Yöntem makalesi

E. coli ve memeli hücrelerinde genetik kod genişletmesiyle siteye özgü lizin laktilasyonu

DOI:

10.3791/70209

⸱

24 Şubat 2026

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Center for Chinese Medicine, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Escherichia coli ve memeli hücrelerinde insan enolaza-1'in (hENO1) belirli bölgelerinde laktil-lizin (Klac) ve süper klasör GFP'nin (sfGFP) belirli bölgelerinde genetik kod genişlemesini kullanan bir yöntem geliştirdi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laktilasyon, çeşitli biyolojik işlevlere sahip yeni keşfedilen post-translasyonel modifikasyon (PTM) olarak ortaya çıkmıştır. 2019'da makrofaj polarizasyonunun düzenleyicisi olarak ilk kez tanımlanmasından bu yana, histon laktilasyonu hücresel metabolizmayı fonksiyonel düzenlemeyle bağlayan kritik bir bağlantı olarak ortaya çıkmıştır. Biyokimyasal olarak, bir laktil grubunun lizin kalıntılarına kovalent transferini içerir; bu transferazlar ya actil-CoA'yı acil donör olarak kullanan laktil-tRNA sentezazları (AARS) aracılığıyla bir laktil-AMP ara maddesi aracılığıyla gerçekleşir. Bu mekanizmalar sayesinde, hücre içi laktat seviyeleri doğrudan protein modifikasyonu ve işleviyle ilişkilendirilir. Laktilasyon, gen düzenlemesi, DNA onarımı, metabolik yeniden programlama ve bağışıklık modülasyonu gibi fizyolojik işlevlerden, tümör ilerlemesi ve metastaz gibi patolojik süreçlere kadar birçok kritik hücresel süreci yönetir. Proteomik tarafından çok sayıda laktilasyon noktası tespit edilmesine rağmen, mutagenez yoluyla siteye özgü lizin laktilasyonu elde etmek hâlâ zordur. Bunu çözmek için, laktil-lizin-spesifik aminoasil-tRNA sentetaz (KlacRS) ve onun ilişkili tRNA'sını kullanarak belirlenen kalıntılara laktil-lizin (Klac) kesin olarak dahil etmek için genetik kod genişletme teknolojisi kullanıyoruz. Bu strateji, doğrudan fonksiyonel çalışmalar için homojen laktillenmiş protein varyantlarının üretilmesini sağlar. Burada, hem Escherichia coli (E. coli) hem de memeli hücrelerinde doğrulanmış site-spesifik protein laktilasyonu için sadeleştirilmiş bir protokolü tanımlıyoruz; model sistem olarak insan enolaz-1 (hENO1) ve süper klasör GFP (sfGFP) kullanılıyor.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lizin laktilasyonu (Klac), başlangıçta histonlarda tanımlanmış, anormal tümör metabolizması ile epigenetik düzenlemeyi birbirine bağlayan kilit bir düğümolarak ortaya çıkmıştır. Tümör hücrelerinde gelişmiş aerobik glikolizden kaynaklanan laktat birikimi, laktilasyon için metabolik bir temel sağlar ve laktatın sadece metabolik bir yan ürün olarak değil, protein fonksiyonunu doğrudan modüle eden bir sinyal molekülü olarak hareket etmesini sağlar. Artan kanıtlar, laktilasyonun kanser hücresiçoğalması 2,3,4,5,metastaz 6, metabolik yenidenprogramlama 7 ve terapötik direnç 8,9 koordinasyonuyla tümör başlatılması ve ilerlemesinde geniş bir şekilde rol aldığını göstermektedir.

Fenotipik düzeyde, yükselmiş laktilasyon tümör agresifliğinin artmasıyla yakından ilişkilidir. Örneğin, şeffaf hücreli böbrek hücreli karsinomda (ccRCC), H3K18 laktilasyonu, trombositten türetilen büyüme faktörü reseptörü β (PDGFRβ) üzerinde regülasyon sağlayarak laktat birikimi ile onkojenik sinyal arasında pozitif bir geri besleme döngüsü oluşturarak proliferasyon ve metastazı teşvik eder. Benzer şekilde, kolorektal kanserde (CRC) yüksek H3K18 laktilasyonu, Rubicon benzeri otofaji güçlendiricisinin (RUBCNL) transkripsiyonunu artırarak tümör ilerlemesini hızlandırır; böylece otofagozom olgunlaşmasını destekler ve kanser hücresinin hayatta kalmasınıdestekler 11.

Doğrudan tümör agresifliği üzerindeki etkilerin ötesinde, laktilasyon metabolizmaya bağlı genlerin ifadesini ve aktivitesini modüle ederek tümör metabolik yeniden programlanmasını dakolaylaştırır 7. Küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde (NSCLC), histon laktilasyonu glikolize ile ilgili enzimleri aşağı regule ederken trikarboksilik asit (TCA) döngüsü enzimlerini yükseltir; bu da tümör hücre glikoz alımını artırır ve metabolik düzensizliği daha dakötüleştirir. Tutarlı olarak, küresel laktilom profilleme, laktilasyonun merkezi metabolik yollarda yer alan enzimleri tercihen hedeflediğini ortaya koymaktadır; bunlar arasında glikoz metabolizması, TCA döngüsü, amino asit/yağ asidi metabolizması da yer alır ve bu değişiklikler agresif tümörfenotipleri 7 ile güçlü şekilde korelasyondur.

Önemli olarak, laktilasyonun biyolojik sonuçları büyük ölçüde bölgeye bağlıdır ve bu değişiklik, tümör terapötik direncinin önemli belirleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. CRC'de, meiotik rekombinasyon 11'in (MRE11) K673 laktilasyonu, homolog rekombinasyon (HR) onarımını artırır ve böylece kemoterapiye ve poli(ADP-riboz) polimeraz (PARP) inhibitörlerine dirençsağlar 13. Glioblastoma (GBM) içinde, aldehit dehidrojenaz 1 aile üyesi A3 (ALDH1A3) ile piruvat kinaz M2 (PKM2) arasındaki etkileşim, laktat üretimini artırır ve ardından X-ışını onarım çapraz tamamlayıcı protein 1 (XRCC1) ile K247 laktilasyonunu tetikleyerek DNA hasarının onarımını artırır ve böylece radyorezistans ve temozolomid (TMZ) kemorezistansınıartırır 14. Bu çalışmalar, tanımlanmış lizin kalıntılarında laktilasyonun hassas kontrolünün mekanik diseksiyon ve terapötik hedefleme için hayati olduğunu vurgular.

Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisindeki ilerlemeler, metabolik enzimler, transkripsiyon faktörleri ve sinyal dönüştürücüler arasında yaygın laktilasyonu ortaya koymuş ve metabolizma, sinyal iletimi ve hücresel fizyolojide geniş rol oynamıştır 15,16,17,18. Bugüne kadar, laktilasyonu katalize eden birkaç yazı enzimi rapor edilmiştir - örneğin, AARS1, tümörgenez19'u teşvik etmek için p53 laktilasyonuna aracılık eder ve AARS1/2 doğuştan gelen bağışıklığı bastırmak için cGAS laktilasyonunu düzenlerdir - ancak bu enzimler substrat seçicidir ve şu anda rastgele proteinlerde tam site-spesifik laktilasyongerçekleştiremiyor 20. Bu nedenle, alan Klac'ı araştırma veya terapötik amaçlarla yönlendirilmiş şekilde nasıl manipüle edileceği konusunda hâlâ zorluk çekmektedir.

Fonksiyonel çalışmalar hâlâ ağırlıklı olarak site yönlendirilmiş mutajeneziye dayanır—genellikle bir lizin (K) yerine glutamin (Q) kullanılır; bu da asetilasyon veya laktilasyon gibi yüksüz asil-lizin modifikasyonlarını takliteder 21,22,23,24. Ancak, bu yaklaşımın doğal laktilasyonu sadık şekilde tekrarlamada önemli sınırlamaları vardır: glutaminin kimyasal yapısı ve yan zincir geometrisi, laktillenmiş bir lizininkinden farklıdır ve önemli olarak, K'den Q'ya bir ikame, her iki modifikasyonun aynı bölgede gerçekleşebileceği durumlarda asetillenmiş ve laktillenmiş durumları ayırt edemez.

Genetik kod genişlemesi (GCE), kanonik olmayan amino asitlerin tanımlanmış bölgelerdeki proteinlere doğrudan dahil edilmesini mümkün kılarak bu sınırlamalara güçlü bir çözüm sunar. Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS) mutant kütüphanesinin pozitif taraması sayesinde, daha önce Klac'a bağımlı büyüme gösteren bir varyant tespit etmiştik. Bu mutant, L301M, Y306L, L309A ve C348F mutasyonlarını taşıyarak KlacRS125,26 olarak adlandırıldı. KlacRS1, Klac ile eşdeğer ortogonal tRNA'sını aminoasiller, kehribar stop kodonunu baskılar ve Klac'ın hedef proteinlere etkili, yere özgü entegrasyonunu sağlar. KlacRS1'in yanı sıra, MbPylRS türevli LacKRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) ve LacKRS3 (Y271M/C313S)19,27 ile MmPylRS türetilmiş LacKRS (C348T/Y384F)28 dahil olmak üzere Klac dahil olabilen birkaç başka aaRS varyantı da bildirilmiştir. Bu araçlar birlikte, bireysel laktilasyon olaylarının biyolojik sonuçlarını anlamak için siteye özgü laktillenmiş protein varyantları üretmek için çok yönlü bir genetik araç seti oluşturur.

Önceki çalışmalarımızda, bu GCE tabanlı sistemi hem E. coli hem de memeli hücrelerinde Lys147'de site-spesifik laktilasyon içeren ALDOA proteinlerini ifade etmek için uyguladık. Fonksiyonel analizler, Lys147'deki laktilasyonun glikoliz üzerinde olumsuz bir geri besleme etkisi yarattığını, ALDOA'nın termal ve kimyasal stabilitesini artırdığını ve sitoplazmadan çekirdeğe geçişini teşvik ettiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, ALDOA'nın daha önce tanınmamış bir düzenleyici mekanizmasını ortaya çıkarmakla kalmadı, aynı zamanda bu site-spesifik laktilasyon platformunun sağlamlığını, çok yönlülüğünü ve pratik faydasınıda doğruladı 25,26. Bu temel üzerine inşa ederek, burada insan enolaze-1 (hENO1) ve süper klasör GFP (sfGFP) örnekleri olarak, ortogonal KlacRS/tRNA sistemimizi kullanarak hassas Klac entegrasyonu için sade bir stratejiyi tanımlıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Amber stop kodon mutagenezi, Lactyllysine'in hedef gene kodlanması için

  1. Üretici protokolüne uygun olarak site yönlendirilmiş mutajenez ile hENO1 geninin 89. pozisyonuna ve sfGFP geninin 149. konumuna TAG amber stop kodonu getirilir, PCR ürünü arındırılır ve homolog rekombinasyon yapılır. Aşağıdaki primerleri kullanın:
    ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
    ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTTCTGTGACGTTCAGTTCTTG
    sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
    sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
    NOT: Laktillenmiş lizinin siteye özgü entegre edilmesi için, hedef bölge amber stop kodonu (TAG) veya başka anlamsız kodonlara mutasyon yapılmalı ve TAA veya TGA gerçek stop kodonu olarak kullanılmalıdır.
  2. DH5α yetkin hücreleri buz üzerinde eritin, 5 μL rekombinasyon ürününü 50 μL hücreyle karıştırın ve 30 dakika boyunca buzda kuluçka yapın. Karışımı 42 °C'de 45 saniyelik ısı şokuna tabi tutun, ardından 2-3 dakika buzun üzerinde koyun. 350 μL LB orta madde ekleyin ve 37 °C'de 220 rpm'de 1 saat boyunca çalkalayarak inkübe yapın.
  3. Hücreleri, ampisilin içeren önceden ısıtılmış bir LB plakasına yayın ve 37 °C'de 12-16 saat kuluçka yapın. Mutasyonu doğrulamak için Sanger dizilemesi için iki tek koloni seçin.

2. E. coli hücrelerinde laktillenmiş proteinin ekspresyonu

  1. E. coli DH10B hücrelerinin 50 μL'sini, hedef geni kodlayan pBad-ENO1-K89TAG ve KlacRS ile tRNA çiftini kodlayan pEvol-MmKlacRS1 (Addgene plazmidi # 232157) ile birlikte dönüştürür.
  2. Karışımı buz üzerinde 25 dakika kuluçkalayın, 42 °C'de 45 saniye ısı şoku yapın ve 3 dakika buzda tekrar kalın. 350 μL oda sıcaklığında LB ortamı ekleyin, 220 rpm'de 37 °C'de 1 saat boyunca şiddetle çalkalayın.
  3. Hücre kültürünü, 100 μg/mL Ampisilin (Amp100) ve 50 μg/mL Kloramfenikol (Cm50) ile takviye edilen bir LB/plaka üzerine yay. Plakaları 37 °C'de 12-16 saat kuluçka edin.
  4. 4 mL'lik bir başlangıç kültürünü aşılamak için tek bir koloni seçin ve gece boyunca kuluçka yapın. Ertesi gün, gece kültürünü 400 mL LB/Amp 100cm50'ye genişletin ve ardından 220 rpm, 37 °C'de OD 600 0.6-0.8'e kadar şiddetle çalkalayın.
  5. %0,2 L-arabinoz ve 1 mM Klac ile indükle; 30 °C'de, 220 rpm'de ek 16 saat kuluçka için.

3. HEK 293T hücrelerinde Laktillisinin genetik kodlanması

  1. 12 kuyruklu plakalarda tohum hücreleri, her kuyu başına 1 x 105 hücre yoğunluğunda, 1 mL DMEM ortamı ile yapılır. 24 saatlik kuluçkadan sonra, hücre birleşimi %70-80'e ulaştığında, transfeksiyon yapılın.
    NOT: Transfeksiyon için %70-80 birleşme önerilirken, koloni oluşum testleri daha düşük tohumlama yoğunlukları gerektirir ve bu yoğunluklar ampirik olarak belirlenmelidir.
  2. Sulandırılmış bir DNA çözeltisi hazırlamak için, 38 μL serumsuz DMEM'e yüksek glukozlu 0,75 μg pcDNA-sfGFP-N149TAG ve pNeu-KlacRS (Addgene plazmid # 232155) 1:1 oranında ekleyin. Karıştırmak için hafifçe yukarı aşağı veya girdabla kıpırda.
  3. Sulandırılmış transfeksiyon reaktifi hazırlamak için, 38 μL serumsuz DMEM'e 2,25 μL transfeksiyon reaktifi ve yüksek glukozlu 2,25 μL ekleyin. Karıştırmak için 3x-4x yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın.
    NOT: Opti-MEM'in kullanılıp kullanılamayacağı üreticinin talimatlarına bağlıdır, çünkü serum içeriği transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir.
  4. Sulandırılmış transfeksiyon reaktifini hemen seyreltilmiş DNA çözeltisine bir kerede ekleyin.
    NOT: Çözeltileri ters sırayla karıştırmayın.
  5. Hemen 3x-4x veya kısa bir girdap ile yukarı ve aşağı pipet yapın, karıştırmak için. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçka yapın, böylece transfeksiyon/DNA kompleksleri oluşabilir.
    NOT: Transfeksiyon/DNA kompleksi hazırlıktan sonra 20 dakika içinde kullanılmalıdır.
  6. 50 μL transfeksiyon/DNA karışımını her kuyunun üzerine damla damla ekleyin ve plakayı nazikçe döndürerek karışımı homojenleştirin.
  7. Transfeksiyondan 6 saat sonra, ortamı 1 mM Klac içeren taze DMEM ile değiştirin. 24-48 saat kültür.
    NOT: Önceki verilerimize dayanarak, 1-5 mM konsantrasyonlarda Klac hücreler26 üzerinde sitotoksik etki göstermedi. Klac'ın çalışma konsantrasyonu, protein ifade seviyesine göre optimize edilmelidir. Hedef protein laktilasyon modifikasyonunun kaybına yatkınsa, HDAC inhibitörlerinin (örneğin Trichostatin A) veya sirtuin inhibitörü NAM (nikotinamid) uygulaması önerilir.

4. E. coli hücrelerindeki laktillenmiş proteinin his-etiketiyle arıtılması

  1. Hücreleri 6.900 x g hassasiyetinde 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle hasat edin. 50 mL lizin tamponunda (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl) yeniden süzülür. Ultrasonla buz üzerinde 3 saniye darbe, 8 saniye aralıkla 200 W'ta 30 dakika boyunca liz yapıldı. 13.800 x g, 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın ve ardından süpernatantı toplayın.
    NOT: Hedef protein mekanik kesilmeye hassassa, ultrasonikasyon adımı, E. coli için uygun formüle edilmiş bir protein ekstraksiyon reaktifi kullanılarak nazik hücre lizisi ile değiştirilebilir.
  2. Çözünür fraksiyonları toplamak için üst yüzeyi 0,45 μm bir membrandan filtreleyin. Aydınlaştırılmış lizatları 1 mL Ni-NTA yerçekimi kolonuna yükleyin. Yaklaşık 5 mL Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl) ile yıkama
    5 mM imidazol) ile birlikte, eluatta tespit edilebilir bir protein bulunana kadar bu durum daha da belirir. Proteini 1 mL Buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 200 mM imidazol) ile 5 kat elüetle yapın. Tüm kesirleri kaydet. Hızlı bir Bradford testiyle elütasyon proteinini kontrol edin.
  3. Saflaştırılmış protein fraksiyonlarını birleştirin ve depolama tamponuna tampon değişimi yapın (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). Her tüpte konsantre proteinleri 50 μL'ye Aliquot yapın, ani dondurma yapın ve aşağıdaki analiz için -80 °C'de depolayın.

5. Laktillenmiş proteinin biyokimyasal karakterizasyonu

  1. SDS-PAGE ve Western Blotting
    1. Proteini SDS-PAGE ile ayırın (20 dakika 90 V, ardından 50 dakika 150 V). Jeli Coomassie Blue ile boyayıp mikrodalgada 15 saniye ısıtın ve bir shaker üzerinde (%40 mutlak etanol, %10 buzul asetik asit ve %50 deyonize su) temizleme çözeltisiyle detain yapın. Protein bantları net görünene kadar belirlenme adımını tekrarlayın.
    2. Metanolde PVDF membranını 1 dakika boyunca aktive edin. Transfer yığınını şu sırayla birleştirin: sünger, filtre kağıdı, jel, membran, filtre kağıdı, sünger. Transferi 250 mA'da 1 saat boyunca önceden soğutulan bir tamponda gerçekleştirin. Membranı %5 yağsız sütle 1,5 saat boyunca kapatın, ardından TBST ile 3 kez yıkayın (her biri 10 dakika).
    3. Birincil antikorlarla kuluçka (Anti-His 1:10.000; Anti-L-Laktil Lizin 1:1.000) gece boyunca 4 °C'de. TBST ile 3 kez yıkayın.
      NOT: Farklı ticari kaynaklardan alınan antikorlar için optimal seyreltme oranları ampirik olarak belirlenmelidir.
    4. Oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca tavşan ikincil antikoru (1:10.000) ile kuluçka yapın. TBST ile 3 kez yıkayın. Kemilyünesans kullanarak görüntü ve Görüntü Laboratuvarı'nda veri kaydet.
  2. Kütle spektrometrisi analizleri
    1. Sağlam kütle analizi için, proteinleri %0,1 formik asit (FA) içeren suyla nihai konsantrasyona 0,1 μg/μL kadar seyreltin ve ardından ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi (UPLC) sistemine tabi tutulur. Mobil faz, çözücü A (suda %0,1 FA) ve çözücü B (asetonitril, ACN) ile 0,3 mL/dakika akış hızında oluşuyordu.
    2. hENO1-89Klac'ın moleküler ağırlıklarını, m/z aralığı 300-2000 olarak ayarlanmış yüksek çözünürlüklü quadrupole-time-of-flight (Q-TOF) kütle spektrometresi kullanılarak ölçün. Tüm verileri MassLynx yazılımı kullanarak toplayın ve işleyin.
    3. Proteomik analiz için, daha önce tanımlandığı gibi, nano-akışlı sıvı kromatografi sistemi ve yüksek çözünürlüklü tribrid kütle spektrometresi ile analizör ile analiz edilir. Mobil faz, çözücü A (suda %0,1 FA) ve çözücü B (ACN/su, 8:2, v/v) ile 300 nL/dakika akış hızında oluşuyordu.
    4. Ters faz C18 kapiler kolonunda (75 μm x 250 mm) ayrı peptitler 90 dakikalık gradyanla yapılır: %3-%8 B (0-5 dakika), %8-%28 B (5-60 dakika), %28-%38 B (60-75 dakika), %38-100 B (75-80 dakika) ve %100 B (80-90 dakika). M/z 350-1800 üzerinde MS1 spektrumları elde edin, 120.000 çözünürlük ve 4e5 AGC hedefi. MS2 spektrumlarını daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) parçalanması ile (çarpışma enerjisi = %32) üretin; ilk kütle m/z 110, çözünürlük 30.000 ve AGC hedefi 5e4.
  3. Akış sitometrisi analizi
    1. Hücreleri önceden soğutmuş PBS tamponu ile 2 kez yıkayın, ardından her yıkamadan sonra 1.380 x g sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra elde edilen hücre pelletini 500 μL PBS tamponunda yeniden askıya alın ve nazikçe pipetleyin karışımı. Hücre süspansiyonunu 300 ağlık steril bir gazlı bezden filtreleyin, filtreyi tespit sırasında hücre agregalarından gelen paraziti en aza indirmek için akış sitometri tüpüne toplayın. Hazırlanan örneği, çift lazerli bir akış sitometresi kullanılarak, 405 nm'de uyarılma ve 488 nm'de tespit ederek ilgili floresan sinyallerini analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk olarak Klac'ın E. coli'deki proteinlere dahil edilme özgüllüğünü değerlendirdik. İnsan enolaz 1 geni (hENO1), kalıntı K89 (hENO1-89TAG) üzerinde amber stop kodonu içerecek şekilde tasarlandı ve bu yapı, ortogonal KlacRS ve E. coli'deki benzer tRNA çiftiyle birlikte eksprese edildi. 1 mM Klac takviyesi olmadığında, tam boy hENO1 tespit edilmedi; Buna karşılık, büyüme ortamına 1 mM Klac eklendiğinde, 89 pozisyonda Klac içeren tam boy hENO1 (hENO1-89Klac) ~1,2 mg/L verimiyle üretilmiştir (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hem prokaryotik hem de ökaryot hücrelerde proteinlere Klac'ın site-spesifik dahil edilmesi stratejisini açıklıyoruz. Hedef genin istenen konumuna amber stop kodonu eklenerek ve konak hücrelerde ortogonal KlacRS/tRNA çiftiyle birlikte eksprese edilerek, otantik laktil lizin canlı hücrelerdeki proteinlere hassas bir şekilde dahil edilebilir ve laktilasyona özgü biyolojiyi incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Bu iş akışının uygulanabilirliğini, örnek fon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (22377058), Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi tarafından Geleneksel Çin Tıbbında Sentetik Biyoloji için Disiplinlerarası Finansman ve Ulusal Yüksek Düzey Yetenek Özel Destek Programları (10.000 Yetenek Programı) - Genç Yetenekler tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6*onun, Onun etiketi Rekombinant monoklonal antikorProteintech84814-1-RR6× hedefleyen spesifik immünoglobulin sınıfı; Rekombinant proteinlerdeki etiketi (altı ardışık histidin kalıntısından oluşan kısa bir peptit, HHHHHH).
ACQUITY UPLC sistemiSularUltraPerformance Sıvı Kromatografi
Anti-L-Laktillisin Tavşan mAbPTM BiolabsPTM-1401RMProteinlerin translasyon sonrası modifikasyonu (PTM) olan L-Lactil Lizin (Klac) hedefleyen spesifik immünoglobulin sınıfı.
ClonExpress II Tek Adımlı Klonlama KitiVazyme C112Basit, hızlı ve verimli DNA kesintisiz klonlama teknolojisine dayanan insert parçaları, herhangi bir vektörün herhangi bir bölgesine yönlü olarak klonlanabilir.
CytoFlex akış sitometresiBeckmann CoulterYüksek hassasiyetli algılama ve çok renk analiz yeteneğine sahip akış sitometresi
DH10BBiorabbitEC005H-SPlazmid dönüşümü, gen klonlama ve mavi-beyaz tarama için yetkin bir hücre türü.
DH5αVazyme C502Plazmid dönüşümü, gen klonlama ve mavi-beyaz tarama için yetkin bir hücre türü.
EASY-nano LC 1200 sistemiThermo Fisher ScientificYüksek duyarlı, yüksek çözünürlüklü karmaşık örnekleri ayırmak için nano-sıvı kromatografi
Orbitrap Eclipse Tribrid kütle spektrometresiThermo Fisher Scientificamiral gemisi üst düzey tribrid sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) sistemi
Phanta Max Süper Doğrulu DNA PolimerazVazyme P505Hızlı amplifikasyon ve isabetliliği birleştiren yüksek isabetlilikte tek bir enzim
PolyJetSignaGenSL100688PolyJet DNA In Vitro Transfeksiyon Reaktifi, daha az sitotoksisiteyle etkili ve tekrarlanabilir transfeksiyon sağlayan güçlü bir transfeksiyon reaktifi olarak formüle edilmiştir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  2. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  3. Pan, L., et al. Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells. Pharmacol Res. 181, 106270(2022).
  4. Xu, H., et al. Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites. Phytomedicine. 118, 154940(2023).
  5. Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. Lactate/lactylation in ocular development and diseases. Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).
  6. Wang, G., et al. The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors. Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).
  7. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  8. Chen, L., et al. Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression. Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).
  9. Sun, X., et al. The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity. Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).
  10. Yang, J., et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).
  11. Li, W., et al. Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer. Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).
  12. Jiang, J., et al. Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 11, 647559(2021).
  13. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311 (2024).
  14. Li, G., et al. Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma. Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).
  15. Liberti, M. V., Locasale, J. W. The warburg effect: How does it benefit cancer cells. Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).
  16. Varner, E. L., et al. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol. 10 (9), 200187(2020).
  17. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).
  18. Chen, H., et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).
  19. Zong, Z., et al. Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis. Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).
  20. Ju, J., et al. The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer. J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).
  21. Sun, L., et al. Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).
  22. Mao, Y., et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).
  23. Lv, L., et al. Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization. Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).
  24. Okada, A. K., et al. Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes. Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).
  25. Wan, N., et al. Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome. Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).
  26. Shao, C., et al. Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions. Nat Commun. 16 (1), 227(2025).
  27. Sun, Y., et al. Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells. Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).
  28. Ren, C., et al. Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation. Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).
  29. Hu, Y., et al. Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor. Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).
  30. Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification. Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).
  31. Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges. Cancer Lett. 627, 217835(2025).
  32. Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids. Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).
  33. Italia, J. S., et al. Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells. Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Siteye zg LaktilasyonTranslasyon Sonras ModifikasyonEscherichia ColiAminoasil tRNA SentetazProtein ModifikasyonuFloresan MikroskobuAk Sitometrisi

İlgili makaleler