 değerlerini mikroplaka okuyucu ile ölçün.

3. Süperoksit dismutaz (SOD), malondialdehit (MDA), katalaz (CAT) ve glutatyon (GSH) seviyelerinin belirlenmesi

1. HDF'yi 1 mL önceden soğutmalı PBS (0.01 M, pH 7.4) ile yıkayıp 200 μL SOD numune hazırlama çözeltisi (SOD Test Kit'inden) ekleyip hücreleri buzda 15 dakika boyunca lizleyin.
2. Lizat 8000 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edilir ve üst düzey analiz örneği olarak toplanır.
3. Süpernatantın protein konsantrasyonunu belirlemek için bir BCA (Bicinchoninic Acid) protein test kiti kullanın ve örneği 50 μL hacimde toplam 50 μg proteine ayarlayın.
4. 50 μg protein örneğini SOD test tamponu ile karıştırarak son reaksiyon hacmi 200 μL'ye ulaşın, karışımı 37 °C'de 30 dakika karanlıkta inkübe yapın ve ardından OD450 değerini ölçün.
5. SOD testinde kullanılan aynı hücre lizatat süpernatantını alın, ilgili test kitleriyle CAT, GSH ve MDA seviyelerini ölçün.

4. Hücresel ROS seviyelerinin ölçümü

1. HDF hücrelerini farklı koşullarda tedavi edin, 500 μL PBS ile iki kez durulayın ve 500 μL 10 μM reaktif oksijen türü floresan probuyla iyi karıştırın ve ışıktan 20 dakika uzakta 37 °C'de kuluçka yapın.
2. Oda sıcaklığında 1000 × g sıcaklıkta hücreleri toplamak için santrifüj yapın, ardından 500 μL PBS ile iki kez durulayın.
3. Hücreleri 500 μL hücre kültür ortamında yeniden askıya alın ve ardından boyama akış sitometrisiyle analiz edilir.
4. Akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak floresans yoğunluğunu kaydedin ve ardından daha yüksek ROS'un daha güçlü yeşil floresansla eşleştiği floresans yoğunluğuna göre ROS seviyelerini hesaplayın.

5. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-galaktosidaz) boyama

1. HDF'yi 1×10^{6 hücre/} kuyu yoğunluğunda 6 kuyu hücre kültür plakalarına tohum ekin ve yapışma noktasına kadar kültürleyin. Farklı tedavilerden sonra HDF'yi bir kez 2 mL PBS ile yıkayın.
2. Her kuyuya 1 mL β-galaktosidaz boyama sabitleyicisi ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında fiksatif ile 15 dakika kuluçka yapın.
3. Hücreleri 2 mL PBS ile 3 kez yıkayın, her kuyuya 1 mL boyama çalışma çözeltisi ekleyin ve ardından gece boyunca karanlıkta 37°C'de kuluçka yapın.
4. Hücreleri ışık mikroskobu ile gözlemleyin ve fotoğraflayın (yaşlanan hücreler mavi görünür).

6. Hücre döngüsü testi

1. HDF'yi 1×10 6 hücre/kuyu ile 6 kuyu plakalarına tohumlayın; farklı tedavilerden sonra hücreleri 2 mL PBS ile iki kez durulayın.
2. Oda sıcaklığında 1000 × g sıcaklıkta hücreleri toplamak için 5 dakika santrifüj yapın, 1 mL %70 etanol (hücre fiksator) ekleyin ve pipetle nazikçe karıştırın. Sabit hücreleri 4°C bir buzdolabına 12 saat koyun.
3. Hücre boyama çözeltisi için her numune için 500 μL propidium iyodid (PI, nihai konsantrasyon 50 μg/mL) ve RNaseA (nihai konsantrasyon 200 μg/mL) PBS ile karıştırılır. Hücreleri 500 μL boyama çözeltisine maruz bırakın, 37°C'de 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçka yapın.
4. Akış sitometrisi kullanarak floresans yoğunluğunu değerlendirin. Akış sitometresi kullanarak hücre döngüsü analizi yapın.

