Yöntem makalesi

Fare Embriyolarından Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin İzolasyonu ve Kültürü

244 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70101

⸱

17 Nisan 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory Lille Neuroendocrinology, Lille Neuroscience & Cognition, University of Lille, Inserm, CHU Lille

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Fare embriyolarından beyaz ve kahverengi preadiositlerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunuyoruz; adiposit soyu bağlılığı ve farklılaşmasını yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları disseksiye etmek için güçlü bir in vitro strateji oluşturuyoruz ve yağ dokusu gelişiminin etkisini araştırmak için bir çerçeve sağlıyoruz.

Özet

Yağ dokusu, metabolik homeostazda merkezi bir rol oynar ve özellikleri, embriyonik gelişim sırasında adiposit farklılaşması yoluyla şekillenir. Bu nedenle, embriyonik preadipositler, yağ dokusu oluşumundaki erken olayları ve soy tanımını incelemek için uygun bir modeldir. Bu makale, embriyonik gün 15.5'te (E15.5) fare embriyolarından izole edilen beyaz ve kahverengi preadipositlerin izolasyonu ve in vitro farklılaşması için tekrarlanabilir bir protokolü tanımlar; bu aşamada yağ depoları oluşmaya başlamaktadır. Yöntem, hücre yaşamını ve adipogenik olgunlaşmayı destekleyen doku mikrodiseksiyonu, enzimatik sindirim, birincil kültür ve soy-sığıra özgü farklılaşma koşulları için ayrıntılı rehberlik sağlar. Temsil eden sonuçlar arasında lipid damlacık birikimi ve soy-soyuna bağlı belirteç ekspresyonu yer almakta olup, tanımlanmış kültür koşullarında başarılı farklılaşmayı doğrulamaktadır. Bu yaklaşımla, embriyonik preadipositler beyaz veya kahverengi adiposit kaderlerine yönlendirilebilir; böylece gelişimsel zamanlama, soy özellikleri ve gen ifade profillerinin karşılaştırmalı analizleri mümkün olur. Bu protokol, kontrollü deneysel ortamda yağ dokusu oluşumu ve perinatal programlama mekanizmalarını incelemek için pratik ve gelişimsel açıdan önemli bir araç sunar.

Giriş

Yağ dokusu, enerji depolama, endokrin sinyal ve adaptif termogenezi düzenleyerek tüm vücut homeostazını korumada merkezi bir rol oynar ve hem lokal hem de uzakorganlarla yoğun şekilde etkileşimde bulunur 1,2,3. İki ana yağ dokusu türü ayırt edilebilir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT); bunlar hücresel soy, fizyolojik fonksiyon, anatomik dağılım ve metabolik aktivite açısından belirgin şekilde farklılıkgösterir 4.

WAT, organizmanın birincil enerji rezervuarını oluşturur. Beyaz adipositler, lipid depolamada son derece uzmanlaşmıştır ve sitoplazmik alanın çoğunu kaplayan tek bir büyük lipid damlasının (LD) varlığıylakarakterize edilir 5. Buna karşılık, BAT titremeyen termogenez konusunda uzmanlaşmıştır. Kahverengi adipositler birden fazla küçük LD içerir ve yüksek mitokondriyalyoğunluk gösterir 3,6. BAT'ın termojenik kapasitesi, membran boyunca proton sızıntısını kolaylaştıran iç mitokondriyal membran proteini olan Uncoupling Protein 1 (UCP1)'e dayanır 7. ATP sentezinden oksidatif fosforilasyonu ayırarak, UCP1 proton gradyanını ısı olarak dağıtır ve böylece vücutsıcaklığının 8'in korunmasına katkıda bulunur. Çeşitli rolleri göz önüne alındığında, WAT ve BAT sadece metabolik hastalıklarda ana düzenleyiciler ve potansiyel terapötik hedefler olarak değil, aynı zamanda gelişimsel ve evrimsel biyoloji, immünoloji ve yaşlanma alanlarında da karmaşık ve geniş kapsamlı sistemik etkileşimlerisayesinde önemli ilgi çekmiştir 9,10. Biriken kanıtlar ayrıca, fetal metabolik programlamanın yağ dokusu gelişimiyle yakından ilişkili olduğunu göstermektedir; çünkü intrauterin ortamdaki bozulmalar adiosit sayısını, dağılımını ve fonksiyonunu etkileyebilir ve böylece bireyleri ilerleyen yaşamlarda obezite ve metabolik hastalıklara yatkınhale getirebilir.

