Yöntem makalesi

Sandell-Kolthoff Reaksiyonu Kullanılarak İnsan Karaciğer Mikrozomlarında Deiodinaz 1 Aktivitesinin Kolorimetrik Değerlendirmesi

671 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70104

⸱

10 Nisan 2026

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Sandell-Kolthoff reaksiyonunu kullanarak insan karaciğer mikrozomlarındaki kimyasalların Deiodinaz 1 (DIO1) aktivitesi üzerindeki etkisini güvenilir şekilde değerlendirmek için kolorimetrik bir yöntemi tanımlar. Önceden tanımlanmış kabul kriterleri ve istatistiksel performans metriklerini içerir ve OECD test rehberlerine dahil edilmesi için devam eden çabaları destekler.

Özet

Bu yöntem, DIO1 aktivitesini engelleyen ve böylece tiroid hormonu homeostazını engelleyebilen test maddelerinin tanımlanmasını sağlar. Sunulan protokol, insan karaciğer mikrozomlarında Deiodinaz 1'in (DIO1) enzimatik etkinliği üzerindeki test maddelerinin etkilerini değerlendirmek için radyoaktif olmayan, kolorimetrik bir yöntemi tanımlar. Test, ters triiodotironin (rT3)'nin diiodotironine (T2) deiodinasyonu sırasında serbest bırakılan iyoditi niceleyen Sandell-Kolthoff (SK) reaksiyonuna dayanır. Sarı serium (IV), iyodid varlığında renksiz serium (III) haline indirgenir ve 415 nm'de fotometrik algılama mümkün olur. Bu standart kurulumda, seryum (IV) konsantrasyonu, tanımlanan koşullarda sinyal kararlılığını ve dayanıklılığını artırmak için 40 mM olarak ayarlanmıştır. Test güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için kapsamlı bir kontrol sistemi dahildir: 6-propil-2-tiourasil (referans öğe), aurothioglikoz (pozitif kontrol), 1-tio-β-D-glukoz sodyum tuzu (negatif kontrol) ve %1 dimetil sülfoksit (çözücü kontrol). Protokol, uygun test konsantrasyonlarını belirlemek için menzil bulma testi, mikrozom partisine özgü iyod salınım aktivitesinin standartlaştırılması ve mikrozom yokluğunda yapılandırılmış kimyasal girişim testi ile DTT'ye bağlı artefaktları belirlemek için ditiothreitol (DTT) olmadan isteğe bağlı bir takip değerlendirmesini içerir. DIO1-SK testi, orta ve yüksek verimli tarama ve mekanik toksikoloji çalışmaları için uygundur. Sağlamlığı, ölçeklenebilirliği ve insan mikrozomlarına uygulanabilirliği, endokrin bozulmalarını araştırmak için değerli bir araç haline getirir. Bu protokol, düzenleyici doğrulama çabalarını destekler.

Giriş

Endokrin bozucular (ED'ler), hormonal düzenlemeyi engelleyen ve bu nedenle insanlarda olumsuz etkilere yol açankimyasallardır 1,2. Deiyodinazlar (DIO), membranla ilişkili enzimlerdir ve aktif bölgelerinde selenosistein önemli bir kalıntıdır. Bu enzim ailesi, dolaşımdaki tiroid hormonu (TH) konsantrasyonlarını birlikte modüle eden ve hücreler içindeki dokuya özgü erişilebilirliklerini düzenleyen üç ayrı izoformdan (DIO1, DIO2 ve DIO3) oluşur. Prohormon olarak hizmet veren tiroksin (T4) ve aktif formu olan triiodotironin (T3), vücutta enerji harcaması, büyüme, gelişim süreçleri ve termoregülasyonun düzenlenmesinde hayati rolleroynar 4. DIO izoformları, deiyodin saha özgüllüğü, kinetik özellikleri ve substrat tercihleri açısındanfarklılık gösterir 3. DIO1, yetişkin karaciğerde ana deiodinaz izoformudur ve ters triiodotironin (rT3) ile sülfatlanmış iodotironinlere karşı güçlü substrat afinitesi gösterirken, DIO2 tercihen T4 ve rT3 kullanırken, DIO3 esas olarak T4 ve T3 üzerinde etkili olur. İnsan karaciğer mikrozomları ve rT3'ün substrat olarak kullanılması, DIO1 aktivitesinin seçici olarak tespit edilmesini sağlar ve diğer izoformlardan gelen paraziti en aza indirir. Madde kaynaklı DIO1 inhibisyonunun kesin sonuçları henüz tam olarak açıklanmamış olsa da, DIO1'i etkileyen insan gen mutasyonlarından elde edilen kanıtlar, DIO1'in tiroid hormon sistemini bozabileceğini açıkçagöstermektedir 5. Sonuç olarak, DIO1 inhibisyonunu araştırmak için sağlam ve tekrarlanabilir yöntemlere kritik bir ihtiyaç vardır.

Sunulan yöntemin amacı, Sandell-Kolthoff (SK) reaksiyonuna dayanan radyoaktif olmayan, kolorimetrik bir yaklaşımla in vitro DIO1 aktivitesini niceltmektir. DIO1, ters rT3'ün T2'ye dönüşümünü katalize eder; bu süreç iyot iyonları salınmasına yol açar. SK reaksiyonu, salınan iyodin hassas tespitini sağlar ve DIO1 aktivitesinin doğrudan ölçülmesi olarak iyodid salınım aktivitesinin (IRA) belirlenmesini sağlar. Bu test, test maddelerinin DIO1 üzerindeki inhibitör etkilerinin tespit edilmesini sağlar ve mekanik toksikoloji, tarama veya düzenleyici karar alma süreçlerini destekler. Özellikle, DIO1 inhibisyonunun, tiroid bozulmasına yol açan olumsuz sonuç yollarının moleküler başlatıcı bir olayı olarak incelenmesi için önemlidir; bu, EURL ECVAM 6,7 gibi uluslararası doğrulama çalışmalarında belirtilmiştir. Yöntem, ilk olarak 2012yılında geliştirildi ve özellikle tiroid hormon metabolizması bağlamında endokrin tarama için test pillerine entegre edilebilecek sağlam, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir in vitro testlere olan artan ihtiyaç karşısında 6,7 daha da optimizeedildi. Son zamanlarda, orta-10'dan yüksek verimliliğe sahip tarama11'e analog SK tabanlı kurulumların uygulanması yayımlandı ve bu da SK tabanlı yaklaşımın geniş uygulanabilirliğini gösterdi.

DIO1-SK testi, TH ürünleri yerine IRA'yı niceleyerek dolaylı olarak DIO1 aktivitesini ölçse de, alternatif tekniklere göre çeşitli avantajlar sunar. Radyo etiketlisubstratlar 12 veya tükenmiş veya oluşmuş tiroid hormonlarının kütle spektrometrisi tabanlı nicelendirilmesine dayananyöntemlerin aksine, SK reaksiyonu 415 nm14 seviyesinde iyod salınımını ölçerek basit, ölçeklenebilir ve maliyet etkin bir okuma sağlar. Katı faz ekstraksiyon (SPE-LC-MS/MS) ile LC-MS/MS yöntemleri, rT3 ve T2'nin niceliklendirilmesinde yüksek özgüllük ve hassasiyet sunarken, pahalı enstrümantasyon gerektirir ve yüksek verimlilikli tarama için daha az uygundur. Buna karşılık, DIO1-SK testi standart laboratuvar ortamlarında uygulanabilir ve insan karaciğer mikrozomlarıyla kullanımı için önceden doğrulanmıştır; yüksek tekrarlanabilirlik ve tahminedilebilirlik göstermektedir 6,7. Karşılaştırmalı bir çalışmada, SK reaksiyonunun, özellikle iyod salınımının sonuçları, SPE-LC-MS/MS 15 kullanılarak tiroid hormon metabolitlerinin (rT3 ve T2) nicelendirilmesiyle doğrudan karşılaştırıldı. Bulgular, iki yaklaşım arasında çeşitli test maddeleri ve inhibisyon güçleri arasında güçlü bir uyum olduğunu ortaya koydu. Test edilen tüm maddeler için, SK reaksiyonuyla ölçülen iyod salınım aktivitesindeki (IRA) değişiklikler, kütle spektrometrisiyle belirlenen rT3 ve T2 seviyelerindeki değişiklikleri yakından yansıtıyordu. Bu, SK okumasının DIO1 etkinliği için bir vekil olarak geçerliliğini daha da destekledi. Bu karşılaştırmalı analizler, SK testinin daha karmaşık analitik tekniklere sağlam ve güvenilir bir alternatif sağladığını ve iyod salınımının DIO1 inhibisyonunu in vitro değerlendirmek için güvenle ölçülebileceğini doğrular.

Ancak, SK yönteminin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır: Serbest iyodit içeren maddelerden kaynaklanan parazite hassastır, ya enzimatik olmayan olarak iyodid salgılar veya ditiothreitol (DTT) gibi analiz bileşenleriyle reaksiyona girer. DTT, aktif bölge selenosisteinin dönüşüm sırasında azalmış halindeki yenilenmesini destekleyerek deiyodinaz katalitik yetkinliğini korumak için indirgetici kofaktör olarak dahil edilmiştir. DTT güçlü bir indirgentici olduğundan, bazı test maddeleri (veya safsızlıklar) redoks reaksiyonlarına uğrayabilir ve bu reaksiyonlar kolorimetrik gösteriyi etkileyebilir ve bazı durumlarda enzimatik iyodid salınımıyla ilgisi olmayan DTT'ye bağlı test artefaktlarına yol açabilir. Bu tür girişimler, ölçülen iyodürün rT3'ün enzimatik dönüşümünden kaynaklanmayabileceği için, DIO1 inhibisyonu için yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, SK testi rutin tarama ve çoğu test maddesi için uygun olsa da, LC-MS/MS test paraziti şüphesi olduğunda doğrulama veya karmaşık kimyasal özelliklere sahip maddeler için kullanılabilir.

DIO1-SK testi şu anda, uluslararası bir PEPPER (Endokrin bozucu karakterizasyon yöntemlerinin doğrulanması için kamu-özel platform) projesine OECD test rehberi olarak dahil edilmek üzere hazırlanmaktadır; bu proje, düzenleyici uygulamalar ve endokrin bozucu test stratejilerinin uluslararası uyumlaştırılması için artan önemini vurgulamaktadır. Test, hem kimyasal güvenlik değerlendirmesini hem de endokrin bozulma16 üzerine mekanik araştırmaları destekleyecek kapsamlı in vitro test pillerine entegre edilebilir. Tiroid olumsuz sonuç yolunda ek ana olayları ele alan testlerle birleştiğinde, tiroid hormonu bozulma mekanizmalarının daha kapsamlı anlaşılmasına katkı sağlar.

Ayrıca, protokolün ölçeklenebilirliği ve yüksek tekrarlanabilirliği, onu orta ve yüksek verimli taramalar için oldukça uygun kılar. Bu, ilaç geliştirme sırasında ve akademik ortamlarda çok sayıda maddenin değerlendirilmesi için gereklidir; yakın zamandagösterildiği gibi, 11. DIO1 inhibisyonuyla ilgilenen araştırmacular, ister tarama, mekanik toksikoloji ya da düzenleyici karar alma için olsun, sağlam, erişilebilir ve çok yönlü bir testten faydalanacaklardır. Bu yöntemin doğrulanması, tiroid hormon sisteminin bozulması üzerine araştırmalar ve kimyasal güvenliği değerlendirmek için standart bir araç haline getirecektir.

Protokol

NOT: Ana testi yapmadan önce, DIO1-SK testinin doğruluğunu, tekrarlanabilirliğini ve geçerliliğini sağlamak için bir dizi hazırlık adımı gereklidir. Bu ön analiz faaliyetleri, etkili ayrıştırma ve SK reaksiyonunda arka plan parazitini en aza indirmek için kritik olan iyon değişimi, reçine dolu filtre plakalarının dökülmesini içerir. Sandell-Kolthoff reaksiyonu, sistematik değişiklikleri izlemek ve analiz kalitesini korumak için iyodid standart eğrileri kullanılarak düzenli olarak standartlaştırılır. İnsan karaciğer mikrozomlarının aktivitesi, partiye özgü iyodid salgılama kapasitesini belirlemek için ölçülür; böylece deneyler arasında tutarlı enzimatik performans sağlanır. Bu adımlar birlikte, sonraki ana analiz çalışmaları ve veri değerlendirmesi için sağlam bir temel sağlar ve tekrarlanabilir ve yorumlanabilir sonuçların oluşturulmasını destekler.

1. Ön analiz çalışması

  1. Tamponlar ve reaktiflerin hazırlanması
    1. Tüm tamponları ve stok çözeltilerini önceden Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Kararlılık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için aliquotları belirtildiği gibi sakla.
    2. Test günü, her 96 yuvalık tabak için substrat karışımını taze hazırlayın. Bir 96 kuyu plakası için, 5,75 mL HEPES/EDTA tamponu (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL çözülmüş 1 M DTT ve 10 μL 6 mM rT3 (DMSO'da çözünmüş) birleştirin. Nazikçe karıştırın ve substrat karışımını kullanana kadar buzda tutun.
  2. Referans Hazırlama
    1. Testi yapılan günde uygun bir çözücüde (örneğin DMSO) 10-1 M referans kontrol 6-PTU'nun stok çözeltisi hazırlanır.
    2. Bu stokun diH2O (RI-C8) içinde 1:10 seyreltilmesi hazırlanarak %10 DMSO konsantrasyonu elde edin ve bu stoktan diH 2 O içinde diH2O içinde bir dizi seyrelme yapın.
  3. Pozitif kontrolün hazırlanması
    1. Pozitif kontrol Aurothioglikozu içeren 10-2 M stok çözeltiyi uygun bir çözücüde (örneğin DMSO) hazırlayın ve 4 °C'de 6 aya kadar saklanın.
    2. Test günü, stoku 10-3 M diH2Oseviyesinde seyreltirerek %10 DMSO konsantrasyonu elde edin.
  4. Negatif kontrolün hazırlanması
    1. Test yapıldığı gün, negatif kontrol 1-Tiyo-β-D-glukoz sodyum tuzundan taze olarak 10-2 M stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Test günü, stoku 10-3 M diH2Oseviyesinde seyreltirerek %10 DMSO konsantrasyonu elde edin.
      NOT: Özellikle sodyum arsenit ve sülfürik asit gibi tehlikeli kimyasallarla çalışırken her zaman uygun güvenlik önlemlerini kullanın. Tüm reaktifler deyonize su ile hazırlanmalı ve üreticinin önerilerine göre saklanmalıdır. Hazırlandıktan sonra substrat karışımı ve çözülen DTT aliquot, test gününde tek kullanıma yönelik olarak tasarlanmıştır ve yeniden dondurulmamalıdır.
  5. İyon değişim reçinesinin dökümü
    1. Hazırlık için uygun dikdörtgen şeffaf bir kap kullanın.
    2. Büyük bir kaba yaklaşık 250 g (veya istenen miktar) iyon değişim reçinesi ekleyin ve yıkayın. %10 asetik asit ekleyerek yıkayın; Reçine süspansiyonunu 10 dakika dinlendirin.
    3. Süspansiyonu 10 dakika bekledikten sonra, süspansiyonu hafifçe eğip aspirasyon yapın. En az 5 kez toplamda ya da çözücüye renk sızana kadar yıkayın.
    4. Son yıkama adımından sonra, toplam hacmin yaklaşık %50'sini oluşturacak şekilde %10 asetik asit ekleyin.
    5. Kabı reçine bir tarafa hareket edecek şekilde eğin ve kabı eğik pozisyonda sabitleyin. Fazların ayrılmasını ~10 dakika bekleyin.
    6. 96 kuyuyla bir filtre plakası 96 derinlikte bir kuyulu plakanın üzerine yerleştirilir ve 96 kuyunun her kuyusuna 100 μL %10 asetik asit ekleyin.
    7. Reçine döküm için kullanılan uçları ~1 cm yükseklikte keserek uç açıklığı genişletin ve 96 kuyuyla filtre plakasının her kuyusuna 300 μL iyon değişim reçinesi dökün.
      NOT: Çalışmamızda kullanılan uçların maksimum hacmi 1.200 μL olup çok kanallı pipetlere bağlanabilir.
    8. Asetik asidi, mikrotiter plakaları için salınan rotorlu bir santrifüjde 100–200 × g içeren 96 derinliklik bir kuyu plakasına santrifüj yaparak elüasyon yapın. Reçineyin plaka boyunca eşit şekilde dağılıp dağıtılmadığını kontrol edin.
    9. Plakayı geçirimsiz bir plastik levhayla mühürleyin ve en fazla 6 ay boyunca 4 °C'de saklayın.
      NOT: İyon değişim reçine bileşenleri, doğru şekilde yıkanmazsa SK reaksiyonunu etkilediği bilinmektedir. Çıkarılan süpernatant doğrudan SK reaksiyonunda kullanılabilir (50 μL süpernatant örneği kullanılır, 50 μL seryum eklenir ve son olarak 50 μL arsenit çözeltisi kullanılır) ve bileşenlerin tamamen yıkanmasını sağlamak için %10 asetik asit örneğiyle (boş kontrol) karşılaştırılabilir.
  6. Sandell-Kolthoff reaksiyonunun standartlaştırılması
    1. İlgili bir iyodid kaynağından (örneğin, iyodid standart çözeltisi) önerilen konsantrasyonlarda 1.500, 1.000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 ve 1 nM iyodid sulandırılmasını diH2Oiçinde uygun iyod standardı kullanılarak hazırlayın.
    2. Şekil 1'deki düzende açıklandığı gibi, 96 kuyululu bir plakaya kontrol olarak 50 μL safdiH 2O ve hazırlanmış iyot sulandırmalarından 50 μL üçlü olarak eklenin.
    3. Tüm kuyulardan 50 μL 40 mM seryum çözeltisi eklenir ve tüm kuyulara 50 μL 25 mM arsenit çözeltisi ekleyerek reaksiyona başlanır.
    4. Arsenit çözeltisi eklendikten hemen sonra, 415 nm (±2 nm) ölçümünü plaka okuyucu ile her dakika boyunca optik yoğunluğu (OD) kaydederek ve ilk OD'yu kaydederek ölçün.
    5. Sonuçları bölüm 4'te açıklandığı gibi değerlendirin.
      NOT: Genellikle, saf diH2O kontrolünde ΔOD21 dakika > 0.3 arka plan gereklidir ve temel nedenlerin (örneğin, As veya Ce-partisinde kirlenme, düşük su kalitesi) daha fazla araştırılması gerekir.
  7. Mikrosom aktivitesinin değerlendirilmesi
    1. Referans maddesinin (6-PTU) en yüksek konsantrasyonunu (RI-C8) 1.2'de tarif edildiği gibi hazırlayın.
    2. Tablo 3'te tanımlandığı gibi altı mikrozom seyreltmesini ve Tablo 1'de açıklanan substrat karışımını hazırlayın.
    3. Şekil 2'deki plaka düzeninde tanımlandığı gibi, diH2O içinde %10 (v/v) çözücü seyreltmesinden 10 μL (örneğin, diH2O içinde %10 DMSO) ve 10 μL 10-2 M 6-PTU (RI-C8) eklenir; bu da Şekil 2'deki plaka düzeninde açıklandığı gibi üçlü olarak 96 kuyu bir levhaya eklenir.
    4. 96 delikli plakaya diH2O içinde 40 μL mikrosom seyreltmesi eklenir (sonuçta her kuyu başına 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.68 ve 0 μg mikrozomal protein oluşur).
      NOT: Tedarikçiler genellikle mikrozomal protein stok konsantrasyonunu sağlar. Eğer kullanılmazsa, standart protein nicelendirme yöntemleri kullanılabilir, ancak bu çalışmada uygulamadık.
    5. Her kuyuya 50 μL taze hazırlanmış substrat karışımı ekleyin ve tabağı geçirimsiz bir plastik levhayla kapatın.
    6. 96 kuyu tabakasını bir inkubatördeki bir sarsıntıya (850 rpm'de 37 °C) yerleştirin ve 2 saat kuluçka yapın.
    7. İnkubasyon süresinden sonra, reaksiyonu durdurmak için plakayı buz üzerine koyun.
    8. İyon değişimini adım 2.2'ye benzer şekilde gerçekleştirin.
    9. İyon değişim aşamasında elde edilen derin kuyulardan uygun miktarda numuneyi, seyreltilmemiş (50 μL örnek), 1:2 (25 μL örnek + 25 μL %10 asetik asit) ve 1:4 (12,5 μL örnek + 37,5 μL %10 asetik asit) seyreltmelerini ölçmek için uygun miktarda numuneyi taze 96 kuyu bir plakaya aktarın; böylece levha düzeni değişmemiş kalsın.
    10. Sonuçları bölüm 4'te açıklandığı gibi değerlendirin ve örneklerin %10 asetik asitte seyrelme faktörünü ve Sandell-Kolthoff reaksiyonunda doygunluk platosuna ulaşmadan en yüksek ΔOD21 dakika-BG değerlerine yol açan mikrozomal protein konsantrasyonunu belirleyin.
      NOT: Genellikle, 20 μg mikrozomal protein bir kuyu örneği için 1:4 veya 1:2 derecesinde asetik asit sulandırılmalarında21 dakika > 0,5 iyod salınımı, genellikle 1 dakika civarında21 dakika civarında bir ΔOD salınımıdır. Daha yüksek mikrozomal protein konsantrasyonları önerilmez, çünkü test sırasında arka plan ve spesifik olmayan bağlanmayı artırırlar. Sonucu doğrulamak için belirlenen mikrosom konsantrasyonu ve seyreltme faktörü kullanılarak 6-PTU seyreltme serisinin ölçümü tekrarlanması önerilir.
  8. Test maddelerinin çözünürlüğü değerlendirmesi
    1. Test öğesini 100 mM veya 200 mg/mL sıcaklıkta, uygun bir çözücüde (örneğin DMSO) oda sıcaklığında çözebilirsiniz. Karıştırın veya girdabın ve çözünmeyi görsel olarak kontrol edin (mikroskop).
    2. Çözülmediyse, 5 dakikaya kadar sonikasyon yapın ve tekrar kontrol edin. Hâlâ çözünmemişse, 37 °C'de 60 dakikaya kadar ısıtın ve tekrar kontrol edin.
    3. Çözülmezse, daha fazla seyreldin veya daha düşük konsantrasyonda yeni bir stok hazırlayın ve işlemi tekrarlayın. DMSO uygun değilse, alternatif çözücü olarak su veya etanol deneyin.
    4. Çözüldükten sonra, diH2O (%10 çözücü) içinde 1:10 sulandırma hazırlayın ve değerlendirmeyi tekrarlayın (karıştırma, sonikasyon, gerektiğinde ısıtma).
    5. Test koşullarını simüle etmek için, test tamponunda %1 test öğesi seyreltmesi hazırlayın ve çözünürlüğü kontrolünü tekrarlayın.
  9. Test maddesi hazırlığı ve menzil bulma
    1. Test öğesi stok çözeltisini, çözüm ölçümünün 1.8. adımında belirlendiği gibi, uygun bir çözücüde (tercihen DMSO) en yüksek çözünür konsantrasyonda hazırlayın.
    2. Aralık bulma testi için, stok çözeltisi ve %10 DMSO ile ardışık 1:10 (v/v) seyreltme adımlarıyla sekiz test ürünü seyreltme yapın;diH 2O içinde.
    3. Test öğesinin inhibitisyon profilini tahmin etmek için aralık bulma testi yapılarak bölüm 2'de açıklanan adımları gerçekleştirin. Test maddesi herhangi bir konsantrasyonda ≥%25 inhibisyon gösterirse, nihai test çalışmaları için konsantrasyon aralığını lineer inhibisyon aralığında en az üç konsantrasyon ve varsa %10 IRA'nın altında iki konsantrasyon içerecek şekilde ayarlayın.
    4. Test öğesi tüm test edilen konsantrasyonlarda <%25 inhibisyon gösterirse, aynı seyreltme serisini son test çalışmaları için tekrar kullanın. Bu durumda, aralık bulma testi üç zorunlu bağımsız denemeden biri olarak sayılabilir.
      NOT: Her test öğesi için en az iki, ideal olarak üç bağımsız deney yaparak sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlayın. Eğer aktivite aralığını daha iyi kapsayacak başka bir seyreltme seçilirse, 1:10 seyrelme oranından sapmaya izin verilir. Bu test stratejisindeki %25 kesme (bkz. 1.9.3 ve 1.9.4 adımları), test öğesi etkilerini negatif kontrollerden ayırır; temel aktivite değişkenliğini hesaba katır ve ek bir güvenlik marjı sağlar. Bu eşik inhibür profillerin güvenilir şekilde sınıflandırılmasını sağlar.

figure-protocol-1
Şekil 1: İyod standart eğrisi için plaka düzeni. Bu şekil, iyodid standart eğrisinin oluşturulmasında kullanılan 96 kuyruklu plaka düzenini göstermektedir. Kuyular 1 nM'den 1.500 nM'e kadar seri iyodid seyreltmeleri vediH 2O-only kontroller içerir.  Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Mikrozomal protein titrasyonu ve referans madde testi için plaka düzeni. Bu şekil, mikrozomal protein titrasyonu ve referans inhibitör (6-PTU) testi için 96 kuyu plaka düzenini gösterir. Sıralar, 6-PTU ile ve olmadan her kuyu başına giderek artan miktarda mikrozomal protein içerir.  Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. DIO1–SK testinin gerçekleştirilmesi

  1. Test öğesi ile mikrosom kuluçka
    1. Referans öğesini 1.2. adımda tarif edildiği gibi ve 1.3 ve 1.4. adımlarda açıklandığı gibi pozitif ve negatif kontrolü hazırlayın. Test maddelerini uygun konsantrasyonlarda hazırlayın; adımlar 1.8 ve 1.9'da açıklanan protokole uygun şekilde uygulanır.
    2. Taban karışımını Tablo 1'de tarif edildiği gibi hazırlayın ve dikkatlice çözülmüş, alitasyonlu mikrozom çözeltisi diH2O'da seyreltilerek 1.7. adıma göre önceden tanımlanmış protein konsantrasyonunda mikrosom süspansiyonu hazırlayın. Mikrosom süspansiyonunu kuluçka için ihtiyaç duyulana kadar buzda tutun.
    3. Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterilen plaka düzenlerine uygun olarak (aynı anda ikiden fazla test öğesi değerlendirilirse) 10 μL referans madde konsantrasyonları, pozitif ve negatif kontrol, çözücü kontrolü (diH2O içinde %10 (v/v) çözücü) ve test maddeleri konsantrasyonları kuyruklara eklenin.
    4. Tüm kuyulara 40 μL mikrosom süspansiyonu ekleyin. Örneklere taze hazırlanmış substrat karışımından 50 μL ekleyin.
    5. Plakayı geçirimsiz bir plastik levhayla mühürleyin ve 2 saat boyunca bir kuluçka makinesine (850 rpm'de 37 °C) yerleştirin; Tepkiyi durdurmak için kuluçkadan sonra tabağı buzun üzerine koyun.
    6. Tepkiyi durdurmak için tabakayı kuluçkadan sonra buzun üzerine koyun.
      NOT: Levha, numune bütünlüğünü korumak için ölçüme kadar buz üzerinde saklanabilir. İlk test plakası referans öğesinin sekiz konsantrasyonunu içerirken, aynı gün yapılan her ek plaka sadece referans öğesinin en yüksek konsantrasyonunu içerir ve gerekirse ek test öğeleri için daha fazla alan bırakır.
  2. İyon değişim reçinesi dolu 96 kuyu filtre plakalarıyla ayırma
    1. Hazırlanmış iyon değişim reçinesi dolu 96 kuyu filtre plakasını, 1.5. adımda hazırlandığı gibi, 96 derinlikli bir kuyu plakasının üzerine koyun ve iyon değişim reçinesi dolu 96 kuyu filtre plakasının her kuyusuna 150 μL %10 asetik asit ekleyerek reçineyi sütunlardaki ıslatma sağlanır.
    2. Asetik asidi, mikrotiter plakaları için salınan rotorlu bir santrifüjde kullanılan 96 derinliklik kuyu plakasına santrifüj yaparak 100–200 × g ile elütasyon yapın.
    3. Kullanılmış 96 derinlikli kuyulu plakayı yeni bir 96 derinliklik kuyulu plaka ile değiştirin.
    4. 2.1.6. adımdan itibaren kuluçka edilmiş 96 kuyu plakasının her kuyusuna 133 μL %10 asetik asit ekleyin ve solüsleri karıştırmak için plakayı kısa bir süre sallayın.
    5. Önceki adımda hazırlanan örneklerin 175 μL'sini, iyon değişim reçinesi dolu 96 kuyu filtre plakasına aktarın, başlangıç plaka düzenini koruyun.
    6. Örnekler, mikrotiter plakaları için salınan rotorlu bir santrifüjde (100–200 × g) reçineden geçirin ve 96 derinliklik kuyu plakasına 1 dakika boyunca santrifüj yapın. İyon değişim reçinesi dolu 96 kuyu filtre plakasını çıkarın.
      NOT: Örneklerle birlikte 96 derinlikteki kuyu plakası, geçirimsiz bir plastik levha ile kapatılabilir ve en az 3 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir. Bu, Manuel/teknik hatalar veya Sandell-Kolthoff reaksiyonu veya ölçümde seyreltme faktörünün sonraki günlerdeki değişiklikleri durumunda ek ölçümlere olanak tanır.
  3. Sandell-Kolthoff tepkisi
    1. Kullanılan mikrosom partisi için %10 asetik asitte örneklerin belirlenen seyrelme faktörüne bağlı olarak (bkz. adım 1.7), yeni bir 96 kuyu tabakasına incelenmemiş veya uygun şekilde seyreltilmiş numuneden 50 μL eklenin.
    2. Tüm kuyulara 50 μL 40 mM seryum çözeltisi ( Tablo 1'de tarif edildiği şekilde hazırlanmış) eklenin ve tüm kuyulara 50 μL 25 mM arsenit çözeltisi ( Tablo 1'de tarif edildiği gibi hazırlanmış) eklenerek reaksiyona başlanın.
    3. Arsenit çözeltisi eklendikten sonra, 415 nm (±2 nm) açıklıkta bir plaka okuyucu ile 21 dakika boyunca optik yoğunluğu (OD) kaydederek ve ilk OD'yi kaydederek emilimi ölçün.

figure-protocol-3
Şekil 3: İki test öğesinin paralel test için plaka düzeni. Birden fazla konsantrasyonda iki test öğesinin üçlü olarak test edilmesi için 96 kuyu plaka düzeni, negatif, pozitif, çözücü kontrollerinin ve referans öğenin kopyaları ile birlikte. Günün ilk test plakası olarak kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-4
Şekil 4: Üç test öğesinin paralel testi için plaka düzeni. Üç test öğesini çoklu konsantrasyonlarda üçlü olarak test etmek için 96 kuyu plaka düzeni, negatif, pozitif ve çözücü kontrollerinin tekrarları yer almaktadır. Referans öğe yalnızca en yüksek konsantrasyonunda dahil edilmiştir, çünkü ilk plakada tam olarak test edilmiştir (bkz. Şekil 3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Parazit testi (± mikrozom ve ± DTT)

  1. Referans maddesinin (6 PTU) en yüksek konsantrasyonunu (RI C8) 1.2'de tarif edildiği gibi hazırlayın ve test maddesi stok çözeltisi ile seyreltmeleri (en yüksek test maddesi konsantrasyonu dahil) hazırlayın.
  2. Mikrosom süspansiyonunu, dikkatlice çözülmüş, alikotlu mikrozomlarıdiH 2O içinde seyrelerek tanımlanmış konsantrasyonda hazırlayın (bkz. adım 1.7). Mikrosom süspansiyonunu kullanılana kadar buzda tutun.
  3. İki substrat karışımı hazırlayın: Tablo 1'de tarif edildiği gibi DTT ile standart alt karışımı ve DTT içermeyen (sadece DTT hariç) benzer bir substrat karışımı.
  4. Şekil 5'e göre 96 kuyu plakasının belirlenmiş kuyularına dağıtın: 10 μL RI C8, diH2O (çözücü kontrolü) içinde 10 μL %10 (v/v) DMSO ve her test öğesi seyreltmesinden 10 μL.
  5. Şekil 5'e göre, "mikrozomlu" olarak adlandırılan kuyulara 40 μL mikrosom süspansiyonu ve "mikrozomsuz" olarak belirlenen kuyulara 40 μL diH2O eklenin.
  6. Buz üzerinde, "DTT ile" olarak belirtilen kuyulara 50 μL DTT ile substrat karışımı ve "DTT" ile işaretlenen kuyular için DTT olmadan 50 μL substrat karışımı ekleyin (Şekil 5).
  7. Plakayı geçirimsiz bir plastik levhayla mühürleyin ve bir kışkırtıcıda (37 °C, 850 rpm) 2 saat kuluçka için.
  8. İnkubasyondan sonra, reaksiyonu durdurmak için tabağı buzun üzerine koyun.
  9. 2.2 ve 2.3. adımlarda açıklandığı gibi SK reaksiyonu ile iyon değişim ayrımı ve iyod nicelenmesi gerçekleştirin ve sonuçları Bölüm 4'te açıklandığı şekilde değerlendirin.
    NOT: Bu tek plakalı kurulum (Şekil 5), enzimatik DIO1 aktivitesini test artefaktlarından ayırmak için mikrozomsuz ve DTT olmadan en yüksek test maddesi konsantrasyonunu test eder. Mikrozom olmayan kuyulardan IRA'nın %≥%20 artışı, SK girişimini (DIO1'den bağımsız iyod salınımı/okuma) gösterir ve madde "DIO1 SK testinde uygulanmaz" olarak sınıflandırılır ve analizden dışlanır. DTT ile DTT olmayan koşullar arasındaki farklar, DTT'ye bağlı iyod salınımını ek bir parazit mekanizması olarak tanımlamaya yardımcı olur.

figure-protocol-5
Şekil 5: Girişim testi için plaka düzeni. Bu şekil, parazit testi için 96 kuyuyla plaka düzenini gösterir; burada test öğeleri, referans öğesi ve çözücü kontrolü hem mikrozomlarla hem de mikrozomsuz DTT varlığında ve DTT olmadan test edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Veri değerlendirmesi

  1. DIO1 aktivitesinin değerlendirilmesi
    1. ΔOD21 dakika değerleri, tüm örneklerin 21 dakikalık değerlerinin ilk ölçülen (0 dakika) değerlerinden çıkarılması yoluyla belirlenir:
      figure-protocol-6
    2. ΔOD-BG değerleri, tüm örneklerin ΔOD21 dakika değerlerinden inhibrelenmiş 10 3 M 6-PTU (RI) kontrolünün ΔOD21 dakika değerlerinin ortalamasını çıkararak belirleyin:
      figure-protocol-7
    3. Test öğesinin değerlerini, test öğe(leri) (TI) ΔOD21 dakika-BG TI değerlerini %'de ΔOD21 dakika -BGSC değerlerinin ortalamasıyla bölünerek ilgili çözücü kontrol değerlerine normalleştirerek iyod salınım aktivitesi (IRA) değerlerini %'de üretir.
      figure-protocol-8
    4. Test öğelerinin farklı konsantrasyonlarının IRA değerlerini bir istatistik yazılım paketinde çizin; IRA değerleri y ekseninde (doğrusal) ve test öğesi konsantrasyonları x ekseninde (logaritmik) bulunuyor.
    5. Tercih ettiğiniz istatistiksel yazılımda konsantrasyon-yanıt ilişkisini görselleştirmek için eğri-uyum algoritması kullanın (örneğin, "[Inhibitör] versus response -- Değişken eğim (dört parametre)"). "Top" maksimum yanıtı, "Bottom" en düşük yanıtı temsil eder ve "HillSlope" eğrinin dikliğini tanımlar:
      figure-protocol-9
    6. Referans öğesinin ve varsa test öğesinin IC50'sini belirleyin.
    7. Referans öğenin log IC50 tahmininin varyans katsayısını (CV) %'de hesaplayın:
      figure-protocol-10
    8. Negatif kontrolün IRA'sını %'de çözücü kontrolüne normalize edin:
      figure-protocol-11
    9. Pozitif kontrolün IRA'sını %'de çözücü kontrolüne normalize edilmiş olarak hesaplayın:
      figure-protocol-12
    10. z'-faktörünü hesaplayın:
      figure-protocol-13
    11. Deneyin geçerliliğini kontrol etmek için, hesaplanan değerleri Tablo 4'teki kabul kriterleriyle karşılaştırın.
      NOT: Geçerli bir test çalışması elde etmek için tüm kriterlere ulaşılmalıdır.
    12. Test maddelerini, maksimum inhibisyonları ve IC50 değerleri doğrultusunda, Tablo 5'te özetlenmiş olarak tam inhibitör, kısmi inhibitör veya inhibitör olmayanlar olarak sınıflandırın.

Sonuçlar

Şekil 6, DIO1-SK testi iş akışına genel bir bakış ve yöntemin laboratuvarda başarılı şekilde kurulması için gereken temel standartlaştırma adımlarını sunar. İş akışı (Şekil 6A), insan karaciğer mikrozomlarının kullanımı, test öğeleri ve kontrollerle kuluçka, iyon değişim ayrımı yoluyla iyodid çıkarımı ve Sandell–Kolthoff (SK) reaksiyonu kullanılarak kolorimetrik iyodid nicelizasyonunu içeren analizin ardışık aşamalarını özetlemektedir. Şekil 6B, sağlam performans ve geçerli sonuçları destekleyen standartlaştırma stratejisini vurgular; bunlar arasında (i) SK reaksiyonunun standartlaştırılması, (ii) partiye özgü mikrosom aktivite testi, (iii) çözünürlüğü değerlendirmesi ve girişim testi, (iv) menzil bulma testi ve (v) ilk geçerli test çalışmasına göre test maddesi konsantrasyonlarının ayarlanması yer alır.

Bu stratejinin temel unsurlarından biri, insan karaciğer mikrozom partilerinin rT3 deiodinasyon aktivitelerinde önemli ölçüde farklılık gösterebileceği için partiye özgü mikrozomal aktivite testidir; bu da rutin madde testinden önce her yeni parti için uygun enzim konsantrasyonunun belirlenmesini gerektirir.

Bu aşamalı test stratejisi uygulama açısından kritiktir: ancak testin temel performansı (kontroller, SK reaksiyon davranışı ve mikrosom aktivitesi) doğrulandıktan ve test koşulları standartlaştırıldıktan sonra, madde testinin geçerli, yorumlanabilir inhibitisyon profilleri vermesi beklenebilir.

figure-results-1
Şekil 6: DIO1 SK testi iş akışı ve standartlaştırma adımları. (A) İş akışı, insan karaciğer mikrozomlarının kullanımını, 96 kuyu plakasının kurulumunu, test öğeleri ve kontrollerle kuluçkalamayı, iyod çıkarımı ve SK reaksiyonu ile kolorimetrik nicelleştirmeyi gösterir. Her adım, testin ana aşamalarını vurgulamak için sıralı olarak gösterilir. (B) Standartlaştırma adımları arasında Sandell-Kolthoff reaksiyonunun standartlaştırılması, partiye özgü mikrosom aktivite testi, çözünürlüğü değerlendirmesi ve girişim testi, menzil bulma testi ve ilk geçerli test çalışmasına göre test öğesi konsantrasyonlarının ayarlanması yer alır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6'da gösterilen iş akışı ve standartlaştırma çerçevesine dayanarak, Şekil 7, laboratuvarların referans inhibitörü için sigmoidal inhibitör yanıtını koruyarak yeterli dinamik bir aralık elde etmek için uygun mikrozomal protein konsantrasyonunu (ve iyon değişimi sonrası seyreltme) nasıl belirlediğini gösterir. Şekil 7A'da, ΔOD21min-BG mikrozomal protein arttıkça artar ve iyon değişimi sonrası seyreltmeye bağlıdır (seyreltilmemiş, 1:2, 1:4). En yüksek ΔOD21 dakika-BG veren ve sigmoidal yanıt koruyan seyreltme sonraki deneyler için seçilir (örnek: 1:2 seyreltme). Şekil 7B'de, 6-PTU inhibisyon eğrileri mikrozomal protein miktarları boyunca karşılaştırılır ve sigmoidal eğri veren en düşük protein konsantrasyonu belirlenir (örnek: 5 μg protein/kuyuy) ve böylece hassasiyet ile arka plan dengelenir.

Önemli olarak, bu optimizasyon adımı yöntem uygulanırken her laboratuvar tarafından yapılmalıdır, çünkü gerekli protein konsantrasyonu, kullanılan mikrosom partisinin etkinliğine bağlıdır ve bu da enzim konsantrasyonunun partiye özgü standartlaştırmasını gerektirir.

figure-results-2
Şekil 7: 6-PTU ile mikrozomal aktivite ve inhibisyon. (A) Grafik, arka plan (BG) düzeltilmiş Sandell-Kolthoff sinyali (ΔOD21 dakika n-BG) olarak artan miktarda mikrozomal protein ile birlikte (log10[μg protein/well]) olarak aktivite artışını göstermektedir; bu sinyal sulandırılmamış, 1:2 ve 1:4 seyreltmelerle test edilmiştir. En yüksek ΔOD21 dakika BG değerine sahip en yüksek seyreltme ve sigmoidal şekle gelecek deneylerde kullanılacaktır. Bu durumda ise 1:2 seyreltme şeklindedir. (B) Referans inhibitörü 6-propil-2-tiourasilin (6-PTU) iyot salınım aktivitesini (IRA %) gösteren konsantrasyon-yanıt eğrisi, farklı mikrozomal protein yüklerinde log10[konsantrasyon (M)] karşısında (5, 7.5 ve 10 μg protein/kuyu) çizilmiştir. IRA değerleri çözücü kontrolüne normalize edilir. Her iki grafiğin veri noktaları, bir temsil eden mikrosom aktivite testinden her koşul başına üç teknik replikanın (kuyuyun) ortalama ± SD'sini temsil eder. Eğriler, dört parametreli lojistik ("değişken eğim") modeli (inhibitör vs. tepki) kullanılarak doğrusal olmayan regresyon ile uyarlandı. En küçük protein konsantrasyonu ve sigmoidal eğrisi gelecekteki deneyler için kullanılacaktır; Bu durumda, 5 μg/well. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

İş akışı ve standartlaştırma adımları (Şekil 6) tamamlandıktan ve seçilen mikrosom partisi için uygun mikrozomal protein konsantrasyonu belirlendikten (Şekil 7), rutin madde testine devam etmek için temel test parametreleri yerinde olur. Bu aşamada, test öğeleri plaka kontrol setiyle (referans öğesi, çözücü kontrolü ve pozitif/negatif kontroller) birlikte standart plaka formatında değerlendirilebilir; bu da sağlam normalizasyon ve inhibitisyon profillerinin tutarlı yorumlanmasını sağlar.

Şekil 8, iyod salınım aktivitesinde (IRA) konsantrasyon-yanıt davranışına dayalı test ayrımcılığını göstermektedir. Referans inhibitörü 6-PTU (Şekil 8A), IRA'da konsantrasyona bağlı bir azalma göstererek, test performans doğrulaması için beklendiği gibi sigmoidal inhibisyon profilini sağlar. Tannik asit (Şekil 8B), gösterilen koşullarda referans inhibitörüne (maksimum inhibisyon >%92 %90) benzer bir inhibitör profil gösterir. Test maddesinin en yüksek üç konsantrasyonu negatif IRA değerleri gösterdi. IRA değerleri <0% biyolojik olarak anlamlı bir 'negatif iyodid salınımını' yansıtmaz; hesaplama prosedüründen (arka plan çıkarımı ve çözücü kontrolüne normalizasyon) kaynaklanır; bu da çözücü kontrolündeki küçük dalgalanmaları negatif normalize değerlere yayabilir. Buna göre, %0'ın altındaki IRA değerleri sonuç yorumu için %0'a (taban) eşdeğer kabul edilir. Dibütilftalat (Şekil 8C), test edilen konsantrasyon aralığında inhibisyon göstermez (maksimum %25'in altında), bu da inhibitör olmayan bir profili temsil eder. Bu profiller birlikte, testin standart koşullarda inhibitör ile engelleyici olmayan davranışı ayırt edebileceğini gösterir. Test sistemi ayrıca kısmi inhibitörleri de tespit edebilir; bu inhibitörler maksimum %25 ile %90 arasında inhibisyon seviyelerini gösterir (veri gösterilmemiştir). Bunların nasıl kategorize edildiğine dair daha fazla detay Tablo 5'te bulunabilir.

figure-results-3
Şekil 8: DIO1–SK testinin doz-yanıt davranışı, inhibitörleri inhibitörlerden ayırır. Doz-yanıt eğrileri, (A) referans inhibitörü 6-PTU, (B) temsili bir inhibitör (tannik asit) ve (C) temsil edici olmayan inhibitör (dibutil ftalat) için log10 konsantrasyonuna (M) karşı gösterilen iyot salgılama aktivitesini (IRA cinsinden) gösterir. IRA değerleri arka plan çıkarmasından sonra hesaplandı ve çözücü kontrolüne normalleştirildi. Semboller, her biri her konsantrasyon başına üç teknik kopya (kuyuyu) ile yapılan bağımsız bir deneyden ±alınan ortalama SD (n = 3) ortalamasını temsil eder. Eğriler, dört parametreli lojistik ("değişken eğim") modeli (inhibitör vs. tepki) kullanılarak doğrusal olmayan regresyon ile uyarlandı. %0'ın altındaki IRA değerleri, sonuç yorumu için %0'a (başlangıç) eşdeğer kabul edilir. Bu veriler, testin referans inhibitör için bir sigmoidal inhibitör profili verdiğini ve standart koşullarda konsantrasyon-yanıt eğrisinin inhibitör mi yoksa inhibitör mi olmadığını doğrulayabildiğini göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Geçerli bir test çalışmasında, çözücü kontrolleri (SC) tam inhibe edilmiş referans koşulundan (6-PTU, RI-C8) net bir ΔOD21 dakikalık sinyal ayrımı gösterir. Örnek bir veri setinde (10 bağımsız çalışma), her plaka SC ve tam inhibre edilmiş referans (10−3 M'de 6-PTU) için n = 9 teknik replika içeriyordu. Plakalar boyunca, plaka ortalaması SCΔOD 21 dakika değerleri 1.383 ile 1.819 arasında değişiyordu (ortalama ± SD: 1.565 ± 0.114), iken, inhibrelenmiş 6-PTU durumu için plaka ortalamasıΔOD 21 dakika değerleri 0.258 ile 0.771 arasında değişiyordu (ortalama ± SD: 0.473 ± 0.087). Bu testteki ΔOD hesaplaması, OD0 dakika ileOD 21 dakika arasındaki farka dayanır ve test geçerliliği genellikle >0,5 z′-faktör eşiği ile desteklenir.

10 bağımsız test çalışması boyunca, 6-PTU, IC50 değerleri 1.20E-06 M ile 5.02E-06 M arasında değişen bir sigmoidal konsantrasyon-yanıt eğrisi üretti (ortalama ± SD: 2.74E-06 M ± 1.13E-06 M). IC50 değerleri için referans aralığı 1.00E-06 ile 1.00E-05 arasındaki kabul kriterleri, önceki doğrulama çalışmalarından elde edilen verilere dayanmaktadır. Ancak, IC50 değerleri kullanılan belirli mikrosom partisinden önemli ölçüde etkilenir ve önemli değişkenlik gösterebilir. Buna rağmen, bu farklılıkların aynı büyüklük mertebesinde kalması beklenmektedir.

Test kalitesi, hem sinyal penceresini hem de kontrollerin değişkenliğini yansıtan z′-faktörü kullanılarak özetlenebilir. Açıklanan veri setinde, altı referans eğrisi 0.544 ile 0.774 arasında değişen z′-faktörlerle ilişkilendirildi (ortalama ± SD: 0.658 ± 0.062), yaygın kullanılan kabul hedefi olan z′ > 0.5 ile tutarlıdır.

Pratikte, optimal olmayan çalışmalar, analiz geçmişindeki sapmalar ve/veya önceden belirlenmiş kabul kriterlerini karşılamama ile tespit edilebilir. Örneğin, saf diH₂O boşluğunda ΔOD > 0.3 gösterildiğinde, Sandell-Kolthoff reaksiyonunda yüksek arka plan belirtilir ve bu da araştırma gerektirir (örneğin, reaktif kirlenmesi veya su kalitesi sorunları). Bu tür arka plan artışları, testin dinamik aralığını azaltabilir ve kontrol değişkenliğini artırabilir; böylece kabul kriterlerinin başarısız olmasına katkıda bulunabilir; bunlara z′-faktör 0.5'in altında düşer. Bariz teknik artefaktlar (örneğin, yağıntı veya anormal renk değişimi) gösteren kuyular değerlendirmeden istisna olarak hariç tutulur. Boxplot istisna testi ile belirlenen istisna noktalar da hariçtir. Eğer istisna maddeler kaldırıldıktan sonra kabul kriterleri karşılanmazsa, test işlemi geçersiz sayılır ve tekrarlanmalıdır.

Reaktif/TamponHazırlık bilgileri
Asidik amonyum seryum çözeltisi (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0.5 M H2SO4) (250 mL)250 mL'lik hacimsel şişeye 6,32 g (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O ve 125 mL diH2O ekleyin. 125 mL 1 M H2SO4 ekleyin ve nihai hacmi 250 mL elde edersiniz. Oda sıcaklığında 6 aya kadar saklayın.
DTT (1 M'nin Aliquotları)Aliquot, hazırlanmış veya sağlanan 1 M DTT çözeltisini H2O içinde 0,5 mL aliquot olarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirir ve -20°C'de 6 aya kadar saklar.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) tamponu (pH 7,0)250 mL hacimsel bir şişe kullanarak, 12,5 mL 1 M HEPES çözeltisi, 201 mg Etilen diaminetetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 250 mL'ye kadar diH2O ile doldurun. 4°C'de 3 aya kadar sakla.
rT3 Çözüm ("substrat karışım tüpleri")rT3'ü DMSO'da son konsantrasyona 6 mM olarak çözüp, 10 μL porsiyonlarda 15 mL santrifüj tüplerinde aliquot yapın ve -20°C sıcaklıkta 6 aya kadar saklayın.
Sodyum arsenit çözeltisi (25 mM NaAsO2, 0.8 M NaCl, 0.5 M H2SO4) (250 ml)250 mL'lik hacimsel bir şişeye 0,81 g NaAsO2, 11,7 g NaCl ve 125 mL diH2O ekleyin. 125 mL 1 M H2SO4 ekleyin ve nihai hacmi 250 mL elde edersiniz. Oda sıcaklığında 6 aya kadar saklayın.

Tablo 1: Tamponlar ve reaktiflerin hazırlanması. Bu tablo, DIO1 SK testinde kullanılan tüm tamponlar ve stok çözeltileri için hazırlanma adımlarını ve depolama talimatlarını detaylandırır; bunlar arasında HEPES/EDTA tamponu, DTT, rT3 çözeltisi, asidik amonyum seryum çözeltisi ve sodyum arsenit çözeltisi bulunur.

Referans öğe seyreltme adıReferans öğe seyreltme konsantrasyonu [M]%10 DMSO [μL]Referans öğesiTestteki referans öğesinin nihai yoğunlaştırması [M]
RI-C81.00E-0245050 μL 10-1 M referans madde stok çözeltisi1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 μL RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 μL RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 μL RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 μL RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 μL RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 μL RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 μL RI-C21.00E-08

Tablo 2: Referans öğe seyreltmelerinin hazırlanması. Bu tablo, referans madde (6-PTU) için seri sulandırmaların hazırlanışını, konsantrasyonlar, DMSO hacimleri ve testte kullanılan nihai konsantrasyonları özetler.

Kuyu başına mikrosom [μg]diH2O [μL]Mikrosom seyreltmesi [μL]Testteki nihai enzim konsantrasyonu [μg/mL]
2078020 μL 20 mg/mL mikrosom stok çözeltisi200
10400Her kuyu seyreltme başına 400 μL 20 μg mikrosom100
5400Her kuyu seyreltme başına 400 μL 10 μg mikrosom50
2.5400Her kuyu seyreltme başına 400 μL 5 μg mikrozom25
1.25400Kuyu seyreltme başına 400 μL 2,5 μg mikrosom12.5
0.68400Kuyu seyreltme başına 400 μL 1,25 μg mikrosom6.8

Tablo 3: Mikrosom seyreltmelerinin hazırlanması. Bu tablo, analiz için nihai mikrozomal protein konsantrasyonlarına ulaşmak için gerekli hacim diH₂O ve mikrosom stok çözeltisi dahil olmak üzere kuyu başına mikrozomal protein için seyreltme şemasını sunar.

Kabul kriterleriÖnerilen kesme değeri
Sayısal
Referansöğesi IC 50 [M]1*10-05 - 1*10-06
Log IC50 referans öğe tahmininin CV'si [%]< 3
IRA negatif kontrolü [%]80 - 120
IRA pozitif kontrolü [%]< 20
z'-Faktörü> 0.5
İkili
Referans öğesinin şekli (sigmoidal?)Evet
Referans öğenin nihai konsantrasyon-yanıt eğrisi, üç kopyadan en az altı konsantrasyondan oluşurEvet
Test öğesinin nihai konsantrasyon-yanıt eğrisi, üç kopyadan en az altı konsantrasyondan oluşurEvet

Tablo 4: DIO1 SK testi için kabul kriterleri. Bu tablo, IC₅₀ aralığı, varyasyon katsayısı, kontroller için IRA değerleri, z'-faktörü ve konsantrasyon-yanıt eğrileri gereksinimleri gibi test geçerliliği için kabul kriterlerini listeler. Kabul pencereleri, referans IC₅₀ penceresini bilgilendiren beş bağımsız çalışmaya dayalı bir tekrarlanabilirlik değerlendirmesi de dahil olmak üzere daha önce bildirilen DIO1-SK doğrulamaçalışmalarından türetilmiştir 6. 10 bağımsız çalışmadan oluşan örnek bir veri setinde, z′ faktörü performansı 0.544 ile 0.774 arasında değişiyordu (ortalama ± SD: 0.658 ± 0.062), burada kullanılan z′ kabul eşiğini destekledi.

Kategori (etkinlik şekline göre)Alt kategori (potensiye göre)İnhibisyon aktivitesiEşik
Kategori 1: tam inhibitörC: Güçlü tam inhibitörDIO1 aktivitesini referans madde 6-PTU ile karşılaştırılabilir bir konsantrasyonda tamamen inhibe eder6-PTU'nun üst IC50 veya altında maksimum inhibisyon %90 ve IC50 ile %90'dan yüksektir
B: Zayıf tam inhibitörReferans madde 6-PTU'dan daha yüksek konsantrasyonlarda DIO1 aktivitesini tamamen inhibe eder6-PTU'nun maksimum inhibisyonu %90 üzerinde ve IC50 üst aralık IC50'nin üzerinde
Kategori 2: kısmi inhibitör-Tam inhibisyon yok, ancak negatif ve çözücü kontrolünden daha fazladırMaksimum inhibisyon %25 ile %90 arasında
Kategori 3: inhibitör değil-DIO1'i inhibiye etmez (negatif ve çözücü kontrolü gibi)Maksimum inhibisyon %25'in altında

Tablo 5: Test maddelerinin DIO1 inhibitisyon gücü ve etkinliğine göre sınıflandırılması. Test maddeleri, DIO1 aktivitesinin maksimum inhibisyonuna göre üç etkinlik grubuna (tam, kısmi veya inhibitörsüz) ayrılır. Tam inhibitörler, referans öğe 6-PTU ile karşılaştırıldığında IC₅₀ oranlarına bağlı olarak potansiyel olarak alt kategorilere ayrılır.

Tartışma

DIO1-SK testi, radyo etiketli testler veya kütle spektrometrisi gibi geleneksel DIO1 aktivitesini değerlendirme yöntemlerine radyoaktif olmayan, maliyet etkin ve ölçeklenebilir bir alternatif sunar. İnsan karaciğer mikrozomları için ön doğrulaması ve tiroid hormon seviyelerinin SPE-LC-MS/MS ölçümleriyle güçlü uyumluluğu, OECD test rehberi çalışma planına dahil edilmesiyle de güvenilirliğini ve düzenleyici önemini doğrulamaktadır. Sandell-Kolthoff (SK) reaksiyonunun sadeliği, testi gelişmiş enstrümantasyon olmadan laboratuvarlar için erişilebilir kılar.

Mevcut protokolde, daha önce yayımlanmış DIO1-SK prosedürlerine kıyasla birkaç pratik yön, rutin bir 96-kuyu formatında sağlamlık ve tekrarlanabilirliği daha da desteklemek için daha ayrıntılı şekilde belirtilmiştir. Bu açıklamalar, kontrol kavramının gerekçesine (solvent, negatif ve pozitif kontroller), daha önce dökülmüş plakaların yeniden kullanılmak yerine taze hazırlanmış iyon değişim reçine plakalarının kullanılmasına ve çok kuyu plaka ölçümlerinde kullanım sağlamlığını artıran SK reaksiyon koşullarına odaklanır; biyolojik yorum önceki standartlaştırma çalışmalarıylatutarlı kalırken, 6,7.

Güçlü yönlerine rağmen, rT3'ün DIO1 aracılı olarak T2'ye dönüşümü sırasında serbest bırakılan iyodidi doğru şekilde nicelendirmek için birkaç kritik adım ele alınmalıdır. Bu, tekrarlanabilirliği sağlamak için hassas zamanlama ve tutarlı reaktif kullanımı gerektiren Sandell-Kolthoff reaksiyonu ile sağlanır. SK reaksiyonu, iyodidin sarı seryumun (IV) arsenit tarafından renksiz seryuma (III) indirgenmesini hızlandırdığı hızlı bir katalitik süreçtir; renk değişim hızı, iyod konsantrasyonuyla doğrudan orantılıdır. Arsenik çözeltisi eklendiğinde reaksiyon hızla ilerlediği için, ölçümün gecikmeden başlatılması çok önemlidir. 96 kuyuyla plaka formatında, arsenik çözeltinin yavaş veya tutarsız eklenmesi, kuyular arasında önemli değişkenlik yaratabilir. Bu nedenle, tüm kuyular boyunca eşit ve hızlı reaktif eklemesini sağlamak için çok kanallı pipet veya otomatik dağıtıcı kullanımı şiddetle tavsiye edilir.

Kuyular arasında ve plakalar arasında karşılaştırılabilirliği en üst düzeye çıkarmak için, SK reaksiyonundaki reaktif ekleme sırası tarif edilen iş akışıyla tutarlı tutulmalıdır: Seryum kromojenik substrat olarak bulunur ve reaksiyon, başlangıç zamanını belirleyen ve bu nedenle hızlı, senkronize dağıtım gerektiren arsenit ekleme ile başlatılır. Alternatif reaktif ekleme emirleri bu düzende değerlendirilmemiştir; bu nedenle, protokol yeniden üretilirken sıranın değiştirilmesi önerilmez. Ayrıca, serium konsantrasyonu SK okumasının pratik performans özelliklerini (örneğin sinyal penceresi ve sağlamlık) etkileyebilir. 25 mM serium, önceki test standartlaştırmasında doğrulanmış standart bir koşul olarak tanımlanmışken, 40 mM gibi daha yüksek konsantrasyonların IC50 değerlerini veya biyolojik yorumu etkilemeden sinyal penceresini ve z′-faktörünü artırdığıgösterilmiştir; bu, önceki çalışma 6'da daha önce açıklanmıştır. Bu protokolde, 40 mM seryum, test koşullarında tam ve hızlı iyodid kompleksleşmesini sağlamak ve rutin plaka tabanlı ölçümlerde sağlamlık ve sinyal kararlılığını artırmak için kullanılır. Kabul kriterleri (örneğin, z′-faktör, referans inhibitörün IC50 değerleri) önceki doğrulama çalışmalarında gözlemlenen tarihsel performansa dayanır ve rutin bir test performans kontrolü olarak tasarlanmıştır.

İnsan karaciğer mikrozomlarının kullanımı biyolojik değişkenlik getirir ve mikrozom partisine özgü iyod salınım aktivitesinin standartlaştırılmasını zorunlu kılar. İyon değişim reçinesi dolu filtre plakalarının dikkatli hazırlanması, filtre plakası boyunca reçine dağılımının dengesiz olmasını önlemek ve iyodidin potansiyel olarak müdahale eden maddelerden tamamen ayrılmasını sağlamak için gereklidir. Reçine iş akışına bağlı, reçine doygunluğu, iyodid veya protein taşınmasından kaynaklanan ek değişkenlik riskini ve yeniden kullanımda bağlanma verimliliğinin kaybını en aza indirmek için yeni dökülmüş iyon değişim reçinesi doldurulmuş filtre plakaları seçilmiştir. Reçine ve filtre plakalarının yeniden kullanılması teknik olarak uygulanabilir, ancak bu çalışmada sistematik olarak değerlendirilmemiş bazı riskler barındırabilir. Reçine bağlanma kapasitesi azaldığında veya önceki çalışmalardan sonra reçine yatakta kalan matris bileşenleri kalırsa partiden partiye sürüklenme oluşabilir. Geri dönüşümü düşünen laboratuvarlar için pragmatik bir öneri, yeniden kullanımdan sonra reçine performansının doğrulanması (örneğin, arka plan ve standart eğri davranışını izleyerek ve tutarlı iyodid yakalama sağlanarak) ve artan arka plan, azalmış dinamik aralık veya tutarsız ayrım gözlemlenirse yeniden kullanımı durdurmaktır. Tek kullanımlık reçine dolgulu filtre plakalarının kullanılması önerilir; çünkü bu protokol bu metodolojiye göre özel olarak geliştirilmiştir.

Ayrıca, her test öğesinin çözünürlüğü uygun bir araçta belirlenmelidir; çünkü test edilen maksimum konsantrasyon çözünürlüğüyle sınırlıdır (genellikle %1 DMSO ile 1 mM'ye kadar). Tüm test bileşikleri DMSO'da çözücü olarak uygulandığından, çözücü kontrolü, analiz ile ilgili koşullar altında temel DIO1 aktivitesini tanımlar ve normalleştirme ile karşılaştırma için en uygun referans koşul olarak hizmet eder. Buna karşılık, 1-tio-β-D-glukoz sodyum tuzu, yapısal olarak pozitif kontrol aurothioglukozuna (ATG) benzer ancak kimyasal olarak iodotironin deiodinasyonuna karşı inerttir ve mikrozomal redoks sistemlerine veya DIO1 katalitik aktivitesine müdahale etmediği için negatif kontrol olarak dahil edilmiştir. Dahil edilmesi, gerçek DIO1-spesifik etkileri, bileşik ekleme, işlem veya analiz matrisi etkileşimleriyle ilgili spesifik olmayan etkilerden ayırt etmeye yardımcı olur. Tedavi edilmemiş/araç olmadan kontrol, tüm bileşik aranmış kuyularda DMSO'nun bulunduğu gerçek test ortamını yansıtmayacağı için birincil referans koşulu olarak kullanılmadı; Bu nedenle, çözücü kontrolü analiz yorumu için ilgili temel noktadır.

Sorun giderme çalışması, SK reaksiyonundaki parazitleri tespit etmeye odaklanır. İyot içeren, şelat yapan veya güçlü oksitleyici maddeler, kolorimetrik gösterimiyapay olarak etkileyebilir 14,17,18. Bunu çözmek için protokol, mikrozom olmadan parazit testini içerir. Ayrıca, ditiothreitol (DTT) kofaktör olarak kullanılması bazı test maddelerinden enzimatik olmayan iyodür salınımına da yol açabilir. Bu durumlarda, DIO1 inhibisyonunu doğrulamak için SPE-LC-MS/MS gibi ortogonal yöntemler önerilir. Genel denatürasyon etkileri (örneğin, yüzeyaktif maddeler) yoluyla spesifik olmayan girişim, yanlış pozitifler üretebilir, bu nedenle sık vuranları in silico araçlar veya entegre test yaklaşımları kullanarak tespit etmek için genel bir strateji faydalı olabilir.

Testin birkaç sınırlaması vardır. Test maddelerinin DIO1 aktivitesinden bağımsız olarak analiz bileşenleriyle reaksiyona giren veya iyodid salgıladığı parazitlere hassastır. Test, DIO1'in spesifik inhibisyonu ile enzim fonksiyonu veya yapısal bütünlükle spesifik olmayan etkileşim arasında ayrım yapmaz. Spesifikliği artırmak için, ek mikrozomal enzimlerin inhibisyonu paralel olarak analiz edilebilir ve farklı enzim testleri arasında inhibitör güçlerin karşılaştırılması ek kanıt sağlayabilir.

Olası artefaktları belirlemek için bir diğer strateji, hücre bazlı, in vitro testlerde yaygın olarak yapılan bütünlük veya canlılık testlerini dahil ederek maksimum test konsantrasyonunu tanımlamaktır. DIO1-SK testi için doğrudan bir bütünlük testi eksik olsa da, in vitro test bataryasında kullanılması, diğer hücre tabanlı testlerden alınan sitotoksisite verilerinin konsantrasyon seçimini yönlendirmesine olanak tanır. Böyle çapraz analiz bilgisi mevcut değilse, DIO1-SK testindeki üst konsantrasyon çözünürlüğüyle sınırlıdır ve bu da ilgili in vivo maruziyetleri yansıtmayabilir. Ancak, toksikokinetik yaklaşımlar in vitro test konsantrasyonlarını daha iyi tanımlamak ve yorumlamak için kullanılabilir.

DIO1-SK testi, toksikolojik tarama ve endokrin bozulmanın mekanik çalışmalarında özellikle değerlidir. Tiroid hormonu homeostazındaki önemli bir olayı ele alır ve in vitro test pillerine entegre edilebilir. Dayanıklılığı, tekrarlanabilirliği ve farklı laboratuvar ortamlarına ve veri kapasitesine uyum sağlama yeteneği, kimyasal güvenlik değerlendirmesi ve düzenleyici doğrulama için değerli bir araç haline getirir. Test, standart koşullarda DIO1 inhibisyonunun sağlam bir in vitro ölçümü sağlar ve test maddelerinin iyi karakterize edilmiş bir referans inhibitörle (6-PTU) ilişkili olarak sınıflandırılmasını destekler. Ancak, DIO1 inhibisyonuna ilişkin in vivo veriler azdır ve in vitro DIO1 inhibisyon sonuçlarının in vivo etkilerle doğrudan ilişkilendirilmesi, in vivo tahmin için şu anda geçerli değildir. Buna göre, test sonuçları tiroid hormon metabolizmasında bir önemli olaya müdahalenin mekanik kanıtı olarak yorumlanmalı ve ek kanıtlarla (örneğin, diğer tiroid MoA testleri ve gerektiğinde ortogonal ölçümler) entegre edilmelidir. Önemli olarak, DIO1–SK testi birden fazla doğrulama odaklı çalışmada (optimizasyon/standartlaştırma, öngörü değerlendirmesi ve sağlamlık/doğruluk analizi)6,7,15 ve yöntem OECD uygulamasına doğru ilerledikçe, bu makale ek laboratuvarlarda transfer ve tutarlı uygulamayı kolaylaştırmak için adım adım prosedürel detaylar sunmaktadır.

Açıklamalar

Yazarlar K.S., N.H., D.F.-W. ve R.L., gelecekte ticari ürünler geliştirmek ve kaydetmek için DIO1 testini kullanabilecek bir kimya şirketi olan BASF SE'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

Yazarlar, DIO1-SK testinin ilk kurulmasındaki çalışmaları için Dr. Andreas Weber'e teşekkür etmek isterler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-Tiyo-β-D-glukoz sodyum tuzuSigma-AldrichT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-triiodotironin (rT3) Santa Cruz BiyoteknolojisiSC-209692CAS 5817-39-0
6-Propil-2-tiourasil (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
Asetik asitThermo Fisher9526-33CAS 64-19-7
Analitik dengeNANA0,1 mg okunabilirlikle 30 g'a kadar hassas bir ağırlık ile ulaşabilen
Arsenik sodyum oksit (NaAsO2)Thermo Fisher041533.APCAS 7784-46-5
Analiz plakaları (96 kuyuk formatı)MerckZ707902-108EAÖrneğin, doku kültür plakaları, 96 kuyu plakası, düz taban, polistiren, 0,34 cm2, steril, 108/cs, TPP
Aurothioglikoz (ATG)Sigma-AldrichA0606-5MGCAS 12192-57-3
Santrifüj Tüpleri 15 ve 50  mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EAörneğin TPP santrifüj tüpleri, hacim 15 ve 50 mL, polipropilen  
Mikrotiter plakaları için salınan rotorlu santrifüjNANAÜzerinde 96 kuyu filtre plakası bulunan 96 derinliklik bir kuyu plakası (en az yaklaşık 6 cm yüksekliğinde) sığacak kadar yüksek olmalı
Seryum (IV) amonyum sülfat (Ce(NH4)4(SO4)4)Sigma-Aldrich22269-100G-FCAS 10378-47-9
CO2 Kuluçka MakinesiNANA37 derece sıcaklıkları koruyabilen; C, %5 CO2 ve ≥ %90 nem
Derin kuyu plakaları (96 kuyulu format)Supelco575653-UÖrneğin, SPE 96-Derin Kare Kuyu Toplama Plakası, kuyu hacmi 2 mL, polipropilen
Dimetil sülfoksit (DMSO)AppliChemA3672,0250CAS 67-68-5
Ditiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779-1GCAS 3483-12-3
Etilen diamintetraasetik asit (EDTA) & nbsp;Sigma-AldrichAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Filtre plakaları (96 kuyruklu format)MerckWHA77002810örneğin Micro-Plates, 96-kuyruklu, şeffaf polistiren, 800 ve mikro; L, DNA Bağlama, Whatman
Gaz geçirmez plaka sızdırmazlayıcılarThermo Fisher232698Örneğin: Sızdırmazlık bandı, polyester, steril, Sızdırmazlık bandı, polyester, steril, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
İnsan karaciğer mikrozomlarıBiovitX008070Örneğin, INVITROCYP 150-Donör Havuzlu İnsan Karaciğer Karaciğer Mikrozomları
İyodid (IC standardı)Supelco41271-100MLÖrneğin, IC için iyodid standardı, suda 1000 mg/L, Sigma-Aldrich
Dowex 50WX2 gibi iyon değişim reçinesiRoth334.4CAS 12612-37-2; Mesh 100-200
Mikrosantrifüj tüpleri 1.5  mLMerckEP0030120086-1PAKörneğin Eppendorf® Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri, hacim 1.5 mL, doğal
50 ila 300 Mbps ile ulaşabilen çok kanallı dağıtıcı; µ Adım başına LNANANA
10 ila 100  iletebilen çok kanallı pipet; µ Adım başına LNANANA
Elektrotlu pH ölçer ve kalibrasyon tamponlarıNANA+/- 0.1 pH birimi okuyabilen
Soğurma ölçümü için fotometreTecan Trading AGNAörneğin Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
1 ile 10 ve nbsp teslimat yapabilen pipetler; µ LNANANA
10 ila 100 Mbps (yaklaşık 100 Mbps) verebilen pipetler; µ LNANANA
100 ila 1000 ile 1000 Mbps teslimat yapabilen pipetler; µ L NANANA
Daha yüksek hacimler için pipetlerNANAserolojik pipetler, örneğin 10, 25, 50 mL
Plaka sallayıcıThermo FisherNAÖrneğin, doğrudan kontrol edilen Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER mikrotiter plakası
Tekrarlayıcı pipetNANANA
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-AldrichS9888-25GCAS: 7647-14-5, örneğin sodyum klorür, ACS reaktifi ve s.; 99.0 %
İstatistik yazılımıNANAAnaliz özelliklerini yansıtan regresyon analizi yapabilen ve inhibitör konsantrasyonları hesaplayabilen (örneğin GraphPad Prims 8, GraphPad)
Sülfürik asit (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Hacimsel şişeNANATanımlanmış hacimle sertifikalandırılmıştır

Kaynaklar

  1. Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
  2. Yue, B., et al. Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study. J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).
  3. Köhrle, J. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).
  4. Zhang, J., Lazar, M. A. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).
  5. França, M. M., et al. Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism. Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).
  6. Weber, A. G., et al. Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).
  7. Weber, A. G., et al. A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).
  8. Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay. Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).
  9. Renko, K., et al. An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases. Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).
  10. Olker, J. H., et al. Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases. Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).
  11. Sane, R., et al. Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method. Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).
  12. Visser, T. J., Van Overmeeren, E. Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase. Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).
  13. Hindrichs, C., et al. A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma. Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).
  14. Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. A modified persulfate-arsenite method for manganese. Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).
  15. Stefanidis, K., et al. Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis. Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).
  16. Satya, S., et al. Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption. OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).
  17. Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine. Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).
  18. May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified. Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kolorimetrik Analizyod r Sal n mTiroid Hormon HomeostazMekanistik ToksikolojiEnzim nhibisyon TaramasPlaka Okuyucuyon De i tirici Re ine
Sandell-Kolthoff Reaksiyonu Kullanılarak İnsan Karaciğer Mikrozomlarında Deiodinaz 1 Aktivitesinin Kolorimetrik Değerlendirmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.