7. TUNEL boyama

1. Farklı tedavi gruplarından HDF hücrelerini %4 paraformaldehit içeren 1 mL ile maruz bırakın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
2. Hücrelere %0,3 Triton X-100 içeren 1 mL PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından 500 μL TUNEL testi çözeltisi damla olarak ekleyin ve hücreleri eşit şekilde kaplayın. Karanlıkta 37°C'de 1,5 saat kuluçka yapın.
4. Hücreleri kapatmak için 200 μL DAPI boyama çözeltisi ekleyin ve 25 °C'de ışıktan uzakta 10 dakika kuluçka yapın.
5. Hücreleri floresans sinyal koruma montaj ortamıyla mühürleyin, ardından floresans mikroskopuyla gözlemleyin ve fotoğraflayın (TUNEL-pozitif hücreler yeşil floresans gösterir).

8. İmmünofluoresans boyama

1. Farklı tedavi gruplarından HDF hücrelerini 12 kuyu plakalarına tohumlayın. Hücre yoğunluğu %50-60'a ulaştığında, hücreleri %4 paraformaldehit 1 mL ile maruz bırakın ve oda sıcaklığında 25 dakika kuluçka yapın.
2. Hücre yüzeyini engellemek için 1 mL %5 sığır serum albümini (BSA) damla olarak ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
3. 500 μL primer antikor Ki67 (1:300), kollajen I (1:100), matriks metalloproteinaz (MMP)-1 (1:50) veya MMP-3 (1:100) damlalı olarak eklenin ve gece boyunca 4°C'de kuluçka yapın.
4. Ertesi gün, hücreleri ışıktan 37°C uzakta 500 μL floressein izotiosiyanat (FITC) etiketli ikincil antikor (1:100) ile 1 saat boyunca kuluçka edin.
5. Hücreleri kapatmak için 200 μL DAPI boyama çözeltisi ekleyin, 10 dakika boyunca ışıktan uzak kuluçka yapın, floresan mikroskobu ile gözlemleyin ve görüntü analiz yazılımıyla analiz edin (kollajen I ve MMP-1 pozitif hücreler kırmızı floresans, Ki67 ve MMP-3 pozitif hücreler yeşil floresans gösterir).

9. ELISA

1. MMP-1 veya MMP-3 ELISA kit plakalarının kuyularına 100 μL HDF hücre kültürü süpernatantı eklenin ve 37°C'de 2 saat kuluçka yapın.
2. Kuyular 200 μL PBS ile 3 kez yıkan, ardından her kuyuya 100 μL ilgili antikor eklenip 37 °C sıcaklıkta 1 saat karanlıkta kuluçka yapın.
3. Kuyuyu, 200 μL yıkama tamponu ile (kit içinde sağlanmıştır) 3 kez durulayın, fazla çözeltiyi silkeledin ve örnekleri 100 μL streptavidin-HRP ile 30 dakika boyunca 37°C'de karanlıkta kuluçka yapın.
4. PBS ile durulama yaptıktan sonra, kit talimatlarına göre 100 μL substratlar A ve B ekleyin ve 37°C'de karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
5. 50 μL sonlandırma çözeltisi ekleyin, iyi karıştırın, mikroplaka okuyucu kullanarak_{OD 450} değerini değerlendirin ve konsantrasyonu hesaplayın.

