Yöntem makalesi

Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 Mart 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyoelektron tomografi (kriyo-ET), doğal hücresel ultrastrukturun 3B görselleştirilmesini sağlar, ancak kalın dokulara uygulanması güvenilir vitrifikasyon eksikliği ve düşük verimli lamella hazırlama nedeniyle sınırlıdır. Burada, yüksek basınçlı dondurma (HPF; ~2100 bar; diseksiyon-donma süresi ≤90 s) ile bakır folyo ile "waffle" montajı kullanılarak dokuyu önceden inceltmek, kriyo-FIB kaldırma ve aşırı eğilme dengesiyle 120–200 nm lamellere kontrollü inceltme entegre edilen uçtan uca bir iş akışı sunulmaktadır. İletken kaplama standartlaştırılmıştır (sputter-Pt 30 mA/15 s; GIS kapağı 0,5–1,0 μm) olarak perdelenmeyi en aza indirmek için kullanılır. Otomatik, doz-simetrik veri toplama (0°, ±3°, ±6°... ±60–66°'ye; basamak boyutu 2–3°; toplam doz 100–150 e⁻/ş2) PACEtomo bebeleriyle uygulanır; başlangıç eğim açısı frezeleme açısı ve örnek yönünden türetilir. AreTomo 3 ile işleme, hareket düzeltme, CTF tahmini, hizalama ve WBP yeniden yapılandırması için neredeyse gerçek zamanlı işlevler sağlar; IsoNet isteğe bağlı olarak eksik kama anizotropisini azaltabilir. Subtomogram ortalaması (RELION 4.0), FSC kesim sınırı 0.143'e dayalı çözünürlük raporlamasıyla sözde subtomogram stratejisini takip eder. Fare hipokampusunda gösterilen bu iş akışı rutin olarak iyi vitrifiye edilmiş örnekler ve uniform lameller üretir (hedef kalınlığı 150 ± 40 nm) ve yüksek verimlilikte tilt-seri toplama (genellikle 5–8 dakika/tilt serisi) sağlar. Bu protokol, karmaşık doku ortamlarından doğrudan yerinde yapısal biyolojiyi çalışmak için tekrarlanabilir bir yol sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), makromoleküler kompleksleri ve hücresel mimarileri yerli, hidratlıhallerinde görselleştirmek için kritik bir teknik olarak ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5. Eğimli projeksiyon görüntülerinden üç boyutlu hacimleri yeniden yapılandırarak, kriyo-ET hücresel bağlam ile atoma yakın çözünürlük arasındaki boşluğu kapatır ve yapısal biyolojiye in situ6 konusunda eşi benzeri görülmemiş içgörüler sunar. Hücresel örnekler7 için kriyo-elektron tomografi iş akışları (süspansiyonlarda ve yapışkan hücrelerde kriyo-FIB ile inceltilmiş hücreler dahil) artık iyi kurulmuş olsa da, kalın, mimari olarak sağlam dokulara doğrudan uzanması hâlâ oldukça zorlu 8,9,10. Bu özellikle, güvenilir vitrifikasyon ve elektron-şeffaf lamellerin (genellikle <200 nm) hazırlanması gibi yüksek su içeriğine sahip dokular için geçerlidir; burada güvenilir vitrifikasyon ve elektron-şeffaf lamellerin (genellikle 200 nm) kalıcı darboğazlar oluşturmaya devam ettiği yerlervardır 12.

Dokularda vitrifikasyon sağlamak, yüksek su içeriği ve sınırlı ısı transferi nedeniyle zordur. Dip dondurma ince örnekler için (≤20 μm)13 etkili olsa da, çoğu dokuda başarısız olur. Yüksek basınçlı dondurma (HPF), yüksek basınç uygulayarak buz çekirdeklenmesini bastırır ve teoride örneklerin ~200 μm'ye kadar vitrifikasyonunu mümkün kılar. Ancak, geleneksel HPF'nin verimliliği genellikle vitrifikasyon dokuları için optimal değildir. Sonuçları iyileştirmek için, son çabalarda kriyoprotektanlar14 eklemek ve15,16 (örneğin vibratom kullanılarak) önceden kesitleme yapmak gibi stratejiler uygulanarak numune kalınlığını dondurmadan önce mekanik olarak azaltılmıştır. Bu yaklaşımlar vitrifikasyon kalitesini artırabilse de, genellikle uzun süreli ex vivo kullanım ve doğal yapıları değiştirme riski taşıyan kimyasal katkı maddelerinin kullanılmasını gerektirir. Bu sınırlamaları gidermek için, bu çalışma Kelley ve ark.18 tarafından geliştirilen "waffle" taşıyıcı stratejisini kritik bir optimizasyon ekleyerek değiştirdi: beyin dokusu dondurmadan önce iki cilalı bakır taşıyıcı kullanılarak fiziksel olarak sıkıştırılır; bu da numuneyi önceden inceldirirken aynı anda filmli ızgara ile bakır folyo arasında sabitlenir. Bu tasarım, hızlı ve uniform vitrifikasyonu teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda mekanik stabiliteyi önemli ölçüde artırır; böylece sonraki işlemlerde ızgara kırılmasını ve örnek kaybını etkili bir şekilde önler; sağlam ve yüksek kaliteli donmuş doku örnekleri elde etmek için sağlam bir temel oluşturur.

Vitrifikasyondan sonra, inceltme hem verimlilik hem de kalite için önemli bir engel olarak kalır. Erken ve yaygın olarak benimsenen bir teknik olarak, kriyo-ultramikrotomi çok sayıda temel in situ yapısal çalışmayı mümkün kılar. Buna rağmen, yapısal bütünlüğü tehlikeye atan sıkıştırma ve kesmeartefaktları 19,20 sıklıkla ortaya koymaktadır. Buna karşılık, kriyo-odaklı iyon ışını (kriyo-FIB) frezeleme21 üstün hassasiyet ve minimum bozulmasunar 7,22. Başlangıçta, kriyo-FIB frezelemesi doğrudan ızgaralar üzerindeki vitrifiye örneklere uygulanarak lamel23 üretildi; ancak bu yerinde yaklaşım öncelikle inceörnekler 24,25 (örneğin, kültürlenmiş hücreler veya periferik doku bölgeleri) için etkilidir ve kalın, hacimli dokular içindeki daha derin yapılara erişemez. Bu derinlik sınırlamasını aşmak için, örneklerin iç kısmından ilgi çekici bölgelerin (ROI) alana özgü çıkarılmasını mümkün kılan kaldırmastratejileri 26 geliştirildi. Sonraki metodolojik ilerlemeler, seri kaldırma27 ve ızgara üzerine serili kesitleme (SOLIST)28 dahil olmak üzere, karmaşık dokularda 3D korelasyon hedeflemesinin daha da artırılmış verimliliği, lameller stabilitesi ve hassasiyetini artırdı. Son zamanlarda, Tang ve ark.29 tarafından alınan altı taraflı bağlantı yöntemi, kaldırma ve inceltme sırasında mekanik stabilizasyonu artıran ve Benjamin C. Creekmore ve ark.11 tarafından doğal doku bağlamını koruyarak derin yapıya erişim sağlayan yeni ızgara üzerine frezeleme yaklaşımları dahil olmak üzere alanda ilerlemeye devam etmiştir. Bu gelişmelere rağmen, protokoller farklı doku tipleri arasında verimlilik, tekrarlanabilirlik ve uyum sağlama açısından hâlâ farklılık göstermektedir. Bu optimizasyonları çeşitli kalın dokular için tutarlı bir iş hattı haline entegre eden standartlaştırılmış, kolayca tekrarlanabilir ve geniş çapta uygulanabilir bir iş akışının kurulmasında kritik bir boşluk devam etmektedir.

Bu boşluk, yerleşik metodolojilerden temel teknik detayların sentezlenip genelleştirilmiş, uçtan uca bir üretim hattı haline getirilmesiyle giderilir. Bu protokol, sağlam vitrifikasyon için geliştirilmiş HPF-waffle yöntemini kullanmakla kalmaz, aynı zamanda sistematik aşırı eğilme telafisi, standart iletken kaplama ve kalibre edilmiş frezeleme dizileri gibi kriyo-FIB kaldırma ve inceltme aşamalarını da içerir; bunlar birlikte lamella düzenliliğini artırır, artefaktları azaltır (örneğin perdeleme) ve veri verimliliğini artırır. Belirli hücre tiplerine veya model organizmalara özel protokollerin aksine, bu iş akışı özetinde genellenebilirlikle tasarlanmıştır ve gösterilen fare hipokampusunun ötesinde, nispeten yumuşak ve sıkıştırmaya yatkın olanlar da dahil olmak üzere çok yönlü ve karmaşık dokulara uyarlanabilir çok yönlü bir çerçeve sunar.

Buz hasarına ve yapısal karmaşıklığına duyarlılığı ile dikkat çeken fare hipokampusunun zorlu modelinde gösterilen bu entegre ve genelleştirilmiş iş akışı, yüksek kaliteli lameller (120–200 nm) güvenilir şekilde üretir ve verimli eğik seri edinimini destekler (5–8 dakika/seri). En iyi uygulamaların tutarlı, erişilebilir ve geniş çapta uygulanabilir bir protokole birleşmesi, çeşitli biyolojik ve biyomedikal bağlamlarda kalın doku araştırmalarında kriyo-ET'nin uygulanmasına yönelik teknik engeli azaltan tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan dokusunu içeren tüm işlemler SUSTech IACUC (Protokol SUSTech-JY202501019) ile uyguluyordu. Yöneticiler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Örnek destek hazırlığı