Yağ dokusu biyolojisini araştırmak için olgun adipositlerin bulunabilirliği çok önemlidir. In vitro kültür sistemleri, adipogenez ve adiposit fonksiyonunu etkileyen spesifik faktörlerin değerlendirilmesine olanak tanıyan kontrollü bir ortam sağlar. Yetişkin farelerden veya yenidoğan yavrulardan adipositlerin izolasyonu ve farklılaşması için çeşitli protokolleroluşturulmuştur (12,13,14,15). Ancak, bu adiposit öncülerleri, gelişim sırasında yağ dokularına yol açan orijinal hücre popülasyonlarından farklı olabilir. Farelerde, BAT depoları embriyogenez sırasında ilk gelişen depolardır ve yeni doğanlara doğum sonrası soğuk adaptasyonu için kritik olan titremeyen termojenik kapasite sağlar. Kahverengi adipositlerin depoları, interskaküler bölgede embriyonik gün 14.5 (E14.5)16 gibi erken bir tarihte tespit edilebilir. LD'ler E15.5'te oluşmaya başlar ve UCP1 ifadesi E16.5 civarında başlar. Fare embriyosunda, inguinal WAT (iWAT) preadipositleri de buaşamada zaten mevcuttur 16.

Burada tanımlanan protokol, E15.5'te izole edilmiş preadipositlere odaklanır. Bu aşama, progenitor hücrelerin in vivo16 farklılaşmaya başladığı embriyonik döneme karşılık gelir ve böylece WAT ve BAT'in oluşumunu sağlayan birincil öncülleri temsil eder. Buna karşılık, yetişkin veya yenidoğan evrelerinde izole edilen adipojenik öncüler, çevresel faktörlerden etkilenmiş olabilir ve muhtemelen daha sınırlı plastisiteler sergileyebilirler. Bu nedenle, E15.5'te embriyonik öncüllerin kullanılması, in vivo adipogenik programı sadık şekilde tekrarlamayı artırır; çünkü bu hücreler yüksek gelişimsel plastisite derecesini korur ve fizyolojik farklılaşma yollarını takip etmeye daha yatkındır. Bu yaklaşım, özellikle çevresel faktörlerin perinatal dönemde preadiosit farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için gelişimsel biyolojisi soruları için özellikle ilgi çekicidir ve erken yaşam maruziyetinin yağ dokusu gelişimini ve uzun vadeli metabolik sonuçları nasıl şekillendirebileceğini incelemek için değerli bir model sunar. Ancak, kullanıcılar bu aşama özgüllüğüne dikkat etmelidir: yöntem E15.5 embriyoları için optimize edilmiştir ve embriyon yaşı veya diseksiyon hassasiyetindeki sapmalar hücre verimini veya canlılığını etkileyebilir. Ayrıca, mikrodiseksiyon tekniği, özellikle embriyonik depoların küçük boyutu göz önüne alındığında, yağsız dokularla kontaminasyondan kaçınmak için pratik gerektirir. Bu protokol, embriyonik preadipositlerin olgun brown ve beyaz adipositlere ayırılması, kültürlenmesi, amplifikasyonu ve ayırt edilmesi için yapılan tüm adımları ve prosedürleri özetlemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan işlemleri, yerel düzenlemelere ve 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Konseyi Direktifi (2010/63/EU) tarafından tanımlanan yönergeler uyarınca yapıldı (APAFIS#2617-2015110517317420).

Tüm biyolojik atıklar ve enzimatik çözeltiler, biyo-tehlikeli maddeler için kurumsal biyogüvenlik yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak ele alınmalı ve bertaraf edilmelidir. Özellikle:
- Biyolojik atık: onaylı biyolojik tehlike kaplarında toplanır ve otoklavlama yoluyla veya kurumun biyogüvenlik ofisinin talimatına göre bertaraf edilir.
- Enzimatik çözeltiler: %10 çamaşır suyu eklenerek kalıntı enzimatik aktiviteyi 30 dakika boyunca etkisiz hale getirin ve yerel düzenlemelere uygun olarak kimyasal atık olarak bertaraf edilir.
- Kirlenmiş tüketim maddeleri (pipet uçları, tüpler vb.): biyolojik tehlike torbalarına yerleştirilin ve bertaraf edilmeden önce otoklav edin.
- Fiksasyon reaktifleri: tehlikeli kimyasal atık olarak belirlenmiş kaplarda bertaraf edilir.

Atıklarla çalışırken her zaman uygun PPE giyin.

1. Fare embriyolarının hasadı

  1. Hamile fareleri (C57Bl/6J) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak ötenazi edin.
  2. Hamile farelerin karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin ve rahmi açığa çıkarmak için orta hat kesiti yapın.
  3. Karın boşluğunu keserek embriyoları içeren sarı keselerini E15.5 seviyesinde çıkarın ve bunları soğuk (4 °C) 1x PBS içeren bir agaroz kutusuna yerleştirin.
  4. Her sarı kesesinin dış zarını ve plasentayı çıkarın ve embriyoların göbek bağını kesin.
  5. Embriyoları, içinde soğuk 1x PBS içeren yeni bir agaroz kutusuna yerleştirin.
    NOT: Bilinçli ağrı algısının altında yatan merkezi sinir sistemi yapıları bu gebelik aşamasında tam olarak gelişmemiş olsa da, periferik nosiseptörler E13 ile E15 arasında oluşmaya başlar. Kurumsal hayvan bakım rehberlerine uygun olarak, olası nosiseptif yanıtları en aza indirmek için, embriyoların herhangi bir deneysel manipülasyondan önce kafasının kesilmesiyle ötenazi edilmesini öneriyoruz.

2. Embriyonik yağ dokularının diseksiyonu (Şekil 1)

  1. Skaküler BAT'ın diseksiyonu (Şekil 1A)
    1. %5 agaroz plakasından bir dikdörtgen kesin ve embriyoyu içine yerleştirerek immobilize edin. Tabağı soğuk 1x PBS ile doldur. Embriyoyu içeren agaroz kutusunu dürbün mikroskopu altına yerleştirin.
    2. Embriyonun arkasındaki deriyi çıkarın.
    3. İnce forseps ve mikromakasla interskaküler BAT'ı disseksiye.
    4. BAT'ı çevredeki dokudan (bağ dokusu ve kas) dikkatlice mikromakas kullanarak ayırarak yaklaşık 4–6 mm x 2–3 mm ölçülerinde bir BAT örneği alın.
    5. BAT'ı, 1 mL soğuk (4 °C) Dulbecco's Modified Eagle Medium/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12) glutamin ve 100 U/mL penisilin ve streptomisin (P/S) içeren 2 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  2. iWAT'ın diseksiyonu (Şekil 1B)
    1. Embriyoyu agararoz plakasına yan yatarak (bir tarafa, sonra diğer tarafa) yerleştirin.
    2. iWAT'ı ince forseps ve mikromakasla diseksiye edin.
    3. iWAT'ı çevre dokudan (bağ dokusu ve deri) dikkatlice ayırın, yaklaşık 2–4 mm x 0,5–0,8 mm ölçülerinde iki depo oluşana kadar.
    4. İki WAT örneğini, 1 mL soğuk DMEM/F-12 glutamin içeren 2 mL tüpte 100 U/mL penisilin/streptomisin (P/S) yerleştirin.
      NOT: Tüm diseksiyonlar, mümkün olan en steril ortamda, önceden dezenfekte edilmiş aletlerle dürbün mikroskopu altında yapılmalıdır.

