Yöntem makalesi

Baş ve Beyinden Lenfatik Taşınmayı Değerlendirmek İçin Boyun Lenf Kanalı Kanülasyonlu Fare Modeli

844 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70217

⸱

10 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 2MOE Joint International Research Laboratory of Target Discovery and New Drug Innovation, China Pharmaceutical University, 3Department of Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Bu makalede

Özet

Bu deneysel protokol, baş bölgeden lenfatik drenajın doğrudan ve nicel olarak değerlendirilmesini sağlayan derin servikal lenf kanalı kanülasyonlu bir fare modelini sunmaktadır. Model, merkezi sinir sistemi (CNS) kaynaklı çözgütlerin, bağışıklık hücre popülasyonlarının ve CNS hedefli tedavilerin dağılımı ve temizlenmesinin ayrıntılı analizini kolaylaştırır.

Özet

Lenf, merkezi sinir sisteminden (CNS) bir dizi lenfatik damar (LV) ve servikal lenf kanallarında birleşen lenf düğümleri aracılığıyla akar. Sıvı dengesini korumanın yanı sıra, bu lenfatik kanallar endogen metabolitler, sinyal molekülleri, bağışıklık hücreleri ve küçük ile makromoleküler ilaçlar dahil olmak üzere çok çeşitli maddelerin taşınmasında kilit rol oynar. Bu, hem intrakraniyal (örneğin beyin) hem de ekstrakraniyal bölgelerde (örneğin burun ve ağız boşlukları) fizyolojik homeostaz ve bağışıklık fonksiyonu için kritik öneme sahiptir. Beyinden gelen lenfatik drenajın bozulması, giderek çeşitli nörolojik ve nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilendirilmektedir. Servikal lenf kanalı kanülasyonu, baş ve beyin boşaltan lenflerin toplanmasını sağlar; böylece lenfatik sistem aracılığıyla çeşitli maddelerin konsantrasyonu ve taşınma hızı ölçülür. Bu faktörlerdeki farklı zorluklara (örneğin, ilaçlar, stres, travma) ve hastalıklara (örneğin, felme, enfeksiyon, Alzheimer hastalığı) karşı yanıt olarak değişiklikler de belirlenebilir. Burada, ameliyattan sonra birkaç saat boyunca lenf toplama imkanı sağlayan anestezi, derin servikal lenf kanalı kanülasyonlu bir fare modelini tanımlıyoruz. Bu yöntem, lenfte ilgi duyan geniş bir parametre yelpazesinin ölçülmesi için görüntüleme ve çoklu omik teknolojilerle birleştirilebilir. Bu, baş ve boyun bölgesinin temel fizyolojik ve patofizyolojik araştırmalarını, ayrıca özellikle yoğun sinir sindromü hastalıklarının tedavisi için ilaçların farmakokinetik/farmakodinamik çalışmalarını kolaylaştırır.

Giriş

Vücuda dağılmış olan lenfatik sistem, sıvı homeostazını korumak, bağışıklık yanıtlarını düzenlemek ve besinlerin ile sinyal moleküllerinin taşınmasını kolaylaştırmak için gereklidir1. Periferik lenfatikler, interstisiyel sıvı ve çözünen maddeleri toplayan ve çevresindeki düz kas tabakasına sahip daha büyük toplanmış lenfatik damarlara (LV) akan lenfatik kapilyarlarda başlar; Bu damarlar daha sonra lenfleri bağışıklık işleme için yerel lenfdüğümlerine iletir 2,3. Baş bölgeyi boşaltan lenf ağı, hem intrakraniyal (örneğin beyin) hem de ekstrakraniyal (örneğin burun ve ağız boşlukları) organların homeostazı için önemlidir. Ekstrakraniyal lenfatik ağın yapısı ve organizasyonunun vücut genelinde periferik lenfatiklere benzediğine inanılırken, intrakraniyal lenfatik sistem benzersiz anatomik ve fonksiyonel özellikler sergiler sergiler (fare modellerinde ayrıntılı şematik temsil için Şekil 1'e bakınız)4,5. Tipik LV'ler beyin parenximasında bulunmasa da, lenfatik benzeri fonksiyonlar, serebroomurilik sıvısı (CSF) ile interstisyel sıvı (ISF) arasındaki değişimi kolaylaştıran özel glial bağımlı lenfatik taşıma (glimfatik) sistemi tarafından yönetilir. Glimfatik sistem, beyin parenkiması içindeki ISF'nin CSF ile karışmasını sağlarken, meningeal, perivasküler ve nazofarengeal LV'ler CSF'den çözünen maddeleri kranial boşluğa taşır. Özellikle, meningeal lenfatik yol CSF'yi subaraknoid boşluktan meningeal LV'lere yönlendirir ve intrakraniyal sıvı dinamiğini periferik lenfatikklirens ile ilişkilendirir 7. Paralel olarak, perineural yollar, CSF ve ilgili çözücülerin kranial ve spinal sinir kılıfları boyunca, özellikle koku sinirleri aracılığıyla nazofaringeal lenfatikpleksusa 5,8 atılmasını sağlar. Bu sistemlerin eşzamanlı çalışması, beyin içinde sıvı homeostazısürdürür 6,7,8. CNS'i boşaltan lenf sisteminin anlaşılmasında son gelişmeler, beyin fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkında yeni bilgiler sağlamıştır. Bu bulgular, CNS hastalıklarında terapötik müdahale için yeni yollarsunabilir 9.

