Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare ve sıçanlardan dorsal aorta ve mezenterik direnç arterler için tel miografi

588 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 Şubat 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Fare ve farelerden izole edilmiş direnç arterlerindeki damar reaktivitesini değerlendirmek için yan yana tel miyografisi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Tel miyografi, izole arterlerde damar fonksiyonunun nicel olarak değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılan bir ex vivo tekniktir. Büyük kanal ve küçük direnç arterler yapı ve fizyolojik roller açısından temel olarak farklılık gösterdiğinden, aynı fare veya sıçandan alınan arterler kullanılarak her iki damar sınıfının paralel analizi, hayvanlar arası değişkenliği azaltan ve damar-spesifik fonksiyonel değişiklikleri ortaya çıkaran eşleştirilmiş karşılaştırmalar mümkün kılar. Bu makale, izometrik tel miyografisi kullanarak izole fare kanalı ve direnç arterlerinde damar reaktivitesinin değerlendirilmesi için adım adım bir protokol sunmaktadır. Taze, oksijenli fizyolojik tampon hazırlanmasını tanımlıyoruz; arterel segmentlerin dikkatli diseksiyonu, temizlenmesi ve montajı; ve aktif kuvvet üretimi için gemileri optimal uzunluklarına yakın ayarlamak için normalizasyon. Standart vazokonstriktörler ve vazodilatatörlere kümülatif konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturmak için bir sorun giderme rehberi ve örnek deneysel bir dizis sunulmaktadır. Bu protokol, hem endotel hem de düz kas fonksiyonlarının nicel ölçümünü sağlar ve hipertansiyon gibi damar hastalıklarıyla ilişkili damar reaktivitesindeki damar spesifik değişikliklerin tespit edilmesini kolaylaştırır.

Giriş

Hipertansiyon, endotel disfonksiyonu ve vasküler düz kas hiperaktivitesi gibi vasküler reaktivite değişiklikleriyle karakterize edilir; vazokonstriktörlerekarşı 1. Bu fonksiyonel değişiklikler, mikrovasküler yeniden yapılanma ve seyrekleşme ile birlikte, doku perfüzyonun bozulmasına ve kan basıncınındüzensizliğine katkıda bulunur 2,3,4. İzole damarların ex vivo testleri, damar tonunu sağlık ve hastalıkta kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesinde güçlü araçlardır; çünkü damar mikroçevresinin hassas kontrolüne ve düzgün kas ile endotel sinyal yollarının seçici farmakolojik manipülasyonuna olanak tanır.

İzole arterlerde damar reaktivitesi genellikle iki tamamlayıcı ex vivo tekniği kullanılarak değerlendirilir: tel miyografi ve basınçlımiyografi 5,6. Tel miografide, damar halkası veya segmentleri pimlere veya tellere monte edilir ve izometrik kuvvet 7,8 olarak kaydedilir. Basınç miografisinde, sağlam damar segmentleri belirli bir intraluminal basınca kanülasyon ve basınçlandırılır, kap çapı ise videomikroskopi 9 ile takip edilir. Tel miyografinin aksine, basınç miyografisi transmural basınç ve intraluminal akışın kontrolüne olanak tanır. Bu nedenle, direnç arterlerinin in vivo hemodinamik ortamını daha yakından özetler ve miyojenik ton, akış aracılı yanıtlar ve damar yapısal veya mekanik özellikleriincelemek için yaygın olarak kullanılır 9,10. Buna karşılık, tel miyografi teknik olarak uygulanması daha kolaydır (kanülasyon veya video mikroskopisi yoktur), ticari çok odalı sistemlerle daha yüksek verimliliği destekler ve çapları onlarca ila birkaç yüz mikrometre civarında olan küçük-orta arterlerde tekrarlanabilir farmakolojik konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturmak için uygundur 5,6. Buna göre, tel miyografi, fare veya sıçanlardan izole edilen kanal ve direnç arterlerinde damar reaktivitesinin yan yana farmakolojik profillenmesi için tercih edilir.

Kanal (büyük elastik) ve direnç (küçük kaslı) arterler yapı ve işlev açısından temel farklılıklar gösterir ve bu farklılıklar farklı deneysel değerlendirmeler ve son noktalar gerektirir. Kanal arterleri (örneğin, iniş torasik aorta) çok miktarda elastik doku ve önemli düz kas kütlesi içerir; direnç arterler (örneğin, mezenterik arterler) nispeten daha yüksek düz kas-lümen oranlarına sahiptir ve periferik direncin ve yerel otoregulasyonun başlıcabelirleyicisidir 11,12. Aynı agonist, bu damar yataklarında farklı moleküler yanıtları aktive edebildiği için, aynı hayvandan alınan kanal ve direnç damarlarının yan yana karşılaştırılması faydalı tamamlayıcı bilgiler sağlar. Örneğin, kanal arterlerinde, endotelyumdan türetilen nitrik oksit salınımı, asetilkolinin (ACh) vazorelevşasyonu indükte eden baskın gevşeticiyoldur 13,14. Buna karşılık, küçük direnç arterlerinde ACh, nitrik oksit, prostatasiklin ve önemli olarak endotelyumdan kaynaklanan hiperpolarize faktörler (EDHF) yoluyla gevşeme indükler.15,16. Buna göre, aynı fare veya sıçandan alınan kanal ve direnç arterlerinin yan yana tel miyografisi, damar-spesifik fonksiyonel değişikliklerin tespitini kolaylaştıran ve hayvanlar arası değişkenliği azaltan çift karşılaştırmalar yapılmasını sağlar.

Tel miyografi verilerinin doğru yorumu, fizyolojik tuz çözeltinin (PSS) bileşimi ve oksijenlenmesi, doku işleme ve diseksiyon, montaj tekniği, optimal dinlenme pretensiýasy (normalizasyon), banyo sıcaklığı ve uygun farmakolojik kontrollerin seçimi gibi teknik değişkenlere dikkatli dikkatgerektirir 6. Normalizasyon, geminin mekanik çalışma noktasının aktif kuvvet gelişiminin optimize edilmesi ve fizyolojik çalışma koşullarına yaklaşması için ayarlanması teknikprosedürünü ifade eder 5. Pratikte, aort halkaları için, sabit bir iddia kullanımı yaygın bir uygulamadır; bu genellikle ampirik olarak belirlenir, aşırı şişmeyi önlemek ve kararlı yanıtlar vermek için. Küçük dirençli arterler için, normalleştirme önce 100 mmHg eşdeğer transmural basınca karşılık gelen iç çevre belirlenerek (IC100) yapılır. Daha sonra damar, normalleştirilmiş iç çevreyi (IC1) belirlemek için bu değerin belirli bir kesirine ayarlanır. Pratikte, birçok protokol IC1'i fare MRA için 0.9 × IC100 civarında, fare MRA için ise yaklaşık 1.0 × IC100 civarında ayarlar; ancak bu değerler damar tipi, tür ve deneysel hedefler 5,17 olarak ayarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Aşağıdaki protokol, belirlenen yönergelere uymakta olup, Toledo Üniversitesi Sağlık Bilimleri Kampüsü Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

DIKKAT: Başlamadan önce, lütfen her zaman Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) yönergelerine uyun; uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanmak; cerrahi veya diğer keskin aletler kullanılırken egzersiz özenliliği; kimyasallar ve biyolojik dokularla ilgilenirken ilgili Güvenlik Veri Formlarına (SDS) danışmak ve uyum sağlamak; karbogeni onaylı regülatörler ve güvenli depolama kullanarak basınçlı gaz silindiri olarak kullanmak; ve biyolojik ve kimyasal atıkları kurumsal prosedürlere göre bertaraf etmek.

1. PSS/modifiye Krebs bikarbonat (Krebs) tamponunun hazırlanması

NOT: Krebs tampon bileşimi (nihai konsantrasyonlar, pH 7.4): 130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.17 mM MgSO4, 1.18 mM KH2PO4, 1.6 mM CaCl2, 25 mMNaHCO 3, 5.5 mM glukoz ve 0.03 mM EDTA.

  1. Büyük hacimli stok hazırlayın: NaHCO3, glikoz ve CaCl2 hariç tüm bileşenleri çift damıtılmış suda çözerek stok oluşturun. Bu stoku 4 °C'de sakla.
  2. Deney gününde, gerekli stok hacmini (örneğin 1 L) aliquot edin, sırayla NaHCO3, glikoz ve CaCl2 eklenin ve karbogen (%95 O2/%5 CO2) ile sürekli oksijenlenin.
    NOT: Kalsiyum tuzu çökelmesini en aza indirmek için, 1 M CaCl2 stokunu 4 °C'de hazırlayıp saklayın ve gerekli hacmi ancak NaHCO3 tamamen çözündükten sonra tampona yavaşça ekleyin, sürekli karıştırın. Kalsiyum karbonat oluşumunu azaltmak için CaCl2 ekleme sırasında karbogen köpüklerini sürdürmek (bkz. adım 1.3). Görünür yağış oluşursa, atın ve taze tampon hazırlayın.
  3. pH dengesi için tamponu karbogen ile en az 20 dakika köpükle tutun, ardından pH ölçüp gerekirse pH 7.4'e ayarlayın.
    NOT: Tipik ön köpüklenme pH ≈ 7.7; Sürekli köpüklenme pH'ı fizyolojik ≈7.4'e düşürür.
  4. Miyograf odalarını taze hazırlanmış Krebs tamponu ile doldurarak hazırlayın ve nazikçe karbon köpüklerine başlayın. Gaz değişimini şiddetli bir şekilde karıştırmadan sağlamak için köpüklenme hızını ayarlayın.
  5. Taze hazırlanmış, oksijenli Krebs tamponu bir aliquot ayırın ve doku diseksiyonu için buzda soğutun. Kalan oksijenli tamponu deneyler sırasında kullanmak üzere 37 °C'ye (sürekli karbogen köpüklemesiyle) ısıtın.

2. İnen torasik aort ve mezenterik kemerin diseksiyonu

  1. Hayvanı IACUC yönergelerine göre ötenazi yapın. Hayvan ötenazi ve doku hasadı zamanlamalarını 2 saatlik bir süre içinde standartlaştırarak olası sirkadiyen etkileri en aza indirin.
  2. Hemen orta hat kesisiyle göğüs ve karın boşluklarını açın ve göğüs duvarını yansal olarak yansıtarak kalp ile büyük damarları açığa çıkarın.
    NOT: Standart koşullarda sistemik perfüzyon yapmayın, çünkü bu istemeden endotel hasarına yol açabilir. Ayrıca, mezenterik damarlarda tutulan kan, arterler ile venerler arasındaki görsel ayrımcılığı artırır ve arterial bütünlüğün değerlendirilmesini kolaylaştırır. Ancak, bazı patolojik modellerde (örneğin, trombotik bozukluklar), endotel hasarını en aza indirirken tıkanıklık trombüsünü temizlemek için hepparinlize, buz gibi soğuk fizyolojik tampon ile nazik, düşük basınçlı perfüzyon önerilebilir.
  3. İnen torasik aortayı çıkarın. Diseksiyon kolaylaştırmak için, görselleştirmeyi iyileştirmek için akciğerler ve yemek borusu çıkarılabilir. İnen torasik aortayı doğrudan kavramayın; Bunun yerine, aort arkını veya periadventisial yağı nazikçe tutun, hafifçe kaldırın ve interkostal dal damarlarını aortanın altından dikkatlice kesin. İnen torakik aorta, diyaframdan geçmeden hemen önce keserek kesin ve buz gibi oksijenli Krebs tamponu içeren Sylgard kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
    NOT: Spontan tonu en aza indirmek ve canlılığı korumak için soğuk sıcaklığı koruyun. Black Sylgard, damar diseksiyonu için kontrastı artırır.
  4. Tüm mezenterik oyun salonunu çıkarın. Mezenterik kemeri hafifçe kaldırarak abdominal aorttan diaframa dallanan üst mezenterik arteri bulun. Üst mezenterik arteri proksimal olarak kesin ve mezenterik arcade doğrudan damar manipülasyonu olmadan çevredeki bağ dokusundan kurtarın. Mezenterik kemer, buz gibi oksijenli Krebs tamponu içeren ayrı bir Sylgard kaplı Petri kabına yerleştirin.

3. Aort halkalarının pin miyograflara izolasyonu ve montajı

  1. İnen torasik aortanın proksimal ve distal uçlarını diseksiyon pinleriyle sabitleyerek damarı düzleştirin. Mekanik hasarı önlemek için aşırı gerinmekten kaçının.
    NOT: Hasarı en aza indirmek için iğneleri damar duvarından değil, periadventisyal yağın içine yerleştirin.
  2. Dış ışık kaynağıyla stereomikroskop altında, ince Vannas makası ve forsepsle periadventisyal yağ ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Gemi duvarına zarar vermekten kaçının.
    NOT: Amaç, perivasküler adventisyen dokuların vasküler tonusun düzenlenmesinde rolünü incelemek olmadıkça, periadventisyal yağın alınması yaygın bir uygulamadır.
  3. 2 mm aort halkalarını kesin, temiz, dik kesimler yapın. Delik veya gözle görülür şekilde hasar görmüş halkaları at. Mümkün olduğunda, değişkenliği en aza indirmek için hayvanlar arasında karşılaştırılabilir konumları örnekleyin.
  4. Oksijenli Krebs tamponunu içeren bir odayı miyografi makinesinden ayırın ve dikkatlice stereomikroskopa taşıyın.
    NOT: Kamerayı sarsmak dönüştürücüyü etkileyebilir ve sonuçları değiştirebilir, bu yüzden hazneyi dikkatlice tutun ve nazikçe yere koyun.
  5. Stereomikroskop altında, mikrometreyi kullanarak miyograf pinlerini birleştirin ve aort halkası pinlerin üzerine kaydırılarak luminal yüzeyin manipülasyonunu en aza indirin.
  6. Halka tamamen gevşekken mikrometre okumasına dikkat edin; dokunun taşınabilir hale getirilmesi için hafifçe esnedin.
  7. Odayı cihaza bağlayın ve kabı orijinal mikrometre okumasına geri döndürün.
  8. Tüm halkalar monte edildikten sonra, odaları 37 °C'ye ısıtın ve verilen probla sıcaklığı izleyin (genellikle 37 °C'ye ulaşmak için 20-30 dakika).
  9. Kullanıcı arayüzündeki kuvvet okumalarını sıfırlayın, veri toplama yazılımını başlatın ve kayda başlayın.
  10. Aort halkalarına mikrometre kullanılarak damara uygun sabit bir değere kademeli olarak pretension uygulanır.
    NOT: Fare aort halkaları için tipik bir pretension değeri 5 milliNewton (mN)5'tir. Fare aort halkaları için bildirilen pretension değerleri çalışmalar arasında değişiklik gösterse de, önceki optimizasyon bu protokolde 10 mN pretension desteğinivermektedir 18.
  11. Aort halkalarını seçilmiş pretensionda 45-60 dakika boyunca dengeleyin, 37 °C Krebs ile tekrar tekrar tampon değişimleri yapıldı.
    NOT: Aort halkalarının geriliminin kısmen kaybolması ve bu nedenle gerilimin stabilizasyonu sağlanmadan önce mikrometre kullanılarak birkaç kez pretensionun ince yeniden ayarlanması gerekir.
  12. Deneysel protokollere başlamadan önce kullanıcı arayüzündeki kuvvet okumalarını sıfırlayın.

4. MRA'nın tel miyograflara izolasyonu ve montajı

  1. Mezenterik dalları düzleştirmek için mezenterik kemeri saat yönünde bir desenle sabitleyin. Önce sekumu sabitleyerek başlayın, ardından ince bağırsakları saat yönünde ardışık olarak sabitleyerek mezenterik damarları aşırı gerilmeden nazikçe gerin. Kan veya kalıntıları temizlemek için tamponu gerektiğinde taze Kreblerle değiştirin.
  2. Çanakın ortasında, arkadların yayıldığı üst mezenterik arteri belirleyin.
  3. İzolasyon için uygun bir MRA seçin; Tipik hedefler: iç çapı 200-250 μm (normalizasyon sırasında daha sonra belirlenir).
    NOT: Yetişkin deneysel hayvanlarda, bu genellikle farelerde 2. dereceden dal, sıçanlarda ise3. dereceden 4. dereceye kadar dallara karşılık gelir. Dal düzeni, üst mezenterik arteriden ardışık ikiyetlenmelerle tanımlanır. 1. sınıf dallar doğrudan üst mezenterik arterden, 2. sıradan dallar ise 1. dereceden dallardan çıkar ve benzeri.
  4. Stereomikroskop altında, eşlik eden damarı diseksiyon edin ve Vannas makası ile ince penss kullanarak periadventisyal yağ ve bağ dokusunu çıkarın.
    NOT: MRA'lar, kalın duvarları ve daha küçük lümenleriyle damarlardan ayırt edilebilir; bunlar kalıntı intraluminal kan varlığıyla kolayca görülebilir.
  5. Damar geri tepmesini önlemek için atardayı kesmeden önce, seçilen damarın yanındaki bağırsak duvarını geren yakındaki bağırsak pin(lerini) gevşettirin.
  6. Seçilen MRA (>2 mm uzunluğunda olmalı) tamamen kesin, temiz, dik kesimler yapın. İnce forseps kullanarak, arterin bir ucunu tutup buz gibi soğuk Krebs tamponu içeren temiz bir Petri kabına aktarın (normal, Sylgard kaplamasız kaplar sonraki montajı kolaylaştırır). Arteri hasar açısından inceleyin; İntraluminal kanın varlığı, bütünlüğün görsel olarak değerlendirilmesini kolaylaştırır.
  7. Zarar görmemiş bir bölgeden yaklaşık 2 mm segmenti çıkarın. Taşınma sırasında ele alınan veya görünür hasar gören alanlar atılsın.
    NOT: Şeffaf, Sylgard kaplamasız kaplar kullanmak, kabın altına bir cetvel yerleştirilerek kap uzunluğunu doğru ölçülmesini sağlar.
  8. Montaj için 2,5 cm uzunluğunda iki adet 40 μm paslanmaz çelik tel hazırlayın.
  9. İnce forseps kullanarak, telleri lümenden dikkatlice geçirin, böylece her iki uçtan monte için yeterli tel çıkmasını sağlayın. Endotel travmasını en aza indirin. Her iki tel taktıktan sonra, normalizasyon prosedüründe kullanılmak üzere tam uzunluğu bir cetvel ile kaydedin (bkz. adım 5.2).
    NOT: Bu, protokolün en teknik olarak zor ve zaman alan adımlarından biridir ve endotel hasarını en aza indirmek için sabır ve tekrarlanan pratik gerektirir. İlk teli taktıktan sonra, her iki teli birbirine sıkıştırıp kaptan geçirmek genellikle daha kolaydır.
  10. Oksijenli Krebs tamponunu içeren bir odayı miyografi makinesinden ayırın ve dikkatlice stereomikroskopa taşıyın.
  11. Stereomikroskop altında, MRA (her iki uçta tutucu teller) miyograf odasına aktarılır. Mikrometre kullanarak, miyograf çenelerini birleştirerek tel uçlarını çeneler arasında sıkıştırarak arter serbestçe asılı kalmasını sağlar.
    NOT: Bu aşamada, tellerin üst üste oturacak şekilde sıkıştırılması tavsiye edilir. Bu, telleri yerinde sabitler ve bükülmelerini engeller.
  12. Üst teli montaj vidalarının altından, uçlarını saat yönünde sararak yakındaki mikrometre tarafında sabitleyin; Dönüştürücü tarafındaki ikinci kablo için tekrarlayın.
    NOT: Vidaları nazikçe ama sıkıca sıkın. Vidalar çok gevşekse, kap kayabilir; aşırı sıkılırsa, tel veya dönüştürücü zarar görebilir. İlk ucu sabitledikten sonra, miyograf çeneleri arasındaki boşluğu hafifçe açın ve karşı ucu sabitleyin, böylece tel gerginliği eşit olsun.
  13. Çeneleri hafifçe ayırın ve telleri paralel ve düzlem olarak hizalayın, neredeyse birbirine değinecek şekilde hizalasın.
    NOT: Tüm tel ayarlamalarını monte edilen kaptan uzakta yapın, böylece hasarı en aza indirin.
  14. Tüm MRA'lar için tekrar montaj.
  15. Odaları 37 °C'ye ısıtın ve sıcaklığı izleyin (tipik olarak 20-30 dakika).
  16. Normalizasyon prosedürünü başlatmadan önce kullanıcı arayüzündeki kuvvet okumalarını sıfırlayın.

5. MRA için normalizasyon prosedürü

NOT: Aort halkaları sabit, önceden belirlenmiş bir pretension ile monte edilir. Bu nedenle, ayrı bir normalizasyon adımı yapılmaz.

  1. Veri toplama yazılımında normalizasyon parametrelerini ayarlayın: okulluk kalibrasyonu = 1; hedef basınç = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); normalize iç çevre (IC1) = fare MRA'ları için 0,9 ve fare MRA'ları için 1,0; ortalama zaman = 2 s; gecikme = 60 s.
  2. Normalizasyon modülüne gemiye özgü parametreleri aşağıdaki şekilde girin:
    1. Doku uç noktaları (mm) için: a1 = 0 ve a2 = MRA'nın ölçülen uzunluğu milimetre cinsinden (eksizyon sırasında kaydedilen tam uzunluk) ayarlayın.
    2. Tel çapı girin: 40 μm.
    3. Mikrometre ölçümü: kap monte edildiğinde ve tamamen gevşek halde kaydedilen temel mikrometre değerini girin.
  3. Normalizasyon işlemini 50 μm adımlarla monte edilmiş MRA esneterek başlatın. Her esneklikten sonra, normalizasyon modülüne yeni mikrometre okumasını girin ve aralıklar arasında 60 saniye bekleyin.
    NOT: Mikrometre ayarından sonra gerilimde ani düşüşler genellikle damar kaymasını gösterir. Montaj vidaları nazikçe ama sıkı sıkılmalıdır.
  4. Normalizasyon modülünün dinlenme duvarı gerilimini (mN/mm) iç çevreye (μm) karşı çizmesini bekleyin ve üstel bir eğri oluşturun. Mikrometreyi kullanarak, gerilim-çevre eğrisi 100 mmHg izobarla kesişene kadar adım adım germeye devam edin. Kavşağa yakınken, kabı aşırı germemek için basamak boyutunu 10-30 μm'ye düşürün.
  5. Eğri 100 mmHg izobarla kesiştiğinde, yazılım tarafından hesaplanan iç çevreyi not edin ve mikrometreyi modül tarafından hesaplanan karşılık gelen değere ayarlayın; böylece hazırlık hedef normalize iç çevrede (IC₁) durur.
    NOT: Kötü eğri uyumu genellikle yazılıma girilen yanlış parametreleri gösterir; örneğin doku uzunluğu, tel çapı veya mikrometre okumaları.
  6. Tüm monte edilmiş MRA'lar için normalleştirme prosedürünü tekrarlayın, ardından damarların 37 °C Krebs ile tekrar edilen tampon değişiklikleriyle 30-45 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
  7. Deneylere başlamadan hemen önce kullanıcı arayüzündeki kuvvet okumalarını sıfırlayın.
    NOT: Fare ve sıçanlar arasındaki temel parametre farkları Tablo 1'de özetlenmiştir.
ParametreFareFare
Aort Halkaları için Pretension Değeri5 mN10 mN
MRA için Hedef IC1 Oranı10.9
200-250 μm iç çaplı tipik MRA dal sırası2.3. - 4.

Tablo 1: Fare ve sıçanlar arasındaki temel parametre farkları.

6. Deneysel protokol (örnek dizi)

  1. Kullanılabilirlik kontrolü: Depolarize edici yüksek K⁺ meydan okuması (örneğin, 120 mM KCl) ile kasılma tepkisi ortaya çıkarın.
    NOT: Yüksek K⁺ tamponu (KPSS), osmolariteyi korumak için standart Krebs tamponundan NaCl ile KCl'nin ekvimolyar ikame edilmesiyle hazırlanır ve sürekli olarak %95 O2/%5 CO2 ile oksijenlenir. Soğuk şoku önlemek için, KPSS'yi kullanmadan önce 37 °C'ye ısıtın. KPSS tampon bileşimi (nihai konsantrasyonlar, pH 7.4): 120 mM KCl, 14.7 mM NaCl, 1.17 mM MgSO4, 1.18 mM KH2PO₄, 1.6 mM CaCl2, 25 mMNaHCO 3, 5.5 mM glukoz ve 0.03 mM EDTA.
  2. Stabil pasif bazal gerilim sağlanana kadar en az üç ardışık yıkama yaparak taze 37 °C oksijenli Krebs tamponu kullanın.
    NOT: Tüm yıkama adımları, banyo çözeltisi tamamen çıkarılarak yerine taze 37 °C oksijenli Krebs tamponu ile değiştirilerek gerçekleştirilir. Ticari miyograflarda genellikle miografi odalarını boşaltan yerleşik bir yıkama fonksiyonu bulunur.
  3. Fenilefrine (PE) birikimli bir konsantrasyon-yanıt eğrisi (CRC) oluşturularak artan konsantrasyonlar eklenin (örnek aralık 10⁻9 ile 10⁻4 M). Her konsantrasyonun bir sonraki konsantrasyonu eklemeden önce sabit bir maksimum plato elde edilene kadar sabit bir seviyeye ulaşmasına izin verin.
  4. Stabil pasif bazal gerilim sağlanana kadar en az üç ardışık yıkama yaparak taze 37 °C oksijenli Krebs tamponu kullanın.
  5. Endotel fonksiyonunu değerlendirin: Submaksimal PE konsantrasyonu ile prekripsiyon yapın, yanıtın stabilleşmesine izin verin ve ardından endotel bağımlı gevşemasyonu ACh ile değerlendirin (örnek aralığı 10⁻⁹ ile 10⁻⁵ M). Her konsantrasyonun sabit bir şekilde durmasına izin verin, ardından bir sonraki konsantrasyon eklendikten sonra stabil bir maksimum gevşeme sağlanana kadar. Önceden daralmış tona göre rekor yüzde gevşeme (Bkz. adım 7.4). %70 gevşeme < gösteren hazırlıklar hariçtir.
    NOT: Hipertansiyon gibi damar duvarı hastalıkları genellikle endotel disfonksiyonu ile ilişkilidir ve bu da genellikle endotel bağımlı vazorelevasyon yanıtınınACh 19'a karşı bozulmasına yol açar. Bu koşullarda, %70 gevşeme
  6. Stabil pasif bazal gerilim sağlanana kadar en az üç ardışık yıkama yaparak taze 37 °C oksijenli Krebs tamponu kullanın.
  7. Deneysel sorunun gerektirdiği gibi, yol spesifik inhibitörlü ve olmayan diğer vazoaktif ajanları test edin.
  8. Deneyin sonunda, monte edilen tüm kapları çıkarın, tüm odaları %8 asetik asitle temizleyin, ardından üç kez su yıkama yapın ve son olarak gaz tankını ve makineyi kapatın.
  9. Biyolojik ve kimyasal atıkları kurumsal prosedürlere göre bertaraf etmelidir.

7. Veri analizi ve raporlama

  1. Temel tanım ve kayıt. Herhangi bir vazokonstriktör meydan okumasının (örneğin, yüksek K⁺ meydan okuması, vazokonstriktör CRC veya vazodilatör CRC'den önceki prekonstriksiyon) başlamadan hemen önce başlangıç gerilimini kaydedin.
    NOT: Sonraki analizler için, önceki herhangi bir uyarımın yeterince yıkanmasından sonra, herhangi bir vazokonstriktör meydan okumasının hemen öncesinde kullanıcı arayüzündeki kuvvet okumalarını sıfırlamak pratikte daha kolaydır (yani gösterilen temel gerilim = 0).
  2. High-K⁺ meydan okuması. Aktif kuvveti şu şekilde hesaplayın: Aktif Kuvvet = KCl'den sonra Maksimum Ton - Temel gerilim (birim: mN). Aktif kuvveti, monte arterial segmentin birim uzunluğu (mN/mm) veya kesitsel alanına (mN/mm 2) normalleştirilerek ifade edilir. Kesitsel alanın ölçümü, duvar kalınlığını belirlemek için monte arter segmentlerinin histolojik analizini gerektirir.
    NOT: Aort halkaları genellikle sabit olmayan bir yanıt ürettiği için, tüm hazırlıklarda maksimum yüksek K⁺ yanıtını önceden belirlenmiş bir süre içinde (örneğin 10 dakika) ölçün, böylece değişkenliği en aza indirin. MRA'larda, maksimum yüksek K⁺ yanıtı genellikle uyarımadan birkaç saniye içinde elde edilir.
  3. Kasılma CRC'leri. Bir kasılma kümülatif CRC'deki her konsantrasyon (örneğin, PE) için, aktif kuvvet aşağıdaki şekilde hesaplanın. Her yoğunlaşmadaki aktif kuvveti, yüksek K⁺ meydan okumasının ortaya çıkardığı yanıtın yüzdesi olarak ifade edin. Bu %'deki değerleri kasılma CRC'lerinin uyarlanması için kullanın (Bkz. adım 7.5).
    Aktif Kuvvet = Uyuşturucu uygulamadan sonra Maksimum Ton - Temel gerilim (birim: mN)
    NOT: Bazı durumlar, hazırlıklar arasında maksimum yüksek K⁺ yanıtlarında değişkenliğe neden olabilir (örneğin, patolojiden kaynaklanan düz kas kütlesindeki değişiklikler veya farklılaşma durumu). Bu koşullarda, her yoğunlaşmada aktif kuvvet, monte arterial segmentin birim uzunluğu (mN/mm) veya kesitsel alanı (mN/mm 2) olarak normalleştirilmiştir.
  4. Gevşetici CRC'ler. Submaksimal prekonstriksiyondan (prekonstrüksiyon tonu) sonra gevşeme CRC'leri için, her konsantrasyonda yüzde gevşeme aşağıdaki gibi hesaplanın. Bu % değerlerini gevşetme CRC'lerine uydurmak için kullanın (Bkz. adım 7.5).
    Gevşeme = (Prekonstriksiyon tonu - İlaç sonrası ton) / (Prekonstriksiyon tonu - Başlangıç gerilimi) × 100.
  5. Curve fiting. Ya kasılma ya da gevşetici kümülatif CRC'ler için, x ekseninde logu [agonist konsantrasyonu] ile y eksenindeki normalize yanıt ile çizin. Haritalanan eğri, doğrusal olmayan regresyon kullanarak dört parametreli lojistik modelle eşleştirin. İstatistiksel karşılaştırmalar için Emax (maksimum etki) ve pEC50 (−logEC50) ekstraktı yapın; burada EC50 , Emax'ın %50'sini üreten agonist konsantrasyonudur.
  6. Veri sunumu: Normalize CRC'leri sunun. Eğrideki her veri noktası için, ortalama (SEM) veya standart sapma (SD) ± grup ortalaması kullanın. Temsilci orijinal izleri ekleyin ve Emax ile pEC50 değerlerini (ortalama SEM veya SD ±) özetleyen bir parametre tablosu sağlanın.
  7. İstatistiksel analiz:
    1. CRC'leri, iki yönlü tekrarlanan ölçüm analizi olan varyans analizi (ANOVA) ile uygun bir post-hoc testi (örneğin, Bonferroni) deneysel gruplar arasında karşılaştırın. Ancak, varsayımları (spherisite, normallik) kontrol edin ve veri eksik veya dengesiz olduğunda alternatif yaklaşımlar (örneğin, karışık etki modelleri) kullanın.
    2. İki deneysel grup arasında pEC50 ve Emax'ı eşleştirilmedik t-testi veya iki deneysel gruptan fazla karşılaştırılırsa tek yönlü ANOVA ile karşılaştırın. Alternatif olarak, varyans homojenliği ve normallik varsayımları ihlal edildiğinde parametrik olmayan testler kullanabilirsiniz. İstitiksel anlamlılığı p < 0.05'e ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Fare veya sıçanlardan izole edilen kanal ve direnç arterlerinde tel miyografisinin genel iş akışını gösteren bir şematik Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare torasik aort halkası ve 2. dereceden MRA izolasyonu ve montajının temsilci görüntüleri sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir. Sıçan aort halkası ve MRA kullanılarak pretension ve normalizasyon prosedürlerini gösteren yazılım ekra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tel miyografi, damar fonksiyonunu ex vivo sorgulamak için güçlü ve yüksek çözünürlüklü bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Dikkatli uygulandığında, bu yöntem aynı hayvan içindeki makro ve mikrovasküler yatakların titiz karşılaştırılmasına olanak tanırken, farklı biyolojik soruları ele alan güvenilir nicel uç noktalar sağlar. Kanal arter çalışmaları, nabız basıncı ve aort sertliğiyle ilgili küresel arterial mekanik ve büyük damar reaktivitesindeki değişiklikleri ortaya koyarken...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Çalışma, NHLBI ödülü (R00 HL153896 I.O.'ya kadar) ve Toledo Üniversitesi'nden başlangıç fonlarıyla desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL Konik Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific14-959-70C
50 mL Konik Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific14-959-49A
Asetik asitThermo Fisher ScientificA490-212
AsetilkolinMillipore SigmaA6625-100G
Analitik DengeMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Karbogen (%95 O2/%5 CO2)AirgasCD USP50
Diseksiyon Mikroskobu ZEISSZEISS Stemi 305
Diseksiyon petri kabıYaşayan Sistemler EnstrümantasyonuDD-90-S-BLK
Diseksiyon pinleriDanimarka Myo Teknolojisi400626
Diseksiyon araç setiDanimarka Myo Teknolojisi101017Kit, diseksiyon makası (1), çok amaçlı makas (1), Petri kabı (5), penss (3) ve diseksiyon pinlerinden oluşmaktadır.
Dumont #5 - İnce PensepsGüzel Bilim Araçları11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Dondurucu (-20 derece ve derece; C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Dondurucu Menteşeli KutularUSA Scientific2310-5848
Eldivenler (Büyük)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Eldivenler (Orta)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Eldivenler (Küçük)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlikozThermo Fisher ScientificD16-500
Dereceli SilindirThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrizmasıGraphPad YazılımıYokVeri analizi ve grafiksel sunum
Hidroklorik Asit ÇözeltisiThermo Fisher ScientificSA48-1
Buz KovasıThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
LabChart 8 YazılımıAD EnstrümanlarıYokVeri yakalama yazılımı
Laboratuvar BuzdolabıThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
LED Işık KaynağıThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Manyetik KarıştırıcıThermo Fisher ScientificFB30786159
Manyetik Karıştırma Çubukları (Büyük)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Manyetik Karıştırma Çubukları (Ortam)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Mikro Kaşık ve Spatula Örnekleme SetiThermo Fisher ScientificS43322
Mikrosantrifüj TüpleriUSA Scientific1615-5510
Mini MikrosantrifüjThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini tornavidaThermo Fisher ScientificNC1349489
Çok telli miyograf sistemiDanimarka Myo TeknolojisiDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
pH ÖlçerThermo Fisher Scientific01-912-351pH ölçer, LE420 sensörü, kurulum QuickGuide ve pH tampon başlangıç paketi içerir
Fenilefrin Millipore SigmaP6126-5G
Pipet KontrolörüThermo Fisher Scientific01-001-023
Raflarda Pipet Uçları (10 & mikro; L)USA Scientific1111-3810
Raflarda Pipet Uçları (1000 µ L)USA Scientific1111-2830
Raflarda Pipet Uçları (200 ve mikro; L)USA Scientific1111-1810
PYREX Yeniden Kullanılabilir Medya Depolama ŞişeleriThermo Fisher Scientific06-414-1D
Serolojik Pipetler (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Serolojik Pipetler (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Tek Kanallı Mikropipetli Çok PaketThermo Fisher Scientific13-684-2503x pipet (0.5-10 μ L, 10-100 μ L, 100-1000 μ L)
Paslanmaz çelik tel (40 μ m)Danimarka Myo Teknolojisi400447
ZamanlayıcıThermo Fisher Scientific02-261-840
Ultra Saf Su SistemiSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Vannas Bahar MakaslarıGüzel Bilim Araçları15000-00
Hacimsel ŞişeThermo Fisher Scientific13-756-400
Vortex MikserThermo Fisher Scientific10-320-807
Su banyosuThermo Fisher Scientific07-202-155
Tabakların TartılmasıThermo Fisher Scientific02-202-101

Kaynaklar

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vasküler ReaktiviteMezenterik Arterlerİzometrik MiyografiArteriyel DiseksiyonVasküler FonksiyonEndotelyal FonksiyonDüz Kas Fonksiyonu

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.