3. Yağ dokularının sindirimi

  1. DMEM/F12'yi pipetle çıkarın ve tüplere 200 μL DMEM/F12 glutamin, 100 U/mL P/S, %0,2 SıĞıR SERUM ALBÜMINI (BSA), 0,5 U kollagenaz D ve 0,5 U Dispase II ekleyin.
  2. Tüplerdeki dokuları mikromakasla keserek doku parçalarını mümkün olduğunca azaltın ve sindirim sürecine yardımcı olmak için 10 kat yukarı aşağı pipet yapın.
    NOT: Tam sindirilmiş örnekler, görünür doku kümeleri olmadan bulanık bir süspansiyon şeklinde görünmelidir.
  3. 37 °C'de (su banyosunda) 15 dakika kuluçka yapın.
  4. Reaksiyonu durdurun; 600 μL soğuk DMEM/F-12 glutamin ile 100 U/mL P/S, %20 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Pipetleri 10 kez yukarı ve aşağı doğru eşit şekilde yeniden askıya alın.

4. Birincil hücre kültürü

NOT: Bu adımdan itibaren, tüm işlemler kirlenmeyi önlemek için Biyolojik Güvenlik Dolabında (BSC) sıkı steril koşullar altında yapılmalıdır. Steril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük giyin; sterilliği koruyun ve potansiyel tehlikelere karşı korunun. Steril tek kullanımlık plastik ürünler, aseptik teknik kullanın ve tüm reaktivlerin ve ortamların steril olduğundan emin olun. Kontaminasyonu önlemek için steril olmayan yüzeylerle temas etmekten kaçının.

  1. Hücreleri kuyuyu slaytlarına kaplamak ve standart koşullarda (37 °C, %5CO2) 1 saat kuluçka yapın; 8 kuyruklu plakalar için 200 μL/well koyun. İnkubasyondan sonra, mikroskop altında gözlem yaparken plakayı nazikçe hareket ettirerek hücrelerin yapıştığını doğrulayın.
    NOT: Bu aşamada, farklı BAT veya WAT örnekleri tek bir tüpte toplanarak farklı kuyulardan homojenleştirilmiş kültürler elde edilebilir (örneğin, bir tedavinin benzer kültürler üzerindeki etkisini test etmek için).
  2. Ortamı önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F-12 glutamin ile değiştirin ve 100 U/mL P/S, %10 FBS ile hücreleri gece boyunca 37 °C, %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.
    NOT: Ortam değiştirildiğinde, parçalanamamış ölü/bağlanmamış hücreler ve doku parçaları çıkarılır, geriye sadece bağlı hücreler kalır.
  3. Farklılaşma tedavisi (72 saat)
    1. Kahverengi adiposit farklılaşması için, ortamı önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F-12 glutamin ile 100 U/mL P/S, %10 FBS, 125 NM indometasin, 0,5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), 1 nM triiodothironin (T3), 1 μM Rosiglitazon, 1 μM deksametazon ve 850 nM insülin ile değiştirin ve 72 saat boyunca 37 °C, %5CO2 inkübe yapın.
    2. Beyaz adiposit farklılaşması için, önceden ısıtılmış DMEM/F-12 glutamin ile ortamı değiştirin; 100 U/mL P/S, %10 FBS, 0.5 MM IBMX, 1 μM deksametazon ve 850 nM insülin ile 37 °C, %5CO2 ile 72 saat kuluçka yapın.
  4. Bakım tedavisi (her 48 saatte bir)
    1. Önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F-12 glutamin ile ortamı değiştirin; 100 U/mL P/S, %10 FBS, 1 NM T3, 1 μM Roziglitazone ve 850 nM insülin içerir. Aracı her 48 saatte bir yenileyin.
      NOT: Listelenen tüm konsantrasyonlar, reaktiflerin nihai çalışma yoğunluklarına atıfta bulunur. İşlenecek kuyu sayısına göre son farklılaştırma ve bakım ortamı hacimlerini, 8 kuyu plakaları için standart hacim olarak 200 μL kullanarak ayarlayın.

5. Fiksasyon ve immünboyama (Şekil 2A)

  1. Ortamı aspire edin ve hücreleri soğuk 1x PBS ile yıkayın.
  2. Hücreleri 1x PBS'de soğuk 4% formaldehit ile 10 dakika boyunca sabitleyin.
  3. Hücreleri 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıka.
  4. Hücreleri %0,1 Triton ile 1x PBS ile 10 dakika geçirin.
  5. Hücreleri 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıka.
  6. Oda sıcaklığında (RT) 1x PBS ile %5 normal eşek serumu (NDS) ile belirsiz bölgeleri 1 saat boyunca bloklayın.
    NOT: Bloke edici serum için tür seçimi, ikincil antikorların üretildiği türe bağlıdır.
  7. Birincil antikorları %5 NDS ile 1x PBS içinde gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Kuyulardan birine birincil antikor eklemeyin—bu negatif kontrol olarak hizmet eder.
  8. Hücreleri 1x PBS ile 2 x 5 dakika boyunca yıkayın.
  9. Hücreleri %5 NDS ile 1x PBS'de 5 dakika boyunca yıkayın.
  10. İkincil antikorlar, DAPI ve Bodipy ile RT'de 1 saat boyunca kuluçka, ışıktan korumak için örtülü olarak kuluçka yapın.
  11. Kuyular 1x PBS ile 3 x 5 dakika boyunca yıkayın.
  12. Görüntüler alınana kadar hücreleri karanlıkta 4 °C'de tutun.

6. Preadipositlerin kriyokonservasyonu

NOT: Kültürü durdurup hücreleri farklılaşma sürecinden önce veya sonra dondurarak depolamak ve sonraki hücre kültürleri için yeniden kullanmak mümkündür.

  1. Dondurma ortamı hazırlayın: %50 FBS, %40 DMEM/F-12 glutamin, 100 U/mL P/S, %10 Dimetil Sülfoksit (DMSO).
    DIKKAT: DMSO tehlikeli bir kimyasaldır. Cilt ve göz tahriş edicidir, diğer toksik maddelerin ciltten emilmesini kolaylaştırabilir ve solulursa veya yutulduğunda zarar verebilir. DMSO'yu BSC içinde her zaman ele alın, maruziyet ve kontaminasyonu en aza indirin. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin (steril eldivenler, laboratuvar önlüğü ve teması önlemek için koruyucu gözlükler). Cilt temasından kaçının. Temas durumunda hemen bol suyla yıkayın. DMSO'yu kullanılmadığında BSC içinde sıkı kapalı bir kapta saklayın ve laboratuvar güvenlik protokollerine uygun şekilde bertaraf edilmesini sağlayın.
  2. Hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) 1x PBS ile yıkayın.
  3. Hücreleri kimyasal olarak ayırmak için önceden ısıtılmış (%37 °C) %0,05 tripsin ekleyin ve 37 °C'de, %5CO2'de 5 dakika kuluçka yapın. Hücre ayrılmasını mikroskop altında görsel olarak kontrol edin.
  4. Reaksiyonu durdurun; önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F-12 glutamin hacmini 3 kat artırarak 100 U/mL P/S, %10 FBS ile ekleyin. Eşit şekilde tekrar askıya alın.
  5. RT'de 7 dakika santrifüj yapın, 300 × g ve süpernatantı atın.
  6. Hücreleri 10 mL dondurucu ortamda yeniden süzülür. RT'de 7 dakika santrifüj yapın, 300 × g ve süpernatantı atarak yaklaşık 3 mL kalın.
    NOT: Saydıktan sonra toplam hücre sayısını hesaplamak için tam hacmi ölçün.
  7. Küçük bir hacmi Trypan Blue ile 1:2 oranında seyreldin ve canlı hücreleri Neubauer odası ile sayın.
  8. Dondurma ortamında hacmi ayarlayarak 5 × 104 – 1 × 105 hücre/şişe (son hacim: 1 mL/şişe) elde edin.
  9. Şişeleri dondurucu bir kaba aktarın (soğuma hızı: -1 °C/dakika) ve gece boyunca -80 °C'de saklayın.
  10. Uzun süreli depolama için sıvı azota aktarılır.
    NOT: Bu protokol, çözüldükten sonra %90'ın üzerinde canlılık sağlar.
  11. Hücreleri gerektiğinde şişeleri 37 °C su banyosunda hızla eriterek eritebilirsiniz.
  12. Şişe içeriğini 4 mL önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F-12 glutamin ile 100 U/mL P/S, %10 FBS ile aktarın. Yavaşça 10 kez yukarı ve aşağı pipetle dengeli şekilde yeniden süsleyin. Gece boyunca 37 °C, %5CO2 sıcaklıkta kuluçka yapın.
  13. Ortamı taze DMEM/F-12 glutamin ile değiştirin, 100 U/mL P/S, % 10 FBS ve her 48 saatte bir yenileyin.
    NOT: DMSO kalıntılarını çıkarmak için bu madde değişikliği kritik öneme sahiptir, çünkü uzun süreli maruz kalma hücre canlılığını, farklılaşmasını ve işlevini tehlikeye atabilir. Sitotoksik etkileri önlemek için tam ortam değişimi sağlanır.
  14. %80 birleşmeye ulaştıklarında deneylere veya geçiş hücrelerine devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1'de gösterildiği gibi, sağlam BAT ve iWAT depoları E15.5 seviyesinde embriyolardan verimli şekilde izole edilebilir. BAT E15.5 embriyolarında kolayca tespit edilebilirken, iWAT'ı tespit etmek eğitim gerektirebilir. Her iki durumda da, diğer hücre tiplerinin kültürlenmesini önlemek için kaba diseksiyondan sonra çevredeki tüm dokuların mikrodiseksiyonu gereklidir.

Beyaz ve kahverengi preadipositlerin sindirim ve kültürünün ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Preadiposit kültürü çeşitli deneysel bağlamlarda kapsamlı şekilde tanımlanmıştır. Ancak, mevcut protokoller ağırlıklı olarak yetişkin dokulara veya embriyonik fibroblastlara dayanmakta olup, embriyonik preadipositlerin doğrudan gelişmekte olan yağ dokularından izole edilmesi ve kültürlenmesi için standart yöntemler mevcut değildir. Bu hücrelerin incelenmesi özellikle önemlidir, çünkü onlar kendi doğan embriyonik mikro ortamlarında yaşayan özgün preadiosit popülasyonlarını temsil ederler....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Christian Duhem'e tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Fransız Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden (INSERM) destek alıyoruz. M.C-M, ANR-23-CE13-0044 tarafından desteklendi. M.A, Avrupa Genomik Diyabet Enstitüsü (EGID, ANR-10-LABX-0046), Diyabette Hassas Tıp Ulusal Merkezi (PreciDIAB, ANR-18-IBHU-0001) ve Hauts-de-France Bölge Konseyi (22005973) tarafından desteklendi. Şekil 2 BioRender'da oluşturulmuştur. Mayeuf-louchart, A. (2026) https://BioRender.com/3pbzif1. SB, ANR-24-CHBS-0002 hibe ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3,5,3'-triiodothyronineSigma709719T3
3-izobütil-1-metilksantin SigmaI7018IBMX
AgaroseSigmaA0169
AlkolVWR1.59010.0500
Anti-UCP1 antikorAbcamAB10983
Dürbün mikroskobuLeica  MZ9.5
Biyolojik güvenlik kabiniTermo Bilimsel51022482BSC, HeraSafe KS Sınıf II Emniyet Kabini
BodipyInvitrogenD3922Uyarılma/Emisyon 493/504 nm
Sığır serum albüminiEuromedex04-100-812-CBSA
SantrifüjEppendorf5430 R
KelepçelerFST (Almanya Paslanmaz Savunucu)
Kollagenaz DSigma11088882001
KriyotüplerSarstedt72.379
Kültür plakaları (8-kuyusu)Ibidi 80826
Kültür plakaları (12 kuyuyu)Corning CostarCLS3513polistiren plaka, düz taban, steril
DeksametazonSigmaD2915
Dispase IISigma4942078001
DMEM/F12Gibco31331Glutamin eklendi
DMSOSigmaD2438
Eşek anti-tavşan antikoruInvitrogenA32795Alexa Fluo Plus 647
Eppendorfs 1,5 mLEppendorf15625367
FBSGibcoA5256701
Formaldehit %37Termo Bilimsel119690010
Dondurma kapıTermo Bilimsel  5100-0001
Hoechst InvitrogenH3570
Kuluçka makinesiTermo Bilimsel50116048Heracell 150i CO2 kuluçka makinesi
IndometasinSigmaI7378
İnsülinSigmaI9278
  10× ile donatılmış ters mikroskop; Nesnel ve halojen aydınlatmaCarl Zeiss Axio Vert.A1
Fare C57BL/6JCharles Nehri
MikromakasFST (Almanya Paslanmaz Savunucu)
NDSSigmaD9663
Neubauer OdasıTermo Bilimsel10195580
PBS 10xGibco14200
PBS 1xGibco14190
Penisin/StreptomisinGibco15140-122
Petri kaplarıSarstedt83.3902
qPCR plakalarıTermo BilimselAB-0600
Fabp4 için qPCR probuTermo Bilimsel4331182TaqMan testleri Mm00445878_m1
Pparg için qPCR probuTermo Bilimsel4331182TaqMan testleri, Mm00440940_m1
UCP-1 için qPCR probuTermo Bilimsel4331182TaqMan testleri, Mm01244861_m1
Ters transkripsiyon kiti Termo Bilimsel4368813Yüksek kapasiteli cDNA kiti
RNA çıkarma kitiOmega Bio-TekR6934-02E.Z.N.A. Toplam RNA Kiti II
Roziglitazon,SigmaR2408
Triton X-100Termo BilimselA16046
Trypan MavisiSigmaT8154
Tripsin-EDTAGibco25300054
Su banyosuGrantSAP12 12 L kapasite

Kaynaklar

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444 (7121), 847-853 (2006).
  2. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (6), 2548-2556 (2004).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Bouchekioua, A., Pourquié, O., Mayeuf-Louchart, A. In vitro differentiation of beige/brown adipocytes for the treatment of metabolic diseases. Adipose Tissue Homeostasis in Health and Disease. IntechOpen. , (2024).
  5. Fischer-Posovszky, P., Newell, F. S., Wabitsch, M., Tornqvist, H. E. Human SGBS cells - a unique tool for studies of human fat cell biology. Obes Facts. 1 (4), 184-189 (2008).
  6. Mayeuf-Louchart, A., Duez, H. From glycogen to lipid droplet: an intimate connection in the brown adipocyte. Med Sci (Paris). 36 (6-7), 577-579 (2020).
  7. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  8. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  9. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  10. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  11. Merkestein, M., et al. Programming of adipose tissue function: an evolutionary perspective. Mamm Genome. 25 (9-10), 413-423 (2014).
  12. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. J Vis Exp. (162), e61610(2020).
  13. Curtin, M. C., Jackson, A. E., Hilgendorf, K. I. Isolation and culturing of primary murine adipocytes from lean and obese mice. J Vis Exp. (215), e67846(2025).
  14. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio Protoc. 11 (24), e4265(2021).
  15. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. J Vis Exp. (167), e62005(2021).
  16. Mayeuf-Louchart, A., et al. Glycogen dynamics drives lipid droplet biogenesis during brown adipocyte differentiation. Cell Rep. 29 (6), 1410-1418.e6 (2019).
  17. Herbers, E., et al. Preventing white adipocyte browning during differentiation in vitro: the effect of differentiation protocols on metabolic and mitochondrial phenotypes. Stem Cells Int. 2022, 3308194(2022).
  18. Yau, W. W., et al. Thyroid hormone (T3) stimulates brown adipose tissue activation via mitochondrial biogenesis and MTOR-mediated mitophagy. Autophagy. 15 (1), 131-150 (2019).
  19. Zekri, Y., et al. Brown adipocytes local response to thyroid hormone is required for adaptive thermogenesis in adult male mice. eLife. 11, e81996(2022).
  20. Smolińska, K., et al. Targeting fatty acid-binding protein 4: a therapeutic intersection of obesity and cancer via lipid metabolism. Prog Lipid Res. 100, 101353(2025).
  21. Cero, C., et al. Standardized in vitro models of human adipose tissue reveal metabolic flexibility in brown adipocyte thermogenesis. Endocrinology. 164 (12), bqad161(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beyaz PreadipositlerAdipoz DokuEmbriyonik Geli imAdiposit DiferansiyasyonuDoku MikrodissectionEnzimatik SindirimPrimer K lt rSoy Belirleme
Video yakında

İlgili makaleler