figure-introduction-1
Şekil 1: CNS lenfatik klirens yollarının şematik temsili. Bu yollar, (A) perivasküler boşluklar üzerinden glimfatik yol; (B) nazofarengeal lenfatik yol ve (C) meningeal LV. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Baş ve MSS'den boşalan lenfatik ağlar, boyun içindeki servikal lenf kanallarına birleşir; burada lenf, sistemik dolaşıma girmeden önce servikal lenf düğümlerinden filtrelenir. Servikal lenf düğümleri, boyun içindeki anatomik konumlarına göre yüzeysel (sCLN) ve derin servikal lenf düğümleri (dCLN) olarak sınıflandırılır. Servikal lenf kanallarındaki lenf sıvısının bileşimindeki değişikliklerin, beyindeki altta yatan patofizyolojik değişimleri yansıttığı düşünülmektedir; Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), travmatik beyin hasarı (TBI) ve felç sonrası bilişsel bozukluk (PSCI) örnekler 9,10,11,12,13 . Özellikle, AD'de, bu lenfatik yollar üzerinden amiloid-β (Aβ) ve fosforile tau proteinlerinin (P-tau) drenajının bozulması, hastalığın ilerlemesine katkıda bulunan bir faktörolarak gösterilmiştir 9,10,14. Lenf kanallarını doğrudan bitişik damarlara bağlayarak lenfatik drenajın yeniden yönlendirilmesiyle yapılan lenfatik venöz anastomoz (LVA), hem hayvanlarda hem de insanlarda, MSS'den lenfatik çıkışı artırmak için terapötik bir strateji olarak araştırılmaktadır; böylece beyinden Aβ temizlenmesini kolaylaştırmak ve AD 6,15,16'nın ilerlemesini geciktirmek için bir terapötik strateji olarak incelenmektedir . Bu yolun önemi, servikal lenf düğümlerinin cerrahi olarak alınmasına (lenfadenektomi) maruz kalan farelerde yapılan gözlemlerle daha da göze çarpmaktadır; bu da servikal lenfatik klirensin azalmasına yol açmıştır. Klirensin bozulması, Aβ ve P-tau'nun toksik birikimine yol açar ve ardından patolojik kinaz sinyal yollarının aktivasyonuna yol açar. Bu değişiklikler, AD benzeri tauopatinin kademeli bir kötüleşmesiyle ve anksiyete ile depresyona benzer davranışların artan riskiyleilişkilidir 14,16. Ayrıca, CSF tabanlı çalışmalar, beyin lenfomaları gibi MSS tümörlerinin derin servikal lenf kanallarından lenfatik klirensi fiziksel olarak engelleyebileceğini ve aynı zamanda CSF 9,17,18'deki onkoprotein konsantrasyonlarını yükseltebileceğini göstermektedir. MSS iltihabı temelli çalışmalardan elde edilen kanıtlar, meningelerden kaynaklanan hücrelerin meningeal LV'ler aracılığıyla servikal lenfdüğümlerine (8,19) göç edebileceğini göstermektedir. Bu hücreler ağırlıklı olarak lenfositlerden oluşur; dendritik hücreler, makrofajlar ve endotel hücrelerinin daha küçük popülasyonlarıise 19,20. İltihaplanma sırasında veya CNS yaralanması veya ameliyatı sonrasında, lenfatik bağışıklık hücresi taşımı, sitokinler, kemokinler ve diğer iltihap aracılar gibi bağışıklık biyobelirteçlerinin seviyelerinin yükselmesiyle birlikte belirgin şekilde artar21.

Pato-fizyolojik rollerinin yanı sıra, servikal lenfat ağı giderek daha fazla ilaç mevzimine yardımcı olacak önemli bir kanal olarak kabul edilmektedir. Önceki hayvan çalışmaları, MSS uygulaması için tasarlanmış birkaç ilaç formülasyonunun, beyin içi limfa kanalları ve lenf düğümleri aracılığıyla (farklı derecelerde) temizlenebileceğini göstermiştir; bunlar, intracerebrally uygulanan nanopartikül bazlı ajanlar (örneğin, lamotrijin, talazoparib) ve biyolojik ilaçlar (örneğin, monoklonal antikorlar, radyo etiketli iz proteinleri) ile örnek olarak görülür . İnsanlarda yapılan MRI görüntüleme çalışmaları, gadobutrol gibi bazı moleküllerin glimfatik sistemden servikal lenf kanallarına aktif olarak taşındığınıgöstermiştir 26.

Daha önce belirtildiği gibi, servikal lenf düğümleri, hem sCLN hem de dCLN, lenfleri başın farklı bölgelerinden boşaltır; ancak her düğümün drenaj ettiği spesifik kranial bölgeler belirsizkalmaktadır 27,28. Örtüşen drenaj alanları, bireyler arası anatomik değişkenlik ve türler arası potansiyel yapısal farklılıklar, hem hayvanlarda hem de insanlarda servikal lenfatik drenaj desenlerinin tanımlanmasını daha dakarmaşıklaştırmaktadır 29. Karmaşık servikal lenfatik ağ içinde, derin servikal lenf kanalları, nazofaringeal ve meningealLV'lerin 8'in aşağısında yer alan CSF için başlıca çıkış yolları olarak tanımlanmıştır. Deri altı dokuda ince ve değişken ağlar oluşturan ve bireysel fareler arasında boyut ve dallanma açısından büyük farklılıklar gösteren yüzeysel servikal lenf kanallarıyla karşılaştırıldığında, derin servikal lenf kanalı, küçük hayvan modellerinde MSS kaynaklı lenf toplamak için daha erişilebilir ve pratik bir yolsunar 20,30. Bu nedenle mevcut protokol, derin servikal lenf kanalından lenf toplamak için güvenilir bir yöntem oluşturmaya odaklanmaktadır.

Son on yılda yapılan sınırlı sayıda çalışma MSS hastalıklarını incelemek veya ilaç dağılımını analiz etmek için servikal limf sıvılarının toplanmasını tanımlamıştır. Daha önceki bir çalışma, servikal lenfteki ilaç konsantrasyonlarının, izole doku bölümlerinden (örneğin tek bir dCLN'ye bitişik olanlar) sıvının çekilmesi veya sıkılmasıyla ölçülmesini anlatmıştır.31. Ancak, küçük laboratuvar hayvanlarında, özellikle sıçanlarda, servikal lenf kanallarından sürekli lenf toplama deneysel protokolleri hâlâ yeterince geliştirilmemiştir. Bu protokol, (fare) servikal lenf kanalının kanülasyonu için kolayca erişilebilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturur; böylece sürekli lenf toplama sağlanır ve MSS lenfatik taşını, bağışıklık yanıtları ve farmakokinetiği araştırılır. Temel avantajı, belirli zaman aralıkları içinde lenf akışı ve bileşiminin nicelendirilebilmesi ve böylece ilaçların, lipidlerin, yağ asitlerinin ve hücresel bileşenlerin nicel ölçülmesini mümkün kılmaktadır. Özellikle, bu model plazma/CSF örnekleme veya görüntüleme teknikleriyle yeterince temsil edilmeyen lenfatik taşıma süreçlerini yakalıyor ve CNS ilaç düzümü, lipid ve besin taşıması ile bağışıklık sinyalleri hakkında yeni içgörülersunuyor 20.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde tanımlanan prosedür(ler) üniversite hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Çin İlaç Üniversitesi'nin deneysel etik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvanla ilgili herhangi bir prosedüre başlamadan önce, ilgili kurumsal veya organizasyonel etik komitesinden gerekli onayları alın. Deney hayvanları olarak 220 ila 250 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley (SD) fareleri kullanılır. Hayvanlar, yetkili deneysel hayvan tedarikçilerinden temin edilir ( bkz. Materyal Tablosu) ve deneyin başlamasına kadar serbest yiyecek ve suya erişimi olan özel kafeslerde tutulur. Bu protokolde, sol derin servikal lenf kanalının kanülasyonu örnek olarak tanımlanır. Şu anda, sol ve sağ derin servikal lenf kanalları arasındaki anatomik farklılıkları tanımlayan sınırlı kanıt bulunmaktadır. Daha önce tamamlanan deneylerden yapılan gözlemlere dayanarak, iki taraf arasında, lenf akış oranları da dahil olmak üzere, önemli bir fark gözlemlenmemiştir.

1. Güvenlik önlemleri ve prosedürleri

  1. Tüm prosedürleri kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirmeli ve tüm personel bu protokolü uygulamadan önce mikrocerrahi teknikler, deneysel hayvan kullanımı ve kimyasal güvenlik konusunda yeterli eğitim almalıdır.
  2. İşlem boyunca laboratuvar önlüğü, cerrahi eldivenler ve koruyucu gözlükler dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyin. Uçucu bir anestezik (izofluran) kullanıldığı ve uzun süreli maruz kalma sonrası insanlarda merkezi sinir sistemi depresyonu ve kardiyovasküler toksisiteye neden olabileceği için, işlemi iyi havalandırılan bir ortamda gerçekleştirin. Yiyecek ve içecekler laboratuvara getirilmemeli ve akan suyun her zaman kolayca erişilebilir olmasını sağlamalıdır.
  3. Şırınga iğneleri, jilet bıçakları ve mikro-makas gibi tüm keskin eşyaları dikkatle ele alın ve kullanımdan hemen sonra belirlenmiş keskin kaplara atın; Hiçbir koşulda tek kullanımlık keskin eşyalar yeniden kullanılmamalıdır.
  4. Tüm biyolojik örnekleri (örneğin toplanan lenf) ve hayvan vücut sıvılarını (örneğin kan) potansiyel olarak tehlikeli olarak ele almak, toplama ekipmanlarını dikkatli bir şekilde ele almak, örnekleri cerrahi bölgeden uzak tutmaktır. Kazara iğne sapı yaralanması veya ciltte tehlikeli maddelerle teması durumunda, etkilenen bölgeyi hemen sabun ve suyla yıkayın ve olayı kurumsal güvenlik protokollerine uygun olarak bildirin.