10. Foto-yaşlanma hasarı fare model yapımında

1. SPF sınıfı dişi SKH1 tüysüz fareleri (15-20 g, 4-5 haftalık) 22 °C'de, %55-60 nemle ve özerk yiyecek ile suya erişim sağlar. Yiyecek kapları, su şişeleri ve içme pompaları dahil olmak üzere tesisleri düzenli olarak dezenfekte edin.
2. Kontrol grubuna (n=6) ve model grubuna (n=18) fareleri rastgele atanır. Model grup farelerinde UVA 0.35 J/^{cm 2} ile 8 hafta³⁴; UVA ışını olmadan aynı ortamda kontrol grubu fareleri ile aynı yerde kullan.
3. Model grup farelerini eşit olarak 3 alt gruba (n=6 tane) böl.
4. UVA ışınlanması sırasında (sırasıyla 5 mg/kg HNK grubu ve 10 mg/kg grupları olarak kayıt olarak, sırasıyla 5 mg/kg ve 10 mg/kg HNK grubu olarak kayıt olarak, haftada iki kez 100 μL hacimde 5 mg/kg veya 10 mg/kg HNK enjeksiyonları uygulanır). UVA ışınlaması sırasında üçüncü alt gruba haftada iki kez 100 μL salin enjeksiyonu uygulanır (UVA grubu olarak kayıt).
5. Başarılı modellemeden sonra cilt kırışıklığı oluşumunu ve su içeriğini^{değerlendirin 35}.
6. Fareleri intraperitonel olarak sodyum pentobarbital (100 mg/kg) ile ötenazi yapın ve ardından daha ileri deneyler için dorsal cilt dokuları toplayın.

11. Cilt kollajen I içeriğinin ölçümü

1. 50 mg fare sırt derisi dokusu toplayın, sıvı azotla iyice öğütün ve 500 μL önceden soğutulmuş RIPA liz tamponu ile 30 dakika buz üzerinde lizize edin.
2. Lizat 8000 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın, süpernatı toplayın ve üreticinin talimatlarına göre pro-kollajen I C peptid test kiti kullanarak kolajen içeriğini ölçün.

12. Hematoksilin ve eozin (HE) boyama

1. Fare derisi dokularını oda sıcaklığında 10 mL 4% paraformaldehit ile 24 saat sabitleyin, gradyanlı etanolde (%50%, %75, %95%100) kurtulun, parafine gömülüp 4 μm dilimlere kesin.
2. Dilimleri 65°C'de 8 saat pişirin, ksilende iki kez 10 dakika deparaffinize edin ve oda sıcaklığında gradyanlı etanolde yeniden nemlendirin.
3. Dilimleri hematoksilin çözeltisiyle 8 dakika boyay, 1 dakika akan musluk suyla durulayın, 30 saniye farklılaştırma çözeltisiyle fark ettirin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca eosin ile boyanın.
4. Lekeli dilimleri ksilen olarak şeffaf olan gradyan etanolde kurutun, montaj ortamıyla kapatın ve mikroskop altında gözlemleyin (Hücre çekirdeği mavi-mor görünürken, sitoplazma, kolajen lifleri ve eritrositler farklı derecelerde pembe görünür).

13. Masson boyama

1. Fare derisi dokularının parafinli kesitlerini Masson trikrom boyama kiti³⁶ ile boyamak. Parafin kesitlerini ksilenle iki kez, her biri 10 dakika boyunca deparafinize edin, Weigert demir hematoksilin boyama çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boya.
2. Asit etanol farklılaştırma çözeltisiyle 30 saniye ayırt edin, akan musluk suyla 5 dakika durulayın, ardından oda sıcaklığında damla damla Ponceau-fuchsin boyama çözeltisiyle 10 dakika boyayın. Masson'ın mavi çözeltisiyle ters mavilik yapın ve ardından 1 dakika boyunca damıtılmış suyla durulayın.
3. Zayıf bir asit çalışma çözeltisi damıtılmış su oranında hazırlanın: zayıf asit çözeltisi (kitte verilmiştir) = 2:1; 1 mL zayıf asit çalışma çözeltisini damla olarak ekleyin ve oda sıcaklığında 30 saniye yıkayın.
4. Fazla sıvıyı dök, 1 mL fosfomolibdik asit çözeltisi damla olarak ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tedavi edin. Zayıf asit çalışma çözeltisinden 1 mL damla olarak ekleyin, sonra 30 saniye yıkayın.
5. Fazla sıvıyı dökün, 1 mL anilin mavisi boyama çözeltisi damla ekleyin ve 1 dakika boyayın. 1 mL zayıf asit çalışma çözeltisini damla olarak ekleyin ve 30 saniye yıka.
6. %95 etanolde 2 saniye hızlıca kurut. Mutlak etanolde iki kez, her seferinde 10 saniye kurut.
7. Kuruduktan sonra bölümleri ksilenle temizleyin ve nötr sakızla monte edin. Her gruptaki kolajen liflerinin dağılımını mikroskop altında gözlemleyin (Kolajen lifleri mavi görünürken, kas lifleri, sitoplazma ve eritrositler parlak kırmızı, hücre çekirdekleri ise belirgin şekilde mavi-siyah görünür).

14. Cilt dokusu ROS seviyelerinin ölçümü

1. Fare derisi dokusunun donmuş bölümlerini (eksizyondan 1 saat içinde hazırlanmış) alın, 1 mL temizlik solüsyonunu tüm bölüm yüzeyine damla olarak yayın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
2. Yıkama çözeltisini silkele, ardından 1 mL 10 μM Reaktif oksijen türü probu damla olarak ekle, böylece bölümler eşit şekilde kaplanır; 37 °C sıcaklıkta ışıktan uzakta 30 dakika kuluçka yapın.
3. Bölümleri PBS ile iki kez durulayın, kapak kıvılcımları ekleyin ve floresans mikroskobu ile gözlemleyin (ROS pozitif alanlarda kırmızı floresans bulunur; ROS seviyesi ne kadar düşükse, kırmızı floresans sinyali o kadar zayıftır).

15. Biyokimyasal gösterge testi

1. Fare serumu toplayın ve ilgili test setlerinin talimatlarına göre tespit reaktifleri hazırlayın.
2. Fare serumunda aspartat transaminaz (AST) ve alanin transaminazın (ALT) aktivitelerini ilgili kitlerle ölçün.
3. Fare serumundaki kan üre azotu (BUN) ve kreatinin (CRE) seviyelerini ilgili kitlerle belirleyin.

16. Western Blot

1. 50 mg doku veya 1×10⁶ hücre toplayın, örnekleri 200 μL RIPA liz tamponu kullanarak 30 dakika boyunca buzda lizleyin ve proteinler elde edin.
2. 8000 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı toplayın. BCA protein konsantrasyon test kiti kullanarak hücreler ve dokularda protein içeriğini değerlendirin.
3. %12 SDS-PAGE jelinde örnek proteinlerin elektroforezi yapılması ve ayrılmış proteinlerin PVDF membranlarına 4 °C sıcaklıkta aktarılması.
4. PVDF membranlarını oda sıcaklığında %5 BSA ile 3 saat bloklayın. Zarları TBST ile (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl ve %0.1 Tween-20 içerir) 3 kez durulayın, ardından 4°C'de gece boyunca primer antikorlarla kuluçka yapın: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), kollajen I (1:1000), Cyclin A2 (1:500), Cyclin-dependent kinaz 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000) veya p-Smad3 (1:1000).
5. İkinci gün zarları TBST ile 3 kez yıkayın, ardından 1 mL keçi anti-tavşan IgG (1:10000) ile oda sıcaklığında 2 saat kuluçka yapın. Geliştirilmiş kemilyüminsans (ECL) reaktifinden 500 μL zarlara eşit şekilde uygulayın, ardından jel görüntüleme sistemiyle taran.
6. Görüntü analiz yazılımı kullanarak gri değer analizi yapın. Göreli ifade seviyesini, gri değerinin GAPDH'nin oranı olarak ifade edin.

17. İstatistiksel analiz

1. In vitro hücre tabanlı testlerde tüm deneyler bağımsız olarak üç kez tekrarlanır (n=3, biyolojik çoğaltmalar).
2. In vivo hayvan deneylerinde, her grup başına 6 fare dahil edilir (n=6), bu da laboratuvar hayvan refahı ve etik için 3R ilkelerine uygundur.
3. Tüm sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. Veri normalliği Shapiro-Wilk testi kullanılarak test edildi.
4. Normal dağılımlı veriler için, çoklu grup karşılaştırması için tek yönlü ANOVA kullanın, ardından gruplar arasında çiftli karşılaştırmalar için Tukey'nin post-hoc testi uygulanır. Normal dağılım olmayan veriler için, parametrik olmayan Kruskal-Wallis testini uygulayın. P< 0.05 önemli bir farkı gösterir.
5. Grafik yazılımı kullanarak grafikler oluşturun.

