Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Summary

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Abstract

Süper çözünürlüklü mikroskopi (SRM), geleneksel ışık mikroskobisinin kırınım sınırını aşarak hücrealtı yapıların nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Ancak, uyarılmış emisyon azalması (STED) mikroskovi, fotoaktifin lokalizasyon mikroskobu (PALM) / stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) gibi tekniklerin yaygın benimsenmesi, yüksek fototoksisite, özel örnek hazırlama veya karmaşık işlem gibi faktörler tarafından engellenebilir. Burada, çoklu çevrimli süper çözünürlüklü dedektörle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal platformu kullanan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, hesaplamalı işleme ile birleşince, aynı iş akışı içinde konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme arasında doğrudan geçiş sağlar. Protokol, hızlı, yüksek çözünürlüklü ve düşük fototoksisite görüntüleme için kullanıcı dostu bir yaklaşım sunar. Detaylı yöntem, çok renkli floresans, diferansiyel girişim kontrastı (DIC), üç boyutlu Z-yığını yeniden yapılandırması, zaman geçişli canlı hücre görüntüleme, geniş alan döşemesi ve çoklayıcı dizi dedektörünün sunduğu çeşitli süper çözünürlük modları gibi çoklu modal görüntüleme yeteneklerini kapsar. Sistematik karşılaştırmalar, süper çözünürlük modlarının yaklaşık 120 nm yanal çözünürlüğe ulaştığını göstermektedir; bu, geleneksel geniş alan mikroskopisinin kırınım sınırına göre yaklaşık iki kat daha iyi bir gelişme ve aynı platformdaki standart konfokal çalışmaya kıyasla hem çözünürlük hem de sinyal-gürültü oranında (4-8 kat) önemli bir artış sağlar. Tartışma ayrıca, bu teknolojinin sürdürülebilir işleyişini desteklemek için gerekli olan paylaşılan kaynak yönetimi modelinin temel noktalarını da ele almaktadır. Bu entegre rehber, hem yeni hem de deneyimli araştırmacılar ve tesis yöneticileri için, yaşam bilimleri araştırmalarında bu erişilebilir gelişmiş görüntüleme biçiminin potansiyelini benimsemeyi ve en üst düzeye çıkarmayı amaçlayan tesis yöneticileri için değerli bir kaynak olarak hizmet vermektedir.

Introduction

Dinamik subhücre yapılarının görselleştirilmesi, yaşam bilimleri araştırmalarının ilerlemesi için temel bir unsurdur. Ancak, geleneksel optik mikroskopinin çözünürlüğü diyanal olarak yaklaşık 200 nm ile sınırlıdır ve bu da dinamik alt hücresel süreçleri çözme yeteneğini kısıtlar. Bu engeli aşmak için çeşitli süper çözünürlüklü teknikler geliştirilmiştir. Ancak, STED mikroskopi, PALM/STORM ve SIM gibi teknikler, yüksek fototoksisite, özel floroforlar veya örnek hazırlama ihtiyacı, karmaşık hizalama prosedürleri veya yoğun hesaplamalı^{işlem 1,2,3} gibi çok kullanıcılı ortamlarda yaygın benimsenmeye engel teşkil eder.

Bu bağlamda, çoklayıcı dizi dedektörle donatılmış konfokal mikroskop sistemleri, çoklu piksel algılama ve hesaplamalı yeniden atama yoluyla süper çözünürlüklü görüntüleme imkanı sunarak teknik^{eşik 4'ü} önemli ölçüde düşürerek cazip bir alternatif sunar. Bu yaklaşım, her tarama noktasından daha fazla foton toplamak için 32 elementli galyum arsenid fosfit (GaAsP) dedektör dizisi kullanır. Sonraki akıllı dekonvolüsyon algoritmaları bu bilgiyi yeniden atar ve tespit hacmini etkili bir şekilde azaltır. Bu süreç, yanal olarak yaklaşık 120 nm ve eksenli olarak 350 nm uzamsal çözünürlük elde eder; bu, geniş alan mikroskopisindeki kırınım sınırına göre yaklaşık 2 kat iyileştirmeyi temsil eder ve aynı enstrümandaki standart konfokal^mod 4,5,6'ya kıyasla sinyal-gürültü oranında 4-8 kat artış sağlar. Gelişmiş çözünürlük, üstün sinyal kalitesi ve yaygın floresan etiketler ve protokollerle uyumluluğun bu benzersiz birleşimi, geniş uygulama için birincil avantajını oluşturur.

Sonuç olarak, bu erişilebilir süper çözünürlüklü mikroskopi türü, hem sabit hem de canlı hücrelerde organel morfolojisi, sitoskelet dinamikleri, virüs-konak etkileşimleri ve moleküler ortak lokalizasyonun ayrıntılı çalışmalarını mümkün kılan yaşam bilimleri^{araştırmalarında geniş bir uygulama bulmuştur 7,8}. Göreceli yumuşaklığı, canlı örneklerin uzun süreli zaman geçişli gözlemleri için özellikle uygun hale gelir.

Bu tür gelişmiş sistemlerin temel tesislere entegrasyonu, erişimin demokratikleştirilmesi için hayati öneme sahiptir, ancak sürdürülebilir ve etkili çalışmaları belirgin zorluklar yaratmaktadır. Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi gibi kurumsal temel tesislerde, optimal performans ve etki üç temele bağlıdır: (1) standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir görüntüleme protokolleri, (2) titiz rutin bakım ve (3) paylaşılan erişim için etkili bir yönetim çerçevesi. Önceki sistemler⁹için görüntüleme yöntemleri veya genel tesis yönetimi^{ilkeleri 10,11} gibi belirli yönler için değerli kaynaklar mevcut olsa da, modern çoklu dizi dedektörü platformları için detaylı, tekrarlanabilir protokolleri kanıtlanmış bir paylaşılan kaynak yönetim modeliyle bütünleştiren kapsamlı bir rehber şu anda eksiktir. Bu protokol makalesi bu boşluğu kapatmayı amaçlamaktadır.

Genel hedef, ortak kaynak ortamında süper çözünürlüklü görüntüleme için çoklu dizi dedektörü olan konfokal sistemi etkili şekilde uygulamak ve kullanmak için kapsamlı ve adım adım bir rehber sağlamaktır. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; ve tesis yöneticilerinin böyle bir hizmeti kurması veya optimize etmesi. Burada, sistem yapılandırmasını, çok modlu görüntüleme protokollerini (çok renkli, 3D, canlı hücre, döşeme ve süper çözünürlüklü modları kapsayan) ve kanıtlanmış bir paylaşılan yönetim modelini sistematik olarak detaylandırıyoruz. Bu entegre rehber, bu güçlü görüntüleme modalitesinin potansiyelini ve erişilebilirliğini en üst düzeye çıkaran bir kaynak olarak hizmet vermektedir.

Protocol

Biyolojik örneklerle ilgili tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Çekirdek Tesisleri'nin yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylandı (Onay Sertifikası No. BSL20235710079).

NOT: Hücre kültürleriyle ilgili tüm işlemler, aksi belirtilmedikçe steril koşullarda, Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. Bu protokol, mikroskop sisteminin kurulduğunu ve lazer güçlerinin kalibre edildiğini varsayar. Anahtar reaktifler, tüketim malzemeleri ve ekipmanlar (örneğin, görüntüleme çanakları, kapak camı, montaj ortamı) için ayrıntılı teknik özellikler ve önerilen tedarikçiler Malzemeler Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Numune hazırlama

NOT: Başarılı süper çözünürlüklü görüntüleme, optimal örnek hazırlama ile başlar. Yüksek kaliteli, 1,5 kalınlıkta (0,17 mm) cam tabanlı kaplama görüntüleme çanaklarının kullanımı, yüksek NA yağ daldırma objekteflerinin düzeltme yakasıyla uyum sağlamak ve küresel sapmayı önlemek için gereklidir. Tüm santrifüj adımları 300 × g ile 5 dakika boyunca yapılmalıdır, belirtilmedikçe.

1. Çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme için sabit hücre örneği hazırlama (örneğin, COS7 hücreleri)
   NOT: Bu protokol, mikrotübullar (Alexa Fluor 568) ve mitokondriler (Alexa Fluor 488) için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nükleer karşı boyama ile immünboyamayı tanımlar, Şekil 1'de gösterildiği gibi.
   1. Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) kültür COS7 hücreleri, %5 CO₂ nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile 37°C'de takviye edilmiştir.
   2. Hücreleri 35 mm cam tabanlı görüntüleme çanaklarına 1.0 × 10⁵ hücre/çanak yoğunluğunda yerleştirin. Hücrelerin yapışmasını ve %60-70 birleşimde büyümesini (genellikle 24 saat) bırakın.
   3. Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış (37°C) fosfatla tamponlu tuzlu su (PBS) ile nazikçe yıkar. Hücreleri PBS'ye 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçka geçirerek sabitleyin.
   4. PFA çözeltisini aspire edin (tehlikeli atık olarak muamele edin). Hücreleri 2 mL PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamada nazikçe sallayarak 5 dakika kuluçka yapın.
   5. Permeabilizasyon ve bloklama: Hücreleri 1 mL permeabilizasyon/bloklama tamponu (%0,1 v/v) Triton X-100, %1 (w/v) sığır serum albümini (BSA) PBS'de 30 dakika RT ile inkübe edin.
   6. Birincil antikor kuluçkası: Hücreleri, antikor sulandırma tamponunda (PBS'de %1 BSA) 4°C'de gece boyunca (veya RT'de 1-2 saat) α-tubulin (fare monoklonal) ve TOMM20 (tavşan poliklonal) karşı primer antikor karışımıyla inkübe yapın. Cam yüzeyi kapatmak için her tabak başına 300 μL kullanın.
   7. Yıkama: Birincil antikor çözeltisini dikkatlice aspire edin. Hücreleri 2 mL PBS ile üç kez yıkayıp %0,05 Tween-20 (PBST) içeren 2 mL PBS ile her yıkamada 5 dakika boyunca kullanın.
   8. İkincil antikor ve nükleer boyama: Floresan ikincil antikorlar ve DAPI karışımını ışıktan korunan antikor seyreltme tamponunda (%1 BSA/PBS) hazırlayın.
      1. Eşek anti-fare IgG'sini Alexa Fluor 568 (1:500) ile konjuge edilmiş ve eşek anti-tavşan IgG'sini Alexa Fluor 488 (1:500) ile konjuge edilmiş olarak kullanın.
      2. Nükleer boyama için DAPI'yi nihai konsantrasyon olarak 1 μg/mL ile ekleyin. Bu karışımdan hücrelere 300 μL uygulayın ve karanlıkta RT'de 1 saat kuluçka yapın.
   9. Son yıkama: Boyama çözeltisini aspire edin ve hücreleri 2 mL PBS ile üç kez yıkayın, her yıkamada 5 dakika.
   10. Montaj ortamı uygulayın: PBS'yi görüntüleme kabından dikkatlice aspire ederek örneği hafifçe nemli bırakın. Hemen cam taban bölgesine küçük bir damla (~20 μL) sertleştirilmiş anti-fade montaj ortamı (örneğin, ProLong Gold) uygulayın.
   11. Kapat ve kürle: #1.5 yüksek hassasiyetli kapak camını damlanın üzerine nazikçe indirin, böylece baloncuklardan kaçının. Montaj malzemesinin gece boyunca RT ile karanlıkta veya daha hızlı kürlenme gerekiyorsa 37°C'de 2-4 saat boyunca kürlenmesine izin verin.
2. Zaman geçişli görüntüleme için canlı hücre örneği hazırlığı (örneğin, floresan protein etiketi ifade eden Hep3B hücreleri).
   NOT: Bu protokol, mitokondrilere yönelik floresan bir proteini (örneğin, EGFP) stabil şekilde ifade eden Hep3B hücrelerinin görüntülenmesini tanımlar.
   1. Minimum temel ortamda (MEM) %10 FBS takviyesi olan Hep3B hücrelerini kültürleyin. Plaka hücreleri, 35 mm cam tabanlı görüntüleme çanaklarına (1.5 kapak camı) 0.8 × 10⁵ hücre/tabak yoğunluğunda yerleştirin. Optimal sağlık ve görüntüleme yoğunluğu için hücrelerin yaklaşık %70-80 birleşme seviyesine ulaşmasına izin verin (genellikle 18-24 saat).
   2. Görüntüleme için hazırlık: Görüntüleme gününde, standart kültür ortamını 2 mL önceden dengelenmiş (37°C, en az 30 dakika boyunca %5 CO₂ ) ile nazikçe değiştirin; fenol kırmızısı içermemiş, düşük floresans görüntüleme ortamı ile %10 FBS ve gerekirse_CO2 kuluçka makinesi dışında pH stabilizasyonu için 25 mM HEPES tamponu ile takviye edilsin. Bu, arka plan floresansını en aza indirir ve görüntüleme sırasında fizyolojik pH'ı korur.
      NOT: Çanak, sıcaklık, odak ve hücre sağlığı stabilizasyonunu sağlamak için çevresel odada önceden ısıtılmış mikroskop aşamasında en az 30-45 dakika alışmasına izin verin.

2. Mikroskop sisteminin başlatılması, başlatılması ve temel hizalama

1. Mikroskop ana ünitesi, lazer fırlatma modülü (405, 488, 561 ve 640 nm aralıklarında katı hal lazerler içerir), LED ışık kaynağı ve kontrol bilgisayarı için güç veriliyor.
   1. Lazerlerin ısınmasına ve en az 15-20 dakika stabilleşmesine izin verin. Bu, özellikle nicel veya zaman geçişli deneyler için kararlı lazer güç çıkışı için kritik öneme sahiptir.
2. Mikroskop işletim yazılımını başlatın.
3. Ana arayüzden 'Mikroskop' > 'Başlat' seçeneğini seçin veya yazılımın başlatma sihirbazını takip edin.
4. Yazılımda, 'Edinim' paneline gidin. Objektif lens açılır menüsünden 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Yağ ' veya deneyiniz için uygun hedefi seçin.
5. Bir damla daldırma yağı (kırılma indeksi = 1.518) doğrudan objektİFin ön lensine uygulayın. Baloncukları sokmaktan kaçının.
6. Canlı hücre görüntüleme için, görüntülemeden en az 45-60 dakika önce çevresel odayı ve aktif odak stabilizasyon sistemini (örneğin, 'Belirsiz Odak' >) aktive edin. Sıcaklığı 37°C,_CO2'den %5'e, nemi ise >%60'a ayarlayın. Sistemin stabilleşmesine izin verin. Emniyeti hazne sensörleriyle doğrulayın.
7. Sistem artık örnek yükleme ve görüntüleme parametreleri kurulumuna hazırdır.

3. Çok renkli floresans görüntüleme

1. Hazırlanan örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Aşamayı dikkatlice kaldırın, kapak camı daldırma yağına temas edince.
2. Satın alma yazılımında 'Edinim' sekmesine gidin ve Yeni bir deney oluştur seçeneğini seçin.
3. Kullanılan floroforlara karşılık gelen birden fazla görüntüleme izi (kanal) ekleyin. Şekil 1'deki örnek için, şunu yapılandırın:
   1. Yol 1 (DAPI): Uyarılma 405 nm, tespit 410-480 nm.
   2. Pist 2 (Alexa Fluor 488): Uyarılma 488 nm, tespit 495-550 nm.
   3. Parça 3 (Alexa Fluor 568): Uyarılma 561 nm, algılama 570-620 nm.
4. Her ray için konfokal iğne deliği çapını 1 Airy Unit (1 AU) olarak ayarlayın.
5. Her kanal için lazer gücü ve dedektör kazancı aşağıdaki yinelemeli süreci optimize edin:
   1. İlk kanalı seçin (örneğin, DAPI). 'Live' tarama moduna geçin.
   2. Başlangıç lazer gücünü düşük bir değere (örneğin %0,1-0,5) ayarlayın. Dedektör Kazancını doğrusal aralığında orta seviyeye ayarlayın (örneğin, GaAsP PMT için 700 V).
   3. Lazer gücünü kademeli olarak artırın ve hedef yapılar canlı görüntüde arka planın üzerinde net görünür hale geldi.
   4. Histogram ekranını açın. Piksel doygunluğu olmadığından emin olun (histogram sağ kenarda üst üste yığılmamış). Gerekirse lazer gücünü azaltın.
   5. Dedektör Kazancını parlak ve düşük gürültülü bir görüntü elde etmek için ayarlayın. Aşırı gürültüyü önlemek için 850 V'nin üzerindeki kazançlardan kaçının.
   6. Kalan tüm floresan kanalları için 3.5.1-3.5.5 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Lazer gücü, kazanç ve piksel bekleme süresini dengeleyerek sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarırken foto hasarını en aza indirin. Canlı hücreler için daha düşük güç ve daha kısa kalma sürelerini önceliklendirin.
6. Görüntü formatını (piksel sayısı) ve piksel kalma süresini ayarlayın.
   1. Piksel boyutunu Nyquist kriterini karşılayacak şekilde ayarlayın: piksel boyutu ≤(çözünürlük / 2.3). Standart konfokal görüntüleme için (yanal çözünürlük ~250 nm) piksel boyutu ≤108 nm.
   2. Varsa bunu otomatik hesaplamak için yazılımın 'Nyquist ' örnekleme tuşunu kullanın.
   3. Piksel bekleme süresini ayarlayın. Daha yüksek sinyal-gürültü oranı için daha uzun bir bakışlama süresi (örneğin 1.0-2.0 μs) veya daha hızlı görüntüleme için daha kısa bir bakış süresi (örneğin 0.5-1.0 μs) kullanın.
7. Çapraz konuşmayı en aza indirmek için izler arasında 'Ardışık Tarama' modunun seçildiğinden emin olun.
8. Tek bir görüntü elde etmek için 'Başlat' tuşuna tıklayın. Fotoğrafı ilgili meta verilerle birlikte kaydedin.

4. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntüleme

1. Satın alma yazılımının 'Acquisition' sekmesinde 'Yeni bir kanal ekle'yi seçin ve iletim ışık algısı için ayarlayın.
2. Uygun iletim ışık dedektörü seçin (genellikle yazılımda T-PMT (iletim ışık fotoçarpan tüp) veya ESID (harici sistem arayüz detektörü) olarak adlandırılır).
3. DIC prizma ve polarizator konfigürasyonu:
   1. Donanım kontrol paneli veya yazılım arayüzünden, hedefinize uygun DIC prizmasını seçin (örneğin, 63x bir hedef için 'DIC III').
   2. Seçilen prizmayı ışık yoluna yerleştirin.
4. Optimal kontrast için polarizörü ve DIC kaydırıcısını ayarlayın:
   1. Analizörü (polarizatörü) 'Live' görüntüdeki arka plan koyu veya çok loş görünene kadar döndürün.
   2. Canlı görüntüyü izlerken, DIC kaydırıcısının konumunu küçük adımlarla yavaşça ayarlayın.
   3. Hücresel özellikler (örneğin, zarlar, çekirdekler) nötr gri arka planda belirgin bir gölge kasalı, sözde üç boyutlu bir rölyefle ortaya çıkana kadar optimize edilir.
5. DIC'nin aydınlatma dalga boyunca, görünür aralıkta (örneğin, 488 nm veya 546 nm) bir değere ayarlayın.
6. Iletim yoğunluğunu (lazer veya lamba gücü) ve dedektör kazancını ileten ışık kanalı için ayarlayarak doygunluk olmadan net bir görüntü elde edin.
7. DIC görüntüsünü edinin.

5. Üç boyutlu yeniden yapılandırma için Z-yığını edinimi

NOT: Z-yığını tanımlamadan önce, tüm görüntüleme parametrelerini (lazer gücü, kazanç, iğne deliği, piksel boyutu) Bölüm 3'te açıklandığı gibi tek, optimal bir odak düzleminde yapılandırın. Bu, tüm optik bölümlerde tutarlı ayarlar sağlar.

1. 'Acquisition' sekmesinde 'Z-stack' modunu seçin.
2. İlgi hacmini tanımlayın:
   1. Hızlı hızlı canlı tarama kullanarak, ilgi gördüğünüz en üst yapıya odaklanın.
   2. 'Set First' (veya 'Top') tuşuna tıklayın.
   3. İlgi alanınızın en alt yapısına dikkatlice odaklanın.
   4. 'Son Ayarlay' (veya 'Alt') tuşuna tıklayın. Yazılım toplam derinliği gösterecek.
3. Z-step Boyutu'nu, eksenel yönde Nyquist örnekleme kriterini karşılayacak şekilde ayarlayın. (genellikle d_r/2.3, burada d_r eksenel çözünürlüktür). 63x/1.4 NA yağ hedefi için 0.3-0.4 μm kullanın.
4. Alternatif olarak, yazılımın 'Optimal' veya 'Nyquist' butonunu kullanarak adım boyutunu otomatik hesaplayabilirsiniz.
5. Her kanal için görüntüleme parametrelerini (lazer gücü, kazanç, iğne deliği = 1 AU) Bölüm 3'te açıklandığı şekilde yapılandırın. Zayıf sinyaller için, tek bir 2B görüntüye kıyasla lazer gücünü veya kazancını biraz artırmayı düşünün.
6. Tüm görsel yığını toplamak için satın alma işlemini başlatın.
   NOT: Toplam alım süresi = (Tek bir dilimden Kare Süresi) × (Dilim sayısı)
   Özellikle canlı örnekler için buna göre plan yapın.
7. 3D Yeniden İnşaat ve Görselleştirme:
   1. Yazılımın 'İşleme' modülünü (örneğin, 3D projeksiyon fonksiyonu) kullanın veya görüntü yığınını ImageJ/Fiji gibi özel yazılımlarda açın.
   2. Tüm odak sinyallerini tek bir 2D görüntüde görüntülemek için maksimum yoğunluk projeksiyonları (MIP) oluşturun.
   3. Gerçek bir 3D temsil için hacimli render uygulayın. Parlaklığı, opaklığı ve aydınlatmayı gerektiğinde ayarlayın.
   4. Eksenel kapsam ve kayıtları incelemek için Ortogonal görünümler (XZ ve YZ kesitleri) oluşturun.

6. Canlı hücreler için zaman geçişli görüntüleme

1. Canlı hücreleri Bölüm 1.2'de tarif edildiği gibi hazırlayın. ve çanağı çevre odasındaki önceden ısıtılmış mikroskop aşamasına monte eder.
2. Saptırmayı sağlamak için Bölüm 2.6'da tanımlandığı gibi en az 45-60 dakika boyunca numunenin uyum sağlamasına izin verin.
3. Sağlıklı, iyi aralıklı hücrelerle görüş alanına gidin ve Bölüm 3.5'e göre optimize edilmiş parametrelerle tek bir yüksek kaliteli anlık görüntü elde edinin.
4. Aktif odak stabilizasyon sistemini devreye alın (örneğin, Belirli odak veya benzeri). Bu, termal kaymayı telafi etmek için uzun vadeli deneyler için pazarlık konusu değildir.
5. 'Acquisition' sekmesinde 'Zaman Serisi' modunu seçin.
6. Hız, çözünürlük ve fototoksisite arasındaki gerekli dengeye göre uygun görüntüleme modunu seçin:
   1. Daha az dinamik süreçlerde maksimum mekansal çözünürlük için 'SR' (Süper Çözünürlük) modunu seçin.
   2. Birçok organel dinamiğine uygun bir denge için, 'SR 2 Y ' veya 'SR 4 Y ' (hızlandırılmış süper çözünürlük modları) seçin.
   3. Süper çözünürlük olmadan çok yüksek hızlı görüntü almak için 'Konfokal' veya 'Co 2 Y' modunu seçin.
7. Deneysel zaman çizelgesini tanımlayın: Deneyin toplam süresini ve ardışık kareler arasındaki zaman aralığını (Δt) belirleyin. (örneğin, mitokondriyal hareketlilik için 5-30 s.
8. Görüntüleme parametrelerini en aza indirmek için optimize edin:
   1. Algılanabilir bir sinyal veren en düşük lazer gücünden başlayın.
   2. Dedektör kazancını, doğrusal aralığı (600-850 V) içinde ayarlayarak kullanılabilir bir sinyal seviyesi elde edin; lazer gücünü artırmak yerine kazancı tercih edin.
   3. Görüntü kalitesi gereksinimleriyle uyumlu en hızlı tarama hızını (en kısa piksel bekleme süresi) kullanın.
9. Zaman geçişli satın alma işlemini başlatın. İlk birkaç kareyi odak kararlılığı ve hücre sağlığı açısından izleyin.

7. Büyük alanlı fayans tarama görüntüleme

1. 'Acquisition' sekmesinde 'Tile Scan' modunu seçin.
2. TilingRegion'u iki yöntemden biriyle tanımlayın:
   1. Düzene tabanlı: X ve Y yönlerindeki karo sayısını belirtin (örneğin, 3 x 3).
   2. ROI bazlı: İlgi alanını tanımlamak için 'Live' görüntünün üzerine manuel olarak dikdörtgen çizin. Yazılım, gereken karo sayısını otomatik olarak hesaplar.
3. Bitişik taşlar arasındaki örtüşmeyi %10-15 olarak ayarlayın.
   NOT: Bu örtüşme, yazılımın dikiş algoritmasının kesintisiz bir bileşik görüntü oluşturması için yeterli bilgi sağlar.
4. Tek bir karo için görüntü parametrelerini (lazer gücü, kazancı, çözünürlük) statik bir görüntü için yaptığınız gibi yapılandırın.
   NOT: Çok büyük fayanslı alanlar için, toplam alım süresini pratik tutmak ve fotobeyazmayı en aza indirmek için daha hızlı tarama modu (örneğin, 'Co 2 Y') kullanmayı düşünün.
5. Döşeme edinmeye başlayın. Yazılım otomatik olarak karoları alır ve diker.
6. Edindikten sonra, özellikle karo sınırlarında dikişlenmiş görüntüyü dikkatlice inceleyin. Gerekirse yazılımın manuel dikiş ayarlama araçlarını kullanın.

8. Çoklayıcı dizi dedektörünü kullanarak süper çözünürlüklü görüntüleme

1. 'Acquisition' sekmesinde mod seçicisine gidin, 'Smart Setup'a tıklayın ve 'Airyscan' modunu seçin. Sonra çoklayıcı dizi dedektörünün çalışma modu olarak 'SüperÇözünürlük'ü seçin.
2. Deneysel önceliklere göre belirli bir satın alma modunu seçin:
   1. 'SR' Modu: Mümkün olan en yüksek uzamsal çözünürlük için (~120 nm yanal). Sabit örnekler için kullanım.
   2. 'SR 2 Y' Modu: Çözünürlük ve hız arasında bir denge sağlar.
   3. 'SR 4 Y' Modu: En hızlı süper çözünürlüklü mod (teorik olarak ~25 fps'e kadar çizgi hızı), ışık dozunu en aza indirmek için canlı hücre görüntüleme için optimize edilmiştir.
   4. 'Co 2 Y' Modu: Süper çözünürlük gerekmediğinde gelişmiş sinyal-gürültü oranı ile konfokal benzeri görüntüleme hızı sunar.
      NOT: Çözünürlük değerleri (örneğin, 120 nm) ideal koşullarda sistem spesifikasyonlarıdır¹². Gerçek çözünürlük, örnek hazırlığı, sinyal-gürültü oranı ve doğru işlemeye bağlıdır.
3. Görüntüleme parametrelerini (lazer gücü, dedektör kazancı) yapılandırın.
   1. Canlı hücre görüntüleme için, foto hasarını azaltmak için konfokal moddan daha düşük lazer gücüyle başlayın.
   2. Loş, sabit örnekler için, yeterli sinyal-gürültü oranını sağlamak için daha yüksek lazer gücü ve/veya kazanç gerekebilir.
   3. 'Canlı' modunda temiz ve yüksek kontrastlı görüntü elde eden minimum lazer gücünü bulun.
4. Piksel boyutunu ayarlayın ve bekleme süresini belirleyin.
   1. Geliştirilmiş çözünürlüğü yakalamak için, piksel boyutunu Nyquist kriterini karşılayacak şekilde ayarlayın: piksel boyutu ≤(istenen çözünürlük / 2.3). SR modu için (hedef 120 nm), piksel boyutu ≤~52 nm olarak ayarlanın.
   2. Eğer mümkünse, yazılımın 'Optimal' veya 'Nyquist' butonunu kullanarak bunu otomatik olarak hesaplayabilirsiniz.
5. Görüntüyü edin. Ham veri çoklu sinyaller içerir ve henüz süper çözüm değildir.
6. Elde edilen verileri işleyerek süper çözünürlük elde edin:
   1. Yazılımın işlem modülüne gidin.
   2. Veri setini seçin ve 'Süper Çözünürlük İşleme' fonksiyonunu seçin.
   3. 'Otomatik' ayarlarıyla başlayın. Düşük SNR verileri için, keskinliği artırmak için 'Güç' ve 'Gürültü Filtresi'ni manuel olarak ayarlayarak artefaktlar yaratmadan.
   4. (İsteğe bağlı) Özellikle 3B yığınlarda en yüksek isabetlilik için ek bir eklem dekonvolüsyon (jDCV) adımı uygulanır.
   5. İşleme başlatın. Gerçek detayların geliştirilmesini doğrulamak için işlenmiş ve işlememiş görüşleri karşılaştırın.
7. (İsteğe bağlı) Modlar arasında sinyal-gürültü oranının (SNR) nicel karşılaştırması için:
   1. Aynı örnekten farklı modlarda görüntüler alın.
   2. Analiz yazılımında, bir ilgi alanı (ROI) tekdüze bir yapıda tanımlanır ve ortalama sinyal yoğunluğunu ölçür.
   3. Arka plan ROI'sini tanımlayın ve arka plan yoğunluğunun standart sapmasını ölçün.
   4. SNR = (ortalama sinyal) / (arka planın standart sapması) hesaplayın.
8. (İsteğe bağlı) Flüoresan boncuklarla ampirik sistem çözünürlük ölçümü için:
   1. 100 nm floresan boncuklardan bir örnek hazırlayın.
   2. Nyquist örnekleme ile SR modunda izole bir boncuktan bir Zstack edinin.
   3. Yığını süper çözünürlük ve (isteğe bağlı) jDCV ile işleyin.
   4. Yazılımın 'PSF Ölçüm' aracını kullanarak bir 3D Gauss cihazı takabilir ve tam genişliği yarı maksimumda (FWHM) kaydedebilirsiniz.

Results

Çok renkli floresans görüntüleme
Sabit COS7 hücrelerinin çok renkli floresans görüntülemesi Bölüm 3'te açıklandığı gibi gerçekleştirildi. DAPI nükleer karşı boyama ile birlikte α-tubulin (mikrotübullar) ve TOMM20 (mitokondriler) karşı antikorlar kullanıldı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, çekirdekler (mavi), mitokondriler (yeşil, Alexa Fluor 488) ve mikrotübullar (kırmızı, Alexa Fluor 568) yüksek özgüllükle ve minimal spektral çapraz konuşm...

Discussion

Burada sunulan entegre protokol, çoklu dizi süper çözünürlüklü dedektörle donatılmış modern bir konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme yeteneklerini, sürdürülebilir bir paylaşılan kaynak çerçevesi içinde uygulamak için kapsamlı bir yol haritası sunar. Bu bölüm, yöntemin kritik yönlerini, pratik uygulamasını ve biyogörüntüleme alanındaki konumunu sentezler. Bu protokolün başarılı bir şekilde uygulanması birkaç kritik adıma bağlıdır. İlk olarak, titizlikle örnek hazırlamak teme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
COS7 hücreleri	ATCC (veya benzeri)	CRL-1651	Afrika yeşil maymun böbreği fibroblast hücre hattı. Çok renkli süper çözünürlüklü görüntüleme için sabit hücre örneklerinin hazırlanmasında kullanılır;
Eşek anti-fare IgG, Alexa Fluor 568 konjugatı	Invitrogen (veya benzeri)	A10037	Mikrotübul boyama için ikincil antikor. 1:500 seyreltme ile kullanılır
Dulbecco' s modifiye kartal ortamı (DMEM), yüksek glikoz	Gibco (veya benzeri)	11965092	COS7 hücreleri için standart kültür ortamı, %10 FBS takviyesi.
Fetal Sığır Serumu (FBS), ısıyla inaktive edilmiş	Gibco (veya benzeri)	10082147	Serum takviyesi tüm hücre kültür ortamlarında %10 (v/v) oranında kullanılmıştır.
Cam tabanlı Görüntüleme Çanakı (35 mm, µ-Çanak, #1.5 polimer kapak kayağı, 0.17 mm kalınlık)	ibidi (veya benzeri)	81156	Hücre kaplaması ve görüntüleme için substrat. Yüksek NA yağ batırılma hedefleriyle uyumluluk açısından kritik.
Görüntü İşleme & analiz yazılımı (ZEN modülleri)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (mavi)	3D yeniden yapılandırma, süper çözünürlüklü işleme (örneğin, Airyscan İşleme), PSF ölçümü ve SNR analizi için kullanılır.
ImageJ / Fiji	Açık Kaynak	Yok	Ek 3D yeniden yapılandırma, ortogonal görünümler oluşturmak ve genel görüntü analizi için kullanılır.
Daldırma yağı (Kırılma İndeksi = 1.518)	Carl Zeiss (veya benzeri)	444960-0000-000	Yağ batdırma objektifleri için (örneğin, 63x/1.4 NA).
Çoklu dizi dedektörü ile lazer taramalı konfokal mikroskop sistemi (örneğin, Airyscan 2 ile ZEISS LSM 900)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	Protokolde tanımlanan tüm konfokal ve süper çözünürlüklü modlar için kullanılan birincil görüntüleme platformu.
Earle ile Minimum Temel Orta (MEM) s Tuzları	Gibco (veya benzeri)	11095080	Hep3B hücreleri için standart kültür ortamı, %10 FBS takviyesi.
Fare anti-&alfa;-tubulin monoklonal antikor (Klon DM1A)	Sigma-Aldrich (veya benzeri)	T6199	Mikrotubulların etiketlenmesi için birincil antikor. 1:500 seyreltme ile kullanılır
Paraformaldehit (PFA), PBS'de %4	Jinpan  (veya benzeri)	TBS5083	Hücreler için sabitleyici. Oda sıcaklığında 15 dakika kullanın. Uygun önlemlerle müdahale edin.
Fenol-kırmızısı olmayan görüntüleme ortamı	Gibco (veya benzeri)	21063029	Canlı hücre görüntüleme için kullanılan düşük otofloresans ortamı. %5 CO2 ile 37°°° derecede önceden dengelenmiştir; Kullanmadan önce C.
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS), 1X, pH 7.4	CellWorld (veya benzeri)	C0162-311	Protokol boyunca yıkama ve seyreltme tamponu olarak kullanıldı.
ProLong altın antiifade montaj cihazı	Invitrogen (veya benzeri)	P36930	Sabit örneklerde floresansı korumak için sertleştirilmiş montaj ortamı.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (veya benzeri)	T8787	Hücre geçirgenliği için %0,1 (v/v) oranında kullanılmıştır
Tween-20	Sigma-Aldrich (veya benzeri)	P9416	Antikor kuluçkasından sonra yıkama adımlarında PBS (PBST) içinde %0,05 (v/v) oranında kullanılır.
Sığır serum albümini (BSA), Fraction V	Sigma-Aldrich (veya benzeri)	A7906	PBS'de bloklama ve antikor seyreltme tamponunun bir bileşeni olarak %1 (w/v) olarak kullanılır.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma-Aldrich (veya benzeri)	D9542	Nükleer karşı leke. Son konsantrasyon 1 & mikro; g/mL.
Eşek anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 488 eşlenimi	Invitrogen (veya benzeri)	A21206	Mitokondriyal boyama için ikincil antikor. 1:500 seyreltme ile kullanılır
Floresan mikroküreler (boncuklar), çapı 100 nm	Invitrogen (örneğin, TetraSpeck™) veya benzeri	T7279	Sistemin ampirik ölçümü için kullanılır' s nokta yayılım fonksiyonu (PSF) ve çözünürlük.
EGFP-mitokondrileri stabil şekilde ifade eden Hep3B hücreleri	IMMOCELL	IM-H367	Mitokondriyal matrikse hedeflenen EGFP'yi istikrarlı şekilde ifade etmek üzere insan hepatom hücre hattı tasarlandı. Canlı hücre zaman geçişli görüntüleme için kullanılır.
HEPES tampon çözeltisi, 1 M	Gibco (veya benzeri)	15630080	CO2 kuluçka makinesi dışında canlı görüntüleme sırasında pH stabilizasyonu için görüntüleme ortamında son konsantrasyon olarak 25 mM konsantrasyonda kullanılır.
Yüksek hassasiyetli kaplama camı (#1.5, 0.17 mm kalınlığı)	Marienfeld (veya benzeri)	107052	Sabit örnekleri monte etmek için kullanılır.
Mikroskop işletim yazılımı (örneğin, ZEN mavi baskısı)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (mavi)	Sistem kontrolü, görüntü edinimi ve temel işleme için kullanılır.
Objektif lens: Plan-apokromat 63x/1.40 NA Oil DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılan birincil hedef.
Tavşan anti-TOMM20 poliklonal antikor	Abcam (veya benzeri)	AB186735	Mitokondri etiketlemesi için birincil antikor. 1:1000 seyreltme ve nbsp ile kullanılır;