2. Ameliyattan bir gün önce hazırlık

  1. Sıçanları belirli deneyin gereksinimlerine göre oruç tutun veya besleyin. Bu protokol, belirli bir oruç veya federal eyaleti zorunlu kılmaz.
  2. Heparin veya etilenidiamintetraasetik asit (EDTA) ile 10 IU/mL nihai konsantrasyona kadar seyreltilerek antikoagülan bir çözelti hazırlayın. Bu karışımı (yaklaşık 0,7 mL) 30 G'lik bir iğne ile donatılmış 1 mL steril insülin şırıngasına önceden yükleyin; böylece polietilen (PE) kanülünün iç yüzeyi (lenf kanalı kanülasyonu için kullanılır) ön kaplama yapılır. Bu hazırlanmış karışımı steril koşullarda kullanana kadar sakla.
  3. Lenf örneği toplamak için kanülleri, her iki terminal bölüm için 0,5 mm dış çaplı (OD), 0,3 mm iç çaplı (ID) tüpler ve orta bölüm için 0,6 mm OD, 0,5 mm ID tüpleri kullanarak baştan kuyruğuna konfigürasyonda bir PE kanülü hazırlayın.
    1. Kanül segmentlerini, enjektör iğnesine bağlanan proksimal kısım için 2 cm, orta bölüm için 40 cm ve kanülasyon için tasarlanmış distal kısım için 8 cm uzunluklarda kesin.
    2. Kanül montajının distal ucunu yaklaşık 45° açı ile kesin ve eğimlenerek servikal lenf kanalına düzgün yerleştirmeyi kolaylaştırın. Kanül montajının ayrıntılı bir illüstrasyonu için Şekil 2'ye bakınız.
      NOT: Bu eğim, lenf kanalına düzgün bir şekilde yerleştirilmesini kolaylaştırır ve etkili kesit alanını artırarak tıkanıklık riskini azaltır. Başarılı kanülasyonun ardından, proksimal (2 cm) kesit ayrılır ve lenf doğrudan orta bölümün açık proksimal ucundan toplanır (Adım 4.9 ve 4.10'da ayrıntılı olarak açıklandığı gibi).

figure-protocol-1
Şekil 2: Kanül montajının şematik diyagramı (ölçek ölçüsünde değil). Diyagram, kanülün inşasında kullanılan monte edilmiş PE borunun her bir bileşeninin boyutlarını gösterir. Soldan sağa, montaj edilen kanül bundan sonra sırasıyla proksimal uç, orta bölüm ve distal uç olarak adlandırılacaktır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.  

  1. Anestezi soluma sistemini, buharlaştırıcı ile donatılmış basınçlı kaba sıvı izofluran önceden doldurarak hazırlayın. Kullanımdan önce, hava geçirmezliğini doğrulamak ve istikrarlı gaz akışını sağlamak için buharlaştırıcının test sürüşünü (priming) yapın.
  2. Gerekirse, test ilaç adayını uygun bir araçta hazırlayın. Depolama sırasında ve tüm uygulama süresince formülasyon bütünlüğünü doğrulamak için stabilite çalışmaları yapın. Gerekirse ek ajanlar (örneğin, Evans Blue gibi biyolojik boyalar) ekleyin.
  3. Steril mikrosantrifüj tüplerini önceden tartarak ve ilk ağırlıklarını kaydederek kapları lenf toplamaya hazırlayın. Her tüpü planlanan toplama zaman noktalarına (örneğin, saatlik aralıklar) göre sıralı olarak etiketleyin. Her tüpe konsantre heparin (veya EDTA) ekleyin ve çözücüyü azot üfleme buharlaştırmasıyla çıkarın; toplanan lenfin dengesiz seyreltilmesini önlemek için tüpte 2 ila 5 IU kurutulmuş heparin (veya EDTA) bırakın.

3.Ameliyattan  hemen önce yapılan hazırlıklar

  1. Her kanülün açıklığını hazırlanmış antikoagülan çözeltiyle yıkamak için doğrulayın. Bir şırıngayı birleştirilmiş kanülün proksimal ucuna bağlayın ve nazikçe küçük bir hacim çözelti serbest bırakın. Çözeltinin distal uçtan sorunsuz bir şekilde dışarı çıktığından ve sızıntı belirtisi olmadan gerçekleştiğinden emin olun. Eğer bağlantı noktalarında sıvının kaçmasıyla genellikle belirtildiği gibi sızıntı tespit edilirse, tüm kanül montajını atıp Adım 2.3'e göre yenisini yeniden inşa edin.
    NOT: Bu adım, kanülün iç yüzeyini antikoagülanla önceden kaplamak için aynı anda yapılır (bu adım ameliyattan bir gün önce de yapılabilir, böylece kanül gece boyunca önceden kaplanır).
  2. Ameliyatın başlamasından yaklaşık 5 dakika önce burun koni maskesi aracılığıyla inhalasyona izofluran verilmeye başlayın. İşlem boyunca 20 °C'de 101,3 kPa basınçta doğum hızı 0,4 ila 0,6 L/dakika arasında anestezi sürdürün. Anestezi derinliğinden emin olmak için parmak sıkıştırma tepkisini değerlendirin.
    1. Anestezi derinliğini sürekli takip edin. Sıkıntı veya fizyolojik dengesizlik belirtileri gözlemlenirse sıçanı hemen ötenazi yapın.
  3. Fareyi 37 °C'de tutulan ısıtmalı cerrahi pedin üzerine sırtüstü konumlandırın. Başı eğip boynu uzat, gerekirse küçük bir destek (yastık) kullanarak servikal bölgenin en üst düzeyde açıklığını artırın. Başı anestezi maskesi içine sabitleyerek izofluranın sürekli verimini sağlayacak ve işlem sırasında hareketi en aza indirmek için lastik bantlar veya cerrahi bantlarla ön uzuvları nazikçe tutun.
  4. Tıraş olunması kolaylaştırmak için servikal bölgedeki tüyleri steril normal salinle durulayın. Kesiden önce tüylerin tamamen alınmasını sağlamak için cerrahi bölgenin tamamını (çift kenarlı bir güvenlik jileti kullanarak), genellikle boyun ve köprücük kemiği bölgesini iyice tıraş edin (tıraş edilmiş boyun bölgesine örnek olarak Şekil 3A'ya bakınız).
  5. Tüm tıraş edilen alanı iyot içeren bir madde gibi dezenfektanlarla temizleyin.
  6. İlk kesinin uzunluğunu doğrulamak için cerrahi bölgeyi 2,5 cm uzunluğunda noktalı bir çizgi çizerek işaretleyin. Çizgiyi farenin vücudunun orta hattının hafifçe sağına yerleştirin. Kesiyin üst ucunu yaklaşık 1 ila 1,5 cm alt dudağın altına yerleştirin (kesi noktasına örnek olarak Şekil 3B'ye bakınız, ölçümler bir cetvel tarafından desteklenmiştir).

figure-protocol-2
Şekil 3: Cerrahi bölgenin hazırlanması. (A) Boyun bölgesi kesi için tıraş edilir; (B) 2,5 cm noktalı çizgi ile belirtilen yaklaşık kesi uzunluğu ve konumu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Servikal lenf kanalının kanülasyonu

  1. Fareyi başını operatöre doğru konumlandırın. Bu aşamada servikal lenf kanalının çapı nispeten küçük olduğundan mikroskop kullanın.
  2. Steril bir bistüri kullanarak, yukarıda bahsedilen 2,5 cm uzunluğundaki işaret boyunca, orta hattın ortasına neredeyse paralel konumlanmış şekilde servikal kasların yüzeysel tabakasını dikkatlice kesin (açık yüzeysel deri tabakası için Şekil 4A'ya bakınız).
  3. Kalan kas katmanlarını, özellikle yüzeysel servikal fasyayı, nazikçe ayırarak genellikle kırmızı rengiyle ayırt edilebilen servikal arterin ortaya çıkmasını sağlar.
  4. Sternomastoid kası ve submandibular bezi geri çekin ve cerrahi alandan dikkatlice uzaklaştırarak servikal lenf kanalının tanımlanmasını kolaylaştırın. Cerrahi pencereyi korumak için bir doku genişletici kullanın ve kas dokusunu geçici olarak kenara tutmak için pamuk çubuğu kullanın; lenf düğümü ve ilgili lenf kanalını konumlandırın. Tüm kanülasyon süreci boyunca doku genişleticisinin yerinde olduğundan emin olun (doku genişleticisi yerinde olan açık cerrahi pencere için Şekil 4B'ye bakınız).
  5. Servikal lenf kanalını konumlandırın (tercihen mikroskop altında): Kanal, yaklaşık 0,2 ila 0,5 mm çapında opak, renksiz bir damar olarak görünür ve karotis arterine hemen paralel uzanır. Servikal lenf kanalının ilerleyişi boyunca genellikle bir veya daha fazla bitişik ten rengi dCLN gözlemlenebilir (açıkta kalan derin servikal lenf kanalının ve bitişiğindeki dCLN'nin mikroskobik görüntüsü için Şekil 4C'ye bakınız).
    NOT: Servikal lenf kanalları genellikle çevredeki dokulara çok benzer bir renge sahiptir ve özellikle daha fazla yağ dokusuna sahip sıçanlarda bunların tanımlanması genellikle dikkatli inceleme gerektirir. Cerrahi uygulama amaçları için (ancak ilaçların veya endojen maddelerin lenfatik taşınımı üzerine çalışmalar için değil), Evans Blue ameliyatın başında boyun altına deri altına enjekte edilebilir; böylece boya lenfatikler aracılığıyla boşaldığında servikal lenf kanalı daha iyi görgörülebilir.
  6. Bir çift kör forseps kullanarak, ayrılmış bağ dokularından nazikçe geçin ve servikal lenf kanalının cerrahi alanda net görünür kalmasını sağlamak için forsepsi yerinde tutun.
  7. Servikal lenf kanalını, çevredeki bağ ve yağ dokularından künt diseksiyonla dikkatlice izole edin, özellikle hasardan kaçınmaya özen gösterin; çünkü damar son derece kırılgandır.
  8. Açık kanalın üst yarısında küçük bir kesik açmak için mikromakas kullanın. Kanalı tamamen ayırmayın; iki yarı sağlam kalmalıdır.
  9. Hazırlanmış kanülün önceden kaplanmış, antikoagülan çözelti ile (Adım 2.3'te açıklandığı gibi) hava kabarcıklarından arınmış olduğundan emin olun ve nazikçe yıkama işlemi yapın. Yerleştirmeden hemen önce, kanülün distal ucunu penslerle dikkatlice tutun, eğimli yüz yukarıya doğru yönlendirilecek şekilde yönlendirin. Daha sonra kanülü kesi üzerinden kanala yaklaşık 2 mm nazikçe ilerletin ve başa doğru yönlendirin (başarılı kanülasyonun bir örneği için Şekil 4D'ye bakınız). Gerçek yerleştirme derinliği, bireysel fareye göre değişebilir.
    NOT: Bu işlemde kanül yerleştirme nispeten sığ olduğundan, çevredeki bölgeye ek bir fiksasyon noktası yardımcı olabilir. Bu, cerrahi pencereden yaklaşık 1,5 cm uzaklıkta makas kullanılarak küçük bir ikincil deri delintisi (delik) oluşturularak sağlanır. Bu açıklık, sonraki adımlarda (örneğin, dikiş veya yapıştırıcı ile) daha da stabilize edilir. Şekil 4E, bu adımı doku yapıştırıcısı kullanımı bağlamında göstermektedir. Kanül, konumunun güvence altına alınmasına yardımcı olmak için delikten geçirilmelidir.
  10. İnsülin şırıngasını kanülün kısa (2 cm) proksimal segmentiyle birlikte kanül montajının geri kalanından ayırın. Lenf, daha büyük çaplı orta segmentin açık proksimal ucundan doğrudan toplanabilir. Bu toplama segmentinin distal ucunu 1–2 dakika boyunca izleyin. Kanüllenmiş kanaldan görünür, yavaş ve düzenli bir lenf sıvısı akışıyla başarılı kanülasyonun teyit edilmesi.
  11. Kanülasyonun başarılı olduğu doğrulandığında, hem lenf kanalının kesi yerine hem de ikincil fiksasyon deliğine küçük bir damla siyanoakrilat doku yapıştırıcısı ile pipet uygulayarak kanülü sabitleyin (kanül fiksasyonunun gösterimi için Şekil 4E'ye bakınız). Damarı tıkamamaya veya lenf akışını engellememeye ekstra dikkat edin.
  12. Düzenli bir çıkış olduğunu doğrulamak için lenf akışını birkaç dakika boyunca gözlemleyin (kanülün sonunda genellikle bir dakika içinde görünür bir damla oluşur). Doğrulandıktan sonra, cerrahi pencereden doku genişleticisini dikkatlice çıkarın ve alt mandibular bezi orijinal yerine yerleştirin.
  13. Kanülün distal ucuna önceden etiketlenmiş antikoagülan kaplı mikrosantrifüj tüpünü (bkz. Adım 2.6) bağlayarak serbest akan lenfi toplayın.

figure-protocol-3
Şekil 4: Servikal lenf kanalının kanülasyonu. (A) Boyun bölgesinde kesik yeri; (B) cerrahi pencere açılır, bir doku genişletici yerinde ve submandibular bez sağa çekilir; (C) servikal lenf kanalı ve mikroskop altında görüntülenen bir dCLN. (D) Başarılı kanülasyon, yeşil noktalı çizgi ile gösterilir (mikroskobik görünüm). (E) Kesi yerine doku yapıştırıcısı uygulandı ve pipet kullanılarak ikincil bir cilt delintisi yapıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Ameliyat sonrası dönem ve ilaç kullanımı

  1. Servikal lenf kanalı kanülasyonu tamamlandıktan sonra, tüm kas katmanları orijinal konumlarına yeniden yerleştirilin. Daha sonra, cilt kesisini dikiş ve/veya doku yapıştırıcısı ile kapatın; genellikle, 2,5 cm uzunluğunda bir kesi 8 dikişle düzgün şekilde kapatılabilir (dikişle kapatılmış cerrahi pencere için Şekil 5A'ya bakınız). Bu adımı tamamladıktan sonra ön uzuvlardaki kısıtlayıcı lastik bant(lar) veya cerrahi bantları çıkarın.
  2. Uygun bir yöntemle CSF'ye ilaçlar uygulanır; örneğin intra-sisterna magna (ICM), intra-serebroventriküler (ICV) veya lomber intratekal (LIT) enjeksiyon gibi. ICM uygulaması örneğinde, kafatasının tabanında bulunan ve dorsal yüzeydeki tek yumuşak çukur olarak görünen cisterna magna'daki enjeksiyon noktasını belirleyin. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için çevresindeki tüyleri gerektiğinde tıraş edin (ICM enjeksiyonu için uygun bir alan için Şekil 5B'ye bakınız).
    NOT: ICM enjeksiyonu sırasında intrakraniyal basıncı (ICP) korumak için, ilaç uygulamasından önce eşdeğer miktarda CSF genellikle çekilir. Enjeksiyon için yeni, önceden doldurulmuş bir şırınga kullanılması önerilir. Şırınga iğnesinin bükülmesi uygulaması kolaylaştırabilir (bkz. bükülmüş bir şırınga iğnesi ile ICM enjeksiyonunun gösterimi için Şekil 5C'ye bakınız).
  3. Sıçan, enjeksiyondan sonra ve örnek toplama süresi boyunca vücut sıcaklığını korumak için ısıtılmış cerrahi pedde (37 °C'de tutulur) sırtüstü tutun.

figure-protocol-4
Şekil 5: Ameliyat sonrası yönetim. (A) İpek dikiş kullanılarak kapalı kesi bölgesi. (B) Cisterna magna'nın çevresindeki kürklerle birlikte yaklaşık konumu. (C) İnsülin şırıngası ile bükülmüş iğneli bir ilaç adayının ICM uygulaması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Lenf örneklerinin toplanması ve analizi

  1. Lenf, antikoagülan kaplı mikrosantrifüj tüplerine sürekli olarak toplayın, tüpleri önceden belirlenmiş aralıklarla (genellikle saatte bir) değiştirin. Toplanan örnekleri buz paketleriyle soğutucu kutusunda sakla. Mikrosantrifüj tüpünde toplanan servikal lenf örneği için Şekil 6'ya bakınız.
  2. Lenf toplama süreci tamamlandıktan sonra, fareyi uygun protokollere göre insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
  3. Her planlanan aralıkta (saatlik) toplanan lenf hacmini ölçerek lenf akış hızını belirleyin.
  4. Lenfteki ilaç (veya ilgi çekici maddeler) konsantrasyonlarını, HPLC, HPLC-MS veya ticari olarak mevcut test kitleri gibi uygun analitik yöntemlerle ölçün; böylece bu maddelerin CNS'den lenfatik sistem aracılığıyla gelen klirens kinetiklerini karakterize etmek.
  5. Ölçülen ilaç konsantrasyonlarını ilgili lenf hacimleriyle çarparak lenfatik ilaç kütle taşınımını hesaplayın.

figure-protocol-5
Şekil 6: Lenf örneği toplama. Mikrosantrifüj tüpünde toplanan bir örnekin (yaklaşık 100 μL) fotoğrafı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

7. İşlem sonrası işleme ve atık bertaraf

  1. Ötenazi yapılan fare(ler), profesyonel bir tıbbi atık işleme ekibi tarafından toplanıp bertaraf edilene kadar özel bir soğuk depolama alanında (örneğin buzdolabı) belirlenmiş tıbbi atık konteynerlerinde geçici olarak saklanın.
  2. Tüm atılmış keskin eşyaları diğer atıklardan ayrı olarak belirlenmiş bir keskin eşya kapında toplayın.
  3. Deneyde kullanılan diğer keskin olmayan tüm eşyaları (örneğin pamuk çubukları, lastik bantlar, PE kanülleri) tıbbi atık torbalarına atın ve bunları ev içi veya genel atıklarla birlikte atmayın. Bu çantaya keskin bir eşya koymadığınızdan emin olun.
  4. Kalan tüm yeniden kullanılabilir aletleri laboratuvar protokollerine uygun olarak temizleyin ve dezenfekte edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Servikal lenf kanülasyonu modeli kullanılarak saatlik lenf akış hızlarının (mL/h) temsil eden bir veri seti elde edildi (ilgili grafik için Şekil 7'ye bakınız). Bu deneyde üç (n = 3) çalışma faresi yer aldı, lenf sürekli olarak mikrosantrifüj tüplerine toplandı ve 6 saat içinde saatlik olarak değiştirildi.

figure-results-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, sıçanlarda servikal lenf kanalının kanülasyonu için tekrarlanabilir bir yöntem oluşturur ve uzun süreler boyunca sürekli lenf toplamayı mümkün kılar. Yeterli mikrocerrahi eğitimle işlem verimli şekilde gerçekleştirilebilir ve sürekli anestezi ile stabil fizyolojik koşullarda tutarlı lenf örnekleri elde edilir; bu da rutin deneysel kullanım için uygundur. Ustalaştıktan sonra, cerrahi işlem genellikle yaklaşık 40 ila 50 dakika sürer ve bu da tek bir deney seansında birden fazl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen hiçbir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, hayvan deneyleri yapmadaki destekleri için Çin Farmastika Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nden Bay Zhenglin Hao ve Bayan Jie Zhao'ya içtenlikle teşekkür etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
30 gauge iğneYushou SağlıkKanülün proksimal ucunu (0503) heparin şırıngasına bağlamak için kullanılır
Buharlaştırıcı anestezi dağıtıcısıYYUN Enstrüman Şirketi
Künt pensepsRWD Yaşam BilimleriF22002-10 
Pamuk çubuklarıQingdao Shultz BiyoteknolojiMQ-02Kas dokusunu geçici olarak yerinde tutmak için kullanılır
Isıtılan cerrahi pedShanghai Yiheng InstrumentsBoyut 15 & Kez; 20 cm
Heparin sodyumShanghai Aladdin Biyokimyasal TeknolojisiH123383Kullanımdan önce seyreltme gereklidir
İnsülin şırıngası (1 mL)Yushou SağlıkU100-1MLSadece heparin ön kaplama için kullanılır
Soluma için izofluran çözeltisiRWD Yaşam BilimleriR510-22-10Anestezi için buharlaştırıcı ile kullanılır
İşaret kalemleriHerhangi bir markaYok
Mikro-santrifüj tüpü (1.5 mL)Nantong Hairui Deneysel EkipmanlarıHR10003Lenf toplama için kullanılır
Mikro-makasRWD Yaşam BilimleriGD234BA0007925
Naylon cerrahi dikiş ve nbsp;Shanghai Yiheng Instruments4-0 35CM
Pipet (hacim ayarlanabilir, ölçüm aralığı 5 ila 50 μ L)Dragon Laboratuvar Aletleri Limited7030301006Sadece doku yapıştırıcısını ölçmek için kullanılır
Pipet uçları Biosharp Yaşam BilimleriBS-10-TSadece doku yapıştırıcısının transferi için kullanılır, belirli bir hacim gerekmez
Polyeyhylene (PE) kanülü 0,5 mm OD, 0,3 mm ID (0503)AniLab Bilimsel Aletler (Ningbo)PE-0503
Polyeyhylene (PE) kanülü 0,6 mm OD, 0,5 mm ID (0605)AniLab Bilimsel Aletler (Ningbo)PE-0605
Jilet bıçaklarıGillette ŞanghayQ31/0115000301C004Sadece kürk tıraş için kullanılır
Lastik bantHerhangi bir markaYokFarelerin ön uzuvlarını tutmak için kullanılır
HükümdarHerhangi bir markaYok
Scapel bıçakları (#23)RWD Yaşam BilimleriS31010-01
İnfuzyon için sodyum klorür (%0,9) çözeltisiShijiazhuang No. 4 İlaçH20066533 (onay numarası)Sadece kürk durulama için kullanılır
Sprague-Dawley FareleriPekin Vital Nehri Laboratuvarı Hayvan Teknolojisi101Ağırlık 220 ila 250 gram, yaş şartı yok
Cerrahi ışıkPekin Heo Bio-TechXHA011-1
Cerrahi mikroskopShanghai Cewei Optoelektronik TeknolojisiSMZ755TMekanik aşaması olmayan diseksiyon mikroskobu, geri çekilebilir bir stand ile donatılabilir
Doku yapıştırıcısı3M Vetbond1469SBAna bileşen siyanoakrilat 
Doku genişletici (Colibri)RWD Yaşam BilimleriR22029-04Genleşme menzili 20mm/4cm

Kaynaklar

  1. Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
  2. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
  3. Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
  4. Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
  5. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  6. Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
  7. Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
  10. Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
  11. Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
  12. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  13. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
  14. Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
  15. Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
  16. Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
  17. Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
  18. Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
  19. Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
  20. Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
  21. Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
  22. Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
  23. Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
  24. Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
  25. Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
  26. Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
  27. Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
  28. Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
  29. Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
  30. Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
  31. Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
  32. Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
  33. Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
  34. Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
  35. Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
  36. Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
  37. Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
  38. Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
  39. Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
  40. Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
  41. de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Beyin Lenfati iS an Kan lasyonuLenf ToplamaMerkezi Sinir SistemiLenfatik TemizlenmeN roinflamasyon Modelila TemizlenmesiLenf Ak l m

İlgili makaleler