Yöntem makalesi

Ağ Farmakolojisi ve Moleküler Bağlama Analizlerini Standartlaştırmak İçin İlaç Keşfi İçin Tekrarlanabilir Hesaplamalı İş Akışı

460 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70171

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of TCM Constitution and Preventive Treatment of Disease, Wangqi Academy of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 3School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 4Sunsimiao Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu standartlaştırılmış protokol, ilaç keşfi için ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenmeyi Moleküler Dinamik (MD) simülasyonlarıyla birleştirir. Toplu veri setleri kullanılarak çoklu hedefli ilaç taraması için uygun olan ve sonuç güvenilirliğini artıran nicel tarama kriterleri ve tekrarlanabilir adımlar belirler.

Özet

Ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme ilaç keşifinde yaygın olarak uygulanırken, parçalı iş akışları ve tutarsız işlemler sıklıkla sonuçların tekrarlanabilirliğini zayıflatmaktadır. Burada, bu yaklaşımları ilaç taraması ve mekanizma keşfi için tekrarlanabilir bir çerçeveye entegre eden standartlaştırılmış bir protokol tanımlanır ve iş akışı üç ardışık aşamaya ayrılır: veri hazırlama, hesaplamalı analiz ve doğrulama. Hazırlık aşamasında, kamu veritabanlarından bileşik kütüphaneleri, oral biyokullanılabilirlik, ilaç benzerliği ve toksisite tahmini dahil olmak üzere Absorbsiyon, Dağılım, Metabolizma, Çıkarım ve Toksisite (ADMET) kriterleriyle filtrelenirken, potansiyel terapötik hedefler hastalıkla ilgili veritabanlarının tahmini ve entegrasyonu yoluyla elde edilir ve ilaç-hastalık etkileşim adayları kapsamlı şekilde belirlenir. Hesaplamalı analiz aşamasında, örtüşen hedefler Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizlerinden ve protein-protein etkileşim ağı topolojik analizlerinden geçerek çekirdek hedefleri belirlenir; moleküler kenetlenme, belirgin avantajlara sahip iki standartlaştırılmış isteğe bağlı stratejiyle yapılandırılır. İki aşamalı ilerleyen strateji, bileşik kütüphanesinin yüksek verimlilikli ön taraması için AutoDock Vina'yı kullanır, ardından yüksek verimlilikli taramadan kaynaklanan yanlış pozitifleri ortadan kaldıran ve yazılımlar arası format dönüşümünden kaynaklanan yapısal sapmaları önlemek için sonraki YASARA moleküler dinamik (MD) simülasyonlarıyla uyumlu protein-ligand kompleksleri oluşturur. Tek aşamalı strateji, tüm kenetlenme sürecini yalnızca YASARA ile tamamlar; bu da operasyon iş akışını basitleştirir, deneysel verimliliği artırır ve belirli araştırma hedefleri için tam olarak uygulanabilir. Doğrulama aşamasında, standartlaştırılmış MD simülasyonları, kök ortalama kare sapması (RMSD) ve kök ortalama kare dalgalanma (RMSF) temel metrikleri aracılığıyla ligand-protein kompleksi kararlılığını değerlendirir. Bu birleşik, tekrarlanabilir ürün hattı, ağ farmakolojisi ve kenetlenme çalışmalarının güvenilirliğini artırır ve hesaplamalı ilaç keşifinde çapraz karşılaştırmaları kolaylaştırır.

Giriş

Ağ farmakolojisi, ilaçlar ile organizma arasındaki etkileşim kalıplarını bütünsel bir ağ perspektifinden çözen bir araştırmayaklaşımını temsil eder 1. İlaç-bileşen-hedef-hastalık-biyolojik yolu kapsayan etkileşim ağını oluşturup analiz ederek, ilaçların etkilerini gösterdiği ana molekülleri, çekirdek yolları ve sinerjik mekanizmaları nicel olarak tanımlar. Bu analitik çerçeve, çoklu omik veri entegrasyonu ve topolojik ağ analizini vurgulayan ve nihayetinde ilaçların genel terapötik etkilerini aydınlatan, potansiyel yan etkileri öngören veya yeni ilaç geliştirme için sistematik rehberlik sağlayan uluslararası ağ farmakolojisi standardıyla uyumludur. Bu strateji, COVID-19'a karşı steroid olmayan anti-enflamatuar ilaçların (NSAID) hedef proteinleriyle ilişkili sinyal yollarının çözülmesi ve osteosarkom ile tip 2 diyabet 2,3,4 gibi hastalıkların tedavi mekanizmasının araştırılması gibi çeşitli alanlarda başarıyla uygulanmıştır. Bu avantaj, modern farmakolojide tek hedeften çoklu hedefli ilaç keşfine geçişi yönlendirmektedir.

Moleküler kenetlenme, algoritmik modelleme kullanarak küçük moleküllü bileşikler ile biyolojik makromoleküler hedefler arasındaki mekansal uyumluluk ve etkileşim gücünü değerlendiren hesaplamalı bir simülasyon tekniğidir ve böylece optimal bağlanma konfigürasyonlarınıtahmin eder 5,6. Morris ve ark., seçici reseptör esnekliğiyle otomatik kenetlenmeyi mümkün kılan AutoDock4 ve AutoDockTools4'ü tanıtmıştır; bu araçlar moleküler dinamikler ve moleküler geometriye dayanır ve moleküller arasındaki enerji farklarını hesaplayarak bağlanma kararlılığı ve afinitesinideğerlendirir 7. AutoDock gibi klasik araçlar yarı esnek ligand-reseptör modellemesi kullanır ve bu tür simülasyonlarda bağlanma eğilimini değerlendirmek için altın standart halinegelmiştir 7.

İlaç keşfinde, ağ farmakoloji tarama teknikleri sıkça temel bileşenleri belirlemek için kullanılır; bu teknikler moleküler kenetleme yoluyla doğrulanır ve hedef proteinlerle bağlanmaları değerlendirilir; böylece ilaç ile hastalık arasındaki ilişki ortayaçıkar 8. Ancak, mevcut uygulamalar genellikle tutarsız deneysel tasarım, standart olmayan operasyonel prosedürler ve eksik doğrulama adımları nedeniyle mücadele etmektedir. Bitkisel tıp ile ilgili ağ farmakolojisi çalışmalarının sistematik değerlendirmesi bu yaygın sorunu belgelemiş olup, veri heterojenliği ve yetersiz deneysel doğrulamanın tekrarlanamaz sonuçlara yol açtığınıbelirtmiş 9. Bu sınırlamalar, araştırma sonuçlarının tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini zayıflatmakla kalmaz, aynı zamanda hesaplamalı tahminlerin deneysel doğrulamaya çevrilmesini de engeller. Deneysel doğrulama veya keyfi parametrelerle parçalanmış birleştirme iş akışları olmayan izole ağ farmakolojisi çalışmalarının aksine, bu protokol her iki yaklaşımı standartlaştırılmış eşiklerle ve adım adım işlemlerle bütünleştirir. Bu çerçeve, öznel parametre seçimini ortadan kaldırır ve iş akışının farklı operatörler tarafından tutarlı sonuçlarla tekrarlanmasını sağlar.

Bu nedenle, ağ farmakoloji taraması yoluyla potansiyel ilaç hedefleri ve yollarını belirlemek için standartlaştırılmış operasyonel prosedürler oluşturmak, moleküler kenetleme ile birlikte ilaç-hedef bağlanma aktivitesini doğrulamak, ilaç etki mekanizmalarını incelemek ve adayilaçların taraması için deneysel kanıt sağlayabilir 10. Bu protokol, halka açık omik, kimyasal ve protein yapısı veritabanları kullanılarak ilaç bileşenleri ve sentetik küçük moleküllerin çoklu hedefli ilaç taraması için özellikle uygundur; çözülmüş kristal yapısı olmayan hedefler veya bilinen hastalıkla ilgili etkileşim ağı olmayan tek hedefli yetim ilaç taraması için uygulanamaz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, yalnızca kamuya açık veritabanlarının hesaplamalı analizlerini içerir ve insan denekler, omurgalı hayvanlar veya biyolojik dokular kullanılmaz. Bu bölümde açıklanan tüm özet iş akışları Şekil 1'de gösterilmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1: İş akışının özeti. Yeşil dikdörtgenler alternatif ilaç bileşenlerini, kırmızı dikdörtgenler hastalıkları, sarı nokta noktaları kullanılan web sitelerini ve yazılımları, turuncu dikdörtgenler elde edilen dosyaları veya verileri ve ana adımları içerir, mor elmaslar ise nihai gerekli sonuçları temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. İlaç bileşenlerinin ve hedeflerin edinilmesi

  1. PubChem veritabanında (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) kimyasal isimleri anahtar kelime olarak kullanarak SMILES (Simplified Molecular-Input Line-Entry System) dizelerini elde etmek için arama yapın.
  2. ADMETlab 3.0 web sitesine (https://admetlab3.scbdd.com/) erişin, Hizmetler sekmesinden ADMET Değerlendirme seçeneğini seçin, SMILES dizileri girin ve GÖNDER butonuna tıklayın.
  3. ADMET sonuçlarını şu göstergelere göre filtreleyin: Emilim, Dağılım, Metabolizma, Salgılanma, Toksisite, Tıbbi Kimya ve Toksikofor Kuralları. Her gösterge için önceden belirlenmiş eşik kriterlerini karşılayan bileşikleri yalnızca tutun (Tablo 1).
  4. ProTox 3.0 web sitesine (https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home) erişin, filtrelenen bileşiklerin SMILES dizileri girin, TOX TAHMIN modülünü seçin, istenen tüm tahmin seçeneklerini (örneğin organ toksisitesi, kanserojenlik) işaretleyin ve tahmini çalıştırın.
  5. ProTox 3.0 sonuçlarına dayanarak önceden tanımlanmış güvenlik eşiklerini aşan tahmini toksisitelere sahip bileşikleri elenir (Tablo 2).
  6. Hem ADMET hem de ProTox 3.0 taramasından geçen bileşikleri, bileşik adı, SMILES ve tarama durumu için sütunlar içeren yapılandırılmış bir ilaç bileşen veritabanına (örneğin Excel veya CSV formatı) derleyin.
  7. SwissTargetPrediction web sitesine (https://swisstargetprediction.ch/) erişin, organizma açılır menüsünden Homo sapiens'i seçin, ilaç bileşeni veritabanındaki bileşenlerin SMILES dizislerini girin, Predict targets butonuna tıklayın ve 0'dan büyük olasılık puanı olan tüm tahmin edilen hedefleri toplayın.
  8. SEA (Benzerlik Topluluğu Yaklaşımı) web sitesine (https://sea.bkslab.org/) erişin ve hedef tahmini için yukarıda kullanılan aynı SMILES dizelerini girin ve sonuçları filtreleyerek yalnızca _Human ile biten ve p-değeri 0.05'in altında olan Hedef Anahtar alanındaki girişleri koruyun.
  9. SwissTargetPrediction ve SEA'dan elde edilen hedef listelerini tek bir ilaç eylem hedef kütüphanesinde birleştirin. Tekrarlanan hedefleri kaldırın ve hedef isimlerini resmi gen sembollerine (örneğin HGNC yönergeleri kullanılarak) Uniprot (https://www.uniprot.org/) aracılığıyla standartlaştırın.
    NOT: İlaç-eylem hedef kütüphanesi, daha sonra kullanılmak üzere CSV dosyası olarak kaydedilebilir.

Tablo 1: İlaç güvenliği taraması için ADMETlab 3.0 eşik kriterleri. Tablo, temel fizikokimyasal özellikler, ADME parametreleri, metabolizma etkileşimleri, toksisite son noktaları, toksisite yolları ve toksikofor kuralları için önerilen kesim değerleri ve sınıflandırma aralıklarını özetlemektedir. Tahminler, olasılık değerleri (< 0.3, 0.3 - 0.7, > 0.7) veya nicel aralıklara dayalı olarak üç risk seviyesine (düşük, orta ve yüksek) ayrılır; bu da erken ilaç keşfi sırasında bileşik güvenlik profillerinin sistematik olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: İlaç keşfinde toksisite tahmini için ProTox-3.0 eşik kriterleri. Tablo, ProTox 3.0 tarafından öngörülen temel toksisite son noktalarını özetlemekte, erken ilaç keşfi sırasında ilaç güvenliği değerlendirmesi için kritik parametrelere odaklanmaktadır. Her son nokta, potansiyel toksisite riskini gösteren bir olasılık puanı (0-1) ile birlikte ikili bir sınıflandırma (Aktif veya Inaktiv) sunar. Öncelik, organ toksisiteleri (hepatotoksisite, kardiyotoksisite), toksisite son noktaları (kanserojenlik, mutajenlik, immünotoksisite) ve CYP metabolizması inhibisyonu olarak bilinmelidir; çünkü bunlar klinik kayıpların başlıca nedenleridir. Uç noktalar arasında birden fazla aktif isabet, geniş toksisite potansiyelini gösterir ve bileşik önceliklendirmesini gerektirir. Akut toksisite, tahmini LD50 ve GHS sınıfı ile değerlendirilir; Sınıf 1 - 3 (< 300 mg/kg) yüksek toksik olarak kabul edilir. Olasılık puanları her tahmin için güven seviyeleri sağlar. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Hastalık hedeflerinin edinilmesi

NOT: Veritabanlarını tararken hedef gen isimlendirme kurallarını standartlaştırarak isim tutarsızlıklarından kaynaklanan eksiklikleri önleyin.

  1. Beş hastalıkla ilgili veritabanına erişin: OMIM (https://www.omim.org/), Disgenet (https://disgenet.com/), TTD (https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards (https://www.genecards.org/) ve PharmGkb (https://www.pharmgkb.org/). Aşağıdaki veritabanına özgü tarama kriterlerini uygulayın: GeneCards için, 1.0 ≥ Relevance puanına sahip girişleri filtreleyin; DisGeNET için hedef hastalıkla ilişkili girişleri seçin; PharmGKB için, sonuçları genle ilgili girişlerle sınırlayın ve Gen seçeneğini seçin; TTD için, Hastalık sütununun hedef hastalıkla eşleştiği girişleri kalın.
  2. Her veritabanı için, tüm ilgili hedefleri almak için hedef hastalığın resmi adını (örneğin Alzheimer hastalığı) arama anahtar kelimesi olarak kullanın.
  3. Beş veritabanının tamamındaki hedef listeleri tek bir tabloya derleyin. Listeler arasında gen sembollerini karşılaştırarak tekrarlanan hedefleri kaldırın.
  4. Kalan tüm hedef isimlerini Uniprot aracılığıyla resmi gen sembollerine standartlaştırarak isimlendirme tutarsızlıklarını çözebilirsiniz. Standartlaştırılmış, deduplicated listeyi hastalık hedef kütüphanesi olarak (CSV veya Excel formatı) kaydedin.
    NOT: Hastalık hedef kütüphanesi, ilaç-etki hedef kütüphanesi (Adım 1.9) ile birlikte daha sonra 3. Adımda kullanılmak üzere kaydedilebilir.

3. Ortak ilaç hastalık hedeflerinin edinilmesi

  1. Venny 2.1.0 web aracına (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/) erişin. İlaç eylem hedef kütüphanesini (Adım 1.9) ve hastalık hedef kütüphanesini (Adım 2.4) Venny 2.1.0'ın iki giriş alanına aktararak iki hedef seti arasındaki örtüşmeyi gösteren bir Venn diyagramı oluşturun.
  2. Venn diyagram sonuçlarından kesişim hedeflerini çıkarın. Bunları yaygın uyuşturucu hastalık hedefleri (potansiyel etkileşim noktaları) olarak etiketleyin ve CSV dosyası olarak kaydedin.

4. Protein-protein etkileşim (PPI) ağlarının inşası ve çekirdek hedef analizi

  1. STRING veritabanına (https://cn.string-db.org/) erişin. Açılır menüden Homo sapiens'i Organizma olarak seçin.
  2. Yaygın ilaç hastalığı hedeflerini (Adım 3.2) STRING giriş alanına aktarın. Minimum gerekli etkileşim puanı parametresini yüksek güvenliğe (0.700) ayarlayın ve PPI verisi oluşturmak için Ara'ya tıklayın. PPI verilerini TSV (sekmelere ayrılmış değerler) dosyası olarak dışa aktarın.
  3. CytoNCA eklentisi önceden yüklü Cytoscape yazılımını açın. PPI TSV dosyasını Dosya menüsünden File > Import > Network ile Cytoscape'e aktarın.
  4. Apps > CytoNCA Açık hale tıklayarak CytoNCA eklentisini >başlatın. Temel hedef taraması için beş referans metrik seçin: Aralık, Yakınlık, Derece, Özvektör ve LAC.
    NOT: Kullanılan beş ana topolojik metrik şunlardır: Aralıklılık (aralık merkeziliği, ağdaki en kısa tüm yollarda bir hedefin görülme sıklığını ölçmek), Yakınlık (yakınlık merkeziliği, bir hedeften ağdaki diğer tüm hedeflere ortalama en kısa yol uzunluğunu yansıtır), Derece (yerel bağlantı derecesi, hedef ile diğer hedefler arasındaki doğrudan etkileşim sayısını niceliklemek), Özvektör (özvektör merkeziyeti, hem hedefin kendi bağlantısını hem de bağlı hedeflerinin önemini ağırlıklandırmak) ve LAC (yerel ortalama bağlantı, hedefin doğrudan komşu düğümleri arasındaki bağlantı yoğunluğunu değerlendirmek).
  5. Ağ analizini başlatmak için Tools > Analyze Network menüsünü tıklayıp sonra OK'ye tıklayın. Analiz sonuçlarını bir CSV tablosuna dışa aktarın.
  6. Beş metrikin medyan değerini hesaplayın ve medyanı karşılayan veya aşan hedefleri koruyun. 4.5. Adımı 10 ila 20 hedef kalana kadar defalarca tekrarlayın.
  7. Kalan hedefleri Derece metrikine göre (en yüksekten en düşükte) sıralayın ve ilk 10 hedefi çekirdek gen olarak önceden seçin. Çekirdek gen listesini bir CSV dosyası olarak kaydedin.
    1. Yanlış pozitifleri azaltmak ve yalnızca yapısal olarak uygun hedeflerin kenetlenmesini sağlamak için, yapısal fizibilite ve ilaç kullanılabilirliği açısından daha fazla değerlendirme yapın: PDB veritabanında mevcut yüksek çözünürlüklü kristal yapıları (≤ 2.5 Å) kontrol edin veya güvenilir bir homoloji modeli oluşturulup oluşturulamayacağını değerlendirin; uygun bağlanma noktalarının varlığını doğrulamak için cep tahmin araçları kullanın; ve hastalık yoluna ilişkin belgelenmiş ilgiyi doğrulamak için literatür veya fonksiyonel veritabanlarıyla çapraz referans verin.
    2. Yapısal erişilebilirlik, ilaç kullanılabilir cepleri veya kenetleme çalışmaları için hastalık önemi olmayan hedefleri önceliklendirmek için önceliklendirmek için kalın. GO ve KEGG zenginleştirme analizi, yapısal bilgi gerektirmediği için bu adımdan tam çekirdek hedef listesi kullanılarak hâlâ yapılabilir.
      NOT: Adım 4.6 ve 4.7'deki gen sayısı gerektiğinde değiştirilebilir. Genellikle, Adım 4.6'dan sonra 10 ila 20 hedef kalır ve güvenilir GO ve KEGG zenginleştirme analizi ile tutarlı görselleştirme eğilimleri için yeterli veri hacmi sağlamak amacıyla Adım 4.7'de en az 10 çekirdek genin korunması önerilir.

5. GO ve KEGG zenginleştirme analizi ve görselleştirmesi

NOT: Bu bölüm, hücresel bileşen, fonksiyonel ve hücre içi yol seviyelerindeki gen fonksiyonlarını netleştirir.

  1. DAVID web aracına (https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp) erişin. Giriş türü olarak Gen Listesi'ni seçin ve çekirdek genleri giriş alanına aktarın.
  2. Tanımlayıcıyı OFFICIAL_GENE_SYMBOL olarak ayarlayın ve Türleri Seç'ten Homo sapiens'i seçin. Sonra, çekirdek genleri yüklemek için Gönder Listesi'ne tıklayın.
  3. GO zenginleştirme analizi için GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT ve GOTERM_MF_DIRECT kategorilerini seçin.
  4. KEGG zenginleştirme analizi için KEGG_PATHWAY kategorisini seçin. Hem GO hem de KEGG analizleri için anlamlılık eşiğini p < 0.05 olarak ayarlayın.
  5. Zenginleştirme sonuçları oluşturmak için Fonksiyonel Açıklama Tablosu'na tıklayın. GO ve KEGG sonuçlarını CSV dosyaları olarak dışa aktarın. R Studio yazılımını ggplot2 ile kullanarak en iyi 10 zenginleştirilmiş terim/yol için bar grafikler veya baloncuk grafikleri oluşturun.
    NOT: Gösterilen terimler/yol sayısı gereksinimlere göre ayarlanabilir.

6. Autodock Vina kullanarak moleküler kenetlenme

NOT: Adım 6 ve 7 ikisi de moleküler kenetleme adımlarıdır. 6. adım AutoDock Vina 1.1.2 yazılımını kullanırken, 7. adım YASARA 10.3.16 kullanır. YASARA kullanımı, sonraki YASARA moleküler dinamik simülasyonunu kolaylaştırır. AutoDock Vina'dan kenetlenme sonuçları gerekiyorsa, YASARA'daki kenetlenme sonuçları AutoDock Vina'daki sonuçlarla tutarlı olmalıdır. Bu, yazılım değiştirme nedeniyle oluşan tutarsızlıkları önler ve moleküler dinamik simülasyon doğrulama sonuçlarının güvenilirliğini sağlar; ayrıca ayrıntılı yöntemle: 6.31. Adımın "result.pdb" sonucunu LigPlot+ (Sürüm 2.3) kullanarak 2D etkileşim diyagramı oluşturmak için açın, ligandla etkileşime giren anahtar kalıntıları belirleyin, ardından YASARA'nın kenetlenme aşaması 7.18'deki anahtar kalıntıları seçin ve kutu boyutunu bağlama cebini kapsayacak şekilde ayarlayın; böylece Vina ile YASARA arasındaki kenetlenme noktalarının tutarlılığı en üst düzeye çıkarılır. Daha sonra, Adım 7.19'da optimal kenetlenme sonuçları seçilirken, ligand ile reseptör arasındaki anahtar etkileşimli kalıntıların AutoDock Vina sonuçlarıyla belirlenenlerle tutarlı kaldığından emin olun. Bu tutarlılık gereksinimi, kesin atomik uyum yerine temel etkileşim desenlerinin korunmasına odaklanır; kuvvet alanı parametrizasyonu ve yan zincir esnekliğindeki farklılıklar nedeniyle çevresel kalıntı konformasyonlarında küçük değişiklikler beklenir. Anahtar aktif site kalıntılarıyla kritik etkileşimler korunduğu sürece, kenetlenme sonuçları çapraz doğrulama amacıyla tutarlı kabul edilebilir. Eğer AutoDock Vina kenetlenmesi (Adım 6) gerekli değilse, Adım 7 doğrudan gerçekleştirilebilir.

  1. PubChem veritabanından ligand.sdf adlı ilaç bileşiklerinin SDF'sini (Yapı Veri Dosyası) alın, ilgili SMILES dizileri arayan (Adım 1.1).
  2. Chem3D yazılımıyla SDF dosyalarını açın. Hesaplama seçeneğinden MM2'yi seçin ve bileşik yapının serbest enerjisini en aza indirmek için Enerjiyi Minimize Et'e tıklayın.
  3. En aşağı yapını ligand.mol2 dosyası olarak kaydet, File > Save As seçerek kaydet. Çekirdek genin protein reseptörünün PDB (Protein Veri Bankası) formatındaki dosyasını RCSB PDB veritabanından (https://www.rcsb.org/; PDB ID veya gen adıyla ara) reseptör.pdb adından alın.
    1. 2.5 şçözünürlüğüne sahip yapıları önceliklendirin ve varsa çözülmüş bağlanma noktaları ≤. Bir yapı seçerken, girişin tamlığını (örneğin, tüm beklenen domainlerin varlığı, büyük çözülmemiş döngülerin olmaması), ligand bağlanmasını etkileyebilecek olası mutasyonlar ve fonksiyonel olarak önemli kofaktörlerin (örneğin, hem, metal ionları) veya birlikte kristalleşmiş ligandların dahil edilip edilmediği açısından inceleyin.
    2. Bilinen oligomerik montajlara sahip hedefler için, monomerik veya multimerik formun araştırma sorusu için uygun olup olmadığını düşünün; dimerik veya daha yüksek dereceden etkileşimler önemliyse biyolojik montaj indirilebilir. Seçilen yapı sonraki adımlarda ek hazırlıktan geçer, bu nedenle ilk inceleme sonraki akış komplikasyonlarını önlemeye yardımcı olur.
  4. PyMOL yazılımı ile reseptör.pdb adresini açın. Komut satırında remove organic tuşunu yazın ve protein yapısından küçük moleküllü ligandları elemek için Enter tuşuna basın.
    NOT: Bağlanma yerini tanımlamak için birlikte kristalleşmiş ligand kullanılıyorsa, önce ligandın 3D merkez koordinatlarını kaydedin, ardından PyMOL komut satırında organik kaldır tuşunu yazın ve birlikte kristalleşmiş küçük molekülleri silmek için Enter tuşuna basın; aksi takdirde, doğrudan organik kaldırır komutunu çalıştırarak birlikte kristalleşmiş küçük molekülleri çıkarın.
  5. Komut satırında çözücü çıkar ve protein yapısından serbest su moleküllerini çıkarmak için Enter tuşuna basın; Select metal_cofactor, resn [hedef kofaktör kalıntı adı] komutunu kullanarak işlevsel olarak kritik metal iyonlarını veya kofaktorları (örneğin, HEM,Zn 2⁺, Mg2⁺) tespit edin ve bunların yapıda tutulduklarını doğrulayın.
  6. Temizlenmiş reseptörü PyMOL'dan receptor_clean.pdb olarak File > Export Molecule > Save'e tıklayarak dışa aktarın.
  7. UCSF Chimera 1.19'da receptor_clean.pdb seçeneğini açın. Ardıcıllığı Tools > Sequence > Sequence'e tıklayarak bağlanma noktasına bitişik eksik döngüleri inceleyin (eksik bölgeler kırmızı taslak kutularıyla gösterilir). Eksik döngüler varsa, dizi penceresi menüsünden Structure > Modeller (döngüler/iyileştirme) seçerek, terminal olmayan eksik yapıyı seçerek, uygun sayıda model (örneğin 5) ayarlayarak ve hesaplamaya devam ederek diziyi yeniden oluşturun. Tamamlandıktan sonra en makul modeli seçin.
  8. Chimera'daki yapıyı optimize edin. Yan zincirleri optimize etmek için seçilen kalıntılar üzerinde Rotamers aracını (Dunbrack kütüphanesi) kullanın; değerlendirme için Columns menüsünden Çatışmalar ve H-Bağlar ekleyin ve minimum çatışma (0 - 1 tercihli) ile uygun H-bağları olan konformasyonları seçin. Sonra hidrojen ekleyin ve Dock Prep (AMBER ff14SB) ile yükleri atayın. Son olarak, Minimize Structure aracıyla enerji minimize etme işlemi yapın; omurga atomlarını seçerek (sel @ca,c,n,o), seçimi tersine çevirerek ve Sabit atomları etkinleştirerek sabitleyin. İşlenen yapıyı File > Save PDB seçerek receptor_optimized.pdb olarak kaydedin.
    NOT: İyi sıralanmış kalıntılar için yan zincir optimizasyonunu atlayın. Dock Prep protonasyonu otomatik olarak yönetir. Minimize etme omurga sabit halde yapılmalıdır.
  9. PyMOL'da receptor_optimized.pdb'yi yeniden açın ve kanonik bağlanma yerini tanımlayın. Eğer birlikte kristalize edilmiş bir ligand varsa, koordinatlarını kullanarak ızgarayı merkeze alın: ligandın merkezini kaydedin, ardından organik kaldırın. Eğer birlikte kristalize ligand yoksa, literatürden bilinen anahtar kalıntılara (örneğin, select binding_site, resi XXX-XXX) veya görsel değerlendirmeyi doğrulamak için cep tahmin araçlarıyla varsayılan bağlanma cebini görsel olarak belirleyerek tanımlamayı belirtin. Grid kutusu kurulumu için tanımlanmış sitenin 3D merkez koordinatlarını (x/y/z) kaydedin.
    NOT: Burada kaydedilen koordinatlar AutoDock Vina ızgarasının ortalaması için kullanılır. Kalıntı tabanlı tanım için, seçilen kalıntıların geometrik merkezi hesaplanmalıdır; görsel olarak veya tahmin araçlarıyla tanımlanan bir cep için boşluğun merkezi kullanılır. Bağlama bölgesi tanımlanırken, amaçlanan kenetlenme stratejisinin ortosterik (aktif) bölgeyi mi yoksa allosterik bir alanı mı hedeflediği dikkate alınmalıdır. Ortosterik hedefleme için, bağlanma bölgesi literatürde bildirilen ko-kristalize ligand veya korunan aktif site kalıntılarına göre tanımlanmalıdır. Allosterik hedefleme için, özellikle bilinen allosterik düzenlemelere sahip hedefler için potansiyel allosterik siteleri belirlemek için cep tahmin araçları kullanılabilir. Ön bilgi yoksa, küresel kenetlenme ve ardından tahmin edilen bağlanma noktalarının kümelenmesi potansiyel allosterik sitelerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu esneklik, protokolün hem ortosterik hem de allosterik ilaç keşif kampanyalarını barındırmasını sağlar.
  10. PyMOL'dan nihai optimize edilmiş yapıyı reseptör.pdb olarak File > Export Molecule > Save'e tıklayarak dışa aktarın.
  11. AutoDock Tools 4.2.6'da File > Read Molecule'e tıklayarak receptor.pdb sayfasını açın. Esnek kalıntıları tanımlayın. Flexible Residues > Edit > Select Residues ve ligand bağlanması sırasında konformasyon değişiklikleri geçirecek bağlanma alanı kalıntılarını seçin (10 kalıntı ≤ seçin).
    NOT: Bu adım, kenetlenme sırasında seçilmiş yan zincirlerin hareket etmesine izin verir ve indüklenen uyum etkilerini hesaba katırır.
  12. Esneklikli kalıntılarla reseptörü PDB dosyası olarak kaydet. Dosya > Kaydet'e tıklayın, açılır menüden PDB yaz'ı seçin. Mevcut PDB kayıtları penceresinde ATOM ve CONECT'i işaretleyin, ADD'ye tıklayın, ardından OK'ye tıklayın. Dosyayı receptor.pdb olarak kaydedin.
    NOT: Bu PDB dosyası esnek kalıntılar hakkında bilgi içerir ve PDBQT dosyasının oluşturulması için kullanılacaktır.
  13. Makromolekülü kenetlenmeye hazırlayın. Grid > Macromolecule'e tıklayın > Seç, receptor.pdb dosyasını seçin ve Select Molecule'e tıklayın. Reseptörü PDBQT dosyası olarak kaydedin > Kaydet'e tıklayın ve adını reseptor.pdbqt olarak verin.
    NOT: AutoDock Tools, yükleri ve atom tiplerini atar, alıcıyı AutoDock'un doğal PDBQT formatında saklar, grid kutusu oluşturma ve kenetlenme hesaplamaları için hazırdır.
  14. Ligand menüsüne tıklayın, Giriş'i seçin, ardından Aç'a tıklayın. ligand.mol2'yi seçin ve OK'ye tıklayın. Ligand menüsüne tıklayın, Torsions'u seçin, ardından Torsions'u Algıla'yı seçin. AutoDock Tools, ligand yapısındaki dönebilir bağları otomatik olarak tanımlayacaktır (örneğin, alkil zincirlerdeki tek bağlar, peptid bağları hariç amid bağları).
  15. Torsiyon Seçimi penceresinde, tespit edilen dönebilir bağları doğrulayın (geçerli dönebilir bağlar korun, aromatik halka bağları gibi sert bağlar hariç tutulur). Torsiyon tanımlarını doğrulamak için Ayarlan'a tıklayın, ardından Kapat'a tıklayın.
    NOT: Geçerli dönebilir bağların korunması, ligandın kenetlenme sırasında farklı konformasyonlar (esnek ligand) benimsemesini sağlarken, reseptörü sert tutarken — bu, AutoDock Vina'da yarı esnek kenetlenmenin özüdür.
  16. Ligand menüsüne tekrar tıklayın, Çıktı'yı seçin, ardından PDBQT olarak kaydet'e tıklayın. Dosyaya ligand.pdbqt adını verin ve reseptör.pdbqt ile aynı dizine kaydedin.
  17. Display menüsüne tıklayın, İkincil Yapı'yı seçin. Sadece Görüntüle'ye tıklayın, ardından Çizgiler'i seçin ve Görüntülenmeyi Kaldır'a tıklayın; böylece protein görünümünü basitleştirebilirsiniz.
  18. Grid menüsüne tıklayın, Grid Kutusu'nu seçin. X, y, z (merkez koordinatları) ve Aralık(Å) değerlerini ayarlayarak kutuyu proteinin aktif bölgesinin üzerine yerleştirin.
    NOT: Bağlanma bölgesi bilinmiyorsa, cep tahmin araçları (örneğin, CASTp, DoGSite) kullanarak olası bağlanma ceplerini tespit edin. Tüm proteini kaplamak, yanlış pozitifleri ve hesaplama maliyetini önemli ölçüde artırır ve önerilmez.
  19. File > Save current'i kapat'a tıklayın, ardından grid kutusu ayarlarını Grid.gpf olarak kaydetmek için Grid > Output > Save GPF'ye tıklayın.
  20. Grid.gpf'i bir metin düzenleyiciyle açın ve dosyadan gridcentre (x, y, z değerleri) ve npt'leri (x, y, z değerleri) kaydedin.
  21. Config.txt adında yeni bir metin dosyası oluşturun ve aşağıdaki içeriği yazın:
    reseptör = reseptör.pdbqt
    ligand = ligand.pdbqt
    center_x = [gridcentre x değeri Grid.gpf'den]
    center_y = [gridcentre y değeri Grid.gpf'den]
    center_z = [gridcentre z değeri, Grid.gpf'den]
    size_x = [Grid.gpf'den x değeri npts]
    size_y = [Grid.gpf'den y değerini npts ediyor]
    size_z = [Grid.gpf'den z değeri npts]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    Parantez içindeki metni Grid.gpf (Adım 6.19) değerleriyle değiştirin.
    NOT: energy_range parametresi, optimal kombine göre izin verilen maksimum enerji farkı olarak, birim kcal/mol cinsinden ayarlanmalıdır. Örneğin, 5'e ayarlamak, AutoDock Vina'nın optimal modelden enerji farkı 5 kcal/mol'a ulaştığında hesaplamaları sonlandıracağı anlamına gelir. Ayrıca, üretilecek bağlama modeli sayısını genellikle 10'a ayarladığı num_modes belirtir.
  22. vina_split.exe ve vina.exe dosyalarını receptor.pdbqt, ligand.pdbqt ve Config.txt ile aynı dizine yerleştirin.
  23. Windows System Console'u açın, cd komutunu kullanarak dizine gidin (örneğin, cd C:\DockingFiles).
  24. Aşağıdaki komutu yazın ve Enter tuşuna basın: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
  25. Kenetlenmenin tamamlanmasını bekleyin (süre sisteme göre değişir). İki dosya görünür: log.txt (kenetlenme sonuçları) ve output.pdbqt (en düşük enerjili ligand yapısı). Tekrarlanabilirliği sağlamak için, farklı rastgele tohumlarla üç bağımsız kenetlenme çalışması yapılır. En üst pozisyonlar arasında RMSD < 1.0 ştutarlılığı doğrular.
    NOT: Ampirik bir referans olarak, AutoDock Vina bağlanma enerjileri (kcal/mol) şu şekilde yorumlanabilir: ≤ -7 (yüksek affinite, potansiyel aktif konformasyonlar), -7 ila -5 (orta affinite), ≥ -5 (düşük affinite). Bu eşikler sisteme bağlıdır ve deneysel verilerle doğrulanmalıdır.
    1. Belirli bir hedef için kenetlenme doğruluğunu ve ayırt etme yeteneğini değerlendirmek amacıyla, iki tamamlayıcı doğrulama yaklaşımı önerilir. Protokolün deneysel olarak gözlemlenen bağlanma modlarını yeniden üretip üretemeyeceğini değerlendirmek için kristalografik ligandlar kullanarak yeniden kenetleme doğrulaması kullanın; standart kabul kriteri olarak RMSD < 2.0 şkullanılır.
    2. Protokolün gerçek aktif bileşiklerden özellik uyumlu aldatıcılardan ayırt etme yeteneğini değerlendirmek için kamuya açık kıyaslama veri setleri (örneğin, DUD-E) kullanılarak zenginleştirme analizi kullanın; bu, ROC eğrilerinin (sınıflandırma performansının küresel ölçütü sağlaması) ve EF1% gibi zenginleştirme faktörlerinin (en üst sıradaki fraksiyondaki aktiflerin zenginleşmesini niceltmek) hesaplamasını içerir. Bu doğrulama adımları birlikte, uygun eğilim kesimlerini belirlemeye ve hedef hedef sınıf için güvenilir tarama performansını garanti etmeye yardımcı olur.
  26. PyMOL yazılımını açın. output.pdbqt ve receptor.pdbqt içe aktarın, Dosya > Aç'a tıklayarak tıklayın. Birleşik yapıyı Dosya > Kaydet'e tıklayarak result.pdb olarak kaydedin.
  27. PyMOL çalışma alanını Dosya > Yeni Oturum'a tıklayarak temizleyin, ardından result.pdb'yi tekrar açmak için ligand-protein kompleksini görselleştirin.

7. YASARA kullanarak moleküler kenetlenme

NOT: Bu adım, sonraki moleküler dinamik (MD) simülasyonu için hassas yeniden kenetlenme ve ön işleme görevi görür ve 6. Adımdan elde edilen yüksek verimli ön tarama sonuçlarının aşamalı doğrulanmasıdır. 6. adım, bileşik kütüphanesinden mükemmel bağlanma afinitesine sahip aday molekülleri hızla taramak için yüksek verimli sanal tarama aracı olan AutoDock Vina'yı kullanır. Bu adım, kenetlenme modülü YASARA MD simülasyon platformuyla tam uyumlu olduğundan, dosya formatı dönüşümü ve yazılım değiştirme nedeniyle oluşan yapısal sapmaları önleyebilir ve sonraki MD simülasyonu için standartlaştırılmış bir başlangıç kompleks yapı sağlar. 6. adımda AutoDock Vina tarafından taranan tüm aday moleküller için, bu adımda elde edilen kenetlenme sonuçları (aktif cepte bağlanma pozu ve anahtar amino asit etkileşimleri dahil) AutoDock Vina'dan elde edilenlerle tutarlı olmalı ve bağlanma eğiliminin göreceli sıralaması MD simülasyonuna geçmeden önce aynı eğilimi korumalıdır. Mutlak kenetlenme puanları, farklı hesaplama algoritmaları nedeniyle iki yazılım arasında doğrudan karşılaştırılamaz. Bu tutarlılık gereksinimi, yazılım farklılıklarından kaynaklanan yanlış pozitif sonuçları ortadan kaldırabilir, aday moleküllerin bağlanma özelliklerinin istikrarını garanti edebilir ve sonraki MD simülasyon doğrulamasının güvenilirliğini ve mantıksal sürekliliğini garanti edebilir.

  1. OpenBabel kullanarak ligand.sdf dosyasını ligand.pdb dosyasına dönüştürün.
    NOT: OpenBabel burada yalnızca format dönüşümü için kullanılır. Moleküler dinamikler için ligandın gerçek parametrizasyonu, sonraki adımlarda YASARA tarafından otomatik olarak gerçekleştirilecektir.
  2. YASARA yazılımını açın. Dosya > Yükle ' seçeneğine tıklayın ve ligandı içe aktarmak için ligand.pdb seçeneğini seçin. Ligand'dan yapısal kusurları kaldırmak için Düzenle > Clean > All seçeneğine tıklayın.
    NOT: Bu adım temel geometri temizliği gerçekleştirir. YASARA, protein için kullanılan AMBER14 kuvvet alanı ile uyumluluğu sağlamak için General AMBER Kuvvet Alanı (GAFF) ve AM1-BCC yüklerini uygulayan yerleşik AutoSMILES teknolojisiyle ligandın kuvvet alanı parametrelerini otomatik olarak atar. Bu parametrelendirme, hem kenetlenme hem de MD simülasyonlarında doğru enerji hesaplamaları için gereklidir.
  3. Varsayılan pH > Seçenekler'e tıklayın, uygun pH'ı seçin (örneğin, fizyolojik koşullar için 7.4) ve OK tuşuna tıklayın.
  4. Kenetlenme kuvvet alanını ayarlamak için Dock > Force field'a tıklayın, böylece sonraki MD simülasyonlarıyla parametre tutarlılığını sağlar.
    NOT: AMBER14, YASARA 10.3.16'da bu ilaç keşfi iş akışı için önerilen kuvvet alanıdır; çünkü proteinler için kapsamlı parametre kapsamı sağlar ve standart MD simülasyon protokolleriyle tam uyumludur. Standart protein kalıntıları için, parametreler kuvvet alanının yerleşik şablonlarından otomatik olarak atalar. Küçük moleküllü ligandlar için, YASARA yerleşik AutoSMILES teknolojisi kullanılarak otomatik olarak parametrizasyon yapar; bu teknoloji, GAFF (Genel AMBER Kuvvet Alanı) atom tiplerini ve AM1-BCC yüklerini atamaktadır. Bu, protein ve ligand parametreleri arasında uyumluluğu sağlar ve hem kenetlenme hem de MD simülasyonlarında doğru enerji hesaplamalarını mümkün kılar. Daha uygun bir kuvvet alanı, kullanılan gerçek YASARA versiyonuna ve sistemin özel özelliklerine göre seçilebilir.
  5. Simülatör > Tüm atomların etrafında simülasyon hücresi > tanımlayarak çalışma sınırını belirleyin. Simülatör > Hücre sınırları > periyodik sınır koşullarını etkinleştirmek için tıklayın.
  6. Seçenekler'e tıklayın > Deney > Enerji Minimizasyonu seçin, ardından ligandın enerjisini en aza indirmek için Çalıştır'a tıklayın.
  7. Dosya > Kaydet olarak durma'ya tıklayın, dosyaya ligand.pdb adını verin ve orijinal ligand PDB dosyasının üzerine yazmak için Ok'a tıklayın. Çalışma alanını temizlemek için File > New'e tıklayın, ardından Dosya > Yükle'ye tıklayın ve reseptör.pdb dosyasını seçin.
  8. Protein reseptörü için 7.2'den 7.7'ye kadar olan adımları tekrarlayın, işlenen dosyayı yeni bir receptor.pdb dosyası olarak kaydedin.
  9. File > New'e tıklayın, ardından File > Load'a tıklayın ve ligand.pdb ile receptor.pdb seçeneğini seçin. pH ayarlamak, simülasyon hücresini tanımlamak ve kompleks için periyodik sınırlar açmak için 7.3'ten 7.5'e kadar olan adımları tekrarlayın.
  10. İşlemciler > CPU'yu ayarlayın ve kullanılacak CPU çekirdeği sayısını seçin. İşlemciler > GPU'yu ayarlayın ve hesaplamaları hızlandırmak için GPU cihazını seçin.
  11. Dosya > YASARA Sahnesi > Kaydet'e tıklayın, dosyaya sce\nesult.sce adını verin (varsa sce klasörünü oluşturun) ve OK'ya tıklayın.
  12. Macro&Movie > Seçenekler'e tıklayın > Hedefi belirleyin, sce\nesult.sce'yi seçin ve OK'ye tıklayın. Macro&Movie > Makro >oynatma Seçenekler'e tıklayın, dock_run.mcr makro dosyasını seçin ve OK'ye tıklayın.
  13. Simülasyon hücresini seçilmiş atomlar >etrafında > Tanımla, 7.5'i tekrarlayın, ardından kenetlenmeyi başlatmak için Devam et'e tıklayın.
  14. Kenetlenme tamamlanana kadar bekleyin. Yob ekli dosyalar oluşturulacak; name.log bağlanma enerjisi ve temas edici reseptör kalıntılarını içerir.
    NOT: Moleküler dinamik simülasyon doğrulamasının mantıklılığını sağlamak için, YYASARA'da AutoDock Vina'nın kenetlenme sonucuna uygun olan kenetlenme sonucunu seçin.

8. Moleküler dinamik simülasyonu

  1. Çalışma alanını temizlemek için Dosya > Yeni seçeneğine tıklayın. Sonra Dosya > YASARA Nesnesini Yükle > ve result.yob seçeneğini seçin.
  2. SCENE CONTENT panelinde (sağ taraf), tüm Mol girişlerini genişletin. Edit > Split > Object'e tıklayın, Sequence panelinde tüm Mol içeriklerini seçin ve OK'ye tıklayın.
  3. Edit > Join > Object'e tıklayın, ilk ve son giriş (ligand) hariç tüm Mol içeriklerini seçin ve OK'ye tıklayın. İlk Mol girişini seçin ve tekrar OK'ye tıklayarak proteine yeniden katılın.
  4. Bileşenleri yeniden numaralandırmaya devam edin. Düzenle altında Yeniden Numaralandır'ı seçin ve Nesneler'e tıklayın. Bu iki parça oluşturur: birinci parça protein-reseptör kompleksi, ikinci kısım ise küçük molekül ligandıdır.
  5. Edit > Transfer seçeneğine tıklayın, ardından açılır menüden Nesne seçeneğine tıklayın. Sequence panelinde, önce küçük moleküllü ligand içeriğini ilgili girişe tıklayarak seçin. Sonra protein reseptör içeriğini seçin ve giriş kısmına tıklayarak OK tuşuna tıklayın.
  6. Bir sonraki açılır pencerede, transfer sırasında ekranda Atomları Düzelt seçeneğini işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
  7. 7.2'den 7.5'e kadar olan adımları tekrarlayın, ardından Simulator > Sıcaklık'a tıklayın ve 298K seçin. Dosya'ya tıklayın > YASARA Sahnesi > Kaydet, dosyaya sce\nesultrun.sce adını verin ve Tamam'a tıklayın.
  8. Çalışma alanını temizlemek için Dosya > Yeni seçeneğine tıklayın. Sonra Macro&Movie > Hedef Seç seçeneklerine >tıklayın, sce\nesultrun.sce seçin ve OK'ye tıklayın.
  9. 7.4. adımda seçilen kuvvet alanının MD simülasyonu için de kullanıldığından emin olun; md_run.mcr makrosu genellikle mevcut kuvvet alanı ayarlarını devralır. Macro&Movie > Oynat > Makro Seçeneklerine tıklayın, md_run.mcr makro dosyasını seçin ve Moleküler Dinamik Simülasyonunu başlatmak için OK'ye tıklayın.
  10. Protein-ligand kompleksi için farklı başlangıç hızlarıyla üç bağımsız MD simülasyonu (3 x 100 ns) gerçekleştirin ve sonuçların güvenilirliğini sağlamak için üç yörüngenin istatistiksel analizini yapın. İşlem sırasında, sim formatında dosyalar üretilir. Örneğin, yörünge her 100 ps'de kaydedilirse, 100 ns'lik bir simülasyon sim ekiyle 1000 dosya üretir.
  11. Adım 8.10 tamamlandıktan sonra, Macro&Movie > Hedef Ayarlama > Seçenekler'e tıklayın, sce\nesultrun.sce dosyasını seçin ve OK tuşuna tıklayın.
  12. Macro&Movie > Seçenekler'e tıklayın > Makroyu oynatın, md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr ve md_analyzeres.mcr seçeneklerini seçin ve OK'ye tıklayın.
  13. Üç analiz tamamlandıktan sonra, ilgili veri dosyaları result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab ve result_run_analysisres.tab oluşturulur.
  14. Öncelikle, 10 temel parametre sağlayan result_run_analysis.tab'ı analiz edin: Enerji (toplam sistem enerjisi), Bağ (bağ enerjisi), Açı (bağ açısı enerjisi), Dihedral (dihedral açı enerjisi), Düzlemlik (düzlemsel enerji), Coulomb (elektrostatik enerji), VdW (van der Waals enerjisi), CA (protein RMSD'nin Cα RMSD), Backbone (protein omurga RMSD) ve HeavyAtoms (ağır atom RMSD).
  15. Zaman (ns) sütununu ve ilgili parametre sütunlarını çıkararak sistemin enerjisel dengeye ulaşıp ulaşmadığını değerlendirin. Sistemin kararlılığını, başlangıç 10 - 20 ns'den sonra dar bir dalgalanma aralığında potansiyel enerjinin stabilizasyonuyla doğrulayın. Cα atomlarının, protein omurgasının ve ağır atomların kök ortalama kare sapmasını (RMSD) izleyerek konformasyon kararlılığını değerlendirin. Bu RMSD değerleri bir platoya ulaştığında simülasyon yapısal olarak kararlı olarak kabul edildi.
  16. Tipik boyuttaki protein–ligand kompleksleri için ampirik referans noktası olarak, Cα ve omurga RMSD değerleri 2.5 Å'nın altında sabit kalır ve ağır atomlu RMSD 3.5 Å'nin altında dururken, konformasyonel stabilitenin destekleyici göstergeleri olarak kabul edilebilir. Kritik olarak, birincil ve zorunlu kriter ile RMSD yörüngesinde net bir plato fazının varlığını kullanın; yalnızca bu sayısal değerlere sıkı sıkı bağlılık yerine.
    NOT: Bu eşik değerleri ampiriktir ve spesifik protein boyutu ve esnekliği bağlamında yorumlanmalıdır. Yakınsamanın belirleyici göstergesi, yapının tutarlı bir konformasyon topluluğu etrafında stabilleştiğini gösteren kalıcı bir platodur.
  17. Sonra, ligand ile hedef arasındaki bağlanma enerjisini simülasyon yörüngesi boyunca sağlayan result_run_bindenergy.tab'ı analiz edin. Tüm simülasyon dönemi boyunca ortalama bağlanma enerjisini hesaplayın. YASARA'nın MM-PBSA uygulamasında, daha fazla pozitif değer daha güçlü bağlanmayı gösterir. Orta derecede güçlü ve stabil bir etkileşim genellikle pozitif ve yeterince büyük ortalama bağlanma enerjisi ile gösterilir (spesifik sayısal değer sisteme bağlıdır ancak bilinen bağlayıcılar veya deneysel verilerle kalibre edilebilir), ayrıca ortalama göre küçük bir standart sapma ile (örneğin, %50 - 60 varyasyon katsayısı %50 - 60 < ve simülasyon sırasında sınırlı dalgalanmayı yansıtır.
    NOT: Bu adımda bildirilen bağlanma enerjisi, daha hızlı bir yaklaşım (BoundaryFast) kullanan varsayılan YASARA bağlanma enerjisi makrosunun aksine, titiz MM-PBSA yöntemiyle hesaplanır. Varsayılan yaklaşım hızlı tarama veya göreceli karşılaştırmalar için uygundur, MM-PBSA yöntemi ise daha doğru mutlak bağlanma serbest enerjileri elde etmek için önerilir. Yazarın YASARA makro başlığında açıkça belirttiği gibi: Daha fazla pozitif enerji daha iyi bağlanmayı gösterirken, negatif enerjiler bağlanma olmadığını GÖSTERMİR. Bu nedenle, kullanıcılar pozitif değerleri daha güçlü bağlanmanın göstergesi olarak yorumlamalı, sayısal büyüklük ise belirli protein-ligand sistemine bağlıdır.
  18. Son olarak, Residue ID, RMSD, Backbone RMSD, HeavyAtoms RMSD ve RMSF dahil olmak üzere kalıntı başına veri sağlayan result_run_analysisres.tab dosyasını analiz edin. Analizi, belirlenen kararlı üretim aşamasına odaklayın. Öncelikle, hedefin aktif bölgesindeki kalıntıları (örneğin, ligandın 5 şiçindekiler) belirleyin. Sonra, simülasyon sırasında bu bireysel aktif site kalıntılarının konformasyon stabilitesini değerlendirmek için verileri kullanın.
    NOT: Protein-ligand komplekslerindeki kararlı aktif bölge kalıntıları için ampirik referans noktası olarak, RMSF değerleri 1.0 Å'nın altında ve kararlı fazda 1 - 1.5 şiçindeki RMSD dalgalanmaları genellikle iyi korunmuş yerel konformasyonların göstergesi olarak kabul edilir. RMSF 2.0 Å'yı aşan kalıntılar daha fazla esneklik gösterebilir; bu kalıntılar, fonksiyonel olarak ilgili esnek bölgelere (örneğin döngüler veya yüzey alanları) karşılık gelip etmedikleri veya bağlama cebinde potansiyel kararsızlık gösterip göstermedikleri belirlenmek için üç boyutlu yapıya haritalanmalıdır. Bu sayısal yönergeler mutlak kural değildir; birincil kriter büyük konformasyonel kaymanın olmamasıdır ve bu durum genel sistem yakınsamasıyla birlikte değerlendirilmelidir.
  19. Veri dosyaları organize edildikten sonra, düzenlenmiş verileri Prism'e aktararak karşılık gelen grafikler oluşturulur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Loratadinin alerjik rinite (AR) karşı ağ farmakoloji analizinin ardından, loratadin ile PTGS2 arasındaki etkileşim, moleküler kenetleme ve MD simülasyon protokolünün adım adım uygulamasını göstermek için temsilli bir vaka çalışması olarak seçilmiştir. Bu örnek, belirli etkileşimin biyolojik doğrulamasını sağlamak için değil, iş akışı yürütülmesini ve veri yorumunu göstermeyi amaçlamaktadır. Deneysel verilere karşı nicel değerlendirme için, kullanıcılar, protokolü kamuya açık veritabanlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önemi ve kritik adımlar
Bu protokol, ağ farmakolojisi, moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik simülasyonunu birleştirir; bu da bağımsız yöntemlere veya çift kombinasyonlu iş akışlarına göre belirgin avantajlar sunar ve mevcut ilaç keşfindeki temel verimsizlikler ve güvenilirlik boşluklarını gidermeye yardımcı olabilir. Tüm süreç, güvenilirliğini sağlayan üç kritik adıma dayanır ve her biri hesaplamalı ilaç taramasında temel bir zorluğu ele alır. İlk olarak, çoklu v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtir.

Teşekkürler

Çin Ulusal Ana Ar-Ge Programı (2024YFC3506300, 2024YFC3506301), Geleneksel Çin Tıbbı Ulusal Yönetimi Yüksek Düzey Ana Disiplin - Geleneksel Çin Anayasal Tıbbı (No.zyyzdxk-2023251), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Genel Programı (82204948), Çin Eğitim Bakanlığı'nın Temel ve Disiplinlerarası Disiplinler İcrası Planı (JYB2025XDXM612), Hubei Eyaleti'nde Büyük Bilim ve Teknoloji Özel Projeleri (2023BCA005), Hubei Shizhen Laboratuvarı'nın Baş Bilim İnsanı Araştırma Projesi (HSL2024SX0002)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ADMETlab 3.0Şanghay Materia Medica Enstitüsü (SIMM), Çin Bilimler AkademisiYokADMET (Emilim, Dağılım, Metabolizma, Söküntü, Toksisite) özellik tahmini için çevrimiçi platform; ligandların farmakokinetik ve toksikolojik profillerinin değerlendirilmesi için kullanılır (URL:  https://admetlab3.scbdd.com/)
AutoDock Araçları (AutoDock 4)Scripps Araştırma EnstitüsüAutoDock 4.2.6Moleküler kenetlenme simülasyonları için yazılım paketi; kenetlenme için AutoDock 4 ve protein ve ligand giriş dosyalarını hazırlamak (hidrojen ekleme, yük atama, dönebilir bağlar ayarlamak), kenetlenme ızgaralarını tanımlamak ve kenetlenme sonuçlarını analiz etmek için AutoDockTools (ADT) içermektedir.
AutoDock VinaScripps Araştırma EnstitüsüAutoDock Vina 1.1.2Açık kaynak moleküler kenetlenme yazılımı; küçük moleküllü ligandlar ile protein reseptörleri arasındaki bağlanma eğilimleri ve pozları tahmin etmek için kullanılır
Chem3DPerkinElmer InformatikaChem3D 2024Moleküler modelleme yazılımı; küçük moleküllü ligandların 3B yapılarının oluşturulması, optimize edilmesi ve görselleştirilmesi için kullanılır
SitoscapeCytoscape Konsorsiyumu (Sistem Biyolojisi Enstitüsü)Cytoscape 3.10.3Biyolojik ağların görselleştirilmesi ve analizi için açık kaynak yazılım; gen/protein etkileşim ağlarının oluşturulması ve düzenlenmesi için kullanılır
DAVID (Açıklama, Görselleştirme ve Entegre Keşif için Veritabanı)Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü (NIAID), ABDYokFonksiyonel açıklama ve zenginleştirme analizi için çevrimiçi araç olarak; hedef genlerin GO (Gen Ontolojisi) ve KEGG (Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi) yol zenginleştirme analizi için kullanılır (URL:  https://david.ncifcrf.gov/)
DisGeNET VeritabanıBarselona Süper Bilgisayar Merkezi (BSC)YokGen-hastalık ilişkilerinin veritabanı; belirli hastalıklarla bağlantılı genleri tanımlamak için kullanılır (URL:  https://disgenet.com/)
GeneCards VeritabanıWeizmann Bilim EnstitüsüYokİnsan genlerinin entegre veri tabanı; kapsamlı gen bilgisi (örneğin, ifade, fonksiyon, hastalık ilişkileri) almak için kullanılır (URL:  https://www.genecards.org/)
LigPlusAvrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı-Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü (EMBL-EBI)LigPlus 2.33D koordinat dosyalarından otomatik olarak 2B protein-ligand etkileşim diyagramları oluşturmak için yazılım. Şematik olarak hidrojen bağlarını, hidrofobik temasları ve bağlanma bölgesi kalıntılarını tasvir eder. Akademik e-posta ile kayıt yaptırdığınızda şu adresten erişilebilir durumda olabilir; https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ .
OMIM VeritabanıJohns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi (NCBI ile iş birliği içinde)YokÇevrimiçi Mendel Mirası İnsan; genetik bozukluklar ve bunlara bağlı genler hakkında bilgi almak için kullanılır (URL:  https://www.omim.org/)
OpenBabelOpenBabel Geliştirme EkibiYokAçık kaynak kimyasal araç kutusu; Moleküler dosya formatlarını (örneğin, .mol2'den .pdb'ye) farklı yazılım platformları arasında dönüştürmek için kullanılır
PharmGKB VeritabanıStanford ÜniversitesiYokFarmakogenomik Bilgi Tabanı; gen-ilaç etkileşimleri ve farmakogenomik varyantlar hakkında bilgi almak için kullanılır (URL:  https://www.pharmgkb.org/)
PrizmaGraphPad YazılımıPrizma 9Bilimsel grafikleme, veri analizi (örneğin, bağlama enerji dağılım eğrilerinin çizilmesi, hata çubuklarının analizi) ve yayın kalitesinde rakamlar oluşturma için kullanılır.
ProTox 3.0Charité - Universitä tsmedizin Berlin, AlmanyaYokküçük moleküllerin toksikolojik son noktalarını tahmin etmek için çevrimiçi bir araç; aday ligandların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılır (URL:  https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
PubChem VeritabanıUlusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI), ABDYokKimyasal bilgi kamu veritabanı; küçük moleküllü ligandların 2D/3D yapılarını ve fizikokimyasal özelliklerini elde etmek için kullanılır (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
PyMOLSchrö dinger, LLCPyMOL 2.6.1Moleküler görselleştirme yazılımı; protein-ligand komplekslerinin görüntülenmesi, düzenlenmesi ve yüksek kaliteli görüntülerinin oluşturulması için kullanılır
R StudioPoz, PBCRstudio 2025.09.1+401R programlama için entegre geliştirme ortamı (IDE); biyolojik verilerin istatistiksel analizi ve GO/KEGG grafiklerinin oluşturulması için kullanılır
RCSB PDB VeritabanıYapısal Biyoinformatik Araştırma Laboratuvarı (RCSB)YokProtein yapılarının veritabanı; PDB formatında protein reseptörlerinin 3D yapılarını almak için kullanılır (URL:  https://www.rcsb.org/)
SEA (Benzerlik Topluluk Yaklaşımı)Scripps Araştırma EnstitüsüYokKimyasal benzerliğe dayalı hedef tahmini için çevrimiçi bir araç olarak kullanılmıştır; ligand hedeflerini doğrulamak için SwissTargetPrediction tamamlamak için kullanılır (URL:  https://sea.bkslab.org/)
STRINGSTRING Konsorsiyumu (EBI, SIB vb.)YokBilinen ve tahmin edilen protein-protein etkileşimlerinin veritabanı; gen/protein etkileşim ağları oluşturmak için kullanılır (URL:  https://string-db.org/)
SwissTargetTahminiİsviçre Biyoinformatik Enstitüsü (SIB)YokKüçük moleküllerin potansiyel protein hedeflerini tahmin etmek için çevrimiçi sunucu; ligandlar için aday reseptörlerin tanımlanmasında kullanılır (URL:  http://swisstargetprediction.ch/)
TTD Veritabanıİlaç Keşfi ve Geliştirme Enstitüsü (IDRBL), Sun Yat-sen ÜniversitesiYokTerapötik Hedef Veritabanı; doğrulanmış ve potansiyel ilaç hedefleri hakkında bilgi almak için kullanılır (URL:  https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF ChimeraBiyobilgisayar, Görselleştirme ve Bilişim Kaynağı (RBVI), Kaliforniya Üniversitesi, San FranciscoUCSF Chimera 1.19Moleküler görselleştirme ve analiz yazılımı; Protein yapı hazırlığı için eksik döngü yeniden yapılandırması (Modeller arayüzü aracılığıyla), yan zincir optimizasyonu (Dunbrack rotamer kütüphanesi), proton durumu ayarlaması ve AMBER ff14SB kuvvet alanı ile enerji en minimizasyonu gibi yöntemler kullanıldı. Sürüm 1.19 (Mart 2025'te yayımlandı) PDB yapı getirme yeteneklerini düzeltir . Ticari olmayan kullanımlar için ücretsiz olarak şu adreste mevcuttur  https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ .
UniProt VeritabanıUniProt Konsorsiyumu (EBI, SIB, PIR)YokProtein dizisi ve fonksiyonunun kapsamlı veritabanı; protein dizileri, yapılar ve fonksiyonel açıklamalar için kullanılır (URL:  https://www.uniprot.org/)
Venny 2.1.0Centro Nacional de Biotecnologí a (CNB-CSIC), İspanyaYokVenn diyagramları oluşturmak için çevrimiçi bir araç; gen kümeleri arasındaki örtüşmeleri görselleştirmek için kullanılır (örneğin, farklı veritabanlarından hedef genler) (URL:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
YASARAYASARA BiyobilimleriYASARA 10.3.16Moleküler modelleme ve simülasyon yazılımı; Moleküler kenetlenme (Adım 3.7) ve ardından gelen moleküler dinamik simülasyonları için kenetlenme sonuçlarını doğrulamak için kullanılır

Kaynaklar

  1. Hopkins, A. L. Network pharmacology: The next paradigm in drug discovery. Nat Chem Biol. 4 (11), 682-690 (2008).
  2. An, W., et al. Mechanisms of rhizoma coptidis against type 2 diabetes mellitus explored by network pharmacology combined with molecular docking and experimental validation. Sci Rep. 11 (1), 20849(2021).
  3. Hu, M., et al. Use of network pharmacology and molecular docking to explore the mechanism of action of curcuma in the treatment of osteosarcoma. Sci Rep. 13 (1), 9569(2023).
  4. Oh, K. K., Adnan, M., Cho, D. H. Network pharmacology approach to decipher signaling pathways associated with target proteins of NSAIDs against COVID-19. Sci Rep. 11 (1), 9606(2021).
  5. Kuntz, I. D., Blaney, J. M., Oatley, S. J., Langridge, R., Ferrin, T. E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. J Mol Biol. 161 (2), 269-288 (1982).
  6. Sahu, M. K., Nayak, A. K., Hailemeskel, B., Eyupoglu, O. E. Exploring recent updates on molecular docking: Types, method, application, limitation & future prospects. Int J Pharma Res Allied Sci. 13 (2), 24-40 (2024).
  7. Morris, G. M., et al. Autodock4 and autodocktools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  8. Li, C., et al. Characterization of the molecular mechanisms underlying lurasidone-induced acute manic episodes in bipolar depression: A network pharmacology and molecular docking approach. CNS Neurosci Ther. 31 (4), e70383(2025).
  9. Lee, W. Y., et al. Evaluating current status of network pharmacology for herbal medicine focusing on identifying mechanisms and therapeutic effects. J Adv Res. 76, 799-815 (2025).
  10. Shahzadi, Z., et al. Network pharmacology and molecular docking: Combined computational approaches to explore the antihypertensive potential of Fabaceae species. Bioresour Bioprocess. 11 (1), 53(2024).
  11. Che, X., Zhang, L. Blind docking methods have been inappropriately used in most network pharmacology analysis. Front Pharmacol. 16, 1566772(2025).
  12. Ren, M., Ma, J., Qu, M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of shaoyao gancao tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine .(Baltimore). 103 (50), e40929(2024).
  13. Jorgensen, W. L. The many roles of computation in drug discovery. Science. 303 (5665), 1813-1818 (2004).
  14. Gao, L., et al. Molecular dynamics simulation-driven focused virtual screening and experimental validation of fisetin as an inhibitor of Helicobacter pylori htra protease. Mol Divers. 29 (6), 6243-6258 (2025).
  15. Schaefer, M. H., Serrano, L., Andrade-Navarro, M. A. Correcting for the study bias associated with protein-protein interaction measurements reveals differences between protein degree distributions from different cancer types. Front Genet. 6, 260(2015).
  16. Richter, S., Fetzer, I., Thullner, M., Centler, F., Dittrich, P. Towards rule-based metabolic databases: A requirement analysis based on KEGG. Int J Data Min Bioinform. 13 (3), 289-319 (2015).
  17. Gu, S., et al. Benchmarking ai-powered docking methods from the perspective of virtual screening. Nat Machine Intell. 7 (3), 509-520 (2025).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: Towards the artificial intelligence-based precision traditional chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), 1-12 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bilgisayarl la Ke fiTekrarlanabilir AkADMET TaramasHedef TahminiProtein Etkile im AGen Ontolojisi AnaliziMolek ler Dinamik Sim lasyonuKEGG Zenginle tirme

İlgili makaleler