Sonuçlar

HNK, UVA nedeniyle HDF hücrelerinde oksidatif stres hasarını hafifleter
24 saat veya 48 saat boyunca çeşitli HNK tedavisinin HDF hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri, uygun konsantrasyon ve tedavi süresi için Hücre canlılığı testi ile incelendi. Sonuçlar, 2,5, 5 ve 10 μM HNK'nin 24 saat veya 48 saat tedaviden sonra normal HDF hücrelerinin canlılığını anlamlı şekilde etkilemediğini gösterdi ve bu dozlarda HNK'nin normal hücrelere toksik olmadığını gösterdi. Özell...

Tartışma

Ultraviyole ışık, hücrelere ve organizmalara zarar veren çevresel faktörlerden biridir. Önceki çalışmalar, UVA'nın yüksek nüfuz gücüne sahip olup, Dünya yüzeyine ulaşan ana ultraviyole ışığı türü^{olduğunu bildirmiştir 38}. Fibroblastlar dermiste önemli fonksiyonel hücrelerdir ve yaşlanmaları doğrudan veya dolaylı olarak cildin yaşlanmasına neden^{olabilir 39}. HDF hücre modelinde ve tüysüz fare modelinde UVA kaynaklı foto-yaşlanma hasarı, cilt f...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ALT aktivite test kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	P2711M	Alanin transaminaz aktivite tespit kiti
Amplex Red CRE test kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0291S	kreatinin tespit kiti
AntiFade montaj ortamı	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	P0126	floresans sinyal koruma montaj ortamı
AST aktivite test kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	P2715S	Aspartat transaminaz aktivite tespit kiti
BCA protein test kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	P0012	Protein konsantrasyonu belirleme kiti
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	V900933	özgül olmayan bağlanma için bloklama reaktifiyle
BUN Analiz Kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0574S	Kan üresi azotu tespit kiti
CAT Test Kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0051	Katalaz Aktivite Tespit Kiti
CCK-8 reaktifi	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	96992	Hücre canlılık testi çözeltisi suda çözünürken tetrazolyum tuzudur
CDK2 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	PA5-79024	CDK2 tespiti için birincil antikor
Kemimilüminesans ajan ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABD	HY-K1005	Geliştirilmiş kemilyüminesans tespit reaktüsü
Kolajen I antikor	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	PA1-26204	kollajen I tespiti için birincil antikor
Siklin A2 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	PA5-34682	Cyclin A2 tespiti için birincil antikor
DAPI boyama çözeltisi	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	D9542	Nükleer boyama boyası
DCFH-DA floresan prob	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABD	HY-D0940	Reaktif oksijen türleri floresan prob
Farklılaştırma çözümü	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	C0161'ler	Hematoksilin farklılaşma aşaması için reaktif
Dihidroethidyum probu	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0063	Reaktif oksijen türü probu
Fibroblast kültür ortamı	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Çin	SNPM-H342	Fibroblast büyümesi için tam kültür ortamı
FITC etiketli keçi anti-tavşan IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	F-2765	Floressein izotiosiyanat (FITC) ile işaretlenmiş ikincil antikor
Akış sitometrisi	BD biyobilim, San Jose, CA, ABD	BD FACSCaliburTM	Akış sitometresi
FlowJo yazılımı	BD biyobilim, San Jose, CA, ABD	v10.8	Akış Sitometrisi Analiz Yazılımı
Flüoresans mikroskobu	Leica, Heidelberg, Almanya	DM IL LIDERLIK ETTI	Floresans görüntüleme için mikroskop
GAPDH antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	PA1-987	Protein normalizasyonu için iç kontrol antikoru
Jel görüntüleme sistemi	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	iBright CL1500	Protein tespiti için görüntüleme sistemi
keçi karşıtı tavşan IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	31460	İmmünodetectivasyon için ikincil antikor
Graphpad Prism 9.0 yazılımı	GraphPad Software, San Diego, CA, ABD	Prism 9.0	Grafik yazılımı
GSH Test Kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0053	Glutatyon İçerik Tespit Kiti
HE boyama kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	C0105S	doku morfoloji analizi için histolojik boyama kiti
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABD	HY-N0003	Honokiol, biyoaktif bileşik
İnsan dermal fibroblastları	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Çin	SNP-H342	birincil insan cilt fibroblast hücreleri
IBM SPSS Statistics 26.0 yazılımı	IBM Corporation, Armonk, NY, ABD	IBM SPSS İstatistikleri 26.0	İstatistiksel analiz yazılımı
ImageJ yazılımı	Wayne Rasband, ABD Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü	Sürüm 1.54H	Görüntü analiz yazılımı
Ki67 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	MA5-14520	Hücre proliferasyon belirteci tespiti için birincil antikor
Işık mikroskobu	Leica, Heidelberg, Almanya	DM3000	Parlak alan görüntüleme için optik mikroskop
Masson trikrom boyama kiti	Solarbio, Pekin, Çin	G1340	Kolajen ve bağ dokusu boyama kiti
MDA Test Kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0131S	Malondialdehit seviye tespit kiti (lipid peroksidasyon belirteci)
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD	1410101	Hücre tabanlı testler için soğurma ölçüm cihazı
MMP-1 antikor	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	PA5-27210	Matriks metalloproteinaz-1 tespit için birincil antikor
MMP-1 ELISA kiti	Enzimle Bağlantılı Biyoteknoloji, Şanghay, Çin	ml038199	MMP-1'in biyolojik örneklerde nicel tespiti
MMP-3 antikor	Abcam, Cambridge, MA, ABD	AB52915	matriks metalloproteinaz-3 algısı için birincil antikor
MMP-3 ELISA kiti	Enzimle Bağlantılı Biyoteknoloji, Şanghay, Çin	ml105322	MMP-3'ün biyolojik örneklerde nicel tespiti
Nötr sakız	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	C0173	montaj ortamı
P16 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	PA5-20379	P16 proteini tespiti için birincil antikor
P21 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	MA5-14949	P21 proteini tespiti için birincil antikor
P53 antikoru	Abcam, Cambridge, MA, ABD	AB131442	P53 proteini tespiti için birincil antikor
paraformaldehit	Solarbio, Pekin, Çin	P1110	hücre ve doku fiksasyon reaktifi
PI	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	ST512	Hücre döngüsü analizinde DNA boyama için propidium iyodid
Pro-kollajen I C peptid test kiti	TAKARA, Tokyo, Japonya	MK101	Kolajen Sentezi Tespit Kiti
p-Smad2 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	44-244G	fosforile Smad2 tespiti için birincil antikor
p-Smad3 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	44-246G	fosforile Smad3 tespiti için birincil antikor
PVDF zarları	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	88520	Western blotting için protein transfer zarı
RIPA liz tamponu	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	P0013B	Hücre ve doku lizatları için protein ekstraksiyon tamponu
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	ST579	DNA boyama sırasında RNA çıkarılması için ribonükleaz
SA-β-galaktosidaz boyama kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	C0602	Hücresel Yaşlanma Tespit Kiti
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, ABD	HY-10431	TGF-β 1 Sinyal Yolu Engelleyicisi
SDS-PAGE jelleri	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	WG1403BX10	Protein elektroforezi için poliakrilamid jeller
SKH1 tüysüz fareler	Vitalriver, Pekin, Çin		Cilt foto-yaşlanma çalışmaları için hayvan modeli
Smad2 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	51-1300	Smad2 tespiti için birincil antikor
Smad3 antikoru	Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD	51-1500	Smad3 tespiti için birincil antikor
SOD Analiz Kiti	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	S0101S	Süperoksit dismutaz aktivite tespit kiti
TGF-β 1 antikor	Abcam, Cambridge, MA, ABD	AB215715	TGF-&beta için birincil antikor; 1 Tespit
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	X-100	Hücre zarı geçirimliliği için iyonik olmayan deterjan
TUNEL testi çözümü	Beyotime Biotechnology, Şanghay, Çin	C1086	DNA parçalanması için apoptoz tespit reaktifi
Ksilen	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD	247642	doku deparafinizasyonu için organik çözücü