Yöntem makalesi

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70178

⸱

10 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry, University of New South Wales, 2School of Optometry and Vision Science, University of New South Wales

Bu makalede

Özet

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Özet

Antimikrobiyal peptipller (AMP'ler) ve onların sentetik taklitleri, özellikle antimikrobiyal direnç tehdidinin artmasına yanıt olarak, geleneksel antibiyotiklere umut vadeden alternatifler olarak ortaya çıkıyor. Doğal olarak oluşan AMP'ler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel bileşenleridir ve çeşitli mikrobiyal patojenlere karşı geniş spektrumlu aktivite gösterir; sentetik taklitleri, peptidomimetikler ve polimer bazlı analoglar dahil, stabiliteyi artırmak, toksisiteyi azaltmak ve farmakokonetiği geliştirmek için tasarlanmıştır. Bu çalışma, AMP'lerin ve küçük moleküllü peptid taklitlerinin üretimini, karakterizasyonunu ve biyolojik değerlendirmesini göstermeyi amaçlamaktadır. AMP'ler, rekombinant ekspresyon sistemleri veya katı faz peptid sentezi kullanılarak üretilir; bu da amino asit dizisi ve yapısal özellikler üzerinde hassas kontrol sağlar. Küçük moleküllü peptid taklitleri, yapısal stabiliteyi ve farmakolojik performansı artırmak için anthranilik asit (2-aminobenzoik asit) iskelesi dahil olmak üzere kimyasal stratejilerle sentezlenir. Sentezden sonra, bileşikler biyolojik testten önce saflaştırılır ve kimyasal olarak karakterize edilir. Antimikrobiyal aktivite in vitro minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) testleri kullanılarak değerlendirilir ve sitotoksisite, seçiciliği belirlemek için memeli hücre hatlarına karşı değerlendirilir. Temsilci sonuçlar, hem AMP'lerin hem de onların taklitlerinin Klebsiella pneumoniae ve Escherichia coli'ye karşı güçlü bir etkinlik sergilediğini ve geniş spektrumlu antibakteriyel potansiyellerini ortaya koyduğunu göstermektedir. Genel olarak, bu protokol antimikrobiyal peptidlerin ve taklitlerinin yeni nesil anti-enfektif ajanlar olarak geliştirilmesi ve sistematik olarak değerlendirilmesi için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Giriş

Antimikrobiyal direnç (AMR), büyük bir küresel sağlık tehdidi olarak ortayaçıkmıştır 1. Dünya Sağlık Örgütü'ne (DSÖ) göre, AMR 2019 yılında yaklaşık 1,27 milyon ölümden doğrudan sorumlu olmuş ve dünya genelinde tahmini 4,95 milyon ölüme katkıdabulunmuştur 2. Mevcut antibiyotiklerin aşırı ve yanlış kullanımı, çok ilaçlı dirençli patojenlerin ortaya çıkmasını ortaya çıkardı ve bakteriler, mantarlar, virüsler ve protozoalar gibi mikroplara karşı sınırlı tedaviseçenekleri bıraktı 2,3. Bu AMR krizi, etkili, stabil ve direnç gelişimine daha az yatkın alternatif antimikrobiyal stratejiler arayışını başlatmıştır. En umut vadeden adaylar arasında AMP'ler ve onların sentetik taklitleriyer alıyor 4.

AMP'ler, insanların, hayvanların ve bitkilerin doğuştan gelen bağışıklık sistemlerinde hayati rol oynayan doğal olarak bulunanmoleküllerdir 5. Genellikle membran bozulması, mikrobiyal metabolizmaya girişim ve bağışıklık yanıtlarının modülasyonu gibi mekanizmalar aracılığıyla geniş spektrumlu antimikrobiyal aktivitesergilerler 6. Örneğin, insan katelisidin peptidi LL-37, bakteriler, mantarlar ve virüslere karşı güçlü bir etkinlikgöstermiştir 7. Ancak, umut vadedenpotansiyellerine rağmen, doğal AMP'lerin büyük ölçekli terapötik kullanımı genellikle düşük doğal bollukları nedeniyle sınırlanır. Ayrıca, aktif formlarını doğal kaynaklardan elde etmek zor olabilir, çünkü birçok peptid fonksiyonel olarak aktif olmak için spesifik translasyonel modifikasyonlar gerektirir8.

Doğal AMP'lerle ilgili sınırlamaları gidermek için araştırmacılar sentetik analoglar ve peptid taklitleri geliştirmiştir. Taklitler, doğal AMP'lerin antimikrobiyal etkinliğini koruyan ve iyileştirilmiş kararlılık, seçicilik ve farmakokinetik performans sunan küçük, mantıklı tasarlanmışmoleküller olabilir.

Peptit kimyası ve moleküler biyolojideki son gelişmeler, katı faz peptid sentezi (SPPS), sıvı faz peptid sentezi (LPPS) ve rekombinant ifade sistemleri gibi yöntemlerle AMP'lerin verimli üretimini mümkün kılmıştır; böylece dizi bileşimi, yük dağılımı ve amfipatisite gibi temel yapısal parametreler üzerinde hassas kontrolsağlanmıştır 10. Rekombinant ifade sistemleri, büyük ölçekli üretim ve daha uzun veya daha karmaşık polipeptitler için uygundur. Optimize edildikten sonra, genellikle fermantasyon veya biyoreaktör sistemleri kullanan rekombinant yöntemler endüstriyel olarak terapötik peptit üretimi için maliyet etkin ve ölçeklenebilir bir yaklaşımsunar 11.

Bu makale, AMP'lerin ve onların taklitlerinin üretimi ve değerlendirilmesi için tamamlayıcı yaklaşımları göstermektedir. Katı fazlı kimyasal sentez, peptit üretiminde yaygın olarak kullanılırken, toplanma, düşük verim ve saflaştırma zorlukları nedeniyle daha uzun diziler veya yüksek katyonik peptitler için verimsiz ve maliyetli olabilir12. Buna karşılık, kimyasal sentez, kesin yapısal modifikasyonlarla kısa peptid taklitleri ve doğal olmayan kalıntılar üretmek için oldukça avantajlıdır13. Rekombinant ifade sistemleri ise, mikrobiyal konaklarda daha uzun veya yapısal olarak karmaşık peptitlerin maliyet etkin ve ölçeklenebilir biyosentetik üretimini sağlar; tamamen sentetik yaklaşımlarla ilişkili uzunluk ve verim kısıtlamalarınıaşar 12. Kimyasal ve biyolojik üretim stratejilerini entegre ederek, bu birleşik çerçeve yalnızca her iki yönteme göre daha fazla esneklik, ölçeklenebilirlik ve translasyon potansiyeli sunar; bu da onu mekanik araştırma ve terapötik geliştirme için özellikle uygun kılar.

Üretimden sonra, bu bileşiklerin biyolojik değerlendirmesi iki önemli test ile yapılır. Antimikrobiyal aktivite testi, her peptid veya taklitçinin temsil mikroorganizmalara karşı inhibitör potansiyelini ölçür ve spektrum ve potansiyel hakkında içgörüler sağlar. Toksisite testi, memeli hücre hatları kullanılarak sitouyumluluk olup güvenlik ve seçiciliği sağlar. Bu deneysel adım tasarımı, sentez ve fonksiyonel testleri entegre ederek, bu protokol AMP'lerin ve sentetik analoglarının etkinliği ve güvenliğini karakterize etmek için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Bu metodolojiler birlikte, AMR'nin artan küresel sorununu ele almak için yeni antimikrobiyal ajanların geliştirilmesi ve doğrulanması için sistematik bir yaklaşım oluşturur.

Protokol

1. Anthranilamide peptidi RK758 taklidi sentezi

  1. RK758, ana organik yapı blokları olan N-benzil karbamat korumalı L-triptofan ve 5-bromo isatoik anhidrit ile kendi içinde sentezlenmektedir. Birkaç sentetik yaklaşım bildirilmiştir; ancak aşağıdaki bildirilen yaklaşım, daha önce yayımlanan sentetik protokollere göre iyi ölçeklenebilirlik ve genel verim göstermiştir; bu da daha önce yayımlanan sentetik protokollere göre bir gelişmedir14,15.
    1. Yöntem 1: Benzil (S)-(1-((2-((tert-butoksikarbonil)amino)etil)amino)3-(1H-indol-3-yl)-1-oksopropan-2-yl) karbamat (2):
      1. 250 mL'lik tek boyunlu bir şişe, manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış şekilde, Cbz-L-triptofan (10,0 g, 29,6 mmol) tartılır ve 30 mL DMF ile 80 mL DCM içinde çözünür.
        DIKKAT: DMF'nin doğuştan kusurlara neden olduğu şüphesi var; Hamileyseniz ele almaktan kaçının ve sadece gazlı davlumbazda kullanın.
      2. HOBt (4,08 g, 29,6 mmol), N-Boc-etilenediamin (4,66 mL, 29,6 mmol) ve diyisopropiletilamin (8,31 mL, 59,0 mmol) ekleyin ve 15 dakika karıştırın.
      3. EDC hidroklorür tuzu (11,3 g, 59 mmol) ekleyin. Oda sıcaklığında 20 saat karıştırın.
        DIKKAT: EDC gibi karbodiimidler, tekrar tekrar maruz kalmada anafilaktik reaksiyonlara karşı duyarlılık oluşturduğu bilinmektedir; Uygun eldivenlerin takıldığından emin olun.
      4. Tüm Cbz-L-Trp'nin tüketilip tükenmediğini görmek için 1:1 (v/v) DCM/Etil asetat kullanarak TLC'yi kontrol edin.
      5. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, reaksiyonu konsantre etmek için döner evaporatör kullanarak diklorometan karışımdan çıkarılır.
      6. Çamuru yaklaşık 300-400 mL etil asetat içinde solve edin
        NOT: 1.1.1.6 adımında dimetilformamidde bir bulamaç bulunur. Süspansiyonu çözmek için yeterince etil asetat kullanın.
      7. Çözeltiyi 500 mL'lik bir ayırıcı huni ile birlikte 50 mL su ile birlikte dök. Ayırıcı huniyi sallayın.
        DIKKAT: Burada büyük hacimde uçucu çözücü kullanıldığı için, ayırıcı huninin aralıklı olarak havalandırılması zorunludur.
      8. Sulu tabakayı boşaltın, organik etil asetat tabakasını koruyun.
      9. 1.1.1.7-1.1.1.8 adımlarını tekrarlayın; 50 mL su, 50 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 50 mL doymuş sulu sodyum klorür kullanılarak.
      10. Tutulan organik tabakayı 1 L'lik konik bir şişeye aktarın. Organik maddeleri susuz sodyum sülfat ekleyerek kurutup şişeyi döndürerek serbest akan bir toz oluşana kadar döndürün.
      11. Karışımı 1 L yuvarlak tabanlı bir şişeye filtreleyin, ardından döner evaporatörde (180 mbar vakumla 40 °C su banyosu) kuruyana kadar yoğunlaştırın.
      12. 50 mL dietil eter ve manyetik karıştırma çubuğu ekleyin, ardından bulamacı 45-60 dakika karıştırın.
        NOT: Metal spatula ile matla duvardan katı maddeleri kazımak etkili olabilir.
      13. Çamuru filtreleyerek çökeltilmiş katı maddeleri toplayın. Filtre kekini 50 mL dietil eter ile iki kez daha yıkar. Katı maddeleri emici altında kurutarak %87 verimle bej toz olarak 2. bileşik elde edin.
    2. Yöntem 2: Tert-bütil (S)-(2-(2-amino-3-(1H-indol-3-il) propanamido) etil) karbamat sentezi (3)
      1. Kauçuk septum ve cam stoper ile donatılmış 250 mL iki saplı yuvarlak tabanlı bir şişede, manyetik karıştırma ile 100 mL metanolde ürün 2 (10,8 g, 22,3 mmol) çözülür
        NOT: Cam stoper'ı yağlamayın, çünkü bu kirlenmeye yol açabilir.
      2. Karıştırırken, cam stopperle açılan açıklıktan karbon üzerine %10 paladyum (1.07 g) ekleyin. Schlenk manifold kullanarak, karışım içinde en az 30 dakika boyunca azot gazı kabarcıkla geçirin.
        NOT: Argon gibi herhangi bir inert gaz kullanılabilir; ancak bu durumda N2 evi yeterlidir.
      3. Cam stoper'ı 2 yollu topraklama cam eklem adaptörüyle değiştirin; bir hat hidrojen balona, diğeri ise vakuma bağlanır. Bağlantı noktasının etrafına PTFE bantını takarak hava geçirmez bir conta oluşturun.
      4. Termosunu açıp metanol kaynamaya başlayana kadar vakum yapın, sonra hızla termosunu hidrojen balonuna açın. İki kez daha tekrarlayın.
      5. Reaksiyonu ince katmanlı kromatografi ile (eluent olarak 1:1 etil asetat/diklorometan kullanılarak) reaksiya karışımının küçük aliquotlarını kauçuk septumdan bir şırınga ile çıkararak ve 40 μm PTFE membran filtresinden filtreleyerek izleyin.
      6. Schlenk manifoldunda vakumu azota geçirin. Şişeden kauçuk septumu çıkarın ve azotun kalan hidrojenin yaklaşık 5 dakika boyunca dışarı çıkmasına izin verin.
        DIKKAT: Karbon üzerindeki paladyum, hidrojen üzerine adsorbe edildiğinde havada kendiliğinden tutuşabilir. Reaksiyonu inert gaz örtüsü altında yönetmek önemlidir.
      7. Etil asetatta diatomumuz topraktan bir bulamaç oluşturarak ve bulamaç, 500 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye bağlı orta gözenekli cam fritted filtre hunisine aktararak diatomlu toprak yatağı hazırlayın ve çözücü diatomlu toprak seviyesinin hemen üzerine kadar hafif bir vakum çekin
        NOT: Diatomlu toprak sütunu, huni içine yüklendiğinde en az 2–4 cm yüksekliğinde olmalıdır.
        DIKKAT: Diyatozlu toprak/kristal silika yüksek kanserojendir ve solunum maruziyeti yoluyla mezotelyoma neden olduğu bilinir. Her zaman bir duman davlumbonunda veya uygun bir solunum cihazıyla kullanılmalıdır.
      8. Pipet veya başka bir yöntemle, reaksiyon çamurunu celite kolonunun üstüne aktarın, üst katmanı rahatsız etmemeye özen gösterin. Şişede sadece az miktarda reaksiyon bulur (<2 mL) kalana kadar tekrarlayın
        NOT: Yatağın üzerinde yeterince çözücü başı bulunduktan sonra, şişedeki içerikler filtre hunisine dökülebilir.
      9. Aralıklı olarak huni/şişe üzerinde hafif bir vakum çekin, çözücü başlığı yatağın hemen üstüne kadar kullanın, şişedeki içeriği az miktarda etil asetatla yıkayın ve 3–4 kez tekrarlayın
        NOT: Selitin üzerindeki paladyum/karbon tabakası asla havaya maruz kalmamalıdır.
      10. Tüm ürünler süzülene kadar pedi yıkamaya devam edin; bu, filtrelenmiş çözücünün bir kısmını küçük bir TLC plaka parçasına damlatarak ve UV ışığı altında görselleştirerek kontrol edilebilir.
      11. Döner evaporatördeki tüm çözücüleri çıkarın. Kalıntıya minimum miktarda diklorometan (5 mL) ekleyin ve ürünü dietil eter (50 mL) ekleyerek çökeltin.
      12. Karışımı filtreleyin, aradaki çökeltiyi koruyarak, niceliksel verimde ara 3 verimi sağlar.
    3. Yöntem 3: Tert-bütil (S)-(2-(2-(2-(2-amino-5-bromobenzamido)-3-(1H-indol-3-yl)propanamido)etil) karbamat sentezi (4)
      1. 250 mL fırında kurutulmuş tek boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişede ürün 3 (5,00 g, 14,5 mmol) ve 5-bromoisatoik anhidrid (5) (3,50 g, 14,5 mmol) tartılır. 50 mL susuz asetonitril ekleyin.
        NOT: Ansu asetonitril, solventin aktiflenmiş alümina sütunu aracılığıyla süzülmesiyle bir çözücü arıtma sisteminden elde edilmiştir.
      2. Mataşa su soğutmalı reflü kondansatör ve susuz kalsiyum klorür ile doldurulmuş kurutma tüpü ile takın ve eklemleri PTFE bantla kapatın.
      3. Karışımı reflü (b.p. asetonitril = 82 °C), yağ banyosu sıcaklığı = 100 °C olarak ısıtın. Reflü ile 18 saat veya TLC üç saat tüketim gösterene kadar karıştırın. İşlem tamamlandıktan sonra, reaksiyon karışımını vakumda kuru hale getirin.
      4. Katı maddelere 30 mL asetonitril ve 50 mL dietil eter ekleyin ve karışımı filtreleyin, katı ürünü korun. Başlık bileşiği 4'ü %78 verimde elde etmek için katı ürünü toplayın.
    4. Yöntem 4: Tert-bütil (S)-(2-(2-(2-(2-(2-(2-naftamido)-5-bromobenzamido)-3-(1H-indol-3-yl)propanamido)etil) karbamat sentezi (6)
      1. 50 mL fırında kurutulmuş tek boyunlu, yuvarlak tabanlı bir şişede 2-naftail klorür (572 mg, 3,0 mmol) 10 ml diklorometan içinde çözünür. Mataşa kauçuk septumla takın. Bu şişe bundan sonra "A şişesi" olarak adlandırılır.
        NOT: Çalışmada ticari bir tedarikçiden alınan naftal klorür kullanıldı, ancak14'e göre oksalil klorür kullanılarak 2-naftaik asitten benzer sonuçlar elde edildi.
      2. Ayrı bir fırında kurutulmuş 100 mL tek boyunlu, yuvarlak tabanlı şişede 4. ürünü (544 mg, 1.0 mmol) tartın. Bu şişe bundan sonra "Flask B" olarak adlandırılır.
      3. Flask B'yi kauçuk septumla takın ve şırınga iğnesi ile Luer adaptörü kullanarak Schlenk manifold'a bağlayın. Mataşa B'yi vakumda temizleyin ve azotla doldurun, iki kez tekrarlayın.
      4. Şırıngayla 20 mL susuz diklorometan Matla Flask B'ye ekleyin. Şırıngayla Matla B'ye trietilamin (455 μL, 3,24 mmol) ekleyin. Buz banyosu üzerinde 10 dakika soğutun.
      5. A şişesindeki içeriği uygun boyutta bir şırıngaya koyun. Şırıngadan alınan çözeltiyi B şişesine damla karıştırarak ekleyin.
        NOT: Trietilamin hidroklorür üretimi, çözücünün üzerinde beyaz dumanlar olarak görülebilir. Asit klorür çözeltisi eklendikten sonra buz banyosundan çıkarın.
      6. Karışımı, TLC analizine göre 4. bileşiğin tamamını tüketene kadar karıştırın. Karışımı neredeyse kuru olacak şekilde döner bir evaporatörde (600 mbar, 40 °C) konsantre edin.
      7. Karışımı su (30 mL) ve etil asetat (70 mL) arasında böl. Katmanları ayırıcı bir huni içinde silkeleleyerek ve sulu tabakayı atarak ekleyin.
      8. Organik karışımı NaHCO3 (30 mL) ve NaCl doymuş sulu çözeltilerle yıkayın. Organik tabakayı susuz Na2SO4 ekleyerek kurutarak karıştırma sırasında serbest akan bir toz gözlemlenene kadar.
      9. Döner evaporatörde (170 mbar, 40 °C) kuruyana kadar konsantre edin. Ham katı maddeleri asetonitril (15 mL) ve dietil eter (15 mL) ile tritüre ederek başlık bileşiği %70 verimde açık beyaz katı olarak elde edersiniz.
    5. Yöntem 5: (S)-N-(2-((1-((2-aminoetil)amino)-3-(1H-indol-3-il)-1-oksopropan-2-il)karbamoyl)-4-bromofenil)-2-naftamid (7) sentezi
      1. Ara 6 (1,5 g, 2,15 mmol) süspansiyonunu diklorometan (0,2 M nihai konsantrasyon) ile 1,2-etanedithiol (DCM hacmine göre %20 hacim) ile muamele edin.
        DIKKAT: 1,2-etanedithiol, düşük konsantrasyonlarda bile mide bulantısı yaratabilecek rahatsız edici bir kokuya sahiptir. Duman başlıkta tutun.
      2. Karışımı buz banyosunda soğutun, ardından trifluoroasetik asit (DCM ile aynı hacimde) ile işleyin. Karışımı 0 °C'de 2 saat boyunca karıştırın.
      3. Tamamlandıktan sonra, reaksiyon karışımını azot gazı ile arındırarak konsantre edin
        NOT: Egzoz gazları, koku salınımını sınırlamak için bir çamaşır suyu tuzağından kabarcık yoluyla kabarcıklanabilir.
      4. Ham katı maddeleri dietil eter (10 mL) ile tritüre ile geçirin ve katı maddeleri toplamak için filtreleyin. Filtre kekini diyetil eter ile iki kez yıkayın (her biri 10 mL), ardından katı maddelerin emiş altında kurumasına izin verin.
    6. Yöntem 6: Tert-butil (S,Z)-(3-((1H-indol-3-yl)metil)-1-(2-(2-naftamido)-5-bromofenil)-1,4-diokso-9-(fenilimino)-2,5,8,10-tetraazadodekan-12-yl) karbamat sentezi (9)
      1. Tek boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe, ara 7 (1,0 g, 1,4 mmol), thiourea türevi 8 (415 mg, 1,4 mmol) ve trietilamin (1,01 mL, 4,2 mmol) ile N, N-dimetilformamid (5 mL) ile doldurun.
      2. Reaksiyonu -5 °C'ye kadar bir tuzlu buz banyosu içinde soğutun ve cıva (II) klorür (760 mg, 2,8 mmol) ekleyin ve 16 saat karıştırın.
        DIKKAT: Cıva (II) klorür , ağızdan , dermal ve solunum yoluyla maruz kalma yoluyla ölümcüldür. Ayrıca sucul yaşam için son derece toksiktir. Kimyasal dirençli eldiven, göz koruması ve vücut koruması giyin. Ayrıca, cıva(II) klorür içeren aerosol çözeltilerinden kaçının ve bunları bir duman davlumbonu içinde kullanın. Bu süreçten çıkan atıkların diğer organik atık akışlarından ayrıldığından emin olun ve hiçbir cıva atığı giderlere girmediğinden emin olun.
      3. Tamamlandıktan sonra, karışımı 2-propanol ile seyreltir ve selit yatağından geçirerek filtratı toplayın.
      4. Filtratı kuruyana kadar döner bir evaporatörde yoğunlaştırın ve kalıntıyı silika üzerinde 3:97 metanol/diklorometan kullanarak flaş kolon kromatografisine maruz bırakın.
      5. Toplanan kesirleri TLC ile analiz edin ve ardından başlık bileşiğini almak için saf kesirleri toplayın.
    7. Yöntem 7: RK758'in Sentezi
      1. Boc'un ara 8'i deprotekte ederek RK758'i oluşturma yöntemi, Adım 1.1.5 ile aynıdır.
      2. Ortaya çıkan ürünü 5 mL 1:1 (v/v) asetonitrile/ultra-saf suda yeniden çözüp vida kapağına, borosilikat cam şişeye aktarın. Çözeltiyi sıvı azot banyosunda dondurun ve ardından ürünü elde etmek için dondurarak kurutun.
        NOT: Dondurulduğunda çatlamayı önlemek için kullanılan şişenin borosilikat olduğundan emin olmak önemlidir.
        DIKKAT: Sıvı azot maruziyeti donma/cilt hasarına neden olabilir. Uygun eldiven ve göz koruması takıldığından emin olun.

2. Yüksek katyonik antimikrobiyal peptid Mel4'ün (KNKRKRRRRRRGGRR) rekombinant üretimi ve saflaştırılması

  1. Üretim için optimize edilmiş protokol
    1. Gen sentezi
      1. Gen kasetini aşağıdaki bileşenlerle tasarlayıp sentezle: HIS (rekombinant peptid izolasyonu için 6x/7x histidin etiketi, dahil edici vücut (IB) oluşumu için Ketosteroid Isomeraz (KSI) etiketi ve protein motifinden sürdürülebilir, kimyasal olmayan KSI ve His-etiketinin protein motifinden çıkarılması için Tütün Etç Virüsü (TEV) Bölünme Bölgesi (ENLYFQ↓G, S, A, M, C, H) olarak tasarlanmıştır.
      2. Kesimden hemen sonra amino asidi (G, S, A, M, C, H) seçin ki AMP'nin aktivitesini etkilemez.
        NOT: Glisin, TEV bölünmesinde en yüksek verimliliği sunar. N-veya C-terminalinde bulunan tek bir amino asit, AMP'lerin fizikokimyasal özelliklerini, yani aktivitelerini etkileyebilir.
      3. Sentetik gen dizisini, yan bölgeler dahil olmak üzere, 5' XbaI ve 3' XhoI kısıtlama noktalarıyla sentezleyin. Amino asit dizisi Tablo 1'de ve şematik olarak Şekil 1'de verilmiştir.
    2. Klonlama
      1. PET vektörünü uyumlu krestriksiyon enzimleriyle sindirin.
        NOT: Bu durumda, p15TVL plazmid (pET15b türevi Ampr, T7 promotör) istenmeyen parçayı parçalamak için XbaI, XhoI ve ScaI ile sindirildi.
      2. Sindirilen parçaların yeniden bağlanmasını önlemek için, 37 °C'de 10 dakika boyunca buzağı bağırsağı alkali fosfataz ile tedavi edilsin. Sentetik His-KSI-Mel4 genini XbaI ve XhoI ile 20 μL reaksiyonda sindirin.
      3. Tüm kısıtlayıcı enzimlerden parçaları QIAquick PCR Temizleme Kiti ile arındırın. Alternatif olarak, jel elektroforezi çalıştırın ve istenen vektör parçasına bağlı bandı kesin, ardından jel çıkarma kiti kullanarak jelden parça çıkarın.
        NOT: Saflaştırılmış parçaların, ligasyonu optimize etmek için spektrofotometrik yöntemle (NanoDrop) nicelendirildiğinden emin olun.
    3. Ligasyon ve dönüşüm
      1. PET vektörüne yerleştirilen sindirilmiş sentetik geni ligate edin. Insert ile vektörün oranının ekvimolyar olduğundan emin olun.
      2. Karışımı T4 Ligase ile gece boyunca 16 °C'de inkübe edin. Isı şoku veya elektroporasyon yöntemleriyle kimyasal veya elektro yetkili bir DH5α'ye dönüştürülür.
      3. Kimyasal olarak yetkin DH5α hücrelerini plazmid DNA ile nazikçe karıştırın ve DNA tutması için buz üzerinde kuluçka yapın. Sonra hücreleri 42 °C'de 30 saniye boyunca ısı şokuyla DNA alımını kolaylaştırmak için uygular, ardından buzda hızla soğutur.
      4. Bir saat boyunca 37 °C sıcaklıkta antibiyotiksiz 450 μL LB Et suyu ortamında iyileşme sonrası hücreleri uygun antibiyotik içeren seçici agar üzerine yerleştirin.
        NOT: Dönüştürülmüş koloniler genellikle gece kuluçkasından sonra ortaya çıkar. Elektro donanımlı DH5α hücreler için, küçük bir hacmde saflaştırılmış, tuzsuz plazmid DNA'sını (genellikle ~50 μL hücrelere 1–2 μL 10–100 ng hücrelere) soğuttulan elektroporasyon küvetinde hücrelerle karıştırın.
      5. Kısa bir soğutmadan sonra, tek bir darbe verin (yaygın ayarlar: 0.2 cm boşluklu bir küvet için 1.8 kV, ~5 ms zaman sabiti sağlar; cihazınıza/küvetinize göre ayarlayın), tuzdan arındırılmış DNA ve buz gibi reaktifler kullanarak yay oluşumunu önlemeye özen gösterin.
      6. Hemen ~450 μL önceden ısıtılmış LB ekleyin, 37 °C'de bir saat çalkalayarak geri kazanın, ardından seçici agar üzerine tabakla koyun.
      7. LB çorbasında plazmid izolasyonu için gece boyunca kültür dönüştürücüleri plazmid arıtma kiti kullanılarak yapılır. Son plazmid yapısını Tablo 1'deki primerlerle PCR ile doğrulayın ve Sanger dizilemesiyle diziyi doğrulayın.
    4. Doğrulanmış plazmidi yukarıda belirtildiği gibi ifade konakçısı (kimyasal veya elektrokompetent) E. coli BL21(DE3)'e dönüştürün.
  2. Optimize edilmiş ifade ve dahil etme gövdesi (IB) üretimi
    1. 10 mL LB suyu (100 μg/mL ampisillin) aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de büyüyün. Bunu kullanarak 100 mL aşılayın ve ardından 1 L üretim kültürü elde edin.
    2. Kültürün LB içindeki optik yoğunluğa (OD600) 0 = 0.1 zamanında seyreltir. %1 glikoz ve 100 μg/mL ampisilin takviyesi olan LB ortamı kullanın.
    3. 37 °C'de kuluçka yapın ve OD izleyerek log fazına (OD 600 0,5–0,6) ulaşın. Düşük konsantrasyona Isopropil β-D-1-tiogalaktopyranosid IPTG ile genellikle 0,1 mM indüksiyon yapılır.
      Dahil edici cisimlerin oluşumunu artırmak için 16–24 saat boyunca 37 °C'de kalın.
    4. 16 ila 24 saat kuluçkaya devam edin. Hücreleri santrifüjle (5.000 x g, 4 °C) 10 dakika boyunca hasat edin ve peletleri -80 °C'de depolayın.
  3. Hücre lizisi ve protein fraksiyonasyonu
    1. Hücre pelletlerini buz üzerinde eritip kimyasal lizisi başlatmak için Bugbuster reaktifinde yeniden süzülür. Lizat 4.000 x g sıcaklığında 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Üst katmanı çözünür protein fraksiyonu olarak toplayın.
    2. Kalan peleti yıkayın ve %10 (v/v) Bugbuster ile MilliQ suda tekrar askıya alın. Çözünmeyen protein fraksiyonunun (inkluksiyon cisimlerini) tam olarak geri kazanmak için süspansiyonu sonikasyona tabi bırakın.
    3. Örnekleri %5 β-merkaptoetanol içeren 100 μL SDS-PAGE örnek tamponu ile işleyin. Karışımı 95 °C'de 5 dakika kuluçka edin, böylece tam protein denatürasyonu sağlanır.
  4. SDS-PAGE elektroforezi
    1. Denatüre lizatları, standart elektroforetik ayrım için %15 SDS-PAGE çift jellerine yükleyin.
    2. Bir jeli suyla 1 saat yıkayın. GelCode Blue Stain Reagent ile gece boyunca leke yapın. Ertesi gün suyla defile, bantlar net bir şekilde görselleştirilene kadar kullanın.
    3. Biorad Gel Doc cihazı ile Image Lab ile boyalı jeli görselleştirip belgeleyin (Şekil 2A).
  5. Western blotting (İmmünodetection)
    1. Lekelenmemiş jel, bir nitroselüloz membranı, filtre kağıtları ve süngerleri transfer tamponunda dengeleyin (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, %0.1 Tween 20). Transfer sandviçini birleştirin ve 100 V'da ortam sıcaklığında 1 saat boyunca transferi gerçekleştirin.
    2. Membranı, belirli olmayan bağlanmayı önlemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklayıcı tamponda (TBST'de %5 yağsız süt) kuluçka yapın.
    3. Zarı, Mouse anti-HisTag birincil antikoru (bloklayıcı tamponda 1:1.000 seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 °C'de hafif bir çaltlama ile inkübe edin.
    4. Zarı TBST ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıka. Zarı, HRP ile bağlanmış anti-fare IgG (bloklama tamponunda 1:5.000 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
    5. Son bir turda üç TBST yıkama yapın. Geliştirilmiş Kemilyünüminesans (ECL) alt tabakasını membrana 1 dakika boyunca uygulayın ve kemilyünlümensans görüntüleyici veya X-ışını filmine maruz kalarak görselleştirin. Görüntüyü belgeleyin ( Şekil 2B'de görüldüğü gibi).
  6. IB izolasyonu ve affinite arındırması
    1. Hücre pelletini lizis tamponunda yeniden süzüldürün (100 mM Tris· Cl, pH 7.0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT (770 mg/litre), 5 mM benzamidin· HCl (780 mg/litre)) ve mekanik lizis (örneğin, French press/Sonication) gerçekleştirir. Çözünmeyen KSI-Mel4 IB pelletini izole etmek için santrifüj (20.000 x g, 4 °C) ile 20 dakika boyunca kullanıldı.
    2. Peleti yıkama tamponu ile iyice yıkayın (100 mM Tris· Cl, pH 7, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 2 M urea, %2 (w/v) Triton X-100). Pelleti 2M üre'den fazla olmayan miktarda çözünür.
      NOT: IB'yi çözünürmek için kullanılan üre konsantrasyonu, TEV proteazının çalışma aralığı içinde olmalıdır.
    3. Üreticinin talimatlarını takip ederek BCA kiti kullanarak izole edilmiş IB'yi nicelikle hesaplayın.
      1. Pierce Reaktif B ve Reaktif A'yı 1:50 hacim-hacim oranında karıştırın. Üçlü olarak çalıştırılacak standart ve örnek sayısına göre toplam hacmi hesaplayın.
      2. Referans olarak Sığır Serum Albümini (BSA) kullanarak, 3.000 μg/mL ile 200 μg/mL arasında standart bir eğri oluşturmak için bir dizi seyreltme hazırlayın.
      3. 96 kuyulu bir plaka kullanılarak, her BSA standardından 25 μL pipetle ve numune (saflaştırılmış üst örtü ve yeniden askılı çökelti dahil) kuyulara alın.
      4. Her bir standart veya örnek içeren her kuyuya hazırlanmış BCA Çalışma Reaktifinden 200 μL ekleyin. Tabağı kısa bir süreliğine karıştırın ve renk gelişimi için 37 °C'de 1 ila 2 saat kuluçka yapın.
      5. İnkubasyondan sonra, spektrofotometre kullanılarak plakanın 562 nm emilimini ölçebilirsiniz. BSA standartlarının emilimini bilinen konsantrasyonlarına karşı çizerek doğrusal veya kuadratik standart eğri oluşturun.
      6. His-KSI-Mel4 veya rekombinant Mel4 örneklerinin protein konsantrasyonunu, üretilen standart eğri ile emilimcilik değerlerini karşılaştırarak belirleyin. TEV kesintisinden önceki ve sonrası konsantrasyonlar Şekil 3'te gösterilmiştir.
  7. Enzimatik bölünme ve etiket çıkarma
    1. Bölünme reaksiyonu: His-etiketi TEV Proteaz (önerilen azı doz oranı 1:50 ile 1:100 Proteaz: Füzyon Proteini). Maksimum verimlilik için 4 °C'de 16 saat kuluçka yapın.
    2. Etiket çıkarma ve immobilize metal affinite kromatografisi (IMAC) arındırma:
      1. Bölünme reaksiyonu karışımını taze bir nikel-nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) sütunu üzerinden geçirin. Ni-NTA reçinesini bağlama tamponu (Lysis Buffer) ile dengeleyin.
      2. Parçalama reaksiyonu karışımını yükleyin. His-etiketli bileşenler (KSI parçası ve TEV proteaz) reçineye bağlanır.
      3. TEV bölünme noktasından kalan G, S, A, M, C ve H amino asitleriyle etiketlenmemiş rekombinant Mel4 peptidini içeren akış toplayın.
      4. Bu ekstra amino asidin, kimyasal olarak sentezlenmiş Mel4 ile MIC testini yaparak AMP aktivitesini etkilemediğinden emin olun.
      5. Bağlı KSI parçasını ve TEV proteazını, bir elution tampon gradyanı (500 mM İmidazol, 500 mM NaCl, 20 mM Sodyum fosfat tamponu, pH 8) kullanarak elütasyonla elde edin.
      6. Adım 2.6.3'te belirtildiği gibi BCA testi yapın.

3. Antimikrobiyal aktivite

  1. Medya hazırlığı
    1. Üreticinin talimatlarına göre [Mueller Hinton Sçorbası, katyonla ayarlanmış (CAMHB), Triptikaz Soya Suyu (TSB), D/E nötralize edici çorba ve Triptikaz Soya agar (TSA)] hazırlayın. Ayrıca, 10 × konsantre PBS'den 1 × fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) hazırlayın. Sonra bunları 121 °C'de 15 lbs/inç 2 hızda otoklav yapın.
  2. Peptit stok hazırlığı
    1. AMP'yi çözünür ve yüksek konsantrasyonda, örneğin 20 mM veya en az 2 mg/mL olan steril suda taklit eder. Eğer peptid çözünmezse, nihai konsantrasyonu %0,01 asetikasit 16 içeren steril su kullanın. Plastik yüzeylere adsorpsiyon bekleniyorsa, stok çözeltiyi %0,2 (w/v) BSA ile takviye edin, çünkü bu bir blokaj17 görevi görür.
      NOT: Dimetil sülfoksit (DMSO) ayrıca suda çözünmeyen peptitler veya taklitler için de önerilir. 20 mM veya 2 mg/mL gibi konsantre bir stok çözeltisi hazırlayın.
    2. Peptit stokunu aseptik koşullarda 0.22 μm şırınga filtresi ile filtre-sterilize edin.
    3. AMP stokunun alikotlarını hazırlayın ve -20 °C'de (veya AMP'nin stabilitesine göre) saklayın. Aynı bir çözücü kontrolü hazırlayın.
  3. Bakteriyel inokulum hazırlığı
    1. Bakteriyel izolatı TSA gibi besin açısından zengin bir ortama çizerek saf ve iyi izole edilmiş koloniler elde edin.
    2. Plakayı 36 ± 1 °C'de aerobik olarak 18-24 saat boyunca inkubka edin.
    3. Kültür plakasından steril aşılama döngüsü kullanarak morfolojik olarak benzer, iyi izole edilmiş üç ila beş koloni seçin. Bunları 5–10 mL TSB veya CAMHB içeren steril bir tüpe aktarın. Eşit bir süspansiyon elde etmek için, bakteri kolonileriyle oluşan halkayı eğik tüpün iç duvarına nazikçe sürterek homojen bir süspansiyon elde edin.
    4. Et suyu kültürünü 36 ± 1 °C'de 180 devirde 18 ila 24 saat boyunca çalkalayarak kuluçka yapın.
    5. Gece kültürünü 3.000 x g ile 25 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle yapın ve bakteri pelletini steril 1 × PBS ile üç kez yıkayın.
    6. Steril bir kapta, 2 mL 1 × PBS dağıtılır, ardından 50–100 μL yıkanmış bakteri süspansiyon eklenir ve 5–10 saniye girdabında durarak uniforma sağlanır.
    7. 600 nm (OD600) optik yoğunluğunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün. Kısaca, 96 kuyuyla bir plakaya 200 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin, aynı hacmi 1× PBS ile birlikte bir boşluk ile OD600'ü ölçün ve yaklaşık 1–2 × 108 CFU/mL eşdeğeri elde edin (TSA'da uygulanabilir plaka sayısıyla doğrulan).
    8. Ayarlanmış süspansiyonu CAMHB'de 1:100 seyreltirerek nihai aşıyı 106 CFU/mL elde edin.
  4. Plaka kurulumu
    1. Steril, düz tabanlı 96 kuyu plakasını bakteri suşu, AMP adı, tarih ve bilim insanının baş harfleriyle etiketleyin. Plakada, kapağa test, boş ve kontrol kuyu yerlerini işaretleyin.
    2. Plakanın ilk kolonuna 200 μL AMP çözeltisi (en yüksek konsantrasyon) verin. Kalan kuyulara, sütun 2'den 12'ye kadar 100 μL CAMHB ekleyin.
    3. Çok kanallı pipet kullanarak, AMP'nin 1. sütundan 10. sütuna kadar iki kez seri seyreltilmesi yapılabilir ve onuncu kolondan 100 μL çıkarılır.
    4. Her kuyuya 100 μL hazırlanmış bakteri aşısı (106 CFU/mL) ekleyin, sterillik kontrolü (boş) hariç. Bu, test kuyularında yaklaşık 5 × 10-5 CFU/mL nihai bakteri konsantrasyonu elde edecektir. Boş kuyruklara 100 μL CAMHB ekleyin ve nihai hacim 200 μL'ye ulaşır. Her konsantrasyon için üçlü kuyular hazırlayın.
      NOT: CAMHB'de seyreltildiğinde çökelen AMP'ler için, %0,1–0,2 BSA içeren asetik asit eklenmesi sorunu çözebilir; Optimizasyon ampirik testlergerektirebilir 16. Bu durumlarda, CAMHB artı asetik asit ve/veya BSA içeren çözücü kontrol kuyuları da dahil edilecektir.
    5. Benzer şekilde, AMP mimic (RK758) ve karşılaştırıcı antibiyotik (örneğin kolistin) için MIC uygulanır.
    6. Tabağı kapağıyla kapatın, buharlaşmayı önlemek için sargıyla kapatın ve 36 ± 1 °C'de 18–24 saat kuluçka yapın.
    7. E . coli'nin referans suşunu (örneğin, mcr-1 barındıran E. coli NCTC 13846) paralel olarak ekleyin ve peptid veya peptid taklitine benzer şekilde işlensin.
    8. İnkubasyondan sonra MIC'i kaydedin.
  5. MIC'in Belirlenmesi
    1. Her kuyununOD 600'ünü mikroplaka okuyucu ile ölçün. İşlenmemiş büyüme kontrolüne göre büyümedeki yüzde azalmayı hesaplayın. MIC, büyüme kontrol18'e kıyasla OD600'de en az %90 azalma sağlayan AMP'nin en düşük konsantrasyonu olarak tanımlanır.
    2. En az üç bağımsız deneyden üçlü olarak MIC değerleri belirlenir. Tekrarlanabilirliği sağlamak için sonuçları ortalama ± standart sapma olarak bildirin.
      NOT: Kontrol suşu E. coli NCTC 13846 için MIC, beklenen kolistin MIC'inden bir iki kat seyrelme içinde olmalıdır. DMSO, asetik asit ve BSA içeren çözücü kontrollerinin kendi başına inhibitör bir aktivite olmadığını doğrulayın.
  6. Minimum Bakterisit Konsantrasyonun (MBC) Belirlenmesi
    1. MIC üzerindeki ve üzerindeki kuyulardan ve altındaki bir konsantrasyondan, 100 μL bakteriyel süspansiyon 900 μL D/E suyu buluşmasına aktarılır ve seri seyreltmeler hazırlanır.
    2. Her seyreltilmiş süspansiyondan 20 μL plaka TSA'ya üçlü olarak yerleştirilerek uygulanabilir bakteri sayıları belirlenir.
    3. 36 ± 1 °C'de 24 saat boyunca gece kuluçka yaptıktan sonra, kolonileri sayın, ilgili seyreltme faktörü ile çarpın ve geçerli sayıları, aynı şekilde işlenen büyüme kontrol kuyusundan alınanlarla karşılaştırın.
    4. MBC, standart koşullarda 24 saat inkubasyon (büyüme kontrolü) sonrası başlangıç aşısına kıyasla canlı bakteri sayısında %99,9 (≥ 3 log10) azalmaya yol açan antimikrobiyal ajanın en düşükkonsantrasyonu olarak tanımlanır. 19.
  7. Raporlama
    1. MIC ve MBC'yi μg/mL ve μM olarak raporlayın.
    2. μg/mL'yi μM'ye dönüştürün; μM = μg/mL × 1.000/moleküler ağırlık (g/mol) kullanılarak
  8. Enbulaşıcı atık bertaraf
    1. Canlı bakteriyel kültürlerle temas eden tüm malzemeleri, 96 kuyruklu mikrotiter plakalar, pipet uçları ve Falcon tüpleri dahil olmak üzere, belirlenmiş biyolojik tehlike atık torbalarına atın.
    2. Toplanan biyolojik tehlikeli atıkları 121 °C'de, 15–20 dakika boyunca 15 psi basınçta otoklav ederek kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmeden önce tam sterilizasyonu sağlamaktır.

4. Sitotoksisite

  1. Toksisite testi için hücre sayımı ve tohumlama
    1. Fare fibroblast L929 hücreleri, örneğin fare fibroblast L929 hücrelerini, Dulbecco'nun minimum temel ortamında (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik (streptomisin sülfat ve penisilin G) içeren 75 cm2 şişesinde 37 °C ile %5 CO2 içeren bir yerde tutun.
    2. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve %0,25 tripsin-EDTA ile tripsin. Hücreleri, 50 μL hücre süspansiyonu ile %0,4 Trypan Blue içeren 50 μL karıştırarak sayın ve 10 μL hemositometreye yükleyin.
    3. Canlı (lekelenmemiş) ve ölü (mavi) hücreleri dört köşe karede sayın ve toplam hücre sayısını şu şekilde hesaplayın: Toplam hücre = (ortalama canlı hücre sayısı × 104 × 2 [seyreltme faktörü]).
    4. Uygulanabilirliği hesaplayın (% = (canlı / [canlı + ölü]) × 100.
    5. Son hücre konsantrasyonunu 5 × 104 hücre/mL olarak ayarlayın (DMEM ortamı kullanılarak 100 μL'de 5.000 hücre/kuyu demektir).
    6. Steril 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 μL hücre süspansiyonu tohumlanın. Yapışma sağlamak için %5CO2 ile 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
  2. Mel4 ve RK758 test çözeltilerinin hazırlanması
    1. Mel4/RK758'in çalışma çözeltilerini, son hedef konsantrasyonlarında (1.000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.6, 7.8 ve 3.9 μM) Step3.2'de tarif edildiği gibi hazırlanan stok çözeltisi kullanılarak düz DMEM'de (FBS ve antibiyotikler olmadan) hazırlayın.
    2. Her kuyiden kültür ortamını çıkarın. Karşılık gelen 1× Mel4/RK758 çalışma çözeltisinden 100 μL doğrudan kuyulara ekleyin.
    3. Belirlenmiş negatif kontrol (NC) kuyruklarına 100 μL DMEM ekleyin.
    4. Pozitif kontrol (PC) tarafından belirlenmiş kuyulara 100 μL DMSO ekleyin (DMSO'nun yanı sıra, Triton X-100 gibi sitotoksik ajan da pozitif kontrol olarak önerilir).
    5. 100 μL 1 x PBS boş kontrol olarak ekleyin.
      NOT: Tüm tedavileri ve kontrol kontrollerini üç adet gerçekleştirin. DMSO'yu eldiven ve göz koruyucu ile yönetin; Cilt temasından kaçının ve çözücü atıklarını kurumsal prosedürlere uygun olarak bertaraf edin.
  3. 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromid (MTT) testi
    1. 24 saat Mel4/RK758 maruziyetinden sonra, test ortamı hücreleri rahatsız etmeden dikkatlice aspire edilir.
      NOT: Antimikrobiyal bileşiklerle tedavi süresi, belirli deneysel tasarıma bağlı olarak değişebilir.
    2. 5 mg/mL stok çözeltiyi 1:9 oranında düz DMEM (son konsantrasyon 0,5 mg/mL) ile seyreltileyerek MTT çalışma çözeltisi hazırlayın.
    3. Her kuyuya 100 μL MTT çalışma çözümü ekleyin. Plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın ve mor formazan kristalleri oluşana kadar 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
      NOT: MTT ışığa duyarlı ve toksiktir. Eldivenleri tutun ve atıkları kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun şekilde bertaraf edin. MTT reaktifiyle işlem yaparken ışığı her zaman kapatın.
  4. Formazan çözünürlüğü ve soğurma ölçümü
    1. Her kuyidan MTT çözeltisini dikkatlice çıkarın. Her kuyuya 100 μL DMSO ekleyerek formazan kristallerini çözür.
    2. Tabağı 5 dakika boyunca bir shaker üzerinde koyun, böylece tam çözülmesini sağlayın. Mikroplaka okuyucu kullanarak 570 nm'de absorbansı ölçün.
  5. Veri analizi ve %50 sitotoksik konsantrasyon (IC50 veya CC50) belirlemesi
    1. Tüm okumalardan boş absorbans değerlerini (PBS) çıkarın ve hesaplama için düzeltilmiş boşluk kullanın.
    2. Hücre canlılığı (%) şu denklemi kullanarak hesaplayın: Yaşamlılık (%) = (Tedaviedilmiş/ ANC (hücre)) × 100.
    3. IC50 veya CC50'yi GraphPad Prism yazılımı ile hesaplayın.
      NOT: Deneyleri üçlü olarak tekrarlayın ve verileri ortalama ± standart sapma olarak raporlayın.

Sonuçlar

RK758'in Sentezi
Orta seviye 7'ye kadar olan analitik veriler daha önce14 yayımlanmıştır. RK758 ve ara 8–9 için analitik veriler aşağıdaki gibidir:

tert-bütil (2-(3-feniltioeido)etil)karbamat (8):
Ürün 8, açık beyaz katı olarak elde edildi (1,89 g, %87); m.p. 167,4–168,3 °C; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 9.58 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.44–7.29 (m, 4H), 7.11 (t, J = 12.0 Hz, 1H), 6.88 (br s, 1H), 3.55-3.53 (m, 2H), 3.13 (q, J = 4.0 Hz, 2H), 1.59 (s, 9H); 13C NMR (75 MHz,DMSO-d 6) δ 180.9, 156.3, 139.5, 129.1, 124.7, 123.7, 78.2, 44.3, 28.7; HRMS (ESI+): C14H21N3O2 SNa+ [M + Na]+: 318.1247 için hesaplandı, bulundu: 318.1252.

tert-bütil (S,Z)-(3-(((1H-indol-3-il)metil)-1-(2-(2-naftamido)-5-bromofenil)- 1,4-diokso-9-(fenilimino)-2,5,8,10-tetraazadodekan-12-il)karbamat (9):
Ürün 9 beyaz katı olarak elde edildi (0,253 g, %62); m.p. 173.4–174.9 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.23 (s, 1H), 10.86 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 9.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.57-8.54 (m, 2H), 8.44 (s, 1H), 8.11 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.06-8.03 (m, 3H), 7.84 (dd, J = 4.0, 12.0 Hz, 1H), 7.78 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 7.69–7.60 (m, 2H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.27-7.23 (m, 5H), 7.01-6.97 (m, 3H), 4.82-4.78 (m, 1H), 3.14-3.13 (m, 10H), 1.32 (s, 9H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 172.3, 167.8, 165.1, 156.3, 154.4, 138.9, 136.5, 135.4, 134.9, 132.6, 131.7, 129.9, 129.1, 128.7, 128.4, 128.2, 127.6, 127.6, 126.4, 124.8, 124.1, 123.6, 122.8, 121.4, 118.9, 118.7, 115.1, 111.8, 110.9, 78.4, 55.2, 42.3, 41.9, 39.4, 38.3, 29.5, 28.6, 27.9; HRMS (ESI+): c45 H47BrN8O5 [M + H]+: 859.2926 için hesaplandı, bulundu: 859.2925.

(S,E)-N-(2-((1-((2-((3-(2-(2-aminoetil)-2-fenilguanidino)etil)amino)-3-(1H-indol- 3-yl)-1-oksopropan-2-yl)karbamoyl)-4-bromofenil)-2-naftamid (RK758) (10):
RK758, açık beyaz katı olarak elde edildi (0,039 g, %75); m.p. 240.0–240.9 °C; 1H NMR (400 MHz, MeOD-d 4): δ 8.39 (s, 1H), 8.27 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 7.98–7.95 (m, 3H), 7.88 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.71-7.60 (m, 4H), 7.40 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.30-7.20 (m, 4H), 7.16 (s, 1H), 7.05-6.97 (m, 2H), 4.88-4.86 (m, 1H), 3.33-3.32 (m, 3H), 3.27-3.24 (erkek, 5H); 13C NMR (100 MHz, MeOD-d4): δ 174.3, 168.5, 166.4, 154.6, 137.1, 136.7, 135.1, 134.7, 131.4, 132.6, 131.3, 130.8, 129.8, 128.9, 127.97, 127.8, 127.9, 127.6, 127.5, 127.2, 126.8, 125.6, 123.5, 123.24, 123.2, 118.6, 117.8, 116.1, 111.1, 109.6; HRMS (ESI+): c40 H39BrN 8O3 [M + H]+: 759.2401 için hesaplandı, bulundu: 759.2407.

RK758 sentezi, Cbz-L-Triptofan ile 7 adımda %17 toplam verimle gerçekleştirilmiştir (Şekil 4). Bu sürecin genel verimi anahtar ara 7'ye %44 ve RK758'e %19 olmuştur. 1H NMR verileri, nihai bileşiğin yüksek saflıkta ve büyük tespit edilebilir bir safsızlık olmadığını gösteriyor.

Koloni PCR taraması, Mel4 ve His-KSI-Mel4 kasetlerinin seçilen dönüştürücülere başarılı bir şekilde yerleştirildiğini doğruladı (Şekil 5A). Miniprep izole plazmidlerin PCR analizi, beklenen amplikon boyutunu daha da doğruladı ve BL21(DE3)'e dönüşmeden önce doğru yapı montajını destekledi (Şekil 5B).

Yüksek Katyonik Antimikrobiyal Peptit Mel4'ün Rekombinant Üretimi ve Arıtılması
Mel4, ticari olarak AusPep Peptide Company'den minimum %90 saflıkla elde edilse de, SPPS ile sentezlendi ve Mel4'ün biyolojik olarak üretiminde rekombinant bir yaklaşım da kullanıldı. Protokolün sonunda, lizlenmiş hücre pelletinden alınan Total hücre proteininin (TCP) Western blot analizi, rekombinant HIS-KSI-Mel4 füzyon proteininin ekspresyonunu doğruladı. Protein örnekleri SDS-PAGE ile ayrıldı ve moleküler ağırlık referansı olarak protein merdiveni kullanılarak görselleştirildi. HIS-KSI-Mel4 füzyon proteininin beklenen moleküler ağırlığına karşılık gelen belirgin bir bant gözlemlendi ve bu da hedef proteinin konak hücrelerde başarılı bir şekilde ifade edilmesini doğruladı (Şekil 5B).

Seçilen motifin protein dizisinden, teorik amino asit bileşimi hesaplandı ve saflaştırılmış HIS-KSI-TEV-Mel4 IB peptidinden elde edilen deneysel amino asit analizi sonuçlarıyla karşılaştırıldı. Karşılaştırma, tahmin edilen ve deneysel olarak belirlenen amino asit oranları arasında iyi bir korelasyon göstererek, ekspres peptid dizisinin doğruluğunu ve dahil edici vücut fraksiyonunda başarılı izolasyonu doğruluğunu doğruladı (Tablo 2).

Asparagin aspartik aside, glutamin ise glutamik aside dönüştürülür. Amino asit analiz yöntemi sistein ve triptofana duyarsızdır ve bunlar bu yöntemle analiz edilmez. Bu dikkate alınmalı, sonuçların analizinde dikkate alınmalıdır.

Mel4 ve RK758'in antibakteriyel aktivitesi
RK758, Mel4 ve kolistinin minimum inhibitör konsantrasyonları (MICs), iki gram-negatif bakteriyel suş olan K. pneumoniae JIE 2709 ve E. coli NCTC 13846 karşılaştırıldığında değerlendirildi (Tablo 3). RK758, hem K. pneumoniae hem de E. coli'ye karşı 16 μg/mL (21 μM) MIC gösterdi. Karşılaştırma yapmak gerekirse, Mel4 MİK. pneumoniae için 62,5 μg/mL (26,6 μM) ve E. coli için 125 μg/mL (53,2 μM) olarak görüldü; bu da RK758'den daha düşük etkililiği gösteriyor. Kolistin, karşılaştırıcı antibiyotik olarak kullanıldı ve K. pneumoniae için en düşük MIC olan 1 μg/mL (0,87 μM) gösterdi; kolistine dirençli E. coli referans suşunda ise MIC değeri 8 μg/mL (6,9 μM) olarak gösterildi.

Mel4 ve RK758'in sitotoksisite etkisi
Mel4 ve RK758'in sitotoksik potansiyeli, 24 saat boyunca seri konsantrasyonlara maruz kaldıktan sonra MTT testi kullanılarak L929 fare fibroblast hücrelerinde (ATCC CCL-1) değerlendirildi. Her iki bileşik de GraphPad Prism'deki (sürüm 9.5.1) "inhibitör vs. normalize yanıt - değişken eğim" modeliyle doğrusal olmayan regresyonla analiz edilen tipik sigmoidal doz-yanıt eğrileri sergiledi ve bu da hücre canlılığının konsantrasyona bağlı inhibisyonunu doğruladı. RK758, CC50 değeri 172,6 μM olarak gösterirken, Mel4 biraz daha yüksek sitotoksik potensiye sahip 147,5 μM CC50 ile RK758'den yaklaşık 1,17 kat daha fazla sitotoksisite göstermiştir (Şekil 6 ve Şekil 7).

figure-results-1
Şekil 1: p15TV-L-His-KSI-Mel4 ifade kasetinin şematik bir gösterimi. P15TV-L ekspresyon yapısının şematik haritası; T7 promoteri, ribozom bağlanma bölgesi (RBS), 6×His arıtma etiketi, ketosteroid izomeraz (KSI) füzyon partneri, TEV proteaz bölünme bölgesi ve Mel4 peptid dizisi ile ardından T7 transkripsiyon terminatörünü göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Rekombinant protein ekspresyonu için SDS-PAGE ve western blot analizi. (A) Ham hücre lizatının filtrasyonu ve akışından sonra dahil edici cisimler ve toplam hücre proteinlerinin SDS-PAGE'i. (B) Batı lekesi, toplam hücre proteini. Yeşil ok, ilgilenilen proteinin beklenen moleküler ağırlıktaki konumunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: TEV bölünmesinden önce ve sonra rekombinant proteinin nicelendirilmesi. TEV proteaz tedavisinden sonra elde edilen izole inklüzyona sahip vücut fraksiyonu ve ayrılmış rekombinant Mel4 için BCA testiyle belirlenen protein konsantrasyonlarını gösteren bar grafik. Hata çubukları, ölçümler arasındaki deneysel değişimi temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: RK758'i elde etmek için genel sentetik yaklaşım. Cbz-L-triptofan ile başlayan RK758'in yedi aşamalı kimyasal sentezini özetleyen reaksiyon şeması; ara oluşum, fonksiyonel grup dönüşümleri ve peptit mimikini elde etmek için nihai deproteksiyon dahildir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Rekombinant plazmidlerin agaroz jel elektroforezi. (A) His-Mel4 ve His-KSI-Mel4 için dönüştürücü koloni PCR'si. (B) Miniprep sonrası plazmidlerin PCR doğrusu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6. RK758'in L929 fibroblast hücrelerine karşı sitotoksisitesi. RK758'in artan konsantrasyonlarda hücre yaşamlılığı üzerindeki etkisini gösteren doz-yanıt eğrisi. CC50 değerleri, GraphPad Prism'deki "inhibitör vs. normalize yanıt - değişken eğim" modeli kullanılarak doğrusal olmayan regresyon ile hesaplandı ve hücre canlılığının konsantrasyona bağlı inhibisyonunu doğruladı. Veri, üç bağımsız biyolojik replikasyonun ortalama ± SD'sini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Mel4'ün L929 hücrelerine karşı sitotoksisitesi. Mel4'ün hücre canlılığı üzerindeki yoğunlaşmaya bağlı etkisini gösteren doz-yanıt eğrisi. CC50 değerleri, GraphPad Prism'deki "inhibitör vs. normalize yanıt - değişken eğim" modeli kullanılarak doğrusal olmayan regresyon ile hesaplandı ve hücre canlılığının konsantrasyona bağlı inhibisyonunu doğruladı. Veri, üç bağımsız biyolojik replikasyonun ortalama ± SD'sini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Cbz-L-triptofan ile başlayan modifiye sentetik strateji. Cbz-L-triptofan kullanılarak anthranilamide ara maddelerinin hazırlanmasını ve yapısal çeşitliliği mümkün kılmak için sonraki işlevselleştirme adımlarını gösteren alternatif sentetik yol. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: Tiyureanın alkilasyonu ve ardından amin altıyla nükleofil ikame yapılması. Thiourea kükürtünün alkilasyonu ve ardından bir amin substratı ile nükleofil ikame ile guanidin içeren ürünler üretmeyi içeren önerilen reaksiyon yolu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bölümİsim/ÖzellikDizi
Temel BilgilerXbaI_KNRPR_Start5'-TAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATT-3'
T7_TERM_REV5'-CCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCA-3'
Gene kasetiHis-KSI-Mel4 amino asit dizisiMDHHHHHHMIDETQRKATVLEYFERVNAKDLDGVVKLF
ATDAVVADPVGAPPVAGEEALRAYFQRVLHEFDTHDVPGV
PSGAQDGQSVALPLKATINNPQDPTGGVRLDVNLVSVFTIG
EDGLISEMRAYWGLTDIAPAGASSGRENLYFQGKNKRKRRR
RRRGGRRRR
DNA dizisi5'-TAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA
GATATACCATGGATCACCACCACCATCACCACATGATTGACGAGAC
GCAACGTAAAGGGACGGTCTTAGAGTATTTTGAACGCGTGAATGCAA
AAGACTTGGATGGCGTGGTTAAACTCTTGGGACGGGCCGTTGT
AGCCGACCCTGTTGGTGCACCACCAGTGGCTGGTGAGGAGGCACTC
CGTGCCTACTTCCAGCGCGTCTTGCATGAATTTGACACCCATGATGTCC
CGGGCGTTCCATCTGGTGCTCAGGATGGCCAATCAGTCCACTCCCAC
TTAAAGCAACCATCAACAATCCTCAAGATCCAACAGGCGGGGTCCGCCGCCCC
TTGATGTGAACTTAGTGAGCGTATTCACGATTGGCGAAGACGGTTAAT
CTCCGAGATGCGTGGTGGTACTGGGGGTTGACTGATATTGCTCCGGCAGGT
GCAAGCAGTGGTCGCGAGAACTTGTACTTCCAAGGTAAGAACAAGCGTA
AGAGACGCCGGGCCGCCGGGGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGGAGACGTCGCTAATCGAAC
TCGAGATCCGGCT-3'

Tablo 1: PCR doğrulaması için kullanılan primer dizileri, son plazmid yapısının tam gen kaseti dizisi.

AminoasitHesaplanmışTest edildi
Histidin4.70%4.70%
Serine3.60%3.40%
Arginin10.70%9.20%
Glisin9.50%11%
Aspartik asit11.30%11.50%
Glutamik asit8.90%8.90%
Treonin4.70%4.60%
Alanine9.50%9.70%
Proline5.30%5.30%
Lisin4.10%4.50%
Tirozin2.40%2.20%
Metionin1.80%1.90%
İzoleusin3.00%3.20%
Lösin7.10%7.40%
Fenialanin3.60%3.60%
Valin9.50%8.90%
Triptofan0.60%-

Tablo 2: Amino asit bileşimlerinin analizi.

Bakteriyel suşlarMIC μg/mL (μM)
RK758Mel4Colistin
K. pneumoniae JIE 270916 (21)62.5 (26.6)1 (0.87)
E. coli NCTC 1384616 (21)125 (53.2)8 (6.9)

Tablo 3: RK758, Mel4 ve kolistin MIC ile Gram-negatif bakterilere karşı.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, katyonik AMP Mel4'ün (diğer AMP'lerle kullanılmak üzere değiştirilebilir) ve peptid takliti RK758'in üretimi ve işlevsel değerlendirmesi için kapsamlı bir çerçeve sağlar. Bu iş akışı, E. coli'de çok aşamalı kimyasal sentezi veya rekombinant ekspresyonu antimikrobiyal ve sitotoksisite testleriyle birleştirir. Bu yaklaşımların entegrasyonu, kimyasal olarak sentezlenen ve biyolojik olarak üretilen peptidler arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılmasını sağlayan sistematik AMP araştırmaları için çok yönlü bir platform sağlar. Bu protokoldeki birkaç adım, başarılı peptid üretimi ve aktivite değerlendirmesi için özellikle kritiktir.

RK758, anthranilamid iskelesine dayanan sentetik bir peptid taklitidir. Yeni AMP taklitlerinin keşfi için bileşik tarama aşamasında, bileşik kütüphanesini planlamak için in silico tarama kullanmak zordur. Bu nedenle, bu taklitleri, bileşik kütüphanesinde çeşitlilik sağlayan bir iskeleye dayandırmak önemlidir. Anthranilamide iskelesi bu nedenle seçilmiştir. Anthranilamid bazlı bir iskelenin ek faydası olarak, RK758 metaboliti olan 5-Bromoanthranilik asitin antimikrobiyal özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir.

RK758 ve analogların yapısını ve antibakteriyel aktivitesini optimize eden önceki çalışmalar, farklı sentetik prosedürler kullanmıştır. Orijinal yapı-optimizasyon çalışması, farklı katyonik grupların ve alternatif bileşenlerin antranlik fenil grubu üzerindeki etkisini araştırdı. Bu nedenle, sentez, Isatoik anhidrit türevlerinin L-triptofan metil esteri ile halka açılmasıyla başladı. Ürün daha sonra Kuppusamy ve ark.15'in gösterdiği gibi değiştirilebilir. Takip çalışması hidrofobik grubun yapısı ve konumunu inceledi. Takip çalışması, Bromo ikame edilen iskelenin naftil pozisyonunda çeşitli hidrofobik gruplara tolere ettiğini ve ara 4'ün bromo pozisyonunda Suzuki çapraz bağlanmasına uygun olduğunu gösterdi; bu durum Şekil 8'de gösterilmiştir.

Mevcut çalışmalar, önceki yaklaşımların bazı sorunlarını ele almıştır. Şekil 4'te gösterilen yaklaşımda, diyetil eter ile triturasyon yoluyla arındırmayı bildiren ara 11 sentezine rağmen, bu sonucu tekrarlama girişimleri kromatografik arıtma gerektiren sakız gibi saf karışımlar ortaya çıkmıştır. Ayrıca, ara 6 da bu yaklaşımla kromatografik arındırma gerektiriyordu. Genel olarak, orijinal çalışma, L-triptofan metil ester hidroklorürden altı adımda %21'de ara 7 verim elde etti. İkinciyaklaşım 15, daha düşük verimli olmasına rağmen (%14 Cbz-L-triptofan'dan), daha az adımda daha kolay ara ürünler üretti.

Bu çalışma, Cbz-L-Trp'nin N-Boc-etilenediamin ile bağlanmasının üründe DMF kalmamasını sağlamak için optimizasyon gerektirdiğini ortaya koydu; bu reaksiyonu ölçeklendirmek için yapılan ilk çalışmalarda gözlemlendi. DMF ile DCM arasında 3:8 (v/v) oranlı karışık çözücü sistemi kullanılması, DMF miktarını azaltarak çalışma sırasında daha kolay çıkarılmasını sağladı; Ancak, klorlu çözücülerin yerine getirilmesi, çevresel etki konusunda endişeler yaratabilir. Bu değişiklik, muhtemelen EDC'nin üre yan ürününün DCM karışımında çökelmesine ve reaksiyonun itici gücü olarak görev yapmasına bağlanan verimi %87'ye yükseltti. Hidrojenleşme ayrıca darboğaz olarak da tanımlandı; çünkü bu reaksiyonlar genellikle %90>90 verimli. Bu çalışma, THF'nin metanol yerine koyulmasının niceliksel olarak 3 verim sağladığını, önceki çalışmalarda ise %85'in oranına kıyasla gerçekleştiğini ve reaksiyon süresini 4 saate indirdiğini ortaya koydu. Bu aynı zamanda daha saf bir başlangıç materyalinin kullanılmasına da bağlanabilir; çünkü orijinal çalışma muhtemelen kalıntı DMF içeriyordu ve bu da paladyum katalizörünü zehirlemiş olabilir. Genel olarak, önceki yaklaşımlara kıyasla, orta seviye 7'ye verim, Cbz-L-Triptofan'dan 5 adımda %48'e yükselmiştir. Önceki deneylerde (yukarıda tartışılmış), toplam verim %21 olup, takip reaksiyonları için %14 iken, bu çalışmada bileşik 7 için %48 verim elde edilmiştir; bu da uygun şekilde ikame edilmiş isatoik anhidrit türevlerinden sentezlenebilen analogların çeşitliliğini göstermiştir.

Anthranilamide 4'teki yüksek deaktivasyonlu amin ( bkz. Şekil 8) verimli reaksiyon için üç asit klorür eşdeğeri gerektirir. Sadece stoikiyometrik miktarlar kullanıldığında, 4'ün 6'ya tam dönüşümü gerçekleşmez; bu da ara'lar 4 ve 6'nın benzer kromatografik ve çözünürlüğü özellikleri nedeniyle saflaştırmayı zorlaştırır. Yazarlar bunun iskelenin bir sınırlaması olduğunu kabul ediyor ve gereken fazla asit klorüri azaltmak için yeni bir metodoloji geliştirmeye çalışıyorlar.

Thiourea 8'i amin 7'ye bağlamak için son reaksiyon, son derece toksik ve çevre için son derece zararlı olan cıva (II) klorür gerektirir; bu da büyük ölçekli sentezde bu yöntemi engelleyebilir. Bu yaklaşım, cıva (II) aracılı thioureaların oda sıcaklığında gerçekleştiği için mevcut çalışmada kullanılmıştır. Tiyurea 8 kullanılarak kullanılan alternatif bir yöntem, kükürt atomunun alkillenmesini ve ardından Şekil 9'da gösterildiği gibi amin substratı ile nükleofil ikame işlemini içerir. Bu tür reaksiyon bildirilmiştir, ancak birçok durumda yüksek sıcaklıklar ve temel koşullar gerektirir; bu dasubstratlar 20,21 ile yan ürünlerin oluşmasına yol açabilir. Alternatif olarak, benzer bir metillenmiş tiourea substratı kullanılarak, fotokatalitik bir yaklaşım Saetan ve ark.20 tarafından bildirilmiştir. Bu reaksiyonun ortam sıcaklığında, beyaz bir LED'den gelen ışıkla ışınlama altında gerçekleştiğini bildiriyorlar. Bu reaksiyonun çeşitli birincil ve ikincil aminlerle gerçekleştiği ve %80'in üzerinde ürün verdiği bildirildi. Son reaksiyon için, dietil eter ile triturasyon ve ardından dondurularak kurutma ile genellikle daha fazla arıtma gerektirmeyen bir ürün elde eder (>MeOD-d 4'te %95 saf ve 1HNMR). Birincil safsızlık, kalıntı, yüksek kaynama noktasına sahip 1,2-etanedithiol'dür ve kendine özgü lahana benzeri kokusu sayesinde kolayca tespit edilir. Mel4'ün rekombinant ekspresyonu için optimal optik yoğunlukta (OD600 0.5–0.6) indüksiyon ve indüksiyon sıcaklığının dikkatli korunması gerekir; böylece kapsayıcı vücut oluşumu maksimize edilirken bakteriyelcanlılığı korunur 22.

Antimikrobiyal ve sitotoksisite testleri, doğru, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gerekli adımları da içerir. Hassas inokulum hazırlığı ve peptidlerin seri seyreltilmesi gereklidir, çünkü bakteriyel yoğunluk veya peptid çözünürlüğündeki küçük değişiklikler ölçülen MIC ve MBCdeğerlerini önemli ölçüde değiştirebilir16. MTT sitotoksisite testlerinde, doğru hücre sayımı, düzgün tohumlama ve tam formazan çözünürlüğü, güvenilir metabolik okumalar elde etmek için çokönemlidir 23.

Protokolde yapılan birkaç değişiklik yaygın zorlukları çözebilir. Sınırlı sulu çözünürlüğüne sahip peptitler, %0,01 asetik asit16'da çözünebilirken, peptitler veya mimikler de DMSO24'te çözünürebilir veya MIC belirleme sırasında plastik yüzeylere adsorbsiyonu önlemek için %0,1–0,2 BSA17 ile takviye edilebilir. Rekombinant inklüze cisimleri guanidinyum klorür veya üre konsantrasyonları ayarlanarak çözünürebilir ve tekrar katlanabilir, ardından adım adım diyaliz yapılır. MTT testlerinde, hafif sallama ve tam DMSO çözünürlüğü emilimli ölçümlerdeki değişkenliği azaltabilir.

Bu protokolün önemi, standart tek yöntemli yaklaşımlara kıyasla avantajlar sunan tamamlayıcı üretim ve değerlendirme stratejilerinin entegrasyonunda yatmaktadır. Birçok çalışma, peptid veya taklit üretimi için tek bir yönteme odaklanır, ancak tek bir yaklaşım tüm bileşikler için ideal değildir; Peptit özelliklerine göre uygun yöntemin seçilmesi, optimal verim ve işlevselliği sağlar. Örneğin, kimyasal sentez, doğal olmayan amino asitlerin ve peptid4 taklitlerinin hassas bir şekilde dahil edilmesini sağlar ki, bu da rekombinant sistemlerde zor olabilir. Buna karşılık, rekombinant ekspresyon, kimyasal sentezde toplanabilecek yüksek katyonikpeptitler 25'in maliyet etkin üretimini sağlar. Her iki yöntemi standartlaştırılmış fonksiyonel testlerle birleştirerek, protokol AMP aktivitesi ve sitotoksisitesinin titiz karakterizasyonunu sağlar ve yalnızca standart MICtestlerinin kapsamını aşar. 26.

Geleneksel bağımsız yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, bu protokol antimikrobiyal peptid araştırmaları ve terapötik geliştirme için geniş çapta uygulanabilir. Yapı-aktivite ilişkilerini incelemek, peptid potansiyelini optimize etmek ve toksisiteyi değerlendirmek için uyarlanabilir. Ayrıca, yöntemler peptid kütüphanelerinin yüksek verimli taramasını, bakteriyel direnç mekanizmalarının incelenmesini ve geleneksel antibiyotiklerle kombinasyon tedavilerinin değerlendirilmesini destekleyebilmektedir. Antibakteriyel uygulamaların ötesinde, bu iş akışı antiviral veya antifungal peptid testlerine, enfeksiyon kontrolü için yüzey kaplamalarına ve biyofilm bozulması veya immünomodülasyon gibi biyomedikal uygulamalara da uygulanabilir.

Sonuç olarak, bu protokol AMP'lerin ve peptid taklitlerinin üretimi, saflaştırılması ve fonksiyonel değerlendirmesi için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Kritik metodolojik hususları ele alarak, sorun giderme stratejileri sunarak ve çeşitli uygulamaları mümkün kılarak, antimikrobiyal ve biyomedikal araştırmalar için sağlam bir temel oluşturur.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, New South Wales Üniversitesi'ndeki Mark Wainwright Analitik Merkezi ve Rekombinant Ürün Tesisi (RPF)'yi teşekkür etmek isterler. Özellikle, HRMS analizi için Biyoanalitik Kütle Spektrometrisi Tesisi ve NMR cihazlarına erişim için NMR tesisi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-ethanedithiolOakwood M03555
100X AntibiyotikSigma AldrichA5955-20ML
1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid HidroklorürCombi BloklarıSS-7536Bundan sonra EDC olarak anılır
2-NaftaylklorürCombi BloklarıOR-0173
Asetik asit Ajax FinechemR18401O
AsetonitrilVWR 20060.35
Alkalin fosfatazNew England BiolabsM0525S
Sığır serum albümini (BSA)Sigma AldrichA1933
Katyonla ayarlanmış Mueller-Hinton Suyu (CAMHB)Becton, Dickinson ve Şirketi212322
cbz-L-TrpCombi BloklarıQB-6691
Colistin Sigma AldrichC4461
Dey-Engley (D/E) Nötralize Et SuyuOksoidR453042
Diatomlu toprak (Celite 545)Sigma Aldrich1026930,02-0,1 mm parçacık boyutu
Diklorometan (DCM)VWR 23366.327
Dietil eterKimya TedarikiEA036
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Chem-Supply Pty Ltd LCS-CHEM-0098
Ditiothreitol (DTT)Termo BilimselJ15397.03
DMEM kültür ortamıThermo Fisher Scientific UCS-BIO-0058
E. coli BL21(DE3) konakçısıSigma Aldrich70235-M
ElektroporatörTermo BilimselNEON1SK
Etil asetatKimya TedarikiEA011-2.5L-P
Etilen diamintetraasetik asit (EDTA)Termo Bilimsel118432500
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma Aldrich12003C-500ML
Onun-etiketli TEV Protease Sigma AldrichT4455
Hidroksibenzotriazol HidratChem-Implex24755
İmidazoleTermo Bilimsel288-32-4
İzopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG)Sigma AldrichI6758
Luria-Bertani Buloru (LB),  Termo Bilimsel12795027
Lysis Buffer Termo Bilimsel89822
Cıva (II) klorürSigma Aldrich215465
Metanol (HPLC Grage)VWRA452-4K
MTT reaktifiSigma AldrichM2128-100MG
N,N-Diisopropiletilamin (DIPEA)Sigma Aldrich3440
N,N-Dimetil formamid (DMF)Kimya TedarikiRP1051
NanoDropTermo BilimselND-ONE
N-Boc-etilen diaminCombi blokları-1613
NTA Affinity Reçine SütunuSigma Aldrich70666
Karbon üzerinde paladyumSigma Aldrich205699%10 PD ile
Plazmid Arıtma KitiQIAGEN27104
Polipropilen mikrotiter tüpleri SARSTEDT 72.690.008
Flaş kolon kromatografisi için silika jeliSilisikletR12030BSilika Jel 60, 230-400 mesh 
Silika jel İnce tabaka kromatografi plakasıMerk1055540001254 nm floresan göstergeli alüminyum zemin üzerinde 0,2 mm katman kalınlığı
Sodyum fosfat, 0.2M tampon solnTermo BilimselJ63816. AP
Steril, düz tabanlı 96 kuyuyla polipropilen mikrotiter plakası ve kapağıCorning3599
T4 DNA LigazıNew England BiolabsM0202S
Trietilamin (Et3N)Kimya TedarikiTR02151000
Trifluoroasetik asit (TFA)Sigma AldrichT6508
Tris-HCLTermo BilimselJ62848. AK
Triton X-100Termo BilimselA16046.AE
Trypan mavisiMP BIYOMEDIKAL AVUSTRALYA PTY LTD
Tripsin-EDTA (%0,25)Sigma AldrichT4049-500ML
Triptikaz soya agar Becton, Dickinson ve Şirketi211043
Urea Termo Bilimsel29700
Vektör (T7 promotör)-Tercih edilen yüksek kopya sayı plazmidleri

Kaynaklar

  1. Naghavi, M., et al. Global burden of bacterial antimicrobial resistance 1990–2021: a systematic analysis with forecasts to 2050. Lancet. 404 (10459), 1199-1226 (2024).
  2. Antimicrobial resistance. , World Health Organization. Available at: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance (2023).
  3. Puri, B., Vaishya, R., Vaish, A. Antimicrobial resistance: Current challenges and future directions. Med. J. Armed Forces India. 81 (3), 247-258 (2025).
  4. Zhang, T., Jin, Q., Ji, J. Antimicrobial peptides and their mimetics: promising candidates of next-generation therapeutic agents combating multidrug-resistant bacteria. Adv. Biol. 9 (4), 2400461(2025).
  5. Pasupuleti, M., Schmidtchen, A., Malmsten, M. Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system. Crit. Rev. Biotechnol. 32 (2), 143-171 (2012).
  6. Oliveira Júnior, N. G., et al. Antimicrobial peptides: structure, functions and translational applications. Nat. Rev. Microbiol. , (2025).
  7. Keshri, A. K., et al. LL-37, the master antimicrobial peptide, its multifaceted role from combating infections to cancer immunity. Int. J. Antimicrob. Agents. 65 (1), 107398(2025).
  8. Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect. Drug Resist. , 4385-4426 (2025).
  9. Kuppusamy, R., Willcox, M., Black, D. S., Kumar, N. Short cationic peptidomimetic antimicrobials. Antibiotics. 8 (2), (2019).
  10. Xu, J. Peptides chemistry, manufacturing, and controls. Peptide Science: Chemical Ligation, Lead Generation, and Therapeutic Advances. , 471-508 (2025).
  11. Wang, Q., et al. Expression and purification of antimicrobial peptide buforin IIb in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (11), 2121-2126 (2011).
  12. Cai, Z., et al. Peptide synthesis: a review of classical and emerging methods. Biofabrication. 18 (1), 012001(2026).
  13. Gentilucci, L., De Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide bonds, and cyclization. Curr. Pharm pseudo-peptide. Des. 16 (28), 3185-3203 (2010).
  14. Kuppusamy, R., et al. Tuning the anthranilamide peptidomimetic design to selectively target planktonic bacteria and biofilm. Antibiotics. 12 (3), 585(2023).
  15. Kuppusamy, R., et al. Guanidine functionalized anthranilamides as effective antibacterials with biofilm disruption activity. Org. Biomol. Chem. 16 (32), 5871-5888 (2018).
  16. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat. Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  17. Ji, S., et al. Adsorption and morphology analysis of bovine serum albumin on a micropillar-enhanced quartz crystal microbalance. J. Phys. Chem. B. 128 (41), 10247-10257 (2024).
  18. Yasir, M., Dutta, D., Willcox, M. D. Activity of antimicrobial peptides and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa biofilms. Molecules. 25 (17), (2020).
  19. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. terminology. Clin. Microbiol. Infect. 4 (5), 291-296 (1998).
  20. Saetan, T., Sukwattanasinitt, M., Wacharasindhu, S. A mild photocatalytic synthesis of guanidine from thiourea under visible light. Org. Lett. 22 (20), 7864-7869 (2020).
  21. Woodring, J. L., et al. Disrupting the conserved salt bridge in the trimerization of influenza A nucleoprotein. J. Med. Chem. 63 (1), 205-215 (2019).
  22. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
  23. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnol. Annu. Rev. 11, 127-152 (2005).
  24. Deni, W. H., Gao, T., Wu, J. Protocol for reconstituting peptides/peptidomimetics from DMSO to aqueous buffers for circular dichroism analyses. STAR Protoc. 5 (1), 102850(2024).
  25. Lou, M., et al. Microbial production systems and optimization strategies of antimicrobial peptides: a review. World J. Microbiol. Biotechnol. 41 (2), 66(2025).
  26. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nat. Biotechnol. 24 (12), 1551-1557 (2006).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Peptit MimikleriMinimum İnhibitör KonsantrasyonSitotoksisite AnaliziKatı Faz SenteziRekombinant EkspresyonPeptidomimetiklerBakteriyel PatojenlerHücre Canlılığıİlaç Keşfi
Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.