  1. HPF taşıyıcı hazırlığı (bkz. Şekil 1A)
    1. 6 mm bakır HPF taşıyıcılarından (tip B) bir çift alın. Taşıyıcılardan birinin düz bir yüzeye sahip olduğundan emin olun.
    2. Taşıyıcının düz yüzeyini ıslatın ve öğütmeye başlayın. İlk olarak, orijinal işleme izleri tamamen temizlenene kadar 8000 grit zımpara kağıdı kullanın. Sonra, 12000 grit zımpara kağıdına geçin ve önceki adımdaki çizikler büyük ölçüde giderilene kadar öğütmeye devam edin; böylece yüzey eşit ve pürüzsüz bir yüzey elde edilir. Şekil 2, taşlayıcı yüzeyin öğütme ve parlatma işlemi sırasında tipik görüntülerini göstermektedir.
    3. Zemin yüzeyini yumuşak bir metallografik bez ve W0.5 elmas macunu ile parlatın: önce macunu beze uygulayın, ardından yüzeyi dairesel hareketlerle 1–2 dakika boyunca parlatarak pürüzsüz ve oldukça cilalı bir yüzey elde edilene kadar. Taşıyıcıyı etanolle iyice durulayın, ardından tüm aşındırıcı kalıntıları çıkarmak için damıtılmış su kullanın.
    4. Cilalı taşıyıcıları kullanılmadan önce en az 4 saat (veya gece) boyunca 1-heksadekene batırın.
      NOT: Parlatılmış ve işlenmiş taşıyıcılar 1-heksadekende sualtı tutularak saklanabilir.
      DIKKAT: 1-Heksadeken solulursa yanıcı ve zararlıdır; Bir buhar davlumanında PPE ile çalışmak.
  2. TEM destek ızgara hazırlığı ( bkz. Şekil 1B)
    1. Sürekli Formvar/karbon destek filmi olan 100 mesh bakır ızgaralar kullanın.
    2. Sputter kaplama makinesi kullanarak ızgaraların her iki tarafını altınla kaplamak: akımı 50 mA'ya ayarlayın ve her iki tarafı 120 saniye boyunca kaplamak için yaklaşık 6 nm katman elde edin.
  3. Bakır folyo hazırlama ( bkz. Şekil 1C)
    1. 1 μm kalınlıkta yüksek saflıkta bakır folyo elde edin.
      NOT: Bakırın ısı iletkenliği saflığa göre değişir ve daha düşük saflık daha düşük ısı iletkenliğe yol açar. Bu nedenle, yüksek saflıkta bakır folyo (Cu ≥ %99,9) gereklidir.
    2. Bakır folyoyu dairesel bir delik deliği kullanarak 3 mm çapında disklere deliklendirin.

2. Yüksek basınçlı donma

  1. Temiz bir cam yüzeye %10 sakaroz çözeltisi içeren 10 μL damlasını yerleştirin.
  2. Yeni ötenazi edilmiş bir farenin hipokampusunu hızla disseksiye et. Yaklaşık 0,5–1 mm3 boyutlarında küçük doku parçalarını keskin bir jilet ile alın (bkz. Şekil 1D).
  3. Dokuyu HPF taşıyıcısının içindeki bakır destek TEM Grid'lerine (100 ağ) bir kürdan veya ince fırça ile aktarın. Dokuyu nazikçe yerine getirmek için 2-metilbütan (izopentan) kullanarak ızgara üzerindeki mekanik stresi en aza indirin.
    DIKKAT: 2-Metilbütan (izopentan) son derece yanıcıdır. Ateşleme kaynağı olmayan bir duman davlumbonunda kullanın.
  4. Doku ve ızgarayı 3 mm çapında bakır folyo diskle kaplayın. İkinci HPF taşıyıcısını (düz yüzü aşağı) üstüne koyarak kapalı "waffle" sandviçi oluşturarak montajı tamamlayın (bkz. Şekil 1E).
    NOT: Bakır folyo, waffle montajında kritik mekanik bir işlev görür. Dokuyu TEM ızgarası ile folyonun kendisi arasında sıkıştırır. Montaj sırasında, bu konfigürasyon hafif bir baskı uygular, daha ince, daha uniform bir doku dilimi oluşturmasına yardımcı olur; bu da vitrifikasyon için idealdir. Ayrıca, folyo işlem sırasında doku kaybını önler ve yüksek basınçlı dondurma sırasında basıncı dağıtmaya yardımcı olur; böylece ızgara kırılma riskini azaltır. Dondurmadan sonra, folyo ayrıca taşıyıcıların vitrifiye örnek ızgarasından daha kolay ayrılmasını sağlar. Ancak, bu hazırlık yöntemi mekanik sıkıştırma hasarına yol açabilir ve basınçla indüklenen artefaktlara duyarlı örnekler için uygun olmayabilir. Bu tür örnekler için, kompresyon olmadan uygun kalınlığa ulaşan alternatif kesme teknikleri, örneğin vibratom kesitleme veya örnek delme gibi düşünülmelidir.
  5. Üreticinin çalışma protokolüne uygun olarak hemen yüksek basınçlı dondurma işlemini başlatın. Hedef basıncı ~2100 bar olarak ayarlayın ve doku diseksiyonundan donmaya kadar toplam sürenin 90 saniyeyi geçmediğinden emin olun.
    NOT: Uzun süreli ex vivo süresiyle ilişkili yapısal değişiklikleri en aza indirmek için diseksiyondan dondurmaya kadar tüm işlem 90 saniye içinde tamamlanmalıdır. Beyin doku kalınlığı aralığı yaklaşık 20–40 μm civarındadır.

3. FIB frezeleme ve kaldırma

NOT: Aşağıdaki adımları kriyo-aşamalı çift ışınlı mikroskopla gerçekleştirin. Numune sıcaklığını tüm süreçte -170 °C'nin altında tutun.

  1. Alıcı ızgarasının hazırlanması
    1. Kaldırma işlemi için son alıcı ızgarası olarak hizmet edecek yeni bir 300 ağlık altın ızgara edinin.
    2. Oda sıcaklığında stereomikroskop altında, ızgarası uyumlu bir kriyo-FIB AutoGrid halkasına nazikçe kesin.
    3. Monte edilen AutoGrid'i, kullanımdan önce don birikmesini azaltmak için yaklaşık 40 °C sıcaklıkta tutulan kuru fırında doğrudan saklayın.
      NOT: Kırpma sırasında, ızgaranın düz ve ortada durduğundan emin olun, böylece bükülme veya hizalanma bozulması önlenir.
  2. Vitrifikasyon doku ızgarasının geri alınması ve montajı
    1. Montajı sürekli sıvı azot (LN₂) içine batırırken, doku ve bakır folyo içeren vitrifik TEM ızgarasını çevredeki "waffle" montaj bileşenlerinden dikkatlice ayırın.
      NOT: Bakır folyo ara parça genellikle ızgarayı taşıyıcılardan kolayca ayırmanızı sağlar.
    2. Önceden soğutmalı bir kriyo-yükleme iş istasyonunda, izole doku ızgarasını LN₂ koruması altında ikinci bir kriyo-FIB AutoGrid halkasına monte edin.
  3. Şebekeleri kriyo-transfer mekiğine birlikte yükleme
    1. Her iki AutoGrid'i kriyo-transfer mekiğinin belirlenmiş yuvalarına yükleyin.
    2. Her AutoGrid'i freze çentiği dışa bakacak ve dikey olacak şekilde yönlendirin.
    3. Yüklü mekiği LN₂ daldırma altında veya önceden soğutma altında tutun, ta ki FIB/SEM mikroskobuna aktarılana kadar.
  4. FIB/SEM'de lokalizasyon ve iletken kaplama
    1. Mikroskopa kriyo-transferden sonra, düşük SEM büyütme ile doku ızgarasına gidin.
    2. Tüm ızgara yüzeyine iletken ve koruyucu bir kaplama uygulayın.
      1. Şebekeye yüzeyi platin (Pt) ile 30 mA'da 15 saniye boyunca Sputter ile kaplamak.
      2. Gaz Enjeksiyon Sistemi (GIS) kullanılarak 0,5–1,0 μm kalınlığında organometalik bir Pt kapağı yatırın.
      3. Son sputter kaplamalı Pt tabakasını ızgara yüzeyine 30 mA'da 15 saniye boyunca uygulayın.
        NOT: GIS sınırı, perde eserlerini azaltmak için kritiktir.
  5. Doku blok izolasyonu ve kaldırma (bkz. Şekil 3)
    1. Saha seçimi ve yönlendirme
      1. SEM elektron ışını görüntüsünü kullanarak doku ızgarasında seçilen ilgi alanına (ROI) gidin.
      2. Numuneyi ön taraf frezeleme için yönlendirin. Tipik bir aşama pozisyonu 110° dönüş ve 7° eğime ayarlanır ve bu pozisyon, örnek yüzeyini iyon ışınına erişim için uygun bir açıda sunar.
        NOT: Flüoresan belirteçler yoksa, ön tarama stratejisi uygulanabilir. Bu strateji, hedef doku bölgesini tespit etmeyi ve kriyoprotektan veya diğer doku dışı bileşenler içeren alanları dışlamayı amaçlar. Yüzey buzundan arınmış bir bölge seçildikten sonra, standart ön taraf yönünde daha yüksek bir ışın akımı (örneğin, 30 kV'da 15 nA) kullanılarak küçük bir test hendeğini öğütün ve daha düşük bir kiriş akımı ile (örneğin, 30 kV'ta 1 nA) parlatın. Kesiti incelemek için elektron ışınına geçin: doku, elektron ışını altında mükemmel kontrast gösterir; bu özellik özellikle membran yapılarda ve ağır elementlerle zengin bölgelerde belirgindir; Buna karşılık, kriyoprotektan genellikle elektron ışını altında eşit kontrast gösterir. Bu, tam kaldırma işlemine geçmeden önce hızlı doğrulama sağlar.
    2. Bloğu izole etmek için hendek frezelemesi (Şekil 3A)
      1. 30 kV'da çalışan iyon ışını kullanarak hedef doku bloğunu çevreleyen dikdörtgen bir hendek tanımlayın.
      2. Hızlı malzeme çıkarımı için bloktan belirli bir mesafede, nispeten yüksek 15 nA akım kullanarak frezelemeye başlayın.
      3. Hendek duvarları bloka birkaç mikrometre yaklaştıkça, iyon ışını akımını 7 nA'ya düşürür. Akımın azaltılması, daha hassas kontrol sağlar ve ilgilenilen bölgedeki iyon ışını hasarını ve biyolojik materyalin ısınmasını en aza indirir.
      4. Blokun bir tarafını toplu malzemeye geçici olarak tutacak bir "sek" olarak bırakın.
    3. Kalın bloklar için isteğe bağlı alt kesim frezeleme (Şekil 3B)
      1. Tahmini kalınlığı 20 μm'den fazla olan doku blokları için, son kaldırmayı kolaylaştırmak için arka taraftan alt kesim frezeleme adımı yapılabilir.
      2. Sahneyi döndürün (örneğin -70°'ye) ve sahne eğimini (örneğin 23°'ye) ayarlayarak blokun altına ulaşabilirsiniz.
      3. Alt bağlantıyı FIB ile 30 kV ve 3 nA akımda frezleyin.
    4. Mikromanipülatör iğnesine bağlanma (Şekil 3C)
      1. Örneği iğneye bağlamak için ardışık kesit frezeleme desenleri yapın.
        NOT: Altın bloğu, 300 meshlik bir altın ızgaranın çubuğundan çıkarılabilir.
    5. Doku bloğunun kaldırılması (Şekil 3D)
      1. Bloğu toplu numuneye bağlayan kalan "sekme"yi FIB (30 kV, 1 nA) ile kesin.
      2. Mikromanipülatör iğnesini dikkatlice hareket ettirerek artık izole edilmiş doku bloğunu hendek ve çevresindeki orijinal ızgaradan tamamen temiz hale getirin. Sonra, iğneyi geri çekin ve bloğu alıcı ızgarasına taşıyın.
    6. Blok transferi, kaynak ve yeniden kaplama
      1. İğneyi önceden soğutulan, 300 meshli altın alıcı ızgarasına yönlendirin.
      2. Bloğu seçilmiş bir ızgara kareye indirin. Doku bloğunu ızgaradaki filmle temas ettirin, sonra bloğu dikey olarak kaldırarak teması kırın. İyon ışını (30 kV, 1 nA) kullanarak bloktan ~3–4 μm kalınlığında bir dilim ızgara filmine freze yapın (Şekil 3E).
        NOT: Eğer buz kalıntısı varsa, bağlantı noktasını dikdörtgen bir desenle (30 kV, 50 pA) önceden temizleyin. Blokun ızgara filmiyle temas ettiğinden emin olun, böylece elektrostatik yük kesimi rastgele yerinden değiştirebilir.
      3. Kesimi, birleşimin her iki tarafında temizleyici kesit desenleriyle (30 kV, 30 pA) frezeleme ile güvenli bir şekilde kaynak yapın (Şekil 3F).
      4. İletken/koruyucu kaplamayı Adım 3.4.2'de (Şekil 3G) tarif edildiği gibi yeniden uygulayın.
        NOT: Bu GIS kaplama adımında süre blok boyutuna bağlı olarak azaltılabilir.
    7. Lamella inceltme
      1. Aşamayı döndürün (örneğin, -70°'ye) ve başlangıç aşama eğimini (örneğin 15°) ayarlayın (Şekil 3H).
        NOT: Numune tutucusunda 45° ön eğim var.
      2. Doku bloğunun düzgün bir alanında son lamella pozisyonunu belirleyin.
        NOT: Seçilen alanın buz kirliliğinden arındığını doğrulayın.
      3. Tablo 1'de belirtilen iyon ışını akımlarını kullanarak sistematik frezeleme gerçekleştirin. Hedef düzleme yaklaştıkça daha yüksek akımlardan daha düşük akımlara ilerleme kaydedilir (Şekil 3I,J). Isteğe bağlı olarak, lamelin 1–2 μm içinde olduğunda, lamellerinbükülmesini veya kıvrılmasını önlemek için yaklaşık 1,5 μm mesafede bir gerilim giderici hendek frezelenebilir.
        NOT: Kalan malzeme hedef düzlemin ~1 μm içindeyse, her geçişte çıkarılan kalınlığı sınırlayın.

4. Cryo-ET veri toplama

  1. Başarılı lamella hazırlığından sonra, ızgarayı dikkatlice bir kriyo-tutucu, enerji filtresi ve tomografi yazılımı (örneğin SerialEM) ile donatılmış bir geçirim elektron mikroskobuna (TEM) yükleyin.
  2. Tüm ızgaranın atlas haritasını alın (örneğin, Şekil 4A; tipik büyütme 155×).
  3. Lamella konumuna gidin ve bir montaj haritası edinin (örneğin, Şekil 4B; tipik büyütme 3600× -100 μm defolt departmanı ile).
  4. Nominal kayıt büyütmesini ayarlayın ve piksel boyutunun amaçlanan çözünürlüğe uygun olup olmadığını doğrulayın; mevcut çalışmada ise 2.109 şpiksel boyutu kullanılmıştır. Spot boyutu, C2 açıklık çapı ve aydınlatma alanı gibi ilgili aydınlatma parametrelerini ayarlayarak doğrudan elektron dedektörü için optimize edilmiş doz oranı elde edin.
  5. Odak ve deneme aydınlatma koşullarını, Record parametresi için ayarlananlara uygun şekilde yapılandırın.
  6. Aşağıdaki adımları takip ederek PaceTomobetikleri 32 kullanılarak veri toplama işlemi yapılacaktır:
    1. Navigatördeki "puan ekle" fonksiyonunu kullanarak montaj haritasında hedefleri önceden seçin, böylece ilk özellik yeterli kontrast sergiler.
    2. PACEtomo_selectTargets.py script32 ile hedefleri seçin, gerekirse önizleme büyütmesinde öne çıkan alanı ayarlayın. İlgi çekici tipik bölgeler Şekil 4C'de gösterilmiştir.
    3. Doz-simetrik bir şemayı kullanarak eğik seri elde edin (örneğin, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... ±60°–66°) kadar, 2° veya 3° artışla. PACEtomo.py bebesinde alınım parametrelerini belirleyin: başlangıç eğim açısı, Adım 3.7.1'de belirtilen frezeleme açısı (yani 8°) ile belirlenir ve bu işaret kriyo-EM'deki örnek yükleme yönüne bağlıdır; minimum ve maksimum eğik açılar mutlak değerleri ifade eder; ve basamak boyutu eğim artışına karşılık gelir (örneğin, 3°).
      NOT: Bu başlangıç eğim açısı, lamelleri yatay ve elektron ışınına dik konumlandıracak şekilde tasarlanmıştır. Frezeleme açısı bilinmiyorsa, görüntüyü eğip lamelin en büyük görünür yüksekliğinde gösterilir; bu, yeterince doğru hizalama sağlar.
    4. Tüm eğimlere dağıtılmış 100–150 e⁻/Å2 toplam elektron dozunu korumak. Varsa, 10 eV genişliğinde bir enerji filtresi kullanın.
    5. Veri toplama başlatın. Her eğim açısında otomatik odaklama ve takip uygulanır. Tek tilt serisi için tipik edinim süresi 5–8 dakikadır.
      NOT: Sorun giderme rehberi Tablo 2'de verilmiştir.

5. Veri işleme

  1. AreTomo 333 kullanarak Eğim Serisi Hareket Düzeltme, CTF Tahmini, Hizalama ve 3D Tomogram Yeniden Yapılandırma görüntülerini üç temel adım gerçekleştirmek için süreç yapın: (1) ham görüntü karelerinin hareket düzeltmesi, (2) her eğim görüntüsü için kontrast transfer fonksiyonunun (CTF) tahmini ve (3) tam eğim serisinin hizası.
    1. Hizalama sonrası, ağırlıklı geri projeksiyon algoritması ile üç boyutlu (3D) tomogramları yeniden inşa edilir. Bu adım için gerekli girdiler şunlardı: ham görüntü çerçeveleri, mdoc meta veri dosyaları (tilt-seri edinim parametrelerini belgeleyen) ve örnekin önceden belirlenmiş dönüş ekseni.
  2. Eksik kama düzeltmesi
    1. Yeniden yapılandırmadan sonra, oluşturulan tomogramları eksik kama düzeltmesine IsoNet34 ile maruz bırakın.
  3. Parçacık toplama ve küratörlük
    1. EMAN 2.935'te şablon eşleştirme yöntemiyle parçacık seçme işlemi yapılabilir. Otomatik seçmeden sonra, yanlış pozitifler (yani hedef olmayan bölgeler veya yanlışlıkla seçilmiş bölgeler) seçilen parçacık veri setinin kalitesini sağlamak için manuel olarak dışlanıyordu.
  4. Subtomogram ortalaması
    1. Eğim serisini ve ilgili parçacık koordinatlarını RELION 4.0'a aktarın. RELION 4.0 dokümantasyonunda (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html) belirtilen standart iş akışına uygun olarak subtomogram ortalaması yapın; bu da tekrarlanabilirlik için belirlenmiş en iyi uygulamalara uyulmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün başarılı uygulanması, yüksek kaliteli, vitrifik doku lamellerinin üretilmesini ve ardından doğal hücresel ultrayapıyı ortaya çıkaran tomogramların yeniden yapılandırılmasını mümkün kılar. Fare hipokampal dokusu kullanılarak gösterilen aşağıdaki sonuçlar, başarılı bir deneyin temsilcisidir.

"Waffle" yöntemiyle yüksek basınçlı dondurma ile işlenen doku blokları uniform ve elektron şeffaf bir görünüm sergilemiştir (Şekil 4B,C

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan iş akışı, yerli, kalın dokuların yerinde kriyo-elektron tomografisi için genelleştirilmiş, optimize edilmiş ve tekrarlanabilir bir ürün hattı oluşturur. Birincil katkısı, tekil tekniklerin icadı değil, modifiye edilmiş waffle-HPF yöntemiyle sağlam vitrifikasyondan hassas kalibre edilmiş kriyo-FIB kaldırma ve inceltme protokolüne kadar tüm sürecin sistematik entegrasyonu, geliştirilmesi ve ayrıntılı standartlaştırılmasında yatmaktadır. Bu sentez, kriyo-ET'nin karma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik destekleri için Southern University of Science and Technology Cryo-EM Merkezi personeline teşekkür ediyor. Bu proje, Ulusal Bilim ve Teknoloji İnovasyonu (Beyin Bilimi ve Beyin Benzeri Zeka Teknolojisi – Ulusal Bilim ve Teknoloji Ana Projesi, Hibe No. 2022ZD0211905) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32200998 ve No. 32161133022) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-HeksadekenSigma-AldrichH2131Kimya & Reaktifler
2-MetilpentanSigma-AldrichM65807Kimya & Reaktifler
Klips-halkaThermo Fisher Scientific1131750; 1188953Tüketim Malzemeleri
Bakır folyoFengcheng Metal Malzemeleri1 µ m kalınlığındaTüketim Malzemeleri
Bakır destekli TEM Gridler (100 ağ)Pekin Zhongjingkeyi Teknoloji A.Ş., LtdBZ10021bTüketim Malzemeleri
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Ekipman 
Kriyo-FIBThermo Fisher ScientificAquilos 2Ekipman 
Cryo-FIB AutogridThermo Fisher Scientific1205101Tüketim Malzemeleri
Gridler (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 ağ)QuantifoilAltrAufoilTüketim Malzemeleri
Yüksek Basınçlı DondurucuLeica MicrosystemsEM ICEEkipman 
HPF taşıyıcı, bakırLeica Microsystemstip B (6 mm)Tüketim Malzemeleri
İyon Sputter KaplamaYeter SayıQ150RS plusEkipman 
Metallografik Parlatma MacunuLab-testecW0.5Tüketim Malzemeleri
Parlatma kumaşıGORALB00809Tüketim Malzemeleri
Zımpara kağıdıEagle Markalı Zımpara Kağıdı8000 grit, 12000 gritTüketim Malzemeleri
StereomikroskopLeica MicrosystemsS9iEkipman 
SucroseSigma-Aldrich200-334-9Kimya & Reaktifler
Tilt-Serisi Satın Alma Yazılımıhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Yazılım
Tilt-Serisi Hizalama & Yeniden Yapılandırma Yazılımıhttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Yazılım
Tilt-Serisi Satın Alma Yazılımıhttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoYazılım
Tilt-Serisi Hizalama & Yeniden Yapılandırma Yazılımıhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetYazılım
Tilt-Serisi Hizalama & Yeniden Yapılandırma Yazılımıhttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Yazılım
Tilt-Serisi Hizalama & Yeniden Yapılandırma Yazılımıhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Yazılım

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, L. N., Villa, E. Bringing structure to cell biology with cryo-electron tomography. Annu Rev Biophys. 52 (1), 573-595 (2023).
  2. Baumeister, W. Cryo-electron tomography: A long journey to the inner space of cells. Cell. 185 (15), 2649-2652 (2022).
  3. Hong, Y., Song, Y., Zhang, Z., Li, S. Cryo-electron tomography: The resolution revolution and a surge of in situ virological discoveries. Annu Rev Biophys. 52 (1), 339-360 (2023).
  4. Nogales, E., Mahamid, J. Bridging structural and cell biology with cryo-electron microscopy. Nature. 628 (8006), 47-56 (2024).
  5. Schur, F. K. M. Toward high-resolution in situ structural biology with cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 58, 1-9 (2019).
  6. Briggs, J. A. G. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
  7. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  8. McCafferty, C. L., et al. Integrating cellular electron microscopy with multimodal data to explore biology across space and time. Cell. 187 (3), 563-584 (2024).
  9. Pöge, M., et al. Making plant tissue accessible for cryo-electron tomography. Elife. 106455, 1-41 (2025).
  10. Bäuerlein, F. J. B., et al. Cryo-electron tomography of large biological specimens vitrified by plunge freezing. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  11. Creekmore, B. C., Kixmoeller, K., Black, B. E., Lee, E. B., Chang, Y. -W. Ultrastructure of human brain tissue vitrified from autopsy revealed by cryo-ET with cryo-plasma fib milling. Nat Commun. 15 (1), 2660(2024).
  12. Chen, Z., Guo, Q. Innovations in cryo-electron tomography for tissues: Challenges and future prospects. Curr Opin Struct Biol. 93, 103112(2025).
  13. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (2009).
  14. Matsui, A., et al. Cryo-electron tomographic investigation of native hippocampal glutamatergic synapses. Elife. 13, RP98458(2024).
  15. Ning, J., et al. Uncovering synaptic and cellular nanoarchitecture of brain tissue via seamless in situ trimming and milling for cryo-electron tomography. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  16. Zhang, J., et al. Vhut-cryo-fib, a method to fabricate frozen hydrated lamellae from tissue specimens for in situ cryo-electron tomography. J Struct Biol. 213 (3), 107763(2021).
  17. Glynn, C., et al. A generalizable and targeted molecular biopsy approach for in situ cryogenic electron tomography of vitreous brain tissue. Cell Rep Methods. 5 (7), 101080(2025).
  18. Kelley, K., et al. Waffle method: A general and flexible approach for improving throughput in fib-milling. Nat Commun. 13 (1), 1857(2022).
  19. Pierson, J., Ziese, U., Sani, M., Peters, P. J. Exploring vitreous cryo-section-induced compression at the macromolecular level using electron cryo-tomography; 80s yeast ribosomes appear unaffected. J Struct Biol. 173 (2), 345-349 (2011).
  20. Alamoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 150 (1), 109-121 (2005).
  21. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  22. Mahamid, J., et al. A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms. J Struct Biol. 192 (2), 262-269 (2015).
  23. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nat Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  24. Engel, B. D., et al. Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography. Elife. 4, e04889(2015).
  25. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. J Struct Biol. 172 (2), 180-190 (2010).
  26. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo transmission electron microscopy. J Struct Biol. 180 (3), 572-576 (2012).
  27. Schiøtz, O. H., et al. Serial lift-out: Sampling the molecular anatomy of whole organisms. Nat Methods. 21 (9), 1684-1692 (2023).
  28. Nguyen, H. T. D., et al. Serialized on-grid lift-in sectioning for tomography (solist) enables a biopsy at the nanoscale. Nat Methods. 21 (9), 1693-1701 (2024).
  29. Tang, X., et al. Step-by-step procedure for an optimized serial lift-out cryo-focused ion beam milling technique in tissue analysis. Biophys Rep. 11, 1-13 (2025).
  30. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of fib-milled cryo-lamellae. J Struct Biol. 208 (3), 107389(2019).
  31. Berger, C., Watson, H., Naismith, J. H., Dumoux, M., Grange, M. Xenon plasma focused ion beam lamella fabrication on high-pressure frozen specimens for structural cell biology. Nat Commun. 16 (1), 2286(2025).
  32. Eisenstein, F., et al. Parallel cryo electron tomography on in situ lamellae. Nat Methods. 20 (1), 131-138 (2022).
  33. Peck, A., et al. Aretomolive: Automated reconstruction of comprehensively-corrected and denoised cryo-electron tomograms in real-time and at high throughput. Preprint. bioRxiv. , (2025).
  34. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).
  35. Chen, M., et al. A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging. Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).
  36. Yang, Q., et al. The reduction of fib damage on cryo-lamella by lowering energy of ion beam revealed by a quantitative analysis. Structure. 31 (10), 1275-1281.e4 (2023).
  37. Tacke, S., et al. A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling. J Struct Biol. 213 (3), 107743(2021).
  38. Boltje, D. B., et al. A cryogenic, coincident fluorescence, electron, and ion beam microscope. Elife. 11, e82891(2022).
  39. Yang, J., et al. Integrated fluorescence microscopy (IFLM) for cryo-fib-milling and in-situ cryo-ET. Preprint. bioRxiv. , (2023).
  40. Li, S., et al. Eli trifocal microscope: A precise system to prepare target cryo-lamellae for in situ cryo-ET study. Nat Methods. 20 (2), 276-283 (2023).
  41. Medeiros, J. M., et al. Robust workflow and instrumentation for cryo-focused ion beam milling of samples for electron cryotomography. Ultramicroscopy. 190, 1-11 (2018).
  42. Goetz, S. K., et al. A modular platform for automated cryo-fib workflows. Elife. 10, e70506(2021).
  43. Eisenstein, F., Fukuda, Y., Danev, R. Smart parallel automated cryo-electron tomography. Nat Methods. 21 (9), 1612-1615 (2024).
  44. Swulius, M. T., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

High Pressure FreezingTissue Lamella PreparationCryo FIB MillingPlatinum Sputter CoatingSubtomogram AveragingCorrelative MicroscopyNative Cellular UltrastructureSynaptic Structures

İlgili makaleler