Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu araştırma, laringeal kanserde HMGA1 seviyelerinin arttığını ve HAND1 ekspresyonu seviyelerinin azaldığını ortaya koymuştur; bu da metastaz ve klinik evre ile ters bir ilişki ve anlamlı ilişkiler göstermektedir; bu da her ikisinin de tümör ilerlemesine katkıda bulunduğunu göstermektedir.
Bu çalışma, gırtlak skuamöz hücreli karsinomda (LSCC) ve bitişik normal laringeal mukozal dokularda HMGA1 ve HAND1 genlerinin ifade profillerini, immünohistokimya ve RT-PCR yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Amaç, LSCC'nin başlanması, ilerlemesi, istilası ve metastazındaki olası rollerini incelemekti. Hem HMGA1 hem de HAND1, kanserli ve bitişik normal dokularda tespit edilmiştir. Buna rağmen, HMGA1 LSCC dokularında önemli ölçüde yüksek bir ifade gösterirken, HAND1 ipresyon seviyeleri önemli ölçüde azaldı. Yüksek HMGA1 ekspresyonu lenf düğümü metastazı (%100,0 vs. %50,0) ve ileri klinik evre (%91,7 vs. %44,4) pozitif ilişkiliydi, ancak tümör histolojik derecesi, klinik tip veya hasta yaşı ile ilişkili değildi. Buna karşılık, azalmış HAND1 protein ekspresyonu, lenf düğümü metastazı, klinik evresi ve patolojik derecesi ile ilişkilendirilmiştir; bu da tümör ilerlemesi ve metastazda rol olduğunu göstermektedir. Ayrıca, HMGA1 ile HAND1 ifadeleri arasında doğrusal negatif bir korelasyon gözlemlenmiş; bu da HMGA1'in HAND1 ekspresyonunu baskılayabileceği potansiyel bir düzenleyici etkileşimi önermektedir. Bu sonuçlar, HMGA1 ve HAND1'in LSCC patogenezinde tamamlayıcı işlevlere sahip olduğunu, HMGA1'in tümör gelişimini kolaylaştırabileceğini, HAND1'in ise baskılayıcı olarak hizmet verdiğini göstermektedir. Bu iki gen arasındaki etkileşim, LSCC ilerlemesini ve metastazını tetikleyen moleküler mekanizmalar hakkında yeni bakış açıları sunabilir.
Laringeal kanser, baş ve boynun en yaygın ikinci primer kötü hutlu tümörü olup, nazofaringeal kanserden sonra dünya genelinde tüm baş ve boyun tümörlerinin %26–%30'unu oluşturur1. Larenks kanserlerinin %90'ından fazlası larengeal skuamöz hücreli karsinom (LSCC)2 olarak sınıflandırılır. Laringeal kanserin birincil tedavileri cerrahi ve radyoterapidir. Lokal nükleme ve lenf düğüm metastazı, laringeal kanser hastalarında başlıca ölüm nedenleridir. Bu nedenle, nükleme ve metastaz tedavisinin etkili olması büyük bir klinik zorluk olmaya devam etmektedir. Moleküler biyolojinin ilerlemesiyle birlikte, laringeal kanserde anormal ekspresyona sahip çeşitli genler tespit edilmiştir. Ancak, larenks kanserinde tümör invazisi ve metastazının altında yatan mekanizmalar belirsiz kalmış ve daha fazla araştırma gerektiren bir alandır.
Yüksek hareketlilik grubu A (HMGA) proteinleri, hücre çekirdeğinde bulunan histon olmayan kromatin bağlayıcı proteinlerdir. HMGA1, DNA ve ilişkili proteinlere bağlanarak gen transkripsiyonunu düzenleyen kromatin yapısal değişikliklerine yolaçar 3. Kromatinle ilişkili bir transkripsiyonel düzenleyici olarak HMGA1, proliferasyon ve metastazda rol alan birden fazla tümörle ilgili genin ekspresyonunu modüle eder. Önceki çalışmalar, HMGA1'in tiroid, kolorektal, pankreas ve baş ve boyun kanserleri 4,5,6,7 dahil olmak üzere çok çeşitli insan kanserlerinde ve literatürde bildirilen diğer epitel ve katı tümörlerde aşırı ekspresye ulaştığını göstermiştir. HMGA1, proliferasyon ve metastaz yapmada rol alan birden fazla aşağı akım hedef genin ekspresyonunu modüle ederektümörjenezi düzenler 8.
Kalp ve sinirsel krest türevleri (HAND) genleri, HAND1 ve HAND2 dahil olmak üzere bHLH (temel heliks–döngü–heliks) ailesinin üyeleridir. HAND1, bir transkripsiyon faktörü olarak, trofoblast farklılaşmasında ve kalp gelişiminderol oynar 9. Ancak, ekstraembriyonik hücre tabakasında HAND1'in ifade mekanizması belirsizdir. HMGA1'in doğrudan HAND1 promotörüne bağlandığı ve HAND1 aktivitesini hem in vivo hem de invitro 10'da inhibe ettiği doğrulanmıştır. HAND1, bir baskılayıcı protein olarak, hücre farklılaşması ve kanser oluşumunun düzenlenmesinde rol oynamıştır. Çalışmalar, HAND1'in ifade edilmesinin insan midekanseri 11, pankreaskanseri 12, yumurtalıkkanseri 13 ve tiroidkanseri 14'te susturulduğunu ve hipermetillendiğini ortaya koymuştur. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, sınırlı çalışmalar laringeal kanser dokularında HAND1 ekspresyonunu araştırmıştır.
Mevcut çalışmada, LSCC ve bitişik normal mukozal dokularda HMGA1 ve HAND1 proteinleri ile mRNA'nın ekspresyonunu tespit etmek için immünohistokimya (iki aşamalı tespit yöntemi) ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanılmıştır. İmmünohistokimya, doku mimarisindeki protein lokalizasyonunun görselleştirilmesini sağlarken, RT-PCR transkripsiyon düzeyinde gen ifadesinin hassas tespitini sağlar ve protein ile mRNA ekspresyon desenlerine tamamlayıcı bilgiler sağlar. Daha yüksek hassasiyet ve hassas nicelik sunan nicel PCR (qPCR), protein düzeyinde doğrulama sağlayan ancak mekansal bağlamdan yoksun Western blotting ve kapsamlı transkriptomik profilleme sağlayan ancak gelişmiş hesaplamalı analiz gerektiren RNA dizileme (RNA-seq) ile karşılaştırıldığında, immünohistokimya ve RT-PCR'nin birleşik kullanımı, biyobelirteç araştırması için maliyet etkin ve klinik olarak uygulanabilir bir strateji sunar. Çalışma, LSCC'nin oluşumu, gelişimi, ilerlemesi ve metastazındaki bu iki faktörün rolünü ve korelasyonunu araştırmayı amaçladı. Ayrıca, HMGA1 ve HAND1 ekspresyonunun değerlendirilmesi, laringeal kanserde tanı ve prognostik değerlendirme için biyobelirteçler sağlayabilir, risk tabakalaşmasını artırabilir ve klinik karar alma süreçlerine yardımcı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma, Shijiazhuang Halk Hastanesi Araştırma Etik Komitesi tarafından incelenip onaylandı (Onay No. YKLS 2026 No. 041; 27 Mart 2026). Çalışma, İnsan Özekleri Içeren Biyomedikal Araştırmaların Etik İnceleme Yönetmelikleri, Yaşam Bilimlerinin Etik İnceleme Yönetmelikleri ve İnsan Kişileri İlgilendiren Tıbbi Araştırmalar Yönetmelikleri, Helsinki Bildirgesi ve İnsanları İlgilendiren Sağlıkla İlgili Araştırmalar için Uluslararası Etik Yönergeler kapsamında yürütülmüştür. İnsan dokusu örnekleri, kurumsal etik gerekliliklere uygun olarak arşivlenmiş cerrahi örneklerden alınarak anonimleştirilmesi ve hasta verilerinin gizliliğini sağladı. Katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alınıyor veya anonimleştirilmiş arşivlenmiş örneklerin kullanımı için etik komite tarafından onay verilmiş bir izin veriliyordu.
Deneysel malzemeler
Örneklerin kaynağı
Şubat 2011 ile Ağustos 2012 arasında Hebei Otolaringoloji-Baş ve Boyun Cerrahisi Bölümü'nde LSCC'nin cerrahi rezeksiyon örneklerinden toplam 42 LSCC dokusu vakası ve bitişik normal laringeal mukoza dokularından 25 vaka alındı. Bunlar arasında, kanser kenarından 1,0 cm uzaklıktaki bir bölgeden alınan bitişik normal mukoza vakalarının 25'i patolojik olarak inflamatuar veya >normal mukoza olarak doğrulandı. 42 LSCC örneğinin tamamı patolojik olarak skuamöz hücreli karsinom olarak doğrulandı. Tüm dokular -80 °C'de depolandı. 42 hasta erkekti, kadın hasta yoktu. LSCC vakaları arasında 15'i iyi farklılaşmış, 18'i orta derecede farklılaşmış, 9'u ise zayıf farklılaşmıştı. On sekiz vakada lenf düğümü metastazı varken, 24'ünde metastaz bulunmadı. Klinik aşamalandırma, TNM sınıflandırma ve aşamalama sistemine (UICC, 2002) dayanıyordu; 20 vaka evreler I ve II, 22 vaka ise evreler III ve IV aşamalarda bulundu. Sufraglottik tipte 30, glottik tipte 11 vaka ve subglottik tipte 1 vaka bulunuyordu. Hastaların yaş aralığı 40–75 arasında, medyan yaşı ise 60 idi. Ameliyattan önce hiçbir hasta radyoterapi veya kemoterapi almamış ve klinik veriler tamamlanmıştı.
Deneysel yöntemler ve adımlar
HE boyama prosedürü
Slayt hazırlığı ve hematoksilin–Eosin boyama
İmmünohistokimya için cam slaytlar önce 24 saat konsantre asitte bekletildi, ardından kalan asidi çıkarmak için en az 10 dakika akan musluk suyunda iyice yıkandı ve tam durulama için nazikçe çaltımarak 30 dakika damıtılmış suya daldırıldı. %95 etanol içinde 2 saat bekletildikten sonra, slaytlar 60 °C fırında kurutuldu, ardından APES: aseton (1:49, v/v) karışımında 1 dakika boyunca nazikçe çalkalayarak eşit kaplama sağlandı, ardından saf asetonla durulandı. Son olarak, sonraki boyama işlemlerinde doku yapışmasını sağlamak için oda sıcaklığında (20–25 °C) hava kurutulmuştur.
Parafinle gömülü doku bölümleri sırayla 10 dakika boyunca ksilen I ve ksilen II'ye batırıldı, parafin çıkarıldı, ardından 5–10 dakika boyunca derecelendirilmiş etanol (%100, 95%, %80) ile yeniden hidrasyon yapıldı ve ardından 2 dakika boyunca damıtılmış suyla durulandı. Bölümler daha sonra aşağıdaki şekilde hematoksilin–eozin (HE) boyama ile geçirildi: 4 dakika boyunca hematoksilin boyama, 3 dakika boyunca akan musluk suyunda sürekli akımla durulama ve fazla lekeyi gidermek, %1 hidroklorik asit kullanarak etanolde 30 saniye farklılaştırma, farkı sonlandırmak için musluk suyla üç kez yıkanma ve 10 saniye eosin boyama. Rutin dereceli dehidrasyon, %70 etanol, %80 etanol, %95 etanol, susuz etanol I ve susuz etanol II kullanılarak sıralı olarak 5 dakika boyunca gerçekleştirildi. Kuruduktan sonra, sürgü nötr balsam kullanılarak monte edildi.
İmmünohistokimya prosedürü
4 μm kalınlığında parafin kesimleri kesildi, APES kaplı slaytlara düz serildi ve gece boyunca 67 °C fırında bırakıldı, ardından 10 dakika boyunca Xylene I ve II ile deparafinizasyon yapıldı. Yavaş dehidrasyon, %100, %90 ve %70 alkol kullanılarak her biri 5 dakika kullanıldı, ardından musluk suyu ve damıtılmış suyla 3 dakika yıkandı. Endogen peroksidaz aktivitesini engellemek için, slaytlar taze hazırlanmış %3 metanol-hidrojen peroksit çözeltisi ile kuluçka hale getirildi; böylece doku bölümü oda sıcaklığında (20–25 °C) 20 dakika boyunca tam kaplandı, ardından 5 dakika boyunca 0,01 M PBS ile damıtılmış suyla üç yıkama yapıldı.
Antijen alımı, slaytların sitrat tamponuna (pH 6.0) batırılması ve basınçlı tencerede ~ 95–100 °C sıcaklığında HMGA1 için 8 dakika, HAND1 için 10 dakika ısıtılması ve kapakların güvenli şekilde kapatılmasıyla yapıldı; böylece basınç koşulları tutarlı tutuldu. Bölümler daha sonra oda sıcaklığında (20–25 °C) soğutulmuş ve 0,01 M PBS ile her biri 3 dakika boyunca üç kez hafifçe çalkalanmış şekilde yıkanmıştır. HMGA1 ve HAND1'e karşı birincil antikorlar, antikor sulandırıcı ile seyreltildi (sırasıyla 1:150 ve 1:100) ve pipetle nazikçe karıştırıldı, ardından her doku kesitini tamamen kaplamak için eşit şekilde uygulandı. Kaydıraklar, nemli bir odada 4 °C sıcaklıkta gece boyunca kuluçka yapıldı. Gece boyunca kuluçkadan sonra, slaytlar nemlendirilmiş odadan çıkarıldı ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dengelenmesine bırakıldı. Slaytlar, 0.01 M PBS (yıkama başına 5 dakika) ile nazik bir çalkalama altında üç kez yıkandı, böylece bağlanmamış antikorlar çıkarıldı. Fazla sıvı çıkarıldı ve doku kesitleri yüzeylerini tamamen kaplamak için ikincil antikor (HRP etiketli polimer anti-tavşan/fare) eklendi. Daha fazla kuluçka işlemi 37 °C'de 35 dakika boyunca gerçekleştirildi.
DAB substrat çözeltisi dokuyu kaplamak için damla uygulandı ve renk gelişimi 1–3 dakika boyunca mikroskop altında izlendi, kahverengi boyama ortaya çıkana kadar ve optimal boyama yoğunluğu sağlandığında damıtılmış suyla durulayarak hemen durduruldu. Hematoksilin yeniden boyama, hidroklorik asit alkol diferensiasyonu ve mavi tersine çevirme için amonyak çözeltisi gerçekleştirildi. Bunu rutin dereceli alkol dehidrasyonu, ksilen şeffaflığı ve mikroskop altında gözlem için nötr balsamla montaj izledi. PBS, birincil antikor yerine boş kontrol olarak kullanıldı. Ayrıca, daha önce doğrulanmış HMGA1-pozitif baş ve boyun skuamöz karsinom doku bölümleri ile HAND1 pozitif plasenta doku bölümleri pozitif kontrol olarak kullanıldı; böylece leke kalitesi ve tutarlılığı sağlandı.
Sonuç belirleme
Bu deneyde kullanılan kromojen DAB-H2O2 sistemidir. Hematoksilin yeniden boyama yapıldıktan sonra, HMGA1 ve HAND1 pozitif boyama esas olarak hücre çekirdeğinde gözlemlenir ve bazı sitoplazmik boyamalar da vardır. Değerlendirme için, düşük büyütme (×40) altında en yüksek pozitif boyalı hücre yoğunluğuna sahip bölge belirlendi. ×100 büyütme altında, en yüksek pozitif hücre yoğunluğuna sahip beş alan seçