Yöntem makalesi

Romatoid Artritli Hastalardan Primer Fibroblast benzeri Sinovial Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

DOI:

10.3791/70116

⸱

24 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, romatoid artrit hastalarının sinovyal dokularından yüksek saflıkta primer fibroblast benzeri sinoviositlerin (FLS) izole edilmesi ve tanımlanması yöntemini tanımlar; bu yöntem güvenilir hastalık modelleme ve ilaç taraması için yapılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Romatoid artrit (RA), birincil patolojik özelliği olarak sinovial hiperplazi ve ilerleyici eklem hasarı ile karakterize edilen kronik otoimmün bir inflamatuar hastalıktır. Fibroblast benzeri sinoviositler (FLS), RA patogenezinde kritik hücresel bileşenler olarak tanınır; agresif, tümör benzeri davranışlarıyla karakterize edilir; bu davranışlar kıkırdak ve kemik yok oluşunu sağlar. Romatoid artritin izolasyonu ve saflaştırılması: Fibroblast benzeri sinoviyositler (RA-FLS), hastalık mekanizmalarını araştırmak ve potansiyel tedavi edici ilaçları değerlendirmek için kritik bir araçtır. Burada, RA hastalarında diz protezi ameliyatı sırasında alınan rezeksiyon edilen sinovyal doku örneklerinden birincil insan RA-FLS'nin izole edilmesi, kültürlenmesi ve fonksiyonel olarak doğrulanması için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, taze sinovyal doku kullanır ve RA-FLS'nin doku matriksinden en üst düzeye çıkarılması için tripsin ve kollajenaz tip II ile ardışık enzimatik sindirim süreci uygular. Son olarak, hücre tanımlaması Vimentin immünoflüoresansı ve akış sitometrisi ile sağlanır; TNF-α kaynaklı proliferasyonun fonksiyonel değerlendirmesi ile tamamlanır. Bu protokol, spesifik fenotipik özelliklere ve inflamatuar yanıt yeteneğine sahip yüksek saflıkta RA-FLS kültürlerinin edinilmesini sağlar ve araştırmacılara ilaç taraması, mekanik çalışmalar ve doku mühendisliği uygulamaları için uygun kısa süreli kültürlü, hasta kaynaklı RA-FLS elde etmeleri için güvenilir bir yöntem sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Romatoid artrit (RA), çevresel eklemlerin simetrik poliartritiyle karakterize edilen kronik otoimmün inflamatuar hastalıktır; tahmini küresel yaygınlığı %0,5-1 oranındadır ve çeşitli sistemik ve eklem dışı komplikasyonlara yol açmapotansiyeli vardır 1,2,3,4,5. RA'nın temel patolojik özelliği, otoimmün yanıtların aracılı olduğu kronik sinovitttir ve bu da eklem kıkırdak ve subkondral kemiği aşındıran invaziv pannusdokusunun oluşumuna yol açar 6,7. Bunlar arasında sinovit, RA'nın en erken ve en merkezi patolojik özelliğini temsil eder. Sinovyumun baskın yerleşik hücreleri olan fibroblast benzeri sinoviositler (FLS), hem sinovial iltihabın hem de kemik yıkımının koordinasyonundakritik rol oynar 8,9. RA'da sinovial inflamatuar yanıt sırasında, Romatoid artrit Fibroblast benzeri sinoviositler (RA-FLS) normal "düzenleyici" fenotiplerini kaybeder ve bunun yerine "pro-inflamatuar" bir profilsergiler. Bu değişim, ilgili enerji metabolik yollarını aktive edebilecek inflamatuar sitokinlerin büyük ölçüde üretilmesine yol açar; bu da hücre çoğalmasının artmasına ve sinovial inflamatuarkaskadın 11,12,13 daha da güçlenmesine yol açar. Aynı zamanda, RA-FLS diğer bağışıklık hücreleriyle (makrofajlar, T hücreleri ve B hücreleri gibi) etkileşime girerek kalıcı kronik bir iltihap durumunusürdürür 14,15. Ayrıca, RA-FLS, artan göç kapasitesi, invazivlik, kontrolsüz proliferasyon ve apoptoza direnç gibi kanser benzeri özellikler sergiler ve kıkırdak ile kemik erozyonu süreçlerinde aktif roloynarlar.

Son yıllarda, FLS, RA gibi eklem inflamatuar hastalıklarının incelenmesinde in vitro modeller olarak yaygın olarak kullanılmıştır; bu eğilim, kısmen mevcut birinci basamak farmakoterapilerin sınırlamalarındankaynaklanmaktadır (17,18,19). 2D kültürlerde, 3D modellerde ve organ-on-a-chip sistemlerinde hastalık mekanizmalarını araştırmak, terapötik hedefleri doğrulamak ve ilaç taramasıyapmak için kullanılırlar 20,21,22,23. Ayrıca, RAFLS, DMARD yanıtını tahmin etmek için hasta kaynaklı sinovyal organoidler dahil olmak üzere gelişmiş uygulamalar için bir temel oluşturur; CRISPR/Cas9 ile genetik düzenleme ve RA ilerlemesinde gen fonksiyonunu incelemek; ve fonksiyonel sinovyal doku greftleri için bir hücre kaynağıolarak 24,25,26.

Romatoid artrit hastalarının sinovyal dokusundan kısa süreli kültürlenmiş RA-FLS elde etmek, birçok deneyin ilk adımı olarak hizmet eder. FLS hücre hatlarına kıskınca, kısa süreli kültürlenmiş, hastadan türetilen RA-FLS, hastalararası heterojenliği ve hastalık özgül özelliklerini korur; bu da hastalıkla ilişkili transkripsiyonel faktörlerin ve yol düzenleyici farklılıklarının daha özgün temsilini sağlar. Sonuç olarak, hücre verimi, büyüme hızı ve fonksiyonel performans, yaş, hastalık süresi, ilaç öyküsü ve hastalık aktivitesi gibi hastaya özgü faktörler tarafından etkilenebilir ve bu da belirli bir gruplar arası değişkenliğe yol açar. Bu nedenle araştırmacılar, kullanımdan önce doku kaynağının klinik arka planını değerlendirmeli ve hücrelerin fenotipik stabilitesini korumak için erken geçişler (P3-P7) içinde deneyler yapmalıdır.

Bu çalışma, diz sinovial dokusundan RA-FLS'nin çıkarılması ve tanımlanması için basitleştirilmiş bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu yöntem, ardışık enzimatik sindirim (tripsin, ardından tip II kollajenaz) ve hafif mekanik ayrışma ile birleştirilir. Kanıtlar, bu optimize edilmiş, çok adımlı enzimatik stratejilerin genellikle tek enzimli veya ardışık olmayan karışık enzimli tedavilerden üstün olduğunu ve bunun hücre canlılığını ve fenotipi 27,28,29,30 üzerinde etkili olabileceğini göstermektedir. Buna karşılık, sunulan protokol, yüksek canlılıklı, yüksek saflıklı RA-FLS'nin daha verimli ve nazik izolasyonunu sağlar, hücresel hasarı ve fenotipik kaybı en aza indirerek sonraki fonksiyonel testler için uygunluk sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin-Japonya Dostluk Hastanesi'nde eklem replasman ameliyatı geçiren romatoid artrit hastalarından sinovyal doku topladı. Tüm hastalar ameliyattan önce yazılı bilgilendirilmiş onay vermiştir. Toplanan bilgiler ve biyolojik örnekler, hasta gizliliği ve veri güvenliğini sağlamak için sıkı önlemlerle ele alındı. Kalan sinovial doku örnekleri biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edilmiştir. Bu çalışmada romatoid artrit hastalarından diz eklemi sinovyal dokusunun kullanımı, Çin-Japonya Dostluk Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: 2025-KY-223). Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Sinovial dokunun alınması ve hazırlanması

NOT: Ameliyat sırasında elde edilen sinovyal doku, ameliyat odasından biyogüvenlik dolabına nakil sırasında kontaminasyonu önlemek için %0,9 tuzlu çözelti veya PBS ile dolu steril bir kapta yerleştirin. Bakteriyel veya mantar kontaminasyonunu önlemek için etanol batırmayı ve ardından penisillin-streptomisin çözeltisi ile yıkamayı kritik adımlar olarak kullanın; böylece sonraki deneylerin başarısını garanti altına alın.

  1. Taze sinovial dokuyu PBS içeren 50 mL'lik santrifüj tüpüne daldırın ve biyogüvenlik kabine aktarın.
  2. Sinovial dokuyu %75 etanol içeren bir Petri kabına aktarın ve dezenfeksiyon için 30 saniye suya batırın.
  3. Steril cerrahi makas ve pens kullanarak sinovyal dokudan yağ ve kemik dokusunu çıkarın, ardından kalan dokuyu yeni bir kültür kabına aktarın.
  4. Elde edilen sinovial dokuyu %10 penisillin/streptomisin içeren PBS ile 3 kez yıkayın.

2. Sinovial dokunun sindirimi

NOT: Hücre bağlantılarını ve sinovial dokudaki ekstraselüler matriksi bozmak için tripsin kullanın; böylece sonraki izolasyon için. Tip II kollajenazı uygulayarak ekstraselüler matriks yapısını seçici olarak bozarak hücrenin matriksden ayrılmasını kolaylaştırın. Sinovyal doku diseksiyonu için gerekli tüm cerrahi makas, forseps ve hücre süzgeçleri kullanılmadan önce otoklavlama ile sterilize edin. Sindirimden sonra doku parçaları gevşeme, kenarları yıpranmış ve ortam biraz bulanık hale gelebilir. Sindirilmemiş doku kompakt ve opak kalır.

  1. Dokuyu makasla tekrar tekrar 1mm × 1mm parçalara doğran.
  2. Dokuya %0,25 tripsin ekleyin ve 37 °C'de sabit sıcaklıkta (100-150 rpm) veya hücre kuluçka makinesinde 30 dakika sindirin.
  3. Fosfatlı tuzlu (PBS) kullanarak %10 fetal sığır serumu (FBS) çözeltisi hazırlayın.
  4. Doku doku miktarına göre 15 mL veya 50 mL santrifüj tüplerine aktarılır ve %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren PBS ile nötralize edilip sindirilir.
  5. Santrifüj (4 °C, 500 × g, 5 dakika), ardından süpernatantı atıp peleti kalır.
  6. Pelleti PBS'ye yeniden askıya alın.
  7. Santrifüj (4 °C, 500 × g, 5 dakika), ardından üst malzemeyi atıp peleti tutun.
  8. 50 mL DMEM ortamına 100 mg tip II kollagenaz ekleyin ve 2 mg/mL tip II kollagenaz çözeltisi hazırlanır.
  9. Hazırlanan tip II kollagenaz çözeltisi sterilizasyon için 0,22 μm bir membrandan geçirin.
  10. 2 mg/mL tip II kollagenaz ekleyin ve 37 °C sabit sıcaklıkta (100-150 rpm'de) veya hücre kuluçka makinesinde 4 saat sindirin.

3. Fibroblast benzeri sinoviositlerin izolasyonu ve kültürü

NOT: Tüm hücre kültürü prosedürlerini steril koşullarda bir biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin ve kontaminasyonu önlemek için steril eldiven takın.

  1. DMEM bazal ortamını %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye ederek tam DMEM ortamı hazırlayın.
  2. 100 ağlık bir hücre süzgeçini steril bir Petri kabının üzerine yerleştirin ve sindirilmiş sinovyal doku ile sıvıyı süzgecin üzerine dökürün.
  3. Hücre süzgecisini kalıntı dokuyla birlikte başka bir steril Petri kabına aktarın.
  4. Kalan dokuyu süzgeçte 20 mL'lik steril şırınga piston çubuğunun ucuyla öğütün, böylece sadece beyaz, lifli kalıntılar kalır ve daha fazla hücre süspansiyonu oluşamaz.
  5. Süzgeçi uygun miktarda tam DMEM ortamıyla durulayın.
  6. Tüm filtratları toplayın, santrifüj yapın (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatantı atın.
  7. Pelleti PBS'ye yeniden askıya alın, santrifüj yapın (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatantı atın.
  8. Hücreleri tam DMEM ortamında yeniden süzülür.
  9. Hücre sayımı yapın ve hücreleri bir kültür şişesine aktarın.
  10. Termosu hücre kültüründeki kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO₂) inkubasyon yapın.
  11. 48 saat sonra ortamı değiştirin.
  12. Hücreler tam birleşmeye ulaştıklarında tripsin ve geçiş oranında 1:3 oranında sindirin.

4. Vimentin immünoflüoresans boyama kullanarak RA-FLS tanımlanır

NOT: Hücre yıkama için kullanılan PBS çözeltisini 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda önceden ısıtın. Bu bölümde belirtilen tüm reaktif hacimleri, 48 kuyululu plaka formatı için standartlaştırılmıştır. Farklı formattaki plakalar kullanıldığında, hacimler büyüme alanına göre orantılı olarak ölçeklendirilmelidir.

  1. Hücreleri tripsinle sindirin, toplanan hücreleri tekrar süzültü ve tam DMEM ortamı ile 1 ×10 4 hücre/L'ye seyreltin.
  2. RA-FLS'yi 200 μL kapasiteyle 48 kuyu talı bir plakaya tohumlayın.
  3. Hücre kültürüne (37 °C, %5 CO₂) koyun ve 24 saat kuluçka yapın.
  4. Ortamı atın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Hücreleri sabitlemek için %4 paraformaldehit ekleyin, 10 dakika boyunca fiksanti atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
  6. Her kuyu başına %0,1 Triton X-100 çözeltisi PBS içinde 150 μL hazırlayın. Kullanmadan önce vorteks veya nazik ters çevirme ile tam karıştırmayı garanti edin.
  7. Kuyulara %0,1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve hücreleri geçirimlileştirmek için 10 dakika kuluçka yapın.
  8. %0,1 Triton X-100 çözeltisini atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
  9. Her kuyu başına 150 μL hayvansız bloklayıcı çözelti ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  10. Engelleme çözümünü at. Her kuyuya 150 μL vimentin primer antikor çalışma çözeltisi (antikor seyreltici ile 1:200 seyreltilmiş şekilde) ekleyin.
  11. Birincil antikorla 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
  12. Birincil antikoru atın ve hücreleri beş kez PBS ile yıkayın.
  13. Her kuyu başına 150 μL Alexa Fluor 488 ile konjuge edilmiş anti-tavşan IgG ikincil antikoru (evrensel antikor sulaştırıcısında 1:50 seyrelmiş) ekleyin ve ışıktan korunan 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
  14. İkincil antikoru atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  15. Her kuyu başına bir damla DAPI içeren antiifade montaj ortamı ekleyin ve karanlıkta 10 dakika kurutun.
  16. DAPI ve FITC/GFP için uygun filtre ×setleriyle donatılmış ters floresans mikroskobu kullanarak gözlem ve görüntü yakalayın.
    NOT: Kuyular tamamen PBS ile doldurulup 5 dakika kuluçka geçirip ardından PBS çıkararak hücreleri PBS ile yıkayın. Bu prosedür tek bir yıkama döngüsünden oluşur.

5. RA-FLS'yi nicelikle ölçmek ve akış sitometrisi kullanarak saflığı değerlendirmek

NOT: RA-FLS'yi tespit etmek için pozitif belirteç olarak Vimentin ve CD90 kullanılırken, bağışıklık hücresi kontaminasyonunu dışlamak için CD68, CD14 ve CD11b negatif kontrol olarak uygulanır. Vimentin, ağırlıklı olarak RA-FLS sitoplazmasında lokalize olan hücre içi spesifik ara filament proteini olarak hizmet eder. CD90, RA-FLS'de yüksek şekilde ekspreslenen kritik bir yüzey belirteci olarak işlev görür ve bağışıklık hücrelerinden ayırt edilmesini sağlar. CD68, CD14 ve CD11b özellikle makrofajlar, monositler ve miyeloid hücrelerde eksprese edilirken, bağışıklık hücresi kontaminasyonunu engellemek için negatif belirteç olarak kullanılırlar. Florokromları bağlanma özelliklerine göre hücre yüzeyi belirteçlerine atayın ve floresan kanallarında örtüşmeden emin olun. Örneğin, bu deneyde CD90 ve CD68 aynı florokromu paylaşır; bu nedenle, aynı santrifüj tüpüne eklemeyin. Vimentin antikoru ile kuluçkadan önce, hücre zarını bozmak için fiksasyon ve permeabilizasyon ajanları ekleyin. Akış sitometresinde yeterli floresan kanallar varsa, CD90 ve CD68 gibi işaretleyiciler farklı kanallara atanarak çoklu renk eşzamanlı analiz için tespit verimliliğini ve bilgi içeriğini daha da artırabilir.

  1. EDTA-içermeyen tripsin kullanarak üçüncü nesil RA-FLS'yi sindirin.
  2. Sindirimi tam DMEM ortamı, santrifüj (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ile sonlandırın ve üst yüzeyi atın.
  3. Pelleti PBS'de yeniden askıya alın, hücre sayımı yapın ve hücre konsantrasyonunu PBS kullanarak 1 × 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın.
  4. Hücreleri üç santrifüj tüpüne dağıtın, her tüpe 200 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
  5. CD11b antikoru (evrensel antikor seyreltici ile 1:100 seyrelmiş) son hacimde 100 μL ile Tube 1'e ekleyin. Vortex karıştırmak için.
    1. 15 dakikalık kuluçkadan sonra, Tüp 1'e 1 mL fiksasyon/permeabilizasyon ajanı ekleyin, vortex ile karıştırın ve ışıktan korunarak 30 dakika kuluçka yapın.
    2. Tüp 1'e 1 mL fiksasyon/permeabilizasyon tamponu ekleyerek permeabilizasyonu sonlandırın, vortexi karıştırın, santrifüj yapın (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatantı atın.
    3. 100 μL vimentin ve CD68 antikor kokteyli hazırlayın (her biri evrensel antikor seyreltici 1:100 oranında seyreltilmiş), Tüp 1'e ekleyin, vortex karıştırın ve ışıktan korunarak 30 dakika kuluçka yapın.
    4. Tüp 1'e 1 mL fiksasyon/permeabilizasyon tamponu ekleyin, vortex karıştırın, santrifüj (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatantı atın.
    5. Tube 1'e 100 μL Alexa Fluor 488 ile konjuge edilmiş anti-tavşan IgG ikincil antikoru (evrensel antikor seyrentici olarak 1:50 seyreltilmiş) ekleyin. Vortex ile ışıktan korunarak 30 dakika boyunca karıştırıp kuluçka için.
    6. Tüp 1'e 1 mL Buffer ekleyin, vortex karıştırın, santrifüj yapın (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ve süpernatantı atın.
    7. Tüp 1'e 300 μL Buffer ekleyin ve yükleme örneği için vortex karıştırın.
  6. CD90 ve CD14 antikorlarını (her biri evrensel antikor seyreltici ile 1:100 seyreltilmiş) Tüp 2'ye eklemek, nihai hacmi 100 μL. Tube 3'ü negatif kontrol olarak antikorsuz bırakın.
    1. 15 dakikalık kuluçkadan sonra, 2 ve 3 numaralı tüplere 1 mL PBS ekleyin.
    2. Santrifüj tüpleri 2 ve 3 (4 °C, 500 × g, 5 dakika), üst yüzeyi atıyor, 300 μL Buffer ekliyor ve yükleme örneği için vortex karıştırıyor.
  7. Hazırlanan örneklerin akış sitometrisi ile alınmasını gerçekleştirin.
  8. Akış sitometrisi verilerini analiz edin ve uyumlu yazılım kullanarak istatistikleri gerçekleştirin.

6. MTS testi kullanılarak TNF-α kaynaklı RA-FLS proliferasyonunun ölçülmesi

  1. EDTA-içermeyen tripsin kullanarak üçüncü nesil RA-FLS'yi sindirin.
  2. Sindirimi tam DMEM ortamı, santrifüj (4 °C, 500 × g, 5 dakika) ile sonlandırın ve üst yüzeyi atın.
  3. Pelleti tam DMEM ortamında yeniden süzüldürün, hücre sayımı yapın ve 1 × 10⁵ hücre/L olarak seyreltin.
  4. Yeniden askıya alınmış hücreleri, her kuyu başına 100 μL ile 96 kuyu uzunluğunda bir plakaya tohumlayın.
  5. Plakayı hücre kültüründeki kuluçka içinde, hücre yapışması gerçekleşene kadar inkübe edin, ardından boş kontrol ve müdahale gruplarına bölünün.
  6. Müdahale grubuna 10 ng/mL TNF-α ve boş kontrol grubuna eşit hacimde PBS eklenin.
  7. 24 saatlik müdahaleden sonra, her kuyuya 10 μL MTS reaktifi eklenin ve hücre kültüründeki kuluçka aşamasında devam edin.
  8. 1 saat kuluçkadan sonra, mikroplaka okuyucu kullanarak 490 nm'de absorbansı (OD) ölçün.
  9. Her kuyunun OD değerine göre hücre çoğalma yaşamını hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü kullanarak kısa süreli, hastadan kaynaklanan RA-FLS'yi başarıyla izole ettik. Prosedürel iş akışının şematik diyagramı sunulmaktadır (Şekil 1). Işık mikroskopisinde, RA-FLS baskın morfolojik fenotipi olan iğne şeklinde ve düzensiz çokgen hücreler sergilemiştir. Hücreler, uzun süreçlerle geniş sitoplazmik yayılım gösterdi. Hücre sınırları, hücrelerden hücrelere temas veya örtüşme alanlarında biraz belirsiz görünüyordu. Hücrelerin çoğu, polarize uzan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek hücre canlılığı, karakteristik fenotip, spesifik belirteç ekspresyonu ve inflamatuar uyarılara fonksiyonel yanıt verme yeteneği ile RA hastalarından RA-FLS'nin izolasyonu ve kısa süreli kültürü için tekrarlanabilir bir yöntem oluşturur.

Kritik adımlar ve teknik hususlar
Bu yöntemin güvenilirliği birkaç kritik adıma bağlıdır. İlk olarak, taze sinovial doku, alımdan sonra 4-6 saat içinde enzimatik sindirime tabi tutulmalıd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması belirtmemiş ve Figdraw kullanımının Şekil 1 oluşturma için platformun lisanslama şartlarına uyduğunu doğrulamaktadır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82074223 ve 8207141673) ve merkezi hükümet düzeyindeki Ana Proje olan Değerli Çin tıp kaynaklarının sürdürülebilir kullanımının kurulması (No. 2060302) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488-konjuge anti-tavşan IgGZhongshan Jingqiao BiyoteknolojisiZF-0511
%0,25 Tripsin-EDTA (1X)Gibco25200-072
%4 ParaformaldehitSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-insan CD68biyo-efsane562111
Hayvansız Engelleme ÇözümüHücre Sinyal Teknolojisi15019
APC anti-insan CD90biyo-efsane559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 anti-insan CD11bbidegend563015
CellTiter 96 AQueous Tek Çözelti Hücre Proliferasyon Testi (MTS)PromegaG358A
Kollagenaz IISolarbioC8150
DAPI içeren floresan montaj ortamıZhongshan Jingqiao BiyoteknolojisiZLI-9556
DAPI içeren floresan montaj ortamıZhongshan Jingqiao BiyoteknolojisiZLI-9556
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM), Yüksek GlikozHyCloneSH30022.01
Fetal sığır serumu-Superfine (FBS)Şanghay Zhongqiao Xindan Biyoteknoloji A., Ltd.ZQ0500
FITC anti-insan CD14biyo-efsane325604
PBS, 1& kez; (pH 7.4) Fosfat tamponlu tuzlu suServicebioG4202
Penisillin-Streptomisin Karışımı Çözeltisi (Çift Antibiyotik) 100 kez;Şanghay Zhongqiao Xindan Biyoteknoloji A., Ltd.CSP006
QuickBlock Evrensel Protein Blokajı ve Antikor Sulandırma TamponuBeyotimeP0270-500ml
Rekombinant İnsan TNF-αPeprotech300-01A
Transkripsiyon Faktörü Buffe'u BoyandırıyoreBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Tripsin Çözeltisi (EDTA-sız)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  2. Uke, P., Maharaj, A., Adebajo, A. A review on the epidemiology of rheumatoid arthritis: An update and trends from current literature. Best Pract Res Clin Rheumatol. 39 (1), 9(2025).
  3. Wu, D., et al. Systemic complications of rheumatoid arthritis: Focus on pathogenesis and treatment. Front Immunol. 13, 13(2022).
  4. Chen, G., Yan, Z., Wang, Y., Tao, Q. Rheumatoid arthritis and fibromyalgia syndrome: A bibliometric and bioinformatics perspective on comorbidity research. J Multidiscip Healthc. 18, 6811-6827 (2025).
  5. Zhao, Y., Chen, G. Y., Fang, M. Research trends of rheumatoid arthritis and depression from 2019 to 2023: A bibliometric analysis. J Multidiscip Healthc. 17, 4465-4474 (2024).
  6. Komatsu, N., Takayanagi, H. Mechanisms of joint destruction in rheumatoid arthritis - immune cell-fibroblast-bone interactions. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 415-429 (2022).
  7. Zhang, Y. Y., Gao, Z. J., Chao, S. S., Lu, W. J., Zhang, P. P. Transdermal delivery of inflammatory factor-regulated drugs for rheumatoid arthritis. Drug Deliv. 29 (1), 1934-1950 (2022).
  8. Bottini, N., Firestein, G. S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 9 (1), 24-33 (2013).
  9. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 4, 23(2018).
  10. Liu, Y., et al. Regulatory fibroblast-like synoviocytes cell membrane-coated nanoparticles: A novel targeted therapy for rheumatoid arthritis. Adv Sci. 10 (4), 15(2023).
  11. Li, C. L., et al. A transformable nanoplatform precisely positions fibroblast-like synoviocytes via FAP-α for improved rheumatoid arthritis therapy. Adv Healthc Mater. 15 (2), e03277(2026).
  12. Meng, Q. L., Wei, K., Shan, Y. E3 ubiquitin ligase gene BIRC3 modulates TNF-induced cell death pathways and promotes aberrant proliferation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Front Immunol. 15, 10(2024).
  13. Chen, L., et al. AMPK signaling in osteoarthritis: From mechanisms to targeted therapeutics. Front Pharmacol. 16, 1681610(2025).
  14. Bakinowska, E., et al. The role of mesenchymal stromal cells in the treatment of rheumatoid arthritis. Cells. 13 (11), 17(2024).
  15. Filer, A. The fibroblast as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 413-419 (2013).
  16. Promila, L., et al. Mitochondrial calcium uniporter regulates human fibroblast-like synoviocytes invasion via altering mitochondrial dynamics and dictates rheumatoid arthritis pathogenesis. Free Radic Biol Med. 234, 55-71 (2025).
  17. Wang, X. C., He, J. X., Zhang, Q., He, J., Wang, Q. W. Constructing a 3D co-culture in vitro synovial tissue model for rheumatoid arthritis research. Mater Today Bio. 31, 16(2025).
  18. Shi, R. Y., et al. Monocyte membrane-coated drug nanocrystals for enhanced targeted therapy of rheumatoid arthritis. J Control Release. 384, 14(2025).
  19. Smolen, J. S., et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann Rheum Dis. 79 (6), 685-699 (2020).
  20. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  21. Philippon, E. M. L., et al. A novel 3D spheroid model of rheumatoid arthritis synovial tissue incorporating fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. Front Immunol. 14, 11(2023).
  22. Lin, X., et al. Sesamol serves as a p53 stabilizer to relieve rheumatoid arthritis progression and inhibits the growth of synovial organoids. Phytomedicine. 121, 14(2023).
  23. Lee, M. S., Kim, S., Lee, J. H., Bae, Y. S., Lee, S. K. Synovium-on-a-chip reveals fibroblast-macrophage crosstalk underpinning joint homeostasis and evaluation of gout therapies. Adv Healthc Mater. 14 (18), 16(2025).
  24. Kim, D., et al. 3D in vitro synovial hyperplasia model on polycaprolactone-micropatterned nanofibrous microwells for screening disease-modifying anti-rheumatic drugs. Mater Today Bio. 26, 10(2024).
  25. Murakami, A., et al. Human CD4(+) T cells regulate peripheral immune responses in rheumatoid arthritis via insulin-like growth factor-like family member 2. Sci Immunol. 10 (110), eadr3838(2025).
  26. Yue, S., et al. Unveiling the therapeutic potential: Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Expert Rev Mol Med. 27, e18(2025).
  27. Clister, T., et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single-cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets. Cells. 13 (3), (2024).
  28. Hu, Z., et al. Novel strategy for primary epithelial cell isolation: Combination of hyaluronidase and collagenase I. Cell Prolif. 56 (1), e13320(2023).
  29. Sueters, J., Schipperheijn, R., Huirne, J., Smit, T., Guler, Z. Reproducibility and consistency of isolation protocols for fibroblasts, smooth muscle cells, and epithelial cells from the human vagina. Cells. 14 (2), 76(2025).
  30. Jiang, D. X., et al. Primary isolation, culture, and phenotypic verification of rat knee articular chondrocytes. J Vis Exp. (225), e69509(2025).
  31. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res Ther. 20 (1), 139(2018).
  32. Zhang, F., et al. Deconstruction of rheumatoid arthritis synovium defines inflammatory subtypes. Nature. 623 (7987), 616(2023).
  33. Li, P. F., et al. Comparative proteomic analysis of polarized human THP-1 and mouse RAW264.7 macrophages. Front Immunol. 12, 13(2021).
  34. Zhu, E. B., et al. Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies. Nat Nanotechnol. 19 (12), 1914-1922 (2024).
  35. Sato, N., Bamford, R. N., Bryant, B. R., Tagaya, Y., Waldmann, T. A. Accessory cells precondition naive T cells and regulatory T cells for cytokine-mediated proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), 13(2023).
  36. Krishnaswamy, J. K., Alsén, S., Yrlid, U., Eisenbarth, S. C., Williams, A. Determination of T follicular helper cell fate by dendritic cells. Front Immunol. 9, 16(2018).
  37. Ndeupen, S., et al. Langerhans cells and cDC1s play redundant roles in mRNA-LNP-induced protective anti-influenza and anti-SARS-CoV-2 immune responses. PLoS Pathog. 18 (1), 18(2022).
  38. Walsh, M. C., et al. Osteoimmunology: Interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol. 24, 33-63 (2006).
  39. Koenderman, L., Tesselaar, K., Vrisekoop, N. Human neutrophil kinetics: A call to revisit old evidence. Trends Immunol. 43 (11), 868-876 (2022).
  40. Montero, R. B., et al. bFGF-containing electrospun gelatin scaffolds with controlled nano-architectural features for directed angiogenesis. Acta Biomater. 8 (5), 1778-1791 (2012).
  41. Yang, C. Y., Yuan, W. W., Liao, G. X., Yu, Q. Q., Wang, L. G. Construction of bFGF/heparin and Fe3O4 nanoparticles functionalized scaffolds aiming at vascular repair and magnetic resonance imaging monitoring. Int J Biol Macromol. 286, 15(2025).
  42. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of induced-pluripotent stem cells using fibroblast-like synoviocytes isolated from joints of rheumatoid arthritis patients. J Vis Exp. (116), e54072(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fibroblast Benzeri SinovyositlerH cre zolasyonuSinovyal DokuEnzimatik SindirimKollajenaz SindirimiAk SitometrisiVimentin mm nofloresansTNF Alfa Stim lasyonu
Video yakında

İlgili makaleler