Transkriptomik Analiz, Atopik Dermatit Lezyonlarında Mitokondriyal Yönlendirilen Alt Grupları Ortaya Çıkarıyor

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

Transkriptomik Analiz, Atopik Dermatit Lezyonlarında Mitokondriyal Yönlendirilen Alt Grupları Ortaya Çıkarıyor

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopik dermatit (AD), önemli moleküler heterojenliğe sahip kronik bir inflamatuar cilt hastalığıdır. Bu çalışma, farklı mitokondriyal gen ekspresyonu ve bağışıklık sızması tarafından yönlendirilen iki transkriptomik olarak farklı AD alt grubunu tanımlıyor ve hasta tabakalaşması için potansiyel biyobelirteç olarak dört merkez gen ortaya koymaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopik dermatit (AD), yaygın ve kronik bir inflamatuar cilt hastalığıdır ve küresel olarak yaygındır. Klinik heterojenliği ve karmaşık moleküler mekanizmaları, etkili tedavilerin geliştirilmesi için önemli zorluklar yaratmaktadır. AD moleküler heterojenliğini lezyon deri transkriptomik verileriyle incelemek, biyolojik ve bağışıklık profillerini karakterize etmek ve farklılaşmanın altında yatan temel genleri belirlemek. Farklı şekilde eksprese edilen genler DESeq2 kullanılarak tanımlandı, ardından sırasıyla GSEA ve WGCNA ile yol ve ortak ifade analizleri yapıldı. Mitokondriyal ile ilgili genler, MitoCarta3.0 veritabanı ile kesişen DEG'ler ve WGCNA modülleriyle çıkarıldı ve fonksiyonel önemleri GO ve KEGG zenginleştirme yoluyla değerlendirildi. Hub genleri, protein-protein etkileşim ağı analiziyle tanımlandı ve bu genler daha sonra bir sınıflandırma modeli oluşturmak için kullanıldı. Transkripsiyonel düzenleyiciler hTFtarget kullanılarak tahmin edilirken, bağışıklık hücresi infiltrasyonu CIBERSORT ile nicelendirildi. İki moleküler alt grup tanımlandı. Küme 1 hücre sinyal ve yapışma yolları açısından zenginleştirilirken, Küme 2 oksidatif fosforilasyon ve proteazom ile ilgili süreçlerin yukarı regulasyonunu sergiledi. Enerji metabolizmasında esas olarak yer alan toplam 85 mitokondriyal ilişkili gen, kümeler arasında farklı şekilde ifade edildi. PPI ağ analizi, Küme 1'de önemli ölçüde yukarı regülasyona sahip dört hub geni (BAD, BOLA1, CHCHD5 ve ISOC2) tespit etti. Bir hub gen tabanlı sınıflandırıcı güçlü ayırt edici güç gösterdi (eğri altı alan > 0.7). Tahmin edilen ana transkripsiyonel düzenleyiciler arasında ATF3, BRD2, BRD4 ve CEBPA bulunuyordu. Bağışıklık profilleme, Küme 1'de daha yüksek düzenleyici T hücre infiltrasyonu ve Küme 2'de folliküler yardımcı T hücrelerinin arttığını ortaya koydu. Bu çalışma, farklı mitokondriyal fonksiyon ve bağışıklık mikroçevre imzalarıyla karakterize edilen iki moleküler ve immünolojik olarak farklı AD alt tipini ortaya koymaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopik dermatit (AD), çocukların %20'sine ve yetişkinlerin %10'una kadar etkileyen yaygın ve kronik bir inflamatuar cilt^{hastalığıdır 1}. Şiddetli kaşıntı ve tekrarlayan egzama lezyonlarla^{karakterize edilir 2}. Klinik olarak, AD polijenik yatkınlık (örneğin, FLG fonksiyon kaybı mutasyonları), bağışıklık düzensizliği ve düşük nem ile mikrobiyal disbiyoz gibi çevresel maruziyetlerin dinamik bir etkileşiminden^{kaynaklanır.} AD, sedef hastalığıyla bazı patofizyolojik özellikleri paylaşsa da, klinik sunumları birbirini dışlar; ortak yollarda farklı genetik etkiler ve belirgin bağışıklık değişiklikleri^{vardır 4}.

AD, farklı hasta grupları ve hastalık semptomları arasında çeşitli transkriptom profilleriyle karakterize edilen heterojen bir^{hastalıktır 5}. Cilt dokuları ve periferik kan mononükleer hücrelerinin entegre analizleri, eritem ve papulasyon gibi klinik özelliklerin, yerel cilt ile sistemik bağışıklık yanıtları arasındaki etkileşimi yansıtan belirgin immünolojik imzonlarla ilişkili olduğunu^{göstermiştir 6}. Büyük ölçekli transkriptomik çalışmalar, IL-13 yollarının AD patogenezindeki rolünü daha da vurgularken, AD sedef hastalığına göre daha fazla moleküler heterojenlik gösterir; gen ifade desenlerinde hastalık şiddeti, başlangıç yaşı ve genetik arka plan ile bağlantılı^{varyasyonlar vardır} ^5,7. Bu farklılıklar, AD patogenezinin karmaşıklığını ve araştırma ile tedavide kişiselleştirilmiş yaklaşımlara olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Mitokondriyal proteinler, düzensiz oksidatif stres ve metabolik yollar aracılığıyla AD patogenezinde önemli bir rol oynar. Çalışmalar, nonlezyonel AD keratinositlerinde mitokondriyal kompleks I ve II aktivitesinin arttığını ortaya koymuştur; bu da uzun zincirli yağ asitlerinin aşırı oksidlenmesine ve ROS üretiminin artmasına neden olur; bu da epidermal bariyer disfonksiyonunu^artırır ^8,9. Eşzamanlı olarak, proteomik analizler AD epidermisinde azalmış NRF2-antioksidan yol proteinlerini ve mitokondriyal bileşenleri tespit eder ve oksidatif stres çözünürlüğünü^{azaltır 10}. Mitokondriyal DNA hasarı inflamatuar yanıtlara daha fazla katkıda bulunurken, mitokondriyal hedefli antioksidanlar kullanımı gibi müdahaleler ROS ^11,12'yi hafifleterek epidermal homeostazı geri kazanmada etkili olduğunu göstermektedir. Bu bulgular, mitokondriyal proteinlerin hem AD patolojisinin itici güçleri hem de potansiyel terapötik hedefler olduğunu vurgulamaktadır.

AD'nin son transkriptom analizleri, genetik mimarisi ve moleküler heterojenliği anlayışını önemli ölçüde ilerletmiştir. AD'nin ilk RNA dizileme profili, TREM-1 yolunda ve IL-36 sitokin^13'te artan ekspresyonu ortaya koymuştur. Gen ifade profiline dayalı ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi, HSPA4, LCE3E ve LCE3D gibi inflamatuar yanıtları ve keratinizasyonu organize eden farklı moleküler modüller ve merkez genler ortaya koymuştur ve potansiyel terapötik hedefleri^{ortaya koymaktadır 14}. Bu çalışmalar, hastalık tahminini geliştirmede ve AD'nin karmaşık temellerini ortaya çıkarmada çoklu doku transkriptomik ve polijenik risk modellemenin değerini vurgulamaktadır. Ancak mevcut çalışmalar, mitokondriyal genlerin moleküler alt grupları tanımlamadaki rolüne özel olarak odaklanmadan genel AD transkriptomiğine odaklanmıştır. Mevcut çalışma, önceki transkriptomik analizlerin ötesine geçerek, birden fazla GEO veri setini entegre ederek konsensus kümelenmesine dayalı AD alt gruplarını belirlemiş ve sistematik olarak farklı şekilde ifade edilen genleri, WGCNA modüllerini ve küratör mitokondriyal gen kataloğunu kesiştirerek alt grup kimliğini tanımlayan ve yeni biyobelirteç olarak hizmet verebilecek merkez mitokondriyal genleri tespit etmektedir.

Lezyonal AD derisin, farklı mitokondriyal gen ekspresyonlarıyla karakterize edilen moleküler olarak farklı transkriptomik alt gruplara sahip olduğu hipoteziyle ki, bu da AD'nin klinik heterojenliğini destekleyebilir. Bunu test etmek için, bu çalışma yayımlanmış çalışmalardan RNA dizileme verilerini entegre etti ve 266 AD hastasından lezyon deri örneklerinin gen ekspresyonu verilerini topladı. Moleküler alt gruplar, gen ifadesinin konsensus kümelenmesine dayanarak belirlendi ve gen ifadesi iki moleküler alt grup arasında karşılaştırıldı. Bu farkı tetikleyen genler, hücre sinyalizasyonu ve oksidatif fosforilasyonda işlevsel zenginleşme gösterir. Ayrıca, iki moleküler grubu ayıran mitokondriyal genler incelendi ve protein-protein etkileşim ağı içinde ana merkez genleri tanımlandı. Bu bulgular, AD hastalığının genetik heterojenliğini vurgulamakta ve mitokondriyal proteinlerin AD patolojisindeki rollerine dair bilgiyi genişletmektedir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Gen İfadesi Omnibus (GEO) veritabanından kamuya açık gen ifade veri setlerini kullandı. Hasta tarafından tanımlanabilir verilere erişim sağlanmadı ve yeni hasta örnekleri toplanmadı. Bu nedenle, kamuya açık verilerin bu ikincil analizi için kurumsal inceleme kurulu (IRB) onayı veya hasta onayı gerekmemiştir. Kullanılan yazılım ve veritabanları Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1 Veri ve kaynaklar

Atopik dermatit (AD) hastalarının transkriptom verileri GEO veritabanından alındı ve dört çalışma dahil olmak üzere dört çalışma yapıldı: GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ ve GSE277961 (N = 43)¹⁷. Tüm veri setleri, lezyon cilt biyopsilerinden alınan ham veya önceden normalize edilmiş sayım verilerini içeriyordu. Ham sayım matrisleri çalışmalar arasında indirildi ve entegre edildi. Çapraz çalışma parti etkileri, ComBat-seq yöntemi (sva R paketi, v3.44.0) kullanılarak düzeltildi ve dört GEO veri seti boyunca ifade profilleri uyumlaştırıldı, sonraki analizden önce. Dört veri setinin tamamı, insan derisi biyopsisi örneklerinde yapılan RNA-seq'ye dayanıyor ve çalışmaya özgü boru hatları kullanılarak insan referans genomu GRCh38 ile hizalanmıştır. Gen düzeyinde ifade nicelleştirmesi, Ensembl gen annotasyonu (v105) kullanılarak gerçekleştirildi.

2 Konsensus kümelenmesi

Gözetimsiz konsensus kümelenmesi, ConsensusClusterPlus R paketi (v1.64.0)¹⁸ kullanılarak transkriptomik profillere göre AD hastalarından alınan 266 lezyyonel deri örneğini katmanlaştırdı. Kümelenmeden önce, tüm çalışmalardan alınan ham sayı verileri birleştirildi ve çapraz çalışma parti etkileri limma paketinden removeBatchEffect fonksiyonu kullanılarak düzeltildi. Gen ifade verileri daha sonra DESeq2 kullanılarak varyans stabilizasyonlu dönüştürüldü (VST) ve en değişken 5.000 genin korunması için filtrelendi. Kümeleme, Pearson korelasyonu ve ortalama bağlantı ile hiyerarşik kümeleme kullanılarak gerçekleştirildi; her yinelemede %80 örneklem alt örneklemi yapıldı. En iyi küme sayısı (k 2 ile 10 arasında değişir) konsensus kümülatif dağılım fonksiyonu (CDF), delta alan grafikleri ve küme-konsensus puanları değerlendirilerek belirlendi. Ortaya çıkan kümeler, konsensus ısı haritaları ve PCA kullanılarak doğrulandı ve sonraki biyolojik ve klinik analizlerde kullanıldı.

3 Diferansiyel gen ifade analizi

Gen ifade seviyeleri, DESeq2 R paketi (v1.46.0)¹⁹ kullanılarak moleküler alt gruplar arasında karşılaştırıldı. Ham sayım verileri, gen bazında dağılımı tahmin etmek ve negatif binom modeline uymak için girildi. Farklı şekilde eksprese edilen genler (DEG) Wald testi kullanılarak tanımlandı ve sonuçlar ayarlanmış p-değeri 0.01 ve mutlak log2 kat değişimi < 1 > anlamlılık eşiği kullanılarak filtrelendi.

4 Gen seti zenginleştirme analizi

Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA), clusterProfiler R paketi (v4.12.6)²⁰ kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm genler, diferansiyel ifade analizinden elde edilen log2 katlama değişimlerine göre sıralandı ve GSEA fonksiyonu eps = 0, minGSSize = 10 ve maxGSSize = 500 parametreleriyle uygulandı, diğer ayarlar ise varsayılan olarak tutuldu. Zenginleştirme işlemi MSigDB Hallmark gen setlerine karşı gerçekleştirildi. Her moleküler küme için (Küme 1 ve Küme 2), nominal p-değeri ve normalleştirilmiş zenginleştirme puanı (NES) temelinde en iyi üç zenginleştirilmiş yol seçildi. Sonuçlar GseaVis R paketi (v0.1.0)²¹ kullanılarak görselleştirildi.

5 Ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi

WGCNA, AD hastalarının gen ifade profilinde R paketi WGCNA (v1.73)²² kullanılarak transkriptomik alt tip kimliğiyle ilişkili gen ortak ekspresyon modüllerini belirlemek için gerçekleştirildi. Genler, tüm örneklerde en yüksek varyansı olan en üst %75'i korumak için filtrelendi. Yaklaşık ölçeksiz topolojiye yaklaşmak için 1'den 30'a kadar seçilen yumuşak eşik güç kullanılarak işaretli bir ortak ifade ağı oluşturuldu. Gen modülleri, hiyerarşik kümeleme ve dinamik ağaç kesimiyle tanımlandı. Modül-özellik ilişkileri, birlikte eksprese edilen modül özgenleri moleküler alt tip etiketleriyle ilişkilendirilerek incelendi ve moleküler alt tiple anlamlı korelasyon gösteren modüller (p < 0.05) moleküler alt tip için seçildi.

6 AD moleküler alt gruplarındaki mitokondriyal proteinler

DEG'ler ve WGCNA modüllerindeki mitokondriyal ilişkili genleri tanımlamak için, bu gen setleri MitoCarta3.0^23'ten seçilmiş mitokondriyal protein listesiyle örtüştü. Kesişen genler, AD hastalığı bağlamında muhtemel mitokondriyal proteinler olarak kabul edildi.

7 Gen ontolojisi ve KEGG zenginleştirme analizi

Moleküler alt grupları ayırt eden ana hücre fonksiyonlarını ve biyolojik süreçleri belirlemek. ClusterProfiler kullanılarak mitokondriyal ilişkili genler için GO ve KEGG zenginleştirme analizleri yapıldı. GO zenginleştirmesi, Biyolojik Süreç (BP), Hücresel Bileşen (CC) ve Moleküler Fonksiyon (MF) kategorileri için ayrı ayrı olarak enrichGO fonksiyonu kullanılarak OrgDb = "org" ile gerçekleştirildi. Hs.eg.db", ont = "ALL" ve varsayılan parametreler. KEGG yol zenginleştirmesi, organizma "has" olarak ayarlanmış şekilde zenginleştirilmiş KEGG fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Düzeltilmiş p-değeri 0,05 < zenginleştirilmiş terimler önemli olarak kabul edildi.

8 Protein-protein etkileşim ağları

85 DEG'lik ve AD ile ilişkili modül örtüşme mitokondriyal genler, bilinen ve tahmin edilen PPI'ları almak için STRING veritabanında (https://string-db.org)²⁴ sorgulandı. Ağ topolojisi analizi, her proteinin düğüm önemini sıralamak için yedi ölçüm (Derece, Yakınlık, Aralık, Özvektör, Sayfa Sıralaması, Hub ve Otoriteler) kullanılarak gerçekleştirildi. Her ölçümün en üst 30 genleri seçildi ve yedi yaklaşımın kesişimleri UpSet grafiğiyle görselleştirildi. Ölçümlerden alınan 4 kesişen gen, gen ifade seviyelerine göre bir sınıflandırma modeli oluşturmak için kullanıldı. Sınıflandırma performansını değerlendirmek için model doğruluğu, hassasiyeti, özgüllüğü ve ROC eğrisi (AUC) altındaki alan hesaplandı.

9 Transkripsiyonel düzenleme analizi

hTFtarget veritabanı (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ , dört kesişen hub geni için deneysel destekli TF-hedef etkileşimlerini almak üzere sorgulandı. Ortaya çıkan TF-gen düzenleyici ağı, igraph²⁶ ve ggraph²⁷ R paketleri kullanılarak oluşturulmuş ve görselleştirilmiştir.

10 Toplu RNA-seq bağışıklık hücre infiltrasyon analizi

CIBERSORT²⁸ algoritması (https://cibersort.stanford.edu/), lezyon deri transkriptom verilerindeki 22 bağışıklık hücre tipinin göreceli oranlarını tahmin etmek için kullanıldı. Normalize edilmiş gen ifade verileri, LM22 imza matrisi ile birlikte CIBERSORT'a (v0.1.0) girildi. Analiz, 1.000 permütasyon ve kuantil normalizasyonu kapatılmış şekilde yapıldı. CIBERSORT çıktısı p-değerleri < 0.05 olan örnekler aşağı akış analizi için değerlendirildi. Tahmini bağışıklık hücre fraksiyonları, 22 bağışıklık hücre tipi arasında çoklu karşılaştırmalar için Wilcoxon rank-sum testi ile FDR düzeltmesi kullanılarak moleküler alt gruplar arasında karşılaştırıldı (p.adjust.method = "FDR") ve sonuçlar ggplot2²⁹ R paketi kullanılarak kutu grafikleriyle görselleştirildi.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopik dermatitte transkripsiyonel alt gruplar

266 AD hasta örneğinden alınan RNA-dizisi verileri, hastalık içindeki transkripsiyonel heterojenliği araştırmak için analiz edildi. Birden fazla çalışmada kalite kontrolü ve toplu etkilerin düzeltildiği zaman, denetimsiz konsensus kümelenmesi iki farklı moleküler alt grup ortaya çıkardı (Şekil 1A). Küme kararlılığı ve optimal küme sayısı, kümelenmiş dağılım fonksiyonu (CDF) grafiki (Şekil 1B), delta alan grafiki (Şekil 1C) ve konsensus matris ısı haritası (Şekil 1D) kullanılarak değerlendirildi. Bu sonuçlar birlikte, AD'de iki sağlam transkripsiyonel alt tipin varlığını desteklemekte olan ve altta yatan genetik heterojenliği yansıtmaktadır.

AD alt grupları arasında farklı şekilde ifade edilen genler

Normalleştirilmiş gen ekspresyon matrisine dayalı t-SNE grafiki, konsensus kümeleme ile tanımlanan transkripsiyonel alt grupları daha da doğruladı. t-SNE grafigi, AD hastaları arasında farklı moleküler profillerin varlığını destekleyen önceden tanımlanmış alt gruplardan birine karşılık gelen iki iyi ayrılmış küme ortaya koymuştur (Şekil 2A). İki alt grup arasındaki diferansiyel ifade daha sonra DESeq2 kullanılarak analiz edildi; ayarlanmış p < 0.01 eşiği ve |log₂ katlama değişimi| > 1. Ortaya çıkan volkan grafiki (Şekil 2B) farklı şekilde eksprese edilen genleri (DEG) göstererek güçlü transkripsiyonel ayrışmayı göstermektedir. Küme 1'de en çok yukarı düzenlenen 10 gen, küme 1'de ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN ve AHNAK, C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D ve PMPCA kümesinde yer alır (Şekil 2C).

AD alt grubuna bağlı gen seti

Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA), iki transkriptomik küme arasında belirgin fonksiyonel zenginleştirme profillerini ortaya koydu (Şekil 3A). Küme 1, hücre sinyalizasyonu ve yapışma yollarında önemli zenginleşme gösterdi; bunlara odak yapışma (Şekil 3B) ve MAPK sinyal yolu (Şekil 3C) dahil, hücre-hücre-ekstrasellüler matris etkileşimleri ve proliferasyonla karakterize edilen aktif bir durum olduğunu gösterdi. Buna karşılık, Küme 2 oksidatif fosforilasyon (Şekil 3D) ve proteasom fonksiyonu (Şekil 3E) için güçlü zenginleşme göstermiştir; bu da aktif oksidatif ve proteolitik metabolik fenotipi önermektedir.

AD moleküler gruplarında birlikte ekspresyona çıkan genler

Transkriptomik alt tiplerle ilişkili ortak ifade modüllerini belirlemek için, veri ön işlemeden sonra WGCNA gerçekleştirilmiştir. Dışsal örnekler, aşağı akış ağ inşaatının sağlamlığını sağlamak için örnek mesafelerinin hiyerarşik kümelenmesine dayanarak önce tanımlandı ve çıkarıldı (Şekil 4A). Daha sonra ölçeksiz topoloji kriteriyle yumuşak eşik güç seçildi ve ölçeksiz R² > 0.85 elde etmek için 6 kuvveti seçildi (Şekil 4B). Gen modülleri, hiyerarşik kümeleme ve dinamik ağaç kesim yoluyla tanımlandı, ardından yakın ilişkili modülleri birleştirmek için özgen kümelenmesi yapıldı (Şekil 4C ve Şekil 4D). Ortaya çıkan gen ağı, topolojik örtüşme haritası kullanılarak görselleştirilmiş ve belirgin gen ortak ifade desenlerinin varlığını doğrulamıştır (Şekil 4E). Modül-özellik ilişkisi analizi, MEyellow modülü (N_gen = 743) ile moleküler alt grup arasında güçlü ve anlamlı bir korelasyon ortaya koydu (Şekil 4F).

AD alt grubuyla ilişkili mitokondriyal genlerin fonksiyonel zenginlenmesi

Daha sonra GO ve KEGG zenginleştirme analizi, DEG'ler arasında kesişen genler (N = 85), MEyellow modülündeki genler ve MitoCarta3.0'dan mitokondriyal protein listesi (Şekil 5A) üzerinde mitokondriyal ilişkili genlerin kümeler arasındaki transkripsiyonel farklılıkları tetikleyen fonksiyonel rolleri araştırıldı. KEGG yol analizi, oksidatif fosforilasyon ve metabolik yollarda zenginleşmeyi tespit etti (Şekil 5B). GO zenginleştirme analizi, mitokondriyal fonksiyonla ilişkili terimlerin önemli ölçüde aşırı temsilini ortaya koydu; bunlar arasında proton motivasyonuna dayalı mitokondriyal ATP sentezi, solunum zinciri kompleksi ve NADH dehidrojenaz aktivitesi (Şekil 5C), bu genlerin esas olarak mitokondriyal enerji metabolizması ve enerji düzenlemesiyle ilişkili olduğunu göstermektedir.

AD moleküler farklılaşmasında merkez mitokondriyal genler

85 mitokondriyal transkriptom-alt grup ilişkili gendeki anahtar genleri belirlemek için bir PPI ağı oluşturuldu (Şekil 6A). Yedi topolojik ölçütün her birindeki sıralamaya dayanarak (Bkz. yöntemler), en iyi 30 gen seçildi ve kesişimleri UpSet grafikinde analiz edilip görselleştirildi (Şekil 6B). Bu analiz, tüm sıralama kriterlerine (BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2) göre dört merkez geninin sürekli olarak merkezi düğüm olarak tanımlanmasını sağladı. İfade profilleri iki transkriptomik küme boyunca incelendi ve dört merkez geninin tamamının Küme 1'de Küme 2'ye kıyasla anlamlı şekilde yukarı regülasyonlu olduğu bulundu (Şekil 6C). İkili gen ifade korelasyon analizi, dört gen arasında pozitif korelasyonlar göstererek koordineli düzenlemeyi gösterir; CHCHD5 ve ISOC2 en güçlü korelasyonu göstermiştir (Şekil 6D). Ayrıca, bu dört genin ifadesini kullanarak oluşturduğumuz bir sınıflandırma modeli, iki küme arasında sağlam ayırt edici güç gösterdi ve ROC eğrisi eğrinin altında (AUC) 0.7 > bir alan gösterdi (Şekil 6E). Ayrıca, tanımlanan dört hub geninin ekspresyonunu yöneten düzenleyici mekanizmaları incelemek için transkripsiyon faktörü (TF) düzenleyici ağ analizi yapıldı. Bu hub genlerini potansiyel olarak düzenleyen tüm bilinen ve tahmin edilen transkripsiyon faktörleri hTFtarget'tan sorgulandı ve sonuçlar transkripsiyonel düzenleyici ağ olarak entegre edilip görselleştirildi (Şekil 7). TF-hub gen düzenleyici ağında BAD en fazla TF sayısına sahipti ve ATF3, BRD2, BRD4 ve CEBPA , dört hub geniyle etkileşime girerek ortak bir düzenleyici mekanizma olduğunu düşündürüyor.

AD alt grupları arasında bağışıklık hücresi infiltrasyonunun karşılaştırılması

Transkriptomik alt gruplarla ilişkili immünolojik ortamı incelemek için, toplu transkriptom verilerine dayanarak 22 bağışıklık hücre tipinin göreceli oranlarını tahmin eden CIBERSORT kullanılarak bağışıklık hücresi infiltrasyon analizi yapılmıştır (Şekil 8). Bağışıklık alt kümeleri arasında, düzenleyici T hücreleri (Tregs) Küme 1'de anlamlı derecede daha bol bulunmuştur; bu da bu grupta mitokondriyal aktivite ve sinyal yollarının yukarı regulasyonla ilişkili olabilecek immünosupresif mikro ortamın olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, foliküler yardımcı T hücreleri Küme 2'de önemli ölçüde zenginleşmişti; bu da bu alt grupta potansiyel olarak daha aktif adaptif bağışıklık yanıtını göstermektedir.

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

Bu çalışmada analiz edilen transkriptomik veriler, Gen İfadesi Omnibus (GEO) deposunda erişim numaraları GSE121212, GSE157194, GSE193309 ve GSE277961 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) altında kamuya açık olarak mevcuttur.

figure-results-1
Şekil 1: Transkriptomik profillere dayalı atopik dermatit lezyon örneklerinin konsensus kümelenmesi. (A) Atopik dermatit (AD) örnekleri arasında konsensus matrisinin ısı haritası ve hiyerarşik kümelenmesi. (B) Optimal küme sayısını belirlemek için kullanılan konsensus kümülatif dağılım fonksiyonu (CDF) grafiki (k = 2–10). (C) Her k için CDF eğrisi altındaki alandaki göreceli değişimi gösteren delta alan grafiki. (D) k = 2 için konsensus kümesi ataması. Her sütun bireysel bir örneği temsil eder ve renkler küme üyeliğini gösterir (Küme 1, kırmızı; Küme 2, teal). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Atopik dermatit moleküler alt tiplerinin diferansiyel gen ekspresyonu. (A) AD örneklerinin t-dağıtılmış stokastik komşu gömülmesi (t-SNE) grafiki. Her nokta, iki boyuta yansıtılmış bir örneği temsil eder ve küme atamasına göre renklendirilir. (B) Küme 1 ile Küme 2 arasındaki farklı ekspresyon genlerin (DEG) volkan grafiki. Her nokta, log2 katlama değişimi (x ekseni) ve −log10 ayarlanmış p-değeri (y ekseni) ile çizilen bir geni temsil eder. Kırmızı ve mavi noktalar, sırasıyla Küme 1 ve Küme 2'deki genlerin önemli ölçüde yukarı düzenlenmiş olduğunu gösterirken, gri noktalar anlamsız genleri gösterir. (C) Küme 1 ve Küme 2'deki en yüksek ekspresyonlu 10 genin ısı haritası. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Atopik dermatit moleküler alt tiplerinin gen seti zenginleştirme analizi. (A) Küme 1 ile Küme 2 arasında GSEA sonuçlarını gösteren iki taraflı çubuk grafik, üstteki yollar önemli ölçüde zenginleştirilmiştir. Küme 1'de zenginleşmiş yollar sağda, Küme 2'de zenginleşenler solda gösterilmiştir. (B–E) Odak yapışma, MAPK sinyal yolu, oksidatif fosforilasyon ve proteasom yolları için temsil zenginleştirme grafikleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Atopik dermatit örneklerinin ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi. (A) Gen ifade profillerine dayalı dendrogramı örnekleme. (B) Ölçeksiz topoloji uyum indeksi ve yumuşak eşik kuvvetler arasında ortalama bağlantı (1–30). (C) Modül özgenlerinin kümelenmesi ve ısı haritası, renkler çiftli korelasyonları gösterir. (D) Birlikte ekspreslenen modüllerde gruplanmış genleri gösteren hiyerarşik kümeleme dendrogramı. (E) Gen çiftleri arasındaki ortak ifade benzerliğini temsil eden topolojik örtüşme matrisinin (TOM) ısı haritası. (F) Modül özgenleri ile klinik özellikler arasındaki korelasyonları gösteren modül–özellik ilişkilerinin ısı haritası. Her hücre içinde korelasyon katsayıları gösterilir ve renk yoğunluğu korelasyonun gücünü ve yönünü gösterir (kırmızı, pozitif; mavi, negatif). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Alt tiple ilişkili mitokondriyal genlerin gen ontolojisi ve KEGG yolu zenginlenmesi. (A) DEG'ler, alt tiple ilişkili modül genleri ve mitokondriyal genler arasında örtüşmeyi gösteren Venn diyagramı. (B) Kesişen genlerin en zenginleştirilmiş 20 KEGG yolunun baloncuk grafiki. (C) Biyolojik Süreç (BP), Hücresel Bileşen (CC) ve Moleküler Fonksiyon (MF) için en zengin 10 Gen Ontolojisi (GO) terimi. Tüm zenginleştirme analizleri, anlamlılık eşiği olarak 0.05 (yanlış keşif oranı) < ayarlanmış p-değeri kullanılarak gerçekleştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Protein-protein etkileşim analizi ve hub genlerinin tanımlanması. (A) 85 kesişen genden oluşan protein-protein etkileşimi (PPI) ağı. Düğümler proteinleri, kenarlar ise STRING veritabanından tahmin edilen veya deneysel olarak doğrulanmış etkileşimleri gösterir. (B) Yedi ağ merkezilik ölçümüne dayalı olarak en iyi 30 sıralanmış gen arasında kesişimleri gösteren UpSet grafiki. (C) Küme 1 ve Küme 2'deki dört merkez genin ifade seviyelerini gösteren kutu grafikleri. (D) Dört hub gen arasında çiftli korelasyon analizi. (E) Alıcı çalışma karakteristikası (ROC) eğrisi, sınıflandırma performansını gösterir ve hassasiyet özgüllüğe karşı çizilir. Eğrinin altındaki alan (AUC) genel doğruluğu gösterir. (C) panelindeki istatistiksel anlamlılık Wilcoxon sıralama toplamı testi kullanılarak değerlendirildi (*p < 0.05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Merkez genlerin düzenleyici ağı. Kırmızı daireler hub genlerini, mavi daireler ise ilişkili transkripsiyon faktörlerini (TF'leri) temsil eder. Kenarlar düzenleyici etkileşimleri gösterir. Her hub gen düğümünün boyutu, etkileşimde bulunan TF sayısını yansıtır. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Atopik dermatit alt grupları arasında bağışıklık hücresi infiltrasyonunun karşılaştırılması. Her kümedeki 22 bağışıklık hücre tipinin tahmini oranlarını gösteren kutu grafikleri (Küme 1, kırmızı; Küme 2, teal). Yıldızlar (*), birden fazla karşılaştırma için yanlış keşif oranı düzeltmesi ile Wilcoxon sıralama toplamı testi kullanılarak değerlendirilen istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atopik dermatit, yaygın ve genetik olarak heterojen bir inflamatuar cilt hastalığıdır ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri için önemli zorluklar yaratır. Bu çalışma, AD hastalarının 266 lezyon cilt örneğinde iki farklı transkripsiyonel alt grup belirleyerek AD'nin moleküler heterojenliğine dair içgörüler sunmaktadır. Bu alt gruplar farklı biyolojik fonksiyon zenginleştirmesi ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu sergiler; Küme 1 aktif hücre sinyal ve yapışma yolları ile düzenleyici T hücrelerinin (Tregs) zenginleşmesi ile karakterize edilirken, Küme 2 oksidatif fosforilasyon ve proteasom fonksiyonunun artması ile foliküler yardımcı T hücrelerinde artışla tanımlanır. Önemli olarak, Küme 1'de yukarı regülasyona sahip dört mitokondriyal ilişkili gen (BAD, BOLA1, CHCHD5 ve ISOC2) tespit edilmiştir. Bunlar, iki transkriptomik alt tipi tanımlayan ve ATF3, BRD2, BRD4 ve CEBPA dahil transkripsiyon faktörleri tarafından aynı anda düzenlenebilen 85 genden oluşan PPI ağındaki merkez genlerdir.

İki farklı küme, gen ifade desenine göre tanımlanmıştır; bu da AD'nin önemli gen ifadesi heterojenliği sergilediğini gösterir. Önceki çalışmalar, bu heterojenliğin, farklı moleküler endotipleri tanımlayan genetik, epigenetik ve bağışıklık aracılı^{mekanizmalar tarafından yönlendirilebileceğini göstermiştir} ^5,30,31. İki küme arasında, farklı bağışıklık hücresi infiltrasyonu da gözlemlendi; küme 1 düzenleyici T hücreleriyle karakterize edildi ve küme 2 foliküler yardımcı T (Tfh) hücreleriyle zenginleştirildi; bu da AD kohortunda altta yatan immünolojik heterojenlik ve potansiyel olarak farklı hastalık mekanizmalarını ima ediyordu. Treg ağırlıklı bir küme, düzenleyici mekanizmaların belirgin olduğu bir bağışıklık ortamını önerir; bu da muhtemelen iltihabı kontrol etme girişimlerini veya kronik bağışıklık aktivasyonuna karşı telafi edici bir yanıtı^{yansıtır 32,33}. Ancak AD'de, artan sayılara rağmen Treg fonksiyonu bozulabilir ve bu da iltihabı etkili şekilde bastırmayabilir. Buna karşılık, Tfh ile zenginleştirilmiş bir küme, alerjik yanıtların ve AD ^34,35'in daha şiddetli veya dışsal formlarının ayırt edici işaretleri olan B hücresi yardımının artmasına, germinal merkez aktivitesinin artmasına ve muhtemelen yüksek IgE üretimine işaret eder. Tfh hücrelerinin B hücresi farklılaşmasını ve antikor sınıf değişimini desteklediği bilinir ve genişlemeleri hastalık aktivitesi ve alerjik^{duyarlılık ile ilişkilidir 36}. Bu farklı grupların varlığı, farklı klinik fenotipleri, hastalık şiddetlerini veya tedaviye yanıtları yansıtabilir ve AD araştırma ve tedavisinde kişiselleştirilmiş yaklaşımların önemini vurgular.

Mitokondriyal disfonksiyonun, epidermal bariyerin³⁷ korunması, reaktif oksijen türü³⁸ üretimi ve bağışıklık hücresi yanıtının düzenlenmesi gibi mekanizmalar aracılığıyla AD'nin patogenezinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir^. Transkriptomik farklılaşmayla ilişkili genlerin merkezi düğümleri olarak dört mitokondriyal protein tanımlanmıştır; bu düğümler moleküler alt tipi yüksek doğrulukla (AUC>0.7) tahmin edebilir. Daha önce bu genlerin AD ile doğrudan bağlantısını göstermemiş olsa da, bu sonuçlar AD hastalarında mitokondriyal disfonksiyonun değerlendirilmesi ve sınıflandırılması için potansiyel biyobelirteçler olduğunu göstermektedir. BAD (hücre ölümünün BCL2 ile ilişkili agonisti), mitokondriyal apoptotik sinyal iletiminde rol alan BCL-2 ailesinin pro-apoptotik bir üyesidir; Küme 1'deki yukarı regülasyonu, bu alt tipte artan mitokondriyal apoptotik priming'i yansıtabilir. BOLA1 , demir-kükürt kümesi biyogenezi ve oksidatif stres düzenlemesinde rol alan mitokondriyal bir proteindir. CHCHD5 (sarmal-sarmal alanı 5 içerir), krista organizasyonu ve elektron taşıma zinciri verimliliğiyle ilişkili mitokondriyal iç zar proteinidir. ISOC2 (2 içeren izokorismataz alanı) metabolik süreçler ve mitokondriyal fonksiyonla ilişkilendirilmiştir. Küme 1'deki bu dört genin koordineli yukarı regülasyonu, bu AD alt grubunda mitokondriyal metabolik aktivite ve apoptotik sinyalizasyonun arttığını göstermektedir.

Bu çalışmanın birkaç sınırlaması vardır. Bu çalışma, mitokondriyal genlerde farklı gen ekspresyonuna sahip iki moleküler alt grup ve ayrı bağışıklık hücresi infiltrasyonu tespit etmiş olsa da, tabakalaşmayı hastalık şiddeti ve uzunlamasına tedavi yanıtlarıyla ilişkilendirmemizi sağlayacak ayrıntılı klinik fenotip verilerine sahip değiliz. Küme 1'deki bu dört hub geninin yüksek ekspresyonu ne anlama geldiğini tam olarak anlamak için, gelecekteki çalışmalar kapsamlı klinik meta verileri entegre etmeli ve ideal olarak keratinosit veya fare modellerinde fonksiyonel doğrulama yapmalıdır. Ayrıca, bu çalışma kamuya açık toplu RNA-dizisi verilerine dayanmaktadır; Büyük ölçekli analizlerde güçlü olmasına rağmen, belirli hücre tiplerinde çözünürlükten yoksundur. Bu sınırlama, mitokondriyal genlerin gözlemlenen diferansiyel ifadesinin keratinositlerden, sızan bağışıklık hücrelerinden mi yoksa diğer deride yerleşik hücre popülasyonlarından mı kaynaklandığını belirlemeyi zorlaştırır. Tek hücreli ve mekansal transkriptomik yaklaşımların yaygın kullanımıyla, gelecekteki araştırmalar ifade sinyallerini çözme ve hücresel düzeyde transkriptomik profilin daha hassas bir genel görünümünü sağlama gücünden büyük ölçüde fayda sağlayacaktır. Ayrıca, tüm veriler tam kalınlıktaki deri örneklerinden alınan punch biyopsi örneklerinden elde edilmiştir. Bant şeritli RNA-seq'i içeren gelecekteki çalışmalar, yüzeysel epidermal transkriptomun profilini almak için tamamlayıcı, invaziv olmayan bir yaklaşım sunabilir ve tespit edilen alt grup imzalarını minimal invaziv bir ortamda doğrulayabilir. Tek hücreli RNA dizisi ve mekansal transkriptomik verilerin gelecekteki entegrasyonu, AD derisindeki hücre tipine özgü mitokondriyal imzaların çözünürlüğünü daha da ilerletecektir.

Sonuç olarak, bu çalışma 266 örnekte AD'nin transkriptomik heterojenliğini inceledi, önemli mitokondriyal genleri ve benzersiz bağışıklık hücresi infiltrasyonunu belirledi, alt grupları ayırt etti. Bu bulgular, AD moleküler heterojenliğinin anlaşılmasını artırır ve belirli moleküler profillere dayalı hassas tedavi yaklaşımları geliştirme potansiyelini vurgulamaktadır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
CIBERSORT	Stanford Üniversitesi	v0.1.0; bağışıklık hücresi dekonvolüsyonu; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	Biyoiletken	v4.12.6; GSEA ve GO/KEGG zenginleştirme analizi; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
ConsensusClusterPlus	Biyoiletken	v1.64.0; denetimsiz uzlaşma kümelenmesi; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	Biyoiletken	v1.46.0; diferansiyel gen ekspresyonu analizi; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
Gen İfadesi Omnibüsü (GEO)	NCBI	Açık transkriptomik veri deposu; veri setleri GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
ggplot2	CRAN	Veri görselleştirme; https://ggplot2.tidyverse.org
ggraph	CRAN	Grafik ve ağ görselleştirme; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; GSEA görselleştirme; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi	İnsan transkripsiyon faktörü hedef veritabanı; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	CRAN	Ağ inşası ve görselleştirme; https://igraph.org
Limma	Biyoiletken	removeBatchEffect fonksiyonu; https://bioconductor.org/packages/limma
MitoCarta3.0	Broad Enstitüsü	Kürenmiş mitokondriyal protein veritabanı; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (Hallmark gen setleri)	Broad Enstitüsü	GSEA için gen seti veritabanı; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
org. Hs.eg.db	Biyoiletken	İnsan genomu açıklama veritabanı; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	R Çekirdek Takımı	İstatistiksel hesaplama ortamı; https://www.r-project.org
STRING	EMBL	v12.0; protein-protein etkileşim veritabanı; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	Biyoiletken	v3.44.0; toplu etki düzeltme; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	CRAN	v1.73; ağırlıklı gen ortak ekspresyon ağı analizi; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Transkriptomik Analiz, Atopik Dermatit Lezyonlarında Mitokondriyal Yönlendirilen Alt Grupları Ortaya Çıkarıyor

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles