Yöntem makalesi

In Vitro Bitki kaynaklı moleküllerin geleneksel biyositler üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/70172

⸱

8 Mayıs 2026

 ,  ,  , 
1LEPABE, ALiCE, Faculty of Engineering, University of Porto, 2DEQB-Department of Chemical and Biological Engineering, Faculty of Engineering, University of Porto, 3LAQV/REQUIMTE, BioSIM, Department of Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Porto, 4Department of Chemical Engineering, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fitokimyasalların geleneksel biyositlerin bakterisit etkilerini nasıl artırabileceğini değerlendirmek için sistematik bir çerçeve sunar; bakterisit aktivite modellemesi ve kombinatoryal etkileşim testleri kullanarak, mikrobiyal kontrolü iyileştiren ve genel biyosit kullanımını azaltan sinergistik karışımları belirlemeyi amaçlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel biyositlerin antimikrobiyal etkinliğini artırmak için yenilikçi ve verimli yaklaşımlar geliştirmek, sağlık dezenfeksiyonu amaçları için mikrobiyal kontrolü geliştirmek için umut verici bir stratejidir. Bu bağlamda, bitkisel kaynaklı fitokimyasalların sentetik biyositler üzerindeki etkisini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol tanımlıyoruz. Bu bitki bazlı ürünler, yapısal çeşitlilikleri, biyoaktiviteleri ve genellikle daha düşük toksisiteleri nedeniyle biyosid adjuvanları olarak cazip adaylardır. Burada tanımlanan iş akışı, minimum bakterisit konsantrasyonların (MBC) belirlenmesine ve her ürün için bireysel olarak test edilen (biyositler ve fitokimyasallar) ve çift veya üçlü kombinasyonları için hem doz-tepki hem de zaman yanıtı eğrilerinin sistematik olarak oluşturulmasına olanak tanır. Ortaya çıkan veriler, gelişmiş matematiksel modelleme yapılmasına olanak tanır; bunlar arasında fraksiyonel bakterisit konsantrasyon indeksi (FBCI) belirlenir ve test edilen ürünler arasındaki sinerjik, toplayıcı veya antagonistik etkiler arasındaki etkileşimleri Combenefit yazılımı kullanılarak değerlendirir. Bu anlamda, umut vadeden doğal ürünleri biyosid güçlendiriciler olarak tanımlamak, antimikrobiyal etkinliği optimize etmek ve sentetik biyositlerin gerektirdiği konsantrasyonları azaltabilecek daha sürdürülebilir ve güvenli dezenfeksiyon stratejileri tasarlamak mümkündür. Bu, mikrobiyal kontrolü iyileştirir ve aşırı biyosit kullanımıyla ilişkili çevresel ve halk sağlığı risklerini en aza indirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlık hizmetleriyle ilişkili enfeksiyonlar (HAI'ler), dünya genelinde en kritik ve endişe verici halk sağlığı sorunlarındanbiridir 1. Endişe verici şekilde, çok ilaçta dirençli (MDR) mikroorganizmaların yayılmasıyla ve hastane yüzeylerinde bakteriyel biyoyükün kalıcılığıyla güçlü bir şekilde ilişkilendirilmiştir; bu da genellikle uygunsuz veya etkisiz dezenfeksiyon uygulamalarınedeniyle 2,3. Ayrıca, hastalar, sağlık personeli ve tıbbi ekipmanlar arasındaki çapraz kontaminasyon bu sorunu daha daartırıyor 4,5. Örneğin Avrupa'da, yaklaşık 80.000 hastanede yatan hastanın herhangi bir günde en az bir HAI hastası olduğu tahmin edilmektedir; bu da yılda yaklaşık 16 milyon ek hastane günü anlamınagelir 2. COVID-19 pandemisi bu konuyu daha da karmaşıklaştırdı; antimikrobiyal ajanlar/dezenfektan kullanımının yüksek olması nedeniyle MDR bakteriyel enfeksiyonlarında artışa ve hastaneye yatışların artmasınakatkıda bulundu 6,7. Antibiyotik dirençli bakterilerin yükselişi, genişletilmiş spektrumlu β-laktamaz (ESBL) üreten Escherichia coli ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) dahil olmak üzere, dünya genelinde artan sağlık ve ekonomik yüke yol açmıştır. Aslında, bu suşlar enfeksiyon önleme ve kontrolü için yenilikçi çözümler geliştirmenin aciliyetinivurgulamaktadır 1,8,9.

Bunu göz önünde bulundurarak, biyositler dirençli bakteri ve bakteriyel enfeksiyonların yayılmasını kontrol etmek için kritik araçlar haline geldi; hastane yüzeylerini dezenfekte etmek, ekipmanları sterilize etmek, su sistemlerini arıtmak ve tıbbi cihazların kontaminasyonunu önlemek için yaygın olarakuygulandı. Belirli mikrobiyalhedeflere (12) etki eden antibiyotiklerin aksine, biyosidler aynı anda birden fazla hücresel yapıyı bozar; bunlar arasında zarlar, enzimler, ribozomal RNA ve metabolikyollar 13,14,15 bulunur. Bu geniş spektrumlu etkinin başlangıçta direnç riskini azalttığı düşünülmüştü. Ancak, kanıtlar mikroorganizmaların biyosid maruziyetine uyum sağlayabildiğini, bunun da tolerans, kalıcılık ve hatta antibiyotiklere karşı çapraz direnç sağladığınıgöstermektedir 10,16. Örneğin, Pseudomonas aeruginosa'nın siprofloksasin ve novobiosine dirençli varyantlar için seçilen benzalkonium klorüre maruz kalması, fışkı pompalarının aşırı ekspresyonuyla17. Benzer şekilde, triklosan Stenotrophomonas maltophilia'da efek pompalarını aktive ederken, klorheksidin maruziyeti S. aureus18'de artan antibiyotik direnciyle ilişkilendirilmiştir.

Ayrıca, kuaterner amonyum bileşikleri (QAC), klorheksidin, diamidinler, akridinler ve triklosanlar, bakteriyel direnç seçimi ve kalıcı olmanın çeşitli antibiyotiklere karşı olası nedenleri olarakgösterilmiştir 19,20. QacA/B ve smr gibi direnç genlerinin QAC'lara tolerans sağladığı bilinir ve kontamine QAC çözeltilerinde depolanan kateterlerle ilişkili bakteriyemi ve iyodoforların içsel mikrobiyal kontaminasyonu gibi klinik başarısızlıklarda bildirilmiştir 16,17,21. Bu bulgular, mekanik çalışmalar ve rasyonel dezenfeksiyon stratejileriyle desteklenen optimize edilmiş biyosit kullanımının acil ihtiyacını ortaya koymaktadır.

Polisakkaritler, proteinler ve nükleik asitlerden oluşan hücre dışı matriksin içine gömülü yüksek hücre yoğunluğuna sahip ve iyi yapılandırılmış bakteri toplulukları olan biyofilmler, enfeksiyon kontrolü için ek ve önemli bir engeloluşturur 22,23. Antibiyotik ve biyositlere karşı olağanüstü toleranslar sergileyerek hastalarda enfeksiyonların kalıcılığına katkıda bulunurlar. Ayrıca, biyofilmler sıklıkla tıbbi cihazların, cerrahi aletlerin ve hastane yüzeylerinin kalıcı kontaminasyonuyla dailişkilendirilir 24. Klinik önemlerine rağmen, biyofilmler yalnızca son on yıllarda kronik enfeksiyonlara ve antimikrobiyal dirençte önemli katkılar olarak kabul edilmiştir. Dayanıklılıkları öyledir ki, agresif dezenfekte edici ajanlar bile genellikle onları yok edemez veenfeksiyonu yeniden tohumlayabilen kalıcı hücreler bırakır 20,25,26. Bu nedenle, etkili antibiyofilm stratejileri bulmak, HAI'leri kontrol etmek ve MDR patojenlerinin halk sağlığı ve ekonomik yükünü azaltmak için kritiköneme sahiptir 27,28.

Umut vadeden bir çözüm olarak, bitkilerden üretilen ve çıkarılan ikincil metabolitler olan fitokimyasallar, yeni antimikrobiyal ve antibiyofilm ajanları için büyük ölçüde keşfedilmemiş birkaynağıdır 29. Ancak, geleneksel antibiyotiklere kıyasla mütevazı antimikrobiyal etkinliği nedeniyle hiçbir fitokimyasal antibiyotik olarak kullanılmaz. Fitokimyasallar, 100 ila 1000 μg/mL aralığında minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) üreten hassasiyet testlerine dayanarak rutin olarak antimikrobiyal olarak sınıflandırılır; bu değerler, geleneksel antibiyotiklerin(30,31) değerlerinden çok daha yüksektir. Önemli olarak, fitokimyasallar tek başına veya geleneksel biyositlerin potentitörleri olarak kullanıldığında antibiyofilm aktivitesi zaten göstermiştir. Örneğin, quercetin alginat üretimini engelleyebilir ve biyofilm gelişimi sırasında yapışmanın azalmasına yolaçabilir 32,33,34. Emodin, biyofilm oluşumunda yer alan anahtar genlerin ekspresyonunu azaltarak P. aeruginosa, E. coli ve S. aureus tarafından biyofilm gelişiminiengellemiştir 35. Fitokimyasalların, geleneksel olarak kullanılan ancak giderek daha etkisiz olan biyositlerle birleştirmek, direnç değiştirici ajanlar olarak, antimikrobiyal etkinliği artırmak için umut verici bir stratejitemsil eder 36. Böyle sinerjik etkileşimler, mikrobiyal direnç mekanizmalarını etkileyebilir ve tatmin edici dezenfeksiyon elde etmek için gereken minimum etkili biyosid konsantrasyonlarınıdüşürebilir 37. Bu yaklaşım, biyosidal performansı optimize eder, direnç gelişimi için seçici baskıyı azaltır ve aşırı biyosit uygulamasıyla ilişkili ekolojik ve toksikolojik etkileriazaltır 15,20. Fitokimyasallar yapısal olarakçeşitliliklidir (38,39,40), yaygın olarak bulunabilir (38,39,41), ucuz (38,39,42) ve genellikle sentetik biyositlere göre insanlara ve çevreye daha az toksiktir (38,39). Bunlar, genellikle yenilenebilir bitki kaynaklarından elde edilen doğal ürünlerdir ve bazı durumlarda belirli sentetik biyositlere kıyasla daha düşük çevresel dayanıklılık ve daha düşük toksisite profilleri sergiledikleribildirilmiştir 43,44,45. Maliyeti, bulunabilirliği ve toksisite profilleri bileşik ve ekstraksiyon sürecine bağlı olarak değişse de, bazı fitokimyasal belirli geleneksel biyositlere kıyasla avantajlı güvenlik ve çevresel özelliklergöstermiştir 46,47.

Bu protokol, fitokimyasalların bireysel olarak veya geleneksel biyositlerle birlikte sağlık dezenfeksiyonu için potansiyelini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Kısacası, protokol geniş konsantrasyon aralıklarında biyosit-fitokimyasal etkileşimleri değerlendirir. Biyositler başlangıçta 0.1–500 mg/L aralığında, fitokimyasallar ise 50–10.000 mg/L arasında test edilerek minimum bakterisit konsantrasyonları (MBC) belirlendi (Tablo 1). Çift kombinasyonlar için subbakterisit konsantrasyonlar şu şekilde seçildi: benzalkonyum klorür (BAC) 0,1, 0,5 ve 0,75 mg/L; perasetik asit (PAA) 0.1, 0.3 ve 0.5 mg/L; salisilik asit (SAL) 50, 100 ve 250 mg/L; ve 100, 250 ve 750 mg/L oranlarında öjenol (EUG) (Tablo 1). Üçlü kombinasyonlar, BAC (0,75 mg/L) veya PAA (0,5 mg/L) ile SAL (100 veya 250 mg/L) ve EUG (250 veya 750 mg/L) kombinasyonları kullanılarak yapıldı (Tablo 1). Zaman yanıtlı testler 1–90 dakika boyunca yapıldı, ardından 24 saat içinde bakteriyel yeniden büyüme değerlendirmesi yapıldı. Antimikrobiyal etkileşimler, fraksiyonel bakterisit konsantrasyon indeksi (FBCI) kullanılarak nicele edilir ve Combenefit yazılımı ile analiz edilirken, dezenfeksiyon kinetikleri Chick-Watson ve Weibull modelleri kullanılarak konsantrasyon bağımlılığı ve inaktivasyon dinamiklerini karakterize etmek için modellenir.

Bu yenilik, fitokimyasallar ve biyositler arasında stabil çift ve üçlü etkileşimlerin rasyonel tasarımında yatıyor; dezenfeksiyon aktivitesini optimize ederken geleneksel biyositlerin azalması nedeniyle toksisite ve çevresel etkiyi en aza indiriyor. FBCI hesaplaması ve sinerji değerlendirmesi gibi matematiksel yaklaşımlar da mikrobiyal kontrolde fitokimyasal-biyosit etkileşimlerini niceliklendirmek için kullanıldı. FBCI, belirli konsantrasyon kombinasyonlarında etkileşimin (sinerji, antagonizma veya kayıtsızlık) kategorik bir yorumunu sunarken, Combenefit daha geniş bir yoğunlaşma aralığında etkileşim kalıplarının daha kapsamlı, yanıt yüzeyine dayalı bir değerlendirmesini sağlar. Bu, tek noktalıindeksler 48,49 tarafından yakalanmayan konsantrasyona bağlı etkileşim etkilerinin görselleştirilmesine ve nicelendirilmesine olanak tanır. Ayrıca, dezenfeksiyon kinetiği Chick-Watson (doz-yanıt için) ve Weibull (zaman yanıtı için)modelleri 50 kullanılarak modellenmiştir. Bu modeller, mikrobiyal inaktivasyonun kinetik modellemesini sağlar ve dezenfeksiyon oranlarını ve hayatta kalma eğrisi davranışını tanımlayan nicel parametrelersunar 50. Öldürmenin log-lineer mi yoksa doğrusal olmayan dinamikleri mi takip ettiğini belirlemeye yardımcı olur ve FBCI 51,52'nin tanımının ötesine geçen tedavi etkilerinin daha mekanik yorumlanmasına olanak tanır.

Bu protokol, umut vadeden fitokimyasal-biyosit kombinasyonlarının sistematik olarak tanımlanmasını ve sağlık dezenfeksiyonu için etkili, sürdürülebilir bir stratejinin geliştirilmesini sağlar. Statik uç nokta ölçümleri sağlayan klasik MIC veya dama tahtası testlerinin aksine, bu protokol dinamik bakterisit modelleme ve etkileşim analizlerini entegre ederek potensiasyonun büyüklüğünü ve kinetik noktalarını yakalar. Klasik dama tahtası testleri, MIC uç noktalarına dayalı inhibitör etkileşimler hakkında değerli bilgiler sağlarken, büyüme ölçümleri ve tek etkileşim indeksleriyle sınırlıdır. Burada açıklanan protokol, büyüme engelleme yerine bakterisit aktiviteyi niceleyerek bu çerçevenin ötesine geçer; tedavi sonrası yeniden büyümeyi değerlendirerek sürdürülebilir antimikrobiyal etkileri değerlendirir, hem çift hem de üçlü biyosit-fitokimyasal kombinasyonları değerlendirir, dezenfeksiyon kinetiklerini Chick-Watson ve Weibull yaklaşımlarıyla modeller ve Combenefit kullanılarak konsantrasyon-yanıt yüzey analizi uygular. Bu çok boyutlu strateji, biyosit-fitokimyasal potensiyonun daha sağlam ve öngörülüp değerlendirilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Önerilen metodoloji, Avrupa Standardı EN 127653'ten uyarlanmıştır.

1. Kültür hazırlığı

  1. Test edilen bakteri suşları olan Escherichia coli CECT 434 ve Staphylococcus aureus CECT 976, -80 °C'de gliserol %30 (v/v) ile kriyoviallerde saklanarak kriyokonserve yapın.
  2. İyileşme için, plaka içindeki bakteriler agar (PCA) plakalarını sayır ve plakalar inkubasyon yoluyla 25 °C'de 24 saat boyunca büyümelerine izin verilir.
  3. İncelenen suşların gece boyunca yetiştirilen kültürlerini, triptik soya çorbasındaki (TSB) çizgili bir plakadan bir bakteri kolonisini aşılayarak üstel büyüme aşamasına ulaşarak (sonraki adımlardan elde edilen kalibrasyon eğrisine göre) ve 100 rpm'de 25 °C sıcaklıkta sallanan bir kuluçka aşamasında inkubasyon yaparak hazırlayın.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak, daha önce bahsedilen kültür koşulları altında her bakteri suşunun 600 nm'deki optik yoğunluğun (OD600) fonksiyonu olarak koloni oluşturan birimlerin (CFU)/mL'nin kalibrasyon eğrisini elde edinin.
    1. TSB'de 25 °C'de bir gece boyunca bakteriyel kültür yetiştirin ve çaltlama (100 rpm).
    2. Kültürün steril tuzlu çözelti içinde (%0,85 w/v NaCl) 10 kat seri seyreltme yapılmasını yapın.
    3. Her seyreltmeninOD 600'ünü spektrofotometre kullanarak ölçün.
    4. PCA'ya uygun seyreltmeleri plaka yapın. Plakaları 25 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
    5. 10 ila 100 koloni arasında bulunan plakaları seçin ve ilgili CFU/mL değerlerini belirleyin.
    6. CFU/mL değerleri, doğrusal aralık içinde (0.04–0.8) karşılık gelen OD600 ölçümlerine karşı çizilsin.
    7. En az iki bağımsız test ve en az iki kopya ile yapılmalıdır. Kalibrasyon denklemini elde etmek için doğrusal regresyon analizi yapın.
    8. Ortaya çıkan denklemi sonraki deneylerde bakteri konsantrasyonlarını tahmin etmek için kullanın.
  5. İnokulayı 3772 x g hassasiyetinde 10 dakika santrifüjlenin ve bir kez fosfat tampon tuzlu su (PBS) ile yıkayın (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,44 g/L Na2HPO 4 ve 0,24 g/L KH2PO4).
  6. Bir spektrofotometre kullanarak, PBS'deki inokulanın OD600'ünü 1 x 108 koloni oluşturan birim (CFU)/mL olarak ayarlayın.

2. Molekül çözeltilerinin hazırlanması ve kontrolleri

  1. Test edilen moleküllerin seçimi, incelenmesi ve hazırlanmasını şu şekilde ele alın: iki biyosid – BAC ve PAA (%15 (w/v) – ve iki fitokimyasal – SAL ve EUG %99 kullanın.
    NOT: BAC, bu çalışmada yaygın olarak kullanılan bir QAC olduğu ve bakterilere karşı membran bozulmasıyoluyla etkili olduğu için seçilmiştir 54,55. Perasetik asit, tıbbi alet sterilizasyonu için giderek daha fazla kullanılan geniş spektrumlu oksitleyici bir dezenfektan56,57. Salisilik asit, antibakteriyel ve antibiyofilm aktivitesi gösterdiği ve bakteriyel virülans ile antibiyotik direnç mekanizmalarını etkilediği için ilgi çekici bir fenolik bileşiktir; bu da dezenfeksiyon ve mikrobiyal kontrolde potansiyel rolleriönermektedir 58,59. Eugenol, tanınmış antimikrobiyal özelliklere sahip doğal bir terpenoid/fenolik aromatik bileşiktir ve sentetik dezenfektanlara daha güvenli ve çevre dostu bir alternatif olarak hizmet verebilir60,61.
  2. BAC ve PAA'yı ultra saf suda taze olarak hazırlayın.
  3. Çözülen EUG ve SAL, dimetil sülfoksitte (DMSO) çözünürdü, böylece hücreler %5'in üzerinde DMSO konsantrasyonuna maruz kalmadı.
  4. Tablo 1'e göre test edilen BAC, PAA, EUG ve SAL konsantrasyonlarını hazırlayın.
  5. Test edilen konsantrasyonları, stok çözelti ve hücre süspansiyonu hacimlerini ayarlayarak istenen nihai molekül konsantrasyonu ve hücre yoğunluğunu elde ederek 15 mL santrifüj tüplerinde hazırlayın.
  6. Tüm sonraki testler için iki negatif kontrol ekleyin: (i) tedavi edilmemiş bakteriler ve (ii) %5 DMSO'ya maruz kalan bakteriler (çünkü bu, hücrelerin testler boyunca maruz kaldığı maksimum DMSO konsantrasyonudur).

3. Biyosid veya fitokimyasal bakteriyellere maruz kalma

  1. 1 mL hücre süspansiyonunu 1 mL ultra saf suya ekleyin ve 2 dakika bekleyin.
  2. Sonra, 8 mL biyosid veya fitokimyasal çözelti (ultra saf suda veya %5 DMSO) ekleyin ve 100 rpm'de 25 °C'de sallanan kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca inkübe yapın.
  3. Bileşikleri hücrelerle vortex yoluyla karıştırın.

4. Nötralizasyon, seri seyreltme ve kaplama

  1. Her bir biyosid veya fitokimyasal nötralizasyonu, seyreltme-nötralleştirme yöntemi ve evrensel nötralize yöntemi kullanılarak test edilen her konsantrasyonda nötralize edilir: 30 g/L polisorbat 80, 30 g/L saponin, 1 g/L L-histidin, 3 g/L lesitin ve 5 g/L sodyum tiosülfat 0.0025 M fosfat tamponunda.
  2. Nötralize edilen numunenin 1 mL'sini 8 mL evrensel nötralize edici ve 1 mL ultra safsuya ekleyin 53.
  3. Sonraki seyreltme için 900 μL steril tuzlu çözeltiye 100 μL belirli bir seyreltme ekleyerek on kat seri seyreltme uygulanır (bunu 10-1 seyreltmesinden 10-7 seyreltme 10-7'ye kadar tekrarlayın) ve nötralize edilmiş örneklerdeki hayatta kalan hücreleri, her seyreltmeden 10 μL PCA'ya kaplama yaparak belirleyin; bu yöntem62 uyarınca.
  4. Hücre sayımları için plakaları 24 saat boyunca 25 °C sıcaklıkta çalkalanmadan kuluçka yapın.
  5. CFU, 10'dan fazla ve 100'den az koloni içeren plakalar için görsel olarak sayıldı ve kültürlenebilirlikte tam azalmanın gerçekleştiği konsantrasyon MBC olarak kaydedildi. Denklem (1)'e göre, CFU/mL hesaplanın; burada n CFU sayısı, SV kaplamalı örnek hacmi (0,01 mL) ve Dil CFU'nun sayıldığı seyreltme şeklidir.
    CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
  6. Logaritmik indirgeme, log indirgemesini, Denklem (2)'ye göre değerlendirin; burada X0 ve X , sırasıyla tedavi edilmemiş bakteriler (kontrol) ve tedavi edilen bakteriler için CFU/mL'dir.
    log indirgeme = log (X0) - log (X) = log (X0/X) (2)

5. İkili ve üçlü kombinasyonların değerlendirilmesi

  1. Yukarıda açıklanan metodolojiyi, bir biyosid ve bir fitokimyasal (çift kombinasyonlar için) veya iki fitokimyasal (üçlü kombinasyonlar için) olabilecek tüm çift ve üçlü kombinasyonlarının aktivitesini değerlendirmek için uygulayarak olası potentize/sinerjik etkileri ararın.
  2. Aşağıdaki konsantrasyon seçimini ele alalım: çift kombinasyonlar için BAC için test edilen konsantrasyonlar 0.1, 0.5 ve 0.75 mg/L idi; PAA için 0,1, 0,3 ve 0,5 mg/L; SAL için 50, 100 ve 250 mg/L idi; EUG için ise 100, 250 ve 750 mg/L (Tablo 1). Üçlü kombinasyon için BAC için test edilen konsantrasyon 0,75 mg/L idi; PAA için 0,5 mg/L; SAL için 100 ve 250 mg/L; EUG için ise 250 ve 750 mg/L (Tablo 1).
  3. Konsantrasyonları seçin, bireysel moleküller için doz-yanıt testinde değerlendirilen ve bakterisit olmayan etkiler ortaya çıkaranları seçin.

6. Bakteriyel yeniden büyüme değerlendirmesi

  1. Bakteriyel yeniden büyüme yeteneğini değerlendirmek için, mikrobiyal hücrelerin tedavi ve nötralizasyondan sonra sıvı ortamda, 25 °C ve 100 rpm'de 24 saatten fazla büyümesine izin verin.
  2. Aynı teknikler ve koşullarla on kat seri seyreltme, kaplama, PCA plakalarının kuluçka ve CFU/mL'nin nicelenmesi gerçekleştirilir.

7. Kombinatoryal sonuçların yorumlanması – Fraksiyonel Bakterisit Konsantrasyon İndeksi (FBCI)

  1. Kombinatoryal analiz sonuçlarını şu şekilde yorumlayın:
    1. Çift kombinasyonlar için, FBCI = FBC(A) + FBC(B) olarak belirtilir; burada A'nın fraksiyonel bakterisit konsantrasyonu, FBC(A), çift kombinasyondaki A'nın MBC'si ile yalnızca A'nın MBC'si arasındaki orandır (yalnızca MBCA kombinasyonu/MBCA), FBC(B) ise çift kombinasyondaki B'nin MBC'si ile yalnızca B'nin MBC'si (MBCB kombinasyonu/MBC B tek başta) arasındaki orandır (Denklem 3).
    2. Üçlü kombinasyonlar için, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) olarak belirtilir; burada FBC(A), üçlü kombinasyondaki A'nın MBC'si ile yalnızca A'nın MBC'si arasındaki orandır (yalnızca MBCA kombinasyonu/MBCA), FBC(B) ise üçlü kombinasyondaki B'nin MBC'si ile yalnızca B'nin MBC'si (MBCB kombinasyonu/tek MBCB) arasındaki orandır. ve FBC(C), üçlü kombinasyonda C'nin MBC'si ile yalnızca C'nin (MBCC kombinasyonu/MBCC tek başına MBC) oranıdır (Denklem 4).
    3. Fernandes ve ark.50 tarafından önerilen sınıflandırmayı uygularsak, FBCI ≤ 0.5 sinerjizmle, 0.5 < FBCI ≤ 1 toplamayı belirtir, 1 < FBCI ≤ 4 kayıtsızlık olarak sınıflandırılır ve FBCI > 4.00 antagonizm olarak kabul edilir.
      FBC(A) + FBC(B) = (MBC çift kombinasyonu/MBC A tek başına) + (MBCB çift kombinasyonu/MBCB tek başı) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBCA üçlü kombinasyon/MBC A tek başına) + (MBCB üçlü kombinasyon/MBC B tek başına) + (MBCC üçlü kombinasyonu/MBCC tek başına) (4)

8. Zaman yanıtlı testi prosedürü

  1. E. coli'nin CECT 434 ve S. aureus CECT 976'nın gece kültürlerini daha önce açıklanan büyüme koşullarına göre hazırlayın (bölüm 1).
  2. 1 mL hücre süspansiyonunu 1 mL ultra saf suya ekleyin ve 2 dakika bekleyin. Bu noktada, her molekül için istenen konsantrasyonlara ulaşmak için 8 mL biyosidal/fitokimyasal çözelti (ultrasaf su veya %5 DMSO) ekleyin: 1/4 x MBC ve MBC, bakteriyel süspansiyon için (OD ayarlanarak), 100 rpm/s ve 25 °C. Molekülleri hücrelerle vortex yoluyla karıştırın.
  3. Aşağıdaki maruz kalma sürelerini değerlendirin: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 ve 90 dakika.
  4. Bölüm 4'te açıklandığı gibi, antimikrobiyal aktiviteyi log (CFU/mL) indirgemesi log (X/X0) olarak hesaplayarak değerlendirin.
  5. Her test edilen konsantrasyon/zaman çifti için seyreltme-nötralleştirme yöntemi ve evrensel nötralizator, seri seyreltme ve kaplama ile biyosit veya fitokimyasal nötralizasyonu, bölüm 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirilir.

9. Combenefit yazılımıyla kombinatoryal verilerin analizi

  1. Doğru yapı ve biçimlendirmeyi sağlamak için verilen 'REPLICATE_TEMPLATE.xls' dosyasını https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ noktasında açın.
  2. Verilerinizi, Ek Tablo 1'e göre bir matrisle düzenleyin, burada:
    1. A ürününün konsantrasyonlarını yukarıdan aşağıya (en düşükten en yüksek numaralı sıraya doğru) artırın. Ürün A için en az üç farklı konsantrasyon ekleyin.
    2. Ürün B konsantrasyonlarını soldan sağa (en düşükten en yüksek numaralı sütunlara doğru) artırın): Ürün B için en az üç farklı konsantrasyon ekleyin.
    3. Üst satırı (0 mg/L çarpım A) tek ajanlı ürün B'yi temsil et.
    4. İlk sütunu (0 mg/L çarpım B) tek ajanlı ürün A'yı temsil eder.
    5. (0,0) hücresini, işlenilmeyen kontrol gibi temsil et.
    6. Her vaka için, kullanılan değerleri normalleştirin; Denklem (5) ile normalleştirin; burada treat_0h , belirli bir tedavi için log'dur (CFU/mL), maruz kaldıktan hemen sonra (0h); treat_24h , maruziyetten 24 saat sonra belirli bir tedavi için günlük (CFU/mL) (yeniden büyüme); control_0h , ilgili kontrol (sadece %5 DMSO'ya maruz kalan hücreler veya hücreler) için log'dur (CFU/mL), maruziyetten hemen sonra (0 saat); ve control_24h , karşılık gelen kontrol için (sadece %5 DMSO'ya maruz kalan hücreler veya hücreler) için günlük (CFU/mL), maruziyetten 24 saat sonra (yeniden büyüme).
    7. Tüm durumlarda, PCA üzerinde plakalı örneklerin 24 saat kuluçka aşamasından sonra CFU sayımı gerçekleştirin.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      NOT: %100 canlılığı tanımlayan kontrol/tedavi edilmemiş koşulları ve maksimum inhibisyonu (isteğe bağlı) tanımlayan pozitif bir kontrol dahil edin; Sadece sayısal değerler kullanın, formül kullanmaz; Kopyalar arasında aynı sayıda satır ve sütun kullanın; Ondalık için '.' kullanın.
  3. Dosyayı .xls veya .xlsx olarak kaydet.
  4. Her kopya için önce ve Ek Tablo 1'de belirtildiği gibi bir Excel dosyası oluşturun ve tüm dosyaları aynı klasöre ekleyin.
  5. Combenefit yazılımını açın (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, sürüm 2.021, https://sourceforge.net/projects/combenefit/'de mevcuttur).
  6. O klasörü Combenefit'e yükleyin.
    1. Combenefit yazılımını aç
    2. Proje klasörü seç ve doğru klasörü seç.
    3. Referans modelinin seçilmesi: Her iki çarpım için tam mekanizmayı varsayan Loewe eklemesi; Bağımsız eylemi varsayan Bliss bağımsızlığı, yani muhafazakar bir model olan HAS'ı (kombinasyonu en iyi tek ajanla karşılaştırır). En iyi uygulama, en az iki modeli çalıştırmak ve en iyisini seçmektir.
    4. Bu durumda, test edilen moleküllerin etki biçimi göz önüne alınarak Bliss modeli seçildi.
    5. İstediğiniz grafiksel çıktıları seçin, Synergy dağıtımı için en az bir tane daha seçmeniz gerektiğini bilin.
    6. Basın Çalışması analizi (Ek Şekil 1). İpucu: Analiz sırasında Kaydet'i seç penceresinde, ortaya çıkan tüm grafiksel çıktıları orijinal klasörde kaydetmek için Her Şey'i seçin.

10. Chick-Watson ve Weibull Modellerinin doz ve zaman tepki verilerine uygulanması

  1. İçe aktarmadan önce veri setini Excel veya CSV'de biçimlendirerek Verilerinizi Hazırlayın: Doz-yanıt için A Sütunu doza (konsantrasyon, mg/L) karşılık gelir ve B Sütunu loga (X/X₀) karşılık gelir; Zaman yanıtı verisi için, A Sütunu zamana (dakikalara) karşılık gelir ve B Sütunu loga (X/X₀) karşılık gelir.
  2. Dosyanızı '.csv' olarak kaydedin veya doğrudan Prism'e kopyalayıp yapıştırın.
  3. Open GraphPad Prism (kullanılan sürüm: Windows 11 için 9.0; La Jolla, Kaliforniya, ABD).
  4. Yeni tablo ve grafikte XY'yi seçin, Veri tablosunda ise yeni bir tabloya Gir veya veri aktarma seçeneğini seçin (Ek Şekil 2).
  5. Seçenekler'de, X için Sayı, Y için yan yana alt sütunlara kopyalama değerlerini girin ve Oluştur (Ek Şekil 2) tuşuna basın.
  6. Doz/zaman verilerini X'e girin ve hayatta kalma verilerini Y'ye kaydedin.
  7. Analiz Et, Doğrusal Olmayan Regresyon (eğri uyumu) bölümüne gidin, analiz etmek istediğiniz veri setlerini seçin ve Tamam tuşuna basın (Ek Şekil 2).
  8. Yeni seç ve sonra yeni denklem oluştur.
  9. Denklemde, Denklem Tipi için Açık Denklem seçin: Y = X ve parametrelerin bir fonksiyonu; İsim için Chick-Watson Modeli/Weibull Modeli yazın; ve tanımda Y = -a*x^(n)*30 Chick-Watson Modeli (Ek Şekil 3) ve Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) Weibull Modeli için yazın (Ek Şekil 4).
    NOT: Chick-Watson modeli, Denklem 6 ile ifade edilir; burada X0 ve X , tedavi edilmemiş bakteriler (kontrol) ve tedavi edilen bakteriler için CFU/mL, C konsantrasyon (doz), kdis inaktivasyon oranı katsayısı, C konsantrasyon (doz), n konsantrasyon üstelleri ve t maruz kalma süresi (bu durumda, 30 dk)50. Chick-Watson modeli, doz-yanıtı gözlemlemek ve dezenfektan konsantrasyonu ile mikrobiyal indirgenim arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için uygulandı.
    log (X/X₀) = -kdis · Cⁿ · t (6)
    NOT: Weibull modeli, Denklem 7 ile ifade edilir; burada X0 ve X , tedavi edilmemiş bakteriler (kontrol) ve tedavi edilmiş bakteriler için CFU/mL, t zaman, α ölçek parametresi (karakteristik zaman) ve β şekilparametresi 50. Weibull modeli, zaman tepkisini gözlemlemek ve hayatta kalma eğrilerinin şeklini karakterize etmek için uygulanmıştır. Ölçek parametresi inaktivasyon süresinin karakteristik süresini temsil ederken, şekil parametresi log-lineer davranıştan sapmaları tanımlar (β = 1 log-linear; β < 1 takip yapma; β > 1 omuz).
    log (X/X0) = -1/2.303 (t/α)^β (7)
  10. Başlangıç Değerleri için Roller'de, her parametre için Başlangıç Değeri olarak 0 ve Kural olarak (Uyacak Başlangıç Değeri) seçin (Ek Şekil 5).
  11. Geri kalan ayarları varsayılan olarak tutun ve OK tuşuna basın.
  12. Montajı çalıştırın ve tahmin edilen parametreleri inceleyin.

11. Biyolojik çoğaltma

  1. Tüm testler için, en az iki kopya ile en az iki bağımsız deney gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, test edilen dört bileşikin — BAC, PAA, SAL ve EUG — bakterisit aktivitesini E. coli CECT 434 ve S. aureus CECT 976 ile karşılaştırarak değerlendirdi. Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, BAC, PAA, SAL ve EUG kültürlenebilirlik üzerinde konsantrasyona bağlı bir etki sergilemiştir. Tablo 2, test edilen moleküllerin maruziyetten sonra ve maruziyetten sonraki 24 saat (yeniden büyüme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada sunulan protokol, yaygın olarak kullanılan iki biyosidin – BAC ve PAA – ve iki umut vadeden fitokimyasal – EUG ve SAL'ın – bireysel ve kombinasyonlu (çift ve üçlü kombinasyonlar) E. coli ve S. aureus'a karşı bakterisit aktivitesini değerlendirmek için entegre bir çerçeve sağlar. Bu protokolün birkaç adımı, antimikrobiyal etkileşimlerin tekrarlanabilirliğini ve doğru yorumlanmasını sağlamak için özellikle kritiktir. Bunlar arasında bakteriyel aşının standartlaştırılması, biyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin yazılmasıyla ilgili rekabet eden finansal çıkarları veya çıkar çatışmaları olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeylerinin olmadığını belirtiyor.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu tarafından finanse edilen Project InnovAntiBiofilm (ref. 101157363) (Horizon-Widera 2023- Acess-02/Horizon-CSA); Projeler MultAntiBiofilm (referans COMPETE2030-FEDER00852000; Nº 17121) ve HCAI_Disinfect (ref. COMPETE2030-FEDER-00752300; Nº 16360) Operasyonel Program Rekabetçilik Faktörleri-COMPETE ile finanse edilen ve Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT) tarafından ulusal fonlarla finanse edilen; LEPABE, UID/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025) ve UID/PRR/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025) ile ALiCE, LA/P/0045/2020 (https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020), FCT/MCTES (PIDDAC; Lizbon, Portekiz). Mariana Sousa'nın doktora bursu (2023.00337.BD; https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD) FCT tarafından sağlanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Benzalkonyum klorür Merck, İspanya8.14363.0100Biyosit
Santrifüjlenmiş Mega Star 600RVWR, ABDVWR Mega Star 600R-
Combenefit - Sürüm 2.021Kanser Araştırmaları Birleşik Krallık Cambridge Enstitüsü, Cambridge, Birleşik Krallık-Sinergizm değerlendirmesi için yazılım
KüvetlerVWR, AlmanyaVWRI634-0678Optik yoğunluk ayarlaması için 1,5 mL küvetler
Destilasyonlu su--Medya hazırlığı için
Dimetil Sülfoksit (DMSO)VWR, Fransa23500.322Organik çözücü
Tek kullanımlık aşılama halkalarıVWR, İtalyaVWRI612-935710 μ L aşılama döngüleri
Eppendorf tüpleriVWR, ÇinVWRI525-11641.5 mL eppendorf güvenli kilitli tüpler 
Escherichia coliİspanyol Tip Kültürü Koleksiyonu (CECT)434Bu çalışmada kullanılan referans suş
EtanolVWR, Fransa83813.36İşin dedisfeksiyonu için plece, materyal ve el
Eugenol %99Sigma-Aldrich, ABD163333Fitokimyasal
Falcon tüpleriVWR, ABDVWRI525-108515 mL şahin tüpleri
Falcon tüpleriVWR, BelçikaVWRI525-110950 mL falcon tüpleri
Windows 11 için GraphPad Prism 9.0La Jolla, Kaliforniya, ABD-Matematiksel ve istatistiksel analiz için yazılımlar
LesitinAlfa Aesar, AlmanyaQ04A010-
L-histidinMerck, ABD1.04351.0025-
Yörünge kuluçka makinesiVWR, ABDVWR 5000I Kuluçka sallayıcı 230V-
Perasetik asit %15AppliChem, Almanya143495-1211Biyosit
Petri kaplarıVWR, İtalyaVWRI391-0582-
Pipet 1 - 10 mLVWR, ABD-
Pipet 100 - 1000 μ LVWR, ABD-
Pipet uçları 100 - 1000 μ LFrilabo, Portekiz1-202-50-0-
Pippette 20 - 200 μ LVWR, ABD-
Pippette uçları 1 - 10 mLVWR, Belçikavwri613-7094-
Pippette uçları 2 - 200 μ LVWR, Meksikavwri613-6418-
Plate Count AgarVWR, Belçika84608-0500Mikroorganizmaların izolasyonu ve yetiştirilmesi
Polisorbat 80VWR, ABD20E2756726-
Potasyum Klorür - KC VWR, Belçika11D110008-
Potasyum Dihidrojen Fosfat - KH2PO4VWR, Almanya26931.263-
Sasilisik asitSigma-Aldrich, ABD84210-500GFitokimyasal
SaponinVWR, Almanya21A124103-
Sodyum Klorür - NaClVWR, Belçika27788.297-
Sodyum Hidrojen Fosfat - Na2HPO4VWR, Belçika28026.26-
Sodyum Tiossülfat - Na2S2O3VWR, ABD18D2056589-
SpektrofotometreVWR, ABDUV-1600PC SpektrofotometreOptik yoğunluk ayarı
Staphylococcus aureusİspanyol Tip Kültürü Koleksiyonu (CECT)976Bu çalışmada kullanılan referans suş
Triptik Soya Suyu Merck, Almanya1.05459.0500Mikroorganizmaların izolasyonu ve yetiştirilmesi
Ultrasaf su--Numune hazırlamak için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salam, M. A., et al. Antimicrobial resistance: A growing serious threat for global public health. Healthcare. 11 (13), 1946(2023).
  2. Szabó, S., et al. An overview of healthcare associated infections and their detection methods caused by pathogen bacteria in Romania and Europe. Journal of Clinical Medicine. 11 (11), 3204(2022).
  3. Dadi, N. C. T., Radochová, B., Vargová, J., Bujdáková, H. Impact of healthcare-associated infections connected to medical devices - An update. Microorganisms. 9 (11), 2332(2021).
  4. Russotto, V., et al. What healthcare workers should know about environmental bacterial contamination in the intensive care unit. BioMed Research International. 2017, 6905450(2017).
  5. Ssekitoleko, R. T., et al. The role of medical equipment in the spread of nosocomial infections: A cross-sectional study in four tertiary public health facilities in Uganda. BMC Public Health. 20 (1), 1561(2020).
  6. Bongiovanni, M., Barilaro, G., Zanini, U., Giuliani, G. Impact of the COVID-19 pandemic on multidrug-resistant hospital-acquired bacterial infections. Journal of Hospital Infection. 123, 191-192 (2022).
  7. Witt, L. S., Howard-Anderson, J. R., Jacob, J. T., Gottlieb, L. B. The impact of COVID-19 on multidrug-resistant organisms causing healthcare-associated infections: A narrative review. JAC-Antimicrobial Resistance. 5 (1), dlac130(2023).
  8. Wieler, L. H., Ewers, C., Guenther, S., Walther, B., Lübke-Becker, A. Methicillin-resistant staphylococci and extended-spectrum beta-lactamases-producing Enterobacteriaceae in companion animals: Nosocomial infections as one reason for the rising prevalence of these potential zoonotic pathogens in clinical samples. International Journal of Medical Microbiology. 301 (8), 635-641 (2011).
  9. Ghosh, S., Basu, S., Anbarasu, A., Ramaiah, S. A comprehensive review of antimicrobial agents against clinically important bacterial pathogens: Prospects for phytochemicals. Phytotherapy Research. 39 (1), 138-161 (2025).
  10. McDonnell, G., Russell, A. D. Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clinical Microbiology Reviews. 12 (1), 147-179 (1999).
  11. Maillard, J. Y. Antimicrobial biocides in the healthcare environment: Efficacy, usage, policies, and perceived problems. Therapeutics and Clinical Risk Management. 1 (4), 307-320 (2005).
  12. Muteeb, G., Rehman, M. T., Shahwan, M., Aatif, M. Origin of antibiotics and antibiotic resistance, and their impacts on drug development: A narrative review. Pharmaceuticals. 16 (11), 1615(2023).
  13. Coombs, K., Rodriguez-Quijada, C., Clevenger, J. O., Sauer-Budge, A. F. Current understanding of potential linkages between biocide tolerance and antibiotic cross-resistance. Microorganisms. 11 (8), 2000(2000).
  14. Russell, A. D. Similarities and differences in the responses of microorganisms to biocides. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (5), 750-763 (2003).
  15. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiology Spectrum. 6 (2), (2018).
  16. Russell, A. D. Bacterial adaptation and resistance to antiseptics, disinfectants and preservatives is not a new phenomenon. Journal of Hospital Infection. 57 (2), 97-104 (2004).
  17. Amsalu, A., et al. Efflux pump-driven antibiotic and biocide cross-resistance in Pseudomonas aeruginosa isolated from different ecological niches: A case study in the development of multidrug resistance in environmental hotspots. Microorganisms. 8 (11), 1647(2020).
  18. Sanchez, P., Moreno, E., Martinez, J. L. The biocide triclosan selects Stenotrophomonas maltophilia mutants that overproduce the SmeDEF multidrug efflux pump. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 781-782 (2005).
  19. Russell, A. D. Introduction of biocides into clinical practice and the impact on antibiotic-resistant bacteria. Journal of Applied Microbiology. 92 (s1), 121S-135S (2002).
  20. Sousa, M., Machado, I., Simões, L. C., Simões, M. Biocides as drivers of antibiotic resistance: A critical review of environmental implications and public health risks. Environmental Science and Ecotechnology. 25, 100557(2025).
  21. Gilbert, P., McBain, A. J. Potential impact of increased use of biocides in consumer products on prevalence of antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 16 (2), 189-208 (2003).
  22. Zhao, A., Sun, J., Liu, Y. Understanding bacterial biofilms: From definition to treatment strategies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 13, 1137947(2023).
  23. Grari, O., et al. A comprehensive review on biofilm-associated infections: Mechanisms, diagnostic challenges, and innovative therapeutic strategies. The Microbe. 8, 100436(2025).
  24. Almatroudi, A. Biofilm resilience: Molecular mechanisms driving antibiotic resistance in clinical contexts. Biology. 14 (2), 165(2025).
  25. Liu, H. Y., Prentice, E. L., Webber, M. A. Mechanisms of antimicrobial resistance in biofilms. npj Antimicrobials and Resistance. 2 (1), 27(2024).
  26. Sharif, S., Yadav, A. K. Bacterial biofilm and its role in antibiotic resistance. The Microbe. 7, 100356(2025).
  27. Assefa, M., Amare, A. Biofilm-associated multi-drug resistance in hospital-acquired infections: A review. Infection and Drug Resistance. 15, 5061-5068 (2022).
  28. Sandu, A. M., et al. Healthcare-associated infections: The role of microbial and environmental factors in infection control - A narrative review. Infectious Diseases and Therapy. 14 (5), 933-971 (2025).
  29. Ogbuagu, O., et al. Novel phytochemicals in traditional medicine: Isolation and pharmacological profiling of bioactive compounds. International Journal of Medical All Body Health Research. 3 (1), 63-71 (2022).
  30. Tegos, G., Stermitz, F. R., Lomovskaya, O., Lewis, K. Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (10), 3133-3141 (2002).
  31. Simões, M., Bennett, R. N., Rosa, E. A. S. Understanding antimicrobial activities of phytochemicals against multidrug resistant bacteria and biofilms. Natural Product Reports. 26 (6), 746-757 (2009).
  32. Górniak, I., Bartoszewski, R., Króliczewski, J. Comprehensive review of antimicrobial activities of plant flavonoids. Phytochemistry Reviews. 18 (1), 241-272 (2019).
  33. Lee, J. H., et al. Anti-biofilm activities of quercetin and tannic acid against Staphylococcus aureus. Biofouling. 29 (5), 491-499 (2013).
  34. Memariani, H., Memariani, M., Ghasemian, A. An overview on anti-biofilm properties of quercetin against bacterial pathogens. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 35 (9), 143(2019).
  35. Borges, A., et al. New perspectives on the use of phytochemicals as an emergent strategy to control bacterial infections including biofilms. Molecules. 21 (7), 877(2016).
  36. Gomes, I. B., Malheiro, J., Mergulhão, F., Maillard, J. Y., Simões, M. Comparison of the efficacy of natural-based and synthetic biocides to disinfect silicone and stainless steel surfaces. Pathogens and Disease. 74 (4), ftw014(2016).
  37. Fernández Fuentes, M. A., et al. Synergistic activity of biocides and antibiotics on resistant bacteria from organically produced foods. Microbial Drug Resistance. 20 (5), 383-391 (2014).
  38. El-Saadony, M. T., et al. Medicinal plants: Bioactive compounds, biological activities, combating multidrug-resistant microorganisms, and human health benefits - A comprehensive review. Frontiers in Immunology. 16, 1491777(2025).
  39. Barbieri, R., et al. Phytochemicals for human disease: An update on plant-derived compounds antibacterial activity. Microbiological Research. 196, 44-68 (2017).
  40. Popovic, L., Rijkers, G. T. Phytochemicals: Principles and practice. Biology. 15 (1), 18(2025).
  41. Yang, Y., Ling, W. Health benefits and future research of phytochemicals: A literature review. Journal of Nutrition. 155 (1), 87-101 (2025).
  42. Jain, A., Madu, C. O., Lu, Y. Phytochemicals in chemoprevention: A cost-effective complementary approach. Journal of Cancer. 12 (12), 3686-3700 (2021).
  43. Rezaee Danesh, Y., Mulet, J. M., Porcel, R. Bridging microbial biocontrol and phytochemical biopesticides: Synergistic approaches for sustainable crop protection. Plants. 14 (22), 3453(2025).
  44. Kocamaz, D., Merchan, O. Environmental perspectives on biopesticides: Current knowledge and research gaps. Pesticides - Balancing Efficient Pest Control with Environmental and Health Safety. , IntechOpen. (2026).
  45. Rahaman, M. T., Moshwan, M. M. Sustainable functionalization of biodegradable materials for mosquito repellent textiles: A review of sources, application, and research directions. Hybrid Advances. 12, 100600(2026).
  46. Sun, S., et al. Impact of extraction techniques on phytochemical composition and bioactivity of natural product mixtures. Frontiers in Pharmacology. 16, 1615338(2025).
  47. Poslinski, H., Hatley, M., Tramell, J., Song, B. H. Harnessing phytochemicals in sustainable and green agriculture. Journal of Agriculture and Food Research. 19, 101633(2025).
  48. Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: An interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
  49. Ormeneanu, V. P., et al. Synergistic interactions between natural phenolic compounds and antibiotics against multidrug-resistant K. pneumoniae: A pooled analysis of 216 in vitro tests. Microorganisms. 13 (11), 2497(2025).
  50. Fernandes, S., Gomes, I. B., Simões, M. Antimicrobial activity of glycolic acid and glyoxal against Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens. Food Research International. 136, 109346(2020).
  51. Peleg, M. Modeling the dynamic kinetics of microbial disinfection with dissipating chemical agents-a theoretical investigation. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (2), 539-549 (2021).
  52. Buzrul, S. The Weibull model for microbial inactivation. Food Engineering Reviews. 14 (1), 66-77 (2022).
  53. European Committee for Standardization. Chemical disinfectants and antiseptics – Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics used in food, industrial, domestic and institutional areas – Test method and requirements. , European Standard EN 1276. Brussels. (2019).
  54. Oh, S., et al. Microbial community degradation of widely used quaternary ammonium disinfectants. Applied and Environmental Microbiology. 80 (19), 5892-5900 (2014).
  55. Merchel Piovesan Pereira, B., Tagkopoulos, I. Benzalkonium chlorides: Uses, regulatory status, and microbial resistance. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00377-e00319 (2019).
  56. Kitis, M. Disinfection of wastewater with peracetic acid: A review. Environment International. 30 (1), 47-55 (2004).
  57. Lin, Y., et al. Underlying the mechanisms of pathogen inactivation and regrowth in wastewater using peracetic acid-based disinfection processes: A critical review. Journal of Hazardous Materials. 463, 132868(2024).
  58. Sykes, E. M. E., White, D., McLaughlin, S., Kumar, A. Salicylic acids and pathogenic bacteria: New perspectives on an old compound. Canadian Journal of Microbiology. 70 (1), 1-14 (2024).
  59. Kantouch, A., El-Sayed, A. A., Salama, M., El-Kheir, A. A., Mowafi, S. Salicylic acid and some of its derivatives as antibacterial agents for viscose fabric. International Journal of Biological Macromolecules. 62, 603-607 (2013).
  60. Ulanowska, M., Olas, B. Biological properties and prospects for the application of eugenol - A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3671(2021).
  61. Jeyakumar, G. E., Lawrence, R. Mechanisms of bactericidal action of eugenol against Escherichia coli. Journal of Herbal Medicine. 26, 100406(2021).
  62. Di Salvo, L. P., et al. The drop plate method as an alternative for Azospirillum spp. viable cell enumeration within the consensus protocol of the REDCAI network. Revista Argentina de Microbiología. 54 (2), 152-157 (2022).
  63. Bridier, A., Briandet, R., Thomas, V., Dubois-Brissonnet, F. Comparative biocidal activity of peracetic acid, benzalkonium chloride and ortho-phthalaldehyde on 77 bacterial strains. Journal of Hospital Infection. 78 (3), 208-213 (2011).
  64. Fink, R. Terpenoids as natural agents against food-borne bacteria - Evaluation of biofilm biomass versus viability reduction. Processes. 11 (1), 148(2023).
  65. Randall, T. E., et al. Bacterial repair and recovery after UV LED disinfection: Implications for water reuse. Environmental Science: Water Research and Technology. 8 (8), 1700-1708 (2022).
  66. Wang, M., Ateia, M., Hatano, Y., Yoshimura, C. Regrowth of Escherichia coli in environmental waters after chlorine disinfection: Shifts in viability and culturability. Environmental Science: Water Research and Technology. 8 (7), 1521-1534 (2022).
  67. Puxeddu, S., et al. Beyond one-size-fits-all: Addressing methodological constraints in novel antimicrobials discovery. Antibiotics. 14 (8), 848(2025).
  68. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 8, 364(2017).
  69. Maillard, J. Y. Bacterial target sites for biocide action. Journal of Applied Microbiology. 92 (s1), 16S-27S (2002).
  70. Lambert, R. J., Johnston, M. D. The effect of interfering substances on the disinfection process: A mathematical model. Journal of Applied Microbiology. 91 (3), 548-555 (2001).
  71. Cheng, K., et al. Staphylococcus aureus SOS response: Activation, impact, and drug targets. mLife. 3 (3), 343-366 (2024).
  72. Patacq, C., Chaudet, N., Letisse, F. Crucial role of ppGpp in the resilience of Escherichia coli to growth disruption. bioRxiv. , (2020).
  73. Kim, T. K., Jang, M., Hwang, Y. S. Adsorption of benzalkonium chlorides onto polyethylene microplastics: Mechanism and toxicity evaluation. Journal of Hazardous Materials. 426, 128076(2022).
  74. Jang, M. H., et al. Elucidating adsorption mechanisms of benzalkonium chlorides on polypropylene and polyethylene terephthalate microplastics: Effects of BACs alkyl chain length and microplastic characteristics. Journal of Hazardous Materials. 468, 133765(2024).
  75. Wang, Y. W. Evaluation of self-heating models for peracetic acid using calorimetry. Process Safety and Environmental Protection. 133, 122-131 (2018).
  76. Kamatou, G. P., Vermaak, I., Viljoen, A. M. Eugenol - From the remote Maluku Islands to the international market place: A review of a remarkable and versatile molecule. Molecules. 17 (6), 6953-6981 (2012).
  77. Mihara, S., Shibamoto, T. Photochemical reactions of eugenol and related compounds: Synthesis of new flavor chemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 30 (6), 1215-1218 (1982).
  78. Gangwang Liu, G., Liu, H., Zhang, N., Wang, Y. Photodegradation of salicylic acid in aquatic environment: Effect of different forms of nitrogen. Science of the Total Environment. , 435-577 (2012).
  79. Kassir, M., et al. Enhanced photocatalytic degradation of salicylic acid in water-ethanol mixtures from titanium dioxide grafted with hexadecyltrichlorosilane. Physics Procedia. 55, 403-408 (2014).
  80. Houchmandzadeh, B., Ballet, P. A novel procedure for CFU plating and counting. Journal of Microbiological Methods. 206, 106693(2023).
  81. Marro, F. C., Laurent, F., Josse, J., Blocker, A. J. Methods to monitor bacterial growth and replicative rates at the single-cell level. FEMS Microbiology Reviews. 46 (6), fuac030(2022).
  82. Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLOS ONE. 11 (2), e0148469(2016).
  83. Hussain, M. S., Tango, C. N., Oh, D. H. Inactivation kinetics of slightly acidic electrolyzed water combined with benzalkonium chloride and mild heat treatment on vegetative cells, spores, and biofilms of Bacillus cereus. Food Research International. 116, 157-167 (2019).
  84. Basavegowda, N., Baek, K. H. Combination strategies of different antimicrobials: An efficient and alternative tool for pathogen inactivation. Biomedicines. 10 (9), 2219(2022).
  85. Haindongo, E. H., et al. Antimicrobial resistance prevalence of Escherichia coli and Staphylococcus aureus amongst bacteremic patients in Africa: A systematic review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 32, 35-43 (2023).
  86. Kim, M., et al. Widely used benzalkonium chloride disinfectants can promote antibiotic resistance. Applied and Environmental Microbiology. 84 (17), e01201-e01218 (2018).
  87. Barros, A. C., Melo, L. F., Pereira, A. A multi-purpose approach to the mechanisms of action of two biocides: Benzalkonium chloride and dibromonitrilopropionamide. Discussion of Pseudomonas fluorescens viability and death. Frontiers in Microbiology. 13, 842414(2022).
  88. Pironti, C., et al. Comparative analysis of peracetic acid and permaleic acid in disinfection processes. Science of the Total Environment. 797, 149206(2021).
  89. Qiao, C., et al. Advances of carbon-based materials for activating peracetic acid in advanced oxidation processes: A review. Environmental Research. 263, 120058(2024).
  90. Marjani, A., Golalipour, M. J., Gharravi, A. M. The effects of subacute exposure of peracetic acid on lipid peroxidation and hepatic enzymes in Wistar rats. Oman Medical Journal. 25 (4), 256-260 (2010).
  91. Yoo, J. H. Review of disinfection and sterilization - Back to the basics. Infection and Chemotherapy. 50 (2), 101-109 (2018).
  92. Arif, T. Salicylic acid as a peeling agent: A comprehensive review. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 8, 455-461 (2015).
  93. Staroń, A., Pucelik, B., Barzowska, A., Pulit-Prociak, J. Synthesis and characteristics of biocidal oil composites enhanced with thymol and salicylic acid. Clean Technologies and Environmental Policy. 26 (10), 3481-3505 (2024).
  94. Reyes-Fernández, E. Z., Schuldiner, S. Acidification of cytoplasm in Escherichia coli provides a strategy to cope with stress and facilitates development of antibiotic resistance. Scientific Reports. 10 (1), 9954(2020).
  95. Song, X., Li, R., Zhang, Q., He, S., Wang, Y. Antibacterial effect and possible mechanism of salicylic acid microcapsules against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (19), 12761(2022).
  96. Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: Mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in Microbiology. 3, 12(2012).
  97. Shariati, A., et al. Inhibitory effect of natural compounds on quorum sensing system in Pseudomonas aeruginosa: A helpful promise for managing biofilm community. Frontiers in Pharmacology. 15, 1350391(2024).
  98. Pedreira, A., Fernandes, S., Simões, M., García, M. R., Vázquez, J. A. Synergistic bactericidal effects of quaternary ammonium compounds with essential oil constituents. Foods. 13 (12), 1831(2024).
  99. Cameron, S. J., Sheng, J., Hosseinian, F., Willmore, W. G. Nanoparticle effects on stress response pathways and nanoparticle-protein interactions. International Journal of Molecular Sciences. 23 (14), 7962(2022).
  100. Nabarro, J., et al. Lipopolysaccharide lateral mobility in the Gram-negative bacterial outer membrane is confined and governed by interactions within the conserved Lipid A anchor. bioRxiv. , (2025).
  101. Vaara, M., Nurminen, M. Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (6), 1459-1462 (1999).
  102. Garde, S., Chodisetti, P. K., Reddy, M. Peptidoglycan: Structure, synthesis, and regulation. EcoSal Plus. 9 (2), 0010-2020 (2021).
  103. Nikolic, P., Mudgil, P. The cell wall, cell membrane and virulence factors of Staphylococcus aureus and their role in antibiotic resistance. Microorganisms. 11 (2), 259(2023).
  104. Wang, M., Buist, G., van Dijl, J. M. Staphylococcus aureus cell wall maintenance - The multifaceted roles of peptidoglycan hydrolases in bacterial growth, fitness, and virulence. FEMS Microbiology Reviews. 46 (5), fuac025(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Biyosidal G lendirmeAntimikrobiyal AktiviteFitokimyasal AdjuvanlarMinimum Bakterisidal KonsantrasyonDoz Yan tZaman Yan tSinerjik EtkilerBiyosit KombinasyonlarMikrobiyal Kontrol
Video yakında

İlgili makaleler