Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu çalışma, tip 2 diyabette (T2DM) bağırsak mikrobiyota çeşitliliğinin azalmasını ve metabolik yolların değişmesini tanımlıyor; artan proteobakteri ve azalmış faydalı taksonları vurgulamaktadır; bu da mikrobiyal disbiyozun T2DM ile ilişkili olduğunu ve patofizyolojisine katkıda bulunabileceğini öne çıkarmaktadır.
Tip 2 diyabetin (T2DM) küresel artışı, özellikle konak-mikrobiyom etkileşimlerini içeren biyolojik mekanizmalarının daha iyi anlaşılması gerekliliğini vurgulamaktadır. Bu çalışma, yeni teşhis edilen T2DM hastalarında bağırsak mikrobiyal çeşitliliğini, taksonomik bileşimi ve tahmin edilen metabolik yolları diyabetik olmayan eşleşen (NM) grupla karşılaştırmayı amaçladı. Taze dışkı örnekleri 16S rDNA dizileme kullanılarak analiz edildi. Alfa çeşitliliği (Chao, ACE, Shannon ve Simpson indeksleri) ve beta çeşitliliği mikrobiyal topluluk yapısını değerlendirmek için hesaplandı. Taksonomik farklılıklar, Wilcoxon sıra-toplamı testleri ve lineer ayrımcı analiz etki boyutu (LEfSe) kullanılarak değerlendirildi. Fonksiyonel yol tahmini, KEGG ve MetaCyc notasyonlarına dayanarak gözlemlenmeyen durumların yeniden yapılandırılması (PICRUSt2) kullanılarak toplulukların filogenetik incelemesi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mendel randomizasyon (MR) analizi, ters varyans ağırlıklandırma, MR-Egger ve ağırlıklı medyan yöntemler dahil olmak üzere, mikrobiyal taksonlar ile T2DM arasındaki genetik olarak tahmin edilen ilişkileri değerlendirmek için uygulandı. Sonuçlar, T2DM hastalarında daha düşük Chao ve ACE indeksleriyle yansıtılan mikrobiyal zenginliğin azaldığını, çeşitlilik yapısının değiştiğini ve daha düşük Shannon ve yüksek Simpson indeksleriyle yansıtılan çeşitlilik yapısının değiştiğini, bunun da önemli bileşimsel değişimlerle birlikte olduğunu gösterdi. Proteobakteri sayısında artış ve Lachnospiraceae ile Blautia gibi faydalı taksonların azalması gözlemlendi. Fonksiyonel tahmin, oksidatif olmayan pentoz fosfat yolu, izobutanol biyosentez ve L-izoleusin biyosenteziyle ilişkili yolların bolluğunun azaldığını gösterdi. MR analizi, belirli mikrobiyal taksonlar ile T2DM hassasiyeti arasındaki ilişkileri destekleyen tamamlayıcı kanıtlar sağladı. Sonuç olarak, T2DM azalmış mikrobiyal zenginlik, değişen çeşitlilik yapısı ve belirgin taksonomik ve fonksiyonel değişikliklerle ilişkilidir. Bu bulgular, T2DM'de bağırsak mikrobiyotasının önemini vurgulamakta ve mikrobiyom tabanlı biyobelirteçlerin ve terapötik stratejilerin potansiyel faydasını desteklemektedir. Bu bulguları doğrulamak ve altta yatan mekanizmaları netleştirmek için daha fazla çalışma gereklidir.
Tip 2 diyabet hastalığı (T2DM), hızlı kentleşme, batılılaşmış beslenme alışkanlıkları ve giderek hareketsiz yaşam tarzları nedeniyle dünya genelinde en hızlı büyüyen kronik hastalıklardanbiri haline geldi 1,2. Küresel hastalık ve ölümlere büyük katkı sağlar ve önemli bir halk sağlığıyükü oluşturur 3. Genetik duyarlılık rol oynasa da, T2DM sidansındaki hızlı artış çevresel ve metabolik belirleyicilerin öneminivurgular. 4. Bu nedenle, değiştirilebilir biyolojik mekanizmaların tanımlanması, erken tespit ve önleme stratejilerini geliştirmek için gereklidir. Son gelişmeler, bağırsak mikrobiyotasını metabolik homeostazın temeldüzenleyicisi olarak tanımlamıştır 5. Bağırsak mikrobiyal ekosistemi, T2DM6'nın patogenezinde merkezi olan glukoz metabolizması, bağışıklık fonksiyonu, bağırsak bariyer bütünlüğü ve kronik düşük dereceli iltihaplanmayı etkiler. Disbiosis, obezite, insülin direnci, endotoksemi ve değişen enerji dengesi ile ilişkilendirilmiştir; bu da mikrobiyal değişiklikler ile hastalık ilerlemesi arasında mekanik bir bağlantı olduğunugöstermektedir 7. Ayrıca, kısa zincirli yağ asitleri, safra asitleri ve dallanmış zincirli amino asitler dahil mikrobiyal metabolitler, insülin duyarlılığını ve konak metabolizmasını modüle etmekte roloynamıştır 8.
Biriken kanıtlar bağırsak mikrobiyomunun T2DM'deki rolünü desteklerken, mevcut çalışmaların çoğu gözlemsel tasarımlara dayanır ve bu da nedensel çıkarımı sınırlar. Pompalı tüfek metagenomikleri ve hedefli metabolomikler gibi alternatif yaklaşımlar, daha yüksek çözünürlüklü fonksiyonel içgörüler sağlayabilir ancak genellikle maliyet, hesaplama karmaşıklığı ve sınırlı fizibilite nedeniyle keşif veya pilot ölçekli çalışmalarda sınırlanır. Buna karşılık, 16S rDNA dizileme mikrobiyal topluluk bileşimini profillemek için maliyet etkin, yaygın olarak benimsenen bir yöntemdir; ancak taksonomik çözünürlüğü tür düzeyiyle sınırlıdır ve fonksiyonel metabolitleri doğrudan niceleyemez. Bu nedenle, 16S rDNA dizileme bu çalışma için keşif klinik kohortlar için uygun maliyet etkin, ölçeklenebilir bir yaklaşım olarak seçilmiştir; aynı zamanda aşağı yönlü fonksiyonel tahmin ve tamamlayıcı analitik çerçevelerle entegrasyonu mümkün kılar. Bu nedenle, 16S tabanlı mikrobiyal profillemenin biyoinformatik, fonksiyonel tahmin ve Mendel rastgeleleştirme (MR) gibi tamamlayıcı yaklaşımlarla entegre edilmesi, hem bileşimsel hem de potansiyel nedensel ilişkileri araştırmak için dengeli bir çerçeve sağlayabilir.
Özellikle, yeni teşhis edilmiş, tedavi görmemiş T2DM hastalarına odaklanan verilerin nispeten eksik olmasıdır. Bu tür popülasyonlarda, mikrobiyal değişikliklerin farmakolojik müdahalelerle, özellikle metforminle, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini ve işlevini önemli ölçüde değiştirdiği bilinen metformin tarafından karıştırılma olasılığı dahadüşüktür. 9. Bu, mevcut literatürde önemli bir boşluk oluşturmaktadır; çünkü mevcut birçok çalışma, farklı tedavi maruziyetlerine sahip heterojen hasta popülasyonlarını ve mikrobiyom profillemenin genetik olarak bilinçli analitik yaklaşımlarla sınırlı entegrasyonunu içermektedir.
Bu bağlamda, mevcut çalışma, yeni teşhis edilen T2DM hastalarında bağırsak mikrobiyotası çeşitliliğini, taksonomik bileşimi ve tahmin edilen fonksiyonel yolları NM grubuna kıyasla 16S rDNA dizileme ve biyoinformatik analiz kullanarak karakterize etmeyi amaçladı. Ayrıca, Mendelian randomizasyonu, halka açık genom çapında ilişki verileri kullanılarak uygulanarak spesifik mikrobiyal taksonlar ile T2DM riski arasındaki potansiyel genetik olarak tahmin edilen ilişkileri araştırdı. Bu birleşik analitik strateji, mikrobiyal topluluk profili ve popülasyon düzeyindeki genetik verilerden tamamlayıcı içgörüler sağlar. Özellikle, 16S rDNA dizileme çalışmadaki popülasyondaki mikrobiyal bileşimin doğrudan karakterizasyonunu sağlarken, Mendel randomizasyonu bağımsız kohortlardan alınan genetik aletleri kullanarak gözlemlenen ilişkilerin genetik olarak tahmin edilen ilişkilerle tutarlı olup olmadığını değerlendirir. Bu entegrasyon, mikrobiyota–T2DM ilişkilerinin sağlamlığını destekleyen tamamlayıcı kanıtlar sunarak gözlemsel mikrobiyom çalışmalarının önemli bir sınırlamasını ele almayı amaçlamaktadır. Bu nedenle, bu yaklaşımların entegrasyonu, tekrarlayıcılık yerine çapraz doğrulama sağlamak amacıyla tasarlanmıştır ve böylece mikrobiyota–T2DM ilişkilerinin yorumlanabilirliğini güçlendirir.
Bu çalışma üç yöne odaklanmaktadır. İlk olarak, yeni teşhis edilmiş, tedavi görmeyen T2DM hastalarında bağırsak mikrobiyotasında yapılan değişiklikleri değerlendirerek farmakolojik müdahalelerden kaynaklanan karışıklığı azaltmaktadır. İkinci olarak, taksonomik profillemeyi öngörülen fonksiyonel yollarla entegre ederek mikrobiyota ile ilişkili metabolik değişikliklerin sistem düzeyinde bir görünümünü sağlar. Üçüncü olarak, gözlemlenen ilişkilerin genetik olarak tahmin edilen ilişkilerle tutarlı olup olmadığını değerlendirmek için Mendel rastgele analizini içerir ve böylece metodolojik üçgenleme sağlar. Bu yönler birlikte, tamamen tanımlayıcı bir çalışma yerine mikrobiyom analizi için tamamlayıcı ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar; bu çalışmayı, genellikle tek yöntemli gözlem tasarımlarına dayanan ve mikrobiyal profilleme, fonksiyonel tahmin ve genetik olarak bilgilendirilmiş çıkarımı birleşik bir analitik çerçeve içinde entegre etmeyen önceki çalışmalardan ayırır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler Chongqing Chenjiaqiao Hastanesi Etik Komitesi tarafından incelenip onaylandı (onay No. 20240131). Örnek toplamadan önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Tüm dışkı örnekleri ve katılımcı bilgileri, Materyaller Tablosu'nda listelenen kimliği yok edilmiş çalışma kodları kullanılarak ele alındı.
Katılımcı taraması ve kayıt
Haziran 2023 ile Aralık 2023 arasında Chongqing Chenjiaqiao Hastanesi'ni ziyaret eden yeni teşhisli T2DM hastaları uygunluk açısından tarandı. Katılımcılar, 20 ile 65 yaş arasındaysa, yeni T2DM tanısı almış, taze dışkı örneği vermeyi kabul eden ve gerekli tıbbi geçmiş değerlendirmesi ile klinik muayeneleri tamamlamışlarsa DM grubuna dahil ediliyordu. Aynı dönemde işe alınan sağlıklı gönüllüler, diyabetik olmayan eşleşen (NM) grup olarak dahil edildi ve yaş, cinsiyet ve genel demografik özellikler açısından DM grubuna mümkün olduğunca yakın eşleştirildi. Katılımcılar, hematolojik bozukluklar, merkezi sinir sistemi hastalıkları, aktif romatizmal hastalık, otoimmün hastalık, akut veya kronik gastrointestinal enfeksiyon, kronik ishal, kabızlık, aktif veya iyileşmekçi gastrointestinal ülser, inflamatuar bağırsak hastalığı, irritabl bağırsak sendromu, bağırsak tüberkülozu, gastrointestinal tümörler, diğer kanserler, şiddetli kalp yetmezliği, şiddetli karaciğer yetmezliği, şiddetli böbrek yetmezliği ve diğer şiddetli metabolik durumlara sahiplerse eleme alındı. hastalıklar, yetersiz beslenme, bağışıklık eksikliği, doğuştan metabolik bozukluklar, psikiyatrik hastalıklar, sedatif-hipnotik kullanım veya uyuşturucu kötüye kullanımı. Katılımcılar, dışkı toplamadan önce 1 ay içinde antibiyotik, asit baskılayıcı ajanlar, gastrointestinal motilite ilaçları, probiyotikler, glukokortikoidler veya immünosupresantlar almışlarsa yarış dışı bırakıldı. Ayrıca, dışkı toplanmadan önce 1 ay içinde ishal yaşamış, gastrointestinal cerrahi veya gastrointestinal endoskopi geçiren veya yaşam ortamında veya beslenme alışkanlıklarında ani değişiklikler bildiren kişiler dışlanmıştır. Örnek toplamadan önce her uygun katılımcıya benzersiz bir çalışma kodu atandı. Uygun kohorttan, örnek kullanılabilirliği ve dizileme kalite gereksinimlerine göre 12 yeni teşhis konan T2DM ve 12 NM katılımcısı, örnek kullanılabilirliği ve dizileme kalite gereksinimlerine göre 16S rDNA dizileme ve mikrobiyom analizleri için seçildi.
Dışkı örnekleri toplama ve depolama
Her katılımcıya, kimliğinin silinmesini sağlamak için yalnızca atanan çalışma kodu ile etiketlenmiş steril dışkı toplama kapı sağlandı. Katılımcılara, idrar kontaminasyonunu en aza indirmek için dışkıdan önce mesanelerini boşaltmaları ve tuvalet suyu, idrar, dezenfektan veya diğer potansiyel kirleticilerle temas etmeden taze dışkıyı doğrudan steril kaba toplamaları talimatı verildi. Toplandıktan hemen sonra, yaklaşık 1–2 g dışkı, steril tek kullanımlık örnekleme kaşığı kullanılarak steril kriyojenik tüpe transfer edildi. Tüp sıkıca kapatıldı ve hemen kuru buz üzerine veya önceden soğutulmuş transfer kabına kondu. Tüm örnekler toplandıktan sonra 2 saat içinde laboratuvara taşındı. Laboratuvara varıldığında, çalışma kodu doğrulandı ve her tüp sızıntı veya görünür kontaminasyon açısından incelendi. Tüm örnekler için toplama ve depolama süreleri kaydedildi. Dışkı örnekleri genomik DNA çıkarımı yapılana kadar −80 °C'de depolandı. Numuneler, depolama ve taşıma sırasında tamamen donmuş kalıyorsa ve boru sızıntısı veya dış kirlenme belirtisi bulunmadığında aşağı akış analizi için kabul edilebilir sayılırdı.
Genomik DNA çıkarımı
Dışkı örnekleri −80 °C sıcaklıkta saklanırken işlemden önce buz üzerine kondu. Her örnek, tekrar eden donma-erime döngüleriyle ilişkili bozulmayı en aza indirmek için homojenizasyon mümkün olana kadar çözüldü. Yaklaşık 200 mg dışkı, steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı ve dışkı DNA çıkarma kitinde sağlanan liz tamponu, Malzemeler Tablosu'nda listelenen üretici talimatlarına göre eklendi. Örnekler tam homojenizasyon için 30 saniye boyunca şiddetle girdablandırıldı ve ardından hücre lizisini kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 5–10 dakika kuluçka altına alındı. Lizisin ardından, örnekler 12.000 × g. sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatant, pelleti rahatsız etmeden dikkatlice yeni steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Genomik DNA, üreticinin protokolüne göre kit ile sağlanan elusyon tamponu veya nükleaz içermeyen su kullanılarak elüasyonlandı. Çıkarılan DNA, kısa süreli kullanım için −20 °C'de veya uzun süreli koruma için −80 °C'de depolanmıştır. Aşağı akış analizi için uygun olarak değerlendirilen DNA örnekleri net ve görünür partikül madde içermeyen görünüyordu.
DNA kalite değerlendirmesi
DNA kalitesi, agaroz jel elektroforezi ve floresans tabanlı niceleme kullanılarak değerlendirildi. %1 agararoz jeli elektroforez tamponunda hazırlandı ve çıkarılan DNA örnekleri, yükleme tamponu ile karıştırıldı ve jel kuyularına yüklendi. Elektroforez işlemi yapıldı, ta ki DNA bantları yeterince ayrılana kadar, ardından jel ultraviyole veya mavi ışık altında incelendi. DNA bütünlüğü, belirgin bozulma veya aşırı bulaşma olmadan sağlam bir genomik DNA bandı gözlemlendiğinde kabul edilebilir sayıldı. DNA konsantrasyonu daha sonra floresans tabanlı bir DNA nicelendirme sistemi kullanılarak nicel edildi. Numuneler, sonraki PCR amplifikasyonu için gereken konsantrasyona kadar seyreltildi. Yüksek kaliteli DNA örnekleri genellikle agaroz jel elektroforezisinde belirgin bir bant gösterir ve sonraki amplifikasyon işlemleri için yeterince konsantre olurdu.
16S rDNA V3–V4 bölgesinin PCR amplifikasyonu
Bakteriyel 16S rDNA'nın V3–V4 hiperdeğişken bölgesi, barkodlu primerlerle amplifikasyon yapıldı. Astarlar şu şekildeydi: ön primer 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′ ve ters primer 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. PCR reaksiyonları, 4 μL PCR tamponu, 2 μL nükleotid karışımı (2,5 mmol/L), 0,8 μL ileri ve geri primerler (5 μmol/L), 0,4 μL yüksek isabetli DNA polimeraz, 10 ng şablon DNA ve nukleazsız su içeren 20 μL nihai hacimde buz üzerinde hazırlandı. Reaksiyon karışımları pipetle nazikçe karıştırılır ve kısa bir süreliğine santrifüjlenerek sıvının tüpün dibinde toplanmasına izin verilmiştir. PCR amplifikasyonu aşağıdaki döngü koşullarıyla gerçekleştirildi: başlangıç denatürasyonu 95 °C'de 5 dakika yapıldı, ardından 95 °C'de 30 saniye boyunca 25 döngü denatürasyon, 30 saniye boyunca 55 °C'de tavlama ve 30 saniye boyunca 72 °C'de uzatma ile son uzatma adımı 72 °C'de 10 dakika sürdü. Amplifikasyon yanlılığını en aza indirmek için her örnek üçlü reaksiyonlarda amplifikasyon yapıldı ve aynı örnekten elde edilen PCR ürünleri daha sonra tek bir tüpte toplandı. Başarılı amplifikasyon, agaroz jel elektroforezide beklenen boyutta net bir amplikon bandının varlığıyla doğrulandı.
PCR ürün doğrulaması ve arıtma
PCR ürünleri %2 agaroz jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı. Her örnekten alınan birleşik PCR ürünleri jel üzerine yüklenir ve hedef amplikon bantları net şekilde ayrılana kadar elektrofore edilirdi. Beklenen amplikon boyutuna uygun bantlar, temiz steril bir bıçakla çıkarıldı ve Malzemeler Tablosu'nda listelenen üretici talimatlarına göre jel çıkarma setiyle saflaştırıldı. Arıtılmış PCR ürünleri daha sonra elusyon tamponu veya nükleaz içermeyen suda elüasyon yapıldı. Her saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonu, floresans tabanlı DNA nicelendirme sistemi kullanılarak nicelendirildi ve konsantrasyon değerleri aşağı akış kütüphane hazırlığı için kaydedildi. Başarılı amplifikasyon ve saflaştırma, agaroz jel elektroforezide beklenen amplikon boyutunda tek, net bir bant ile doğrulandı.
Kütüphane hazırlığı ve havuzlama
Dizileme kütüphaneleri, üreticinin Materyal Tablosu'nda listelenen talimatlarına göre bir DNA kütüphane hazırlık kiti kullanılarak hazırlanmıştır. Dizileme adaptörü dizileri, standart kütüphane hazırlama iş akışına uygun olarak saflaştırılmış amplikonlara bağlandı. Adaptör ile ligasyonlu ürünler, seçilen kütüphane hazırlama protokolüne bağlı olarak jel ekstraksiyonu veya boncuk tabanlı arıtma yöntemiyle daha sonra saflaştırıldı. Arıtılmış kütüphane ürünleri, uygun parça dağılımını doğrulamak için %2 agararoz jel elektroforezi kullanılarak değerlendirildi. Kütüphane konsantrasyonları, floresans tabanlı DNA nicelik sistemi kullanılarak nicelendirildi. DNA konsantrasyonu ve parça boyutuna dayanarak, her kütüphane aynı azı dişleri konsantrasyonuna normalize edildi ve örnekler arasında dengeli dizileme derinliği sağlandı. Bireysel kütüphanelerin eşit azı miktarları 1:1 oranında toplanarak nihai dizileme kütüphane havuzu oluşturuldu. Dizilemeden önce, havuzlu kütüphane, örnek yüklemeden önce sıralama platformu protokolüne göre denatüre edilmiştir. Dizileme için uygun kabul edilen kütüphaneler, beklenen boyut aralığında net bir parça dağılımı ve aşağı akış dizileme analizi için yeterli konsantrasyon sergilemiştir.
Çift uçlu dizileme
Son havuzlanmış kütüphane, üreticinin standart işletim prosedürlerine uygun olarak eşleştirilmiş uçlu bir dizileme platformuna yüklendi. Eşleştirilmiş uçlu dizileme, her örnekte mikrobiyal çeşitliliğin kapsamlı karakterizasyonu için yeterli dizileme derinliği sağlamak amacıyla ya 2 × 250 bp ya da 2 × 300 bp koşu konfigürasyonları kullanılarak gerçekleştirildi. Dizileme kalitesi, platform tarafından oluşturulan kalite metrikleri kullanılarak çalışma boyunca izlendi. Dizileme tamamlandıktan sonra, her örnek için ham eşleştirilmiş uçlu FASTQ dosyaları aşağı akış biyoinformatik analizi için dışa aktarıldı. Dizileme veri setleri, örnek başına yeterli okuma derinliği, uygun Q30 kalite puanları ve başarılı barkod ataması gösterdiklerinde kabul edilebilir kabul edildi.
Ham dizi işleme
Ham eşleştirilmiş uçlu FASTQ dosyaları, aşağı akış işlemleri için mikrobiyom biyoinformatik analiz boru hattına aktarıldı. Diziler, her numuneye atanan barkodlara göre demultiplex edildi. Daha sonra, düşük kaliteli puanlar, belirsiz tabanlar veya dizileme artefaktları içeren okumalar kaldırılmak için kalite filtreleme gerçekleştirildi. Okumaların sonunda bulunan düşük kaliteli bazlar, genel dizi güvenilirliğini artırmak için kalite puan dağılımına göre kesildi. Kalite kontrolünden sonra, eşleştirilmiş uçlu okumalar örtüşen bölgeler arasında birleştirilerek tam uzunlukta diziler yeniden oluşturuldu. Sonraki mikrobiyom analizleri için yalnızca yüksek kaliteli birleşik diziler tutuldu.
Amplikon dizisi varyantı (ASV) üretimi ve taksonomik açıklama
Diziyle denoizasyon, dizileme hatalarını düzeltmek ve dizis doğruluğunu artırmak için DADA2 veya Deblur dahil olmak üzere doğrulanmış bir denozizasyon algoritması kullanılarak gerçekleştirildi. Kimerik diziler denoizasyon sürecinde tespit edilip çıkarıldı. Her örnek için temsilci ASV dizileri ve ilgili ASV bolluk tabloları oluşturuldu. ASV dizilerinin taksonomik ataması Naive Bayes sınıflandırıcısı kullanılarak yapıldı ve taksonomik notasyon SILVA 138 referans veritabanına göre yapıldı. Taksonomik bolluk tabloları, sonraki analiz için filüm, aile ve cins seviyelerinde ihraç edildi. Son ASV veri seti, her örnek için temsil dizileri, bolluk bilgileri ve ilgili taksonomik açıklamaları içeriyordu.
Alfa ve beta çeşitlilik analizi
Chao, ACE, Shannon, Simpson ve Coverage endeksleri dahil olmak üzere alfa çeşitlilik endeksleri, örnek içindeki mikrobiyal çeşitlilik ve zenginliği değerlendirmek için hesaplandı. Alfa çeşitlilik indeksleri ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. Veri normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. Normal dağılımlı değişkenler DM ve NM grupları arasında Student's t-testleri kullanılarak karşılaştırılırken, normal dağılım olmayan değişkenler Wilcoxon sıralama toplamı testleriyle analiz edildi. Beta çeşitlilik mesafeleri, örnekler arasında mikrobiyal topluluk bileşimindeki farklılıkları değerlendirmek için uygun bir mesafe matrisi kullanılarak hesaplandı. Gruplar arasındaki mikrobiyal topluluk yapısındaki farkları görselleştirmek için ana koordinat analizi (PCoA) gerçekleştirildi. Ayrıca, gruplar arası farkların grup içi varyasyonu aşıp aşmadığını belirlemek için benzerliklerin analizi (ANOSIM) yapıldı ve ilgili ANOSIM R ve p değerleri raporlandı. Alfa çeşitliliği analizi, örnek içi mikrobiyal çeşitliliği yansıtırken, beta çeşitlilik analizi gruplar arasındaki mikrobiyal topluluk bileşimindeki farklılıkları değerlendirdi.
Diferansiyel taksonomik analiz
Mikrobiyal topluluk bileşimi filüm, aile ve cins seviyelerinde özetlenmiştir. Baskın taksonların bireysel örnekler ve çalışma grupları arasında göreceli bolluğunu görselleştirmek için üst üste koymuş çubuk grafikleri oluşturuldu. DM ve NM grupları arasında paylaşılan ve gruba özgü ASV'leri karşılaştırmak için Pan/Core eğrileri ve Venn diyagramları da oluşturuldu. Gruplar arasındaki takson bolluğundaki farklar Wilcoxon sıralama toplamı testleriyle değerlendirildi. Daha sonra LEfSe analizi yapılarak gruplar arası ayrımcılığa en çok katkıda bulunan mikrobiyal taksonlar belirlenmiştir. Diferansiyel taksonomik analiz, DM veya NM grubunda zenginleşmiş mikrobiyal taksonların tanımlanmasını mümkün kıldı.
Fonksiyonel tahmin
PICRUSt2 veya eşdeğer doğrulanmış fonksiyonel tahmin hattı, 16S rDNA dizileme profillerinden mikrobiyal fonksiyonel yollar çıkarmak için kullanıldı. ASV bolluğu verileri, seçilen analitik boru hattının gereksinimlerine göre normalleştirildi ve tahmin edilen fonksiyonlar KEGG veya MetaCyc yol notasyonlarına eşlendi. Tahmin edilen yol bollukları DM ve NM grupları arasında karşılaştırıldı. Önemli ölçüde farklı yollar, ısı haritaları veya diğer uygun grafiksel yaklaşımlarla görselleştirildi. Tahmin edilen fonksiyonlar, doğrudan ölçülen metabolit bolluğu yerine çıkarılan mikrobiyal metabolik potansiyel olarak yorumlandı. Fonksiyonel tahmin analizi, gruplar arasında farklılık gösteren aday mikrobiyal yolların tanımlanmasını mümkün kılmıştır; bunlara karbonhidrat ve aminokislota metabolizmasıyla ilişkili yollar da dahildir.
Mendel rastgeleleştirme analizi
Genom çapında ilişki çalışması (GWAS) özeti bağırsak mikrobiyotası için kamuya açık veri setlerindenalınmıştır 10. Mikrobiyal taksonlar için genom genelinde anlamlı ilişki verileri, NHGRI-EBI GWAS Kataloğu'ndan (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) GCST90032172'den GCST90032644'e kadar değişen erişim sayılarıyla alındı. Ek metagenomik veriler, FINRISK 2002 kohortundan Avrupa Genom-Fenom Arşivi (Araştırma Kimliği: EGAS00001005020) aracılığıyla erişildi. Tip 2 diyabet hastalığı için GWAS özet istatistikleri NHGRI-EBI GWAS Kataloğundan da alınmıştır (erişim numarası: EBI-A-GCST006867). Mikrobiyal taksonlarla ilişkili genetik varyantlar, önceden tanımlanmış istatistiksel eşiklere göre arstüman değişkenleri olarak seçildi ve bağlantı dengesizliğindeki varyantlar hariç tutuldu. Maruz kalma ve sonuç veri setleri, tutarlı allel yönelimi sağlamak için uyumlandırıldı. Mendel randomizasyon analizi daha sonra birincil analitik yaklaşım olarak ters varyans ağırlıklı (IVW) yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Duyarlılık analizleri MR-Egger ve ağırlıklı medyan yöntemleri kullanılarak gerçekleştirildi. Alet gücü F-istatistikleriyle değerlendirilirken, enstrümantal değişkenler arasındaki heterojenlik Cochran'ın Q testi kullanılarak değerlendirildi. Yatay pleiotropi MR-Egger kesici testi kullanılarak incelendi. Bonferroni düzeltmesi birden fazla karşılaştırma için uygulanmıştır. Mendel randomizasyon bulguları, nedenselliğe dair kesin kanıt değil, genetik olarak tahmin edilen ilişkiler olarak yorumlandı.
Veri çıkışı ve uç nokta
Son analitik çıktılar arasında ASV bolluk tabloları, taksonomik bileşim grafikleri, alfa çeşitlilik metrikleri, beta çeşitlilik analizleri, farklı taksonomik sonuçlar, öngörülen fonksiyonel yol profilleri ve Mendel rastgeleleştirme tahminleri yer aldı. Dizileme veri setlerindeki tüm örnek tanımlayıcılar, ilgili kimliği yok edilmiş çalışma kodlarıyla tutarlılık sağlamak için doğrulandı. Ham dizileme dosyaları, işlenen ASV tabloları, istatistiksel çıktılar ve şekil kaynak dosyaları aşağı akış analizi ve veri yönetimi için arşivlendi. Yüksek kaliteli dizileme verileri, taksonomik profiller, çeşitlilik metrikleri, öngörülen fonksiyonel yol analizleri ve Mendel randomizasyon sonuçları başarıyla üretilip doğrulandıktan sonra protokol tamamlanmış sayıldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Başlangıçta taranan klinik kohortun başlangıç demografik ve klinik özellikleri Tablo 1'de sunulmaktadır. Daha sonra 12 yeni teşhis konmuş T2DM ve 12 NM katılımcısından oluşan temsilci bir alt grup, 16S rDNA dizileme ve sonraki mikrobiyom analizleri için seçildi.
Dizileme derinliği değerlendirmesi
Shannon indeksi hesaplandı ve dizileme derinliğini değerlendirmek için seyrekleşme eğrisi çizildi. Tüm ö...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Son yıllarda, insan mikrobiyomu, özellikle bağırsak mikrobiyotası, konak metabolizması, bağışıklık düzenlemesi ve hastalık gelişiminde karmaşık ve etkili bir faktör olarak ortaya çıkmıştır. Sağlıklı bir konakta, bağırsak mikrobiyotası bağışıklık homeostazına ve bağırsak bariyerininbütünlüğüne katkıda bulunur 11. Disbioz, metabolik bozukluklar, otoimmün hastalıklar ve maligniteler gibi çeşitli patolojik durumlarlailişkilendirilmiştir 12,13,1...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, araştırmanın potansiyel çıkar çatışması olarak değerlendirilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmadan yürütüldüğünü belirtmektedir.
YAZARLARIN KATKILARI:
Linrui Xie ve Kemiao Chen veri analizi yaptı ve el yazmasını taslak olarak yazdı. Xican Pan, örnek toplama ve deneysel işlemlere katıldı. Xuemei Zhong ve Xiaoyu Li çalışmayı tasarladılar, projeyi denetlediler ve el yazmasını eleştirel bir şekilde revize ettiler. Tüm yazarlar nihai makaleyi inceleyip onayladı.
Yazarlar, örnek toplama ve veri işleme alanında yer alan tüm katılımcılara ve personele bu çalışmaya katkıları için teşekkür etmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Bakteryal 16S bölgesi için evrensel primerler |
| 80 °C Dondurucu | Haier Biomedical | DW-86L626 | Uzun süreli numune depolama |
| Agaroz Jel Sistemi (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | PCR ürün doğrulaması |
| AMPure XP Manyetik Boncuklar | Beckman Coulter | A63880 | DNA saflaştırma ve boyut seçimi |
| Boncuklu Darbe Tüpleri (Lizing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Mikrobiyal hücrelerin mekanik lizinizi |
| Biyobilgisayar İş İstasyonu | Dell | Precision 7920 | QIIME2 ve R kullanarak veri analizi |
| DADA2 boru hattı | Bioconductor | Sürüm 1.28 | Sıralı denge ve ASV üretimi; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Sürüm 2023.5 | Sıralı denge ve hata düzeltme; https://docs.qiime2.org |
| Avrupa Genom-Fenom Arşivi | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Kamu metagenomik veri seti deposu; https://ega-archive.org |
| GWAS Kataloğu | NHGRI-EBI | Erişimler GCST90032172–GCST90032644 | Kamu genom çapında ilişkilendirme özet istatistikleri veritabanı; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sıralama Sistemi | Illumina | SY-410-1003 | Yüksek verimli sıralama platformu |
| KEGG veritabanı | Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi | Sürüm 107 | İşlevsel yol açıklaması veritabanı; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc veritabanı | SRI International | Sürüm 27.1 | Metabolik yol veritabanı; https://metacyc.org |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | 5424R | Numune hazırlama için soğutma santrifüjü |
| Nextera XT Kütüphane Hazırlık Kiti | Illumina | 20018705 | Sıralama için kütüphane hazırlığı |
| PCR Master Karışımı (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Yüksek sadakat PCR için |
| PCR Termosiklör | Bio-Rad | T100 | PCR amplifikasyonu aracı |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Geliştirme Ekibi | Sürüm 2.5.2 | 16S rDNA sıralama verilerinden işlevsel yol tahmini; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Hızlı DNA Stool Mini Kiti | QIAGEN | 51504 | Dışkı örneklerinden DNA ekstraksiyonu |
| QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti | QIAGEN | 28704 | Agaroz jelden DNA saflaştırma |
| Qubit Florometre | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | DNA kantitasyonu |
| R yazılımı | R İstatistiksel Hesaplama Vakfı | Sürüm 4.3.1 | İstatistiksel analiz ve Mendelian rastgeleleştirme analizi; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 veritabanı | SILVA ribozomal RNA veritabanı projesi | Sürüm 138 | Taksonomik açıklama için referans veritabanı; https://www.arb-silva.de |
| Dışkı Toplama Tüpü | Sarstedt | 76.9923.001 | Steril dışkı örnekleme toplama tüpü |
| Dışkı DNA Kiti | Omega | D4015-02 | DNA ekstraksiyon kiti |
| TwoSampleMR paketi | MR-Base | Sürüm 0.5.7 | R'de Mendelian rastgeleleştirme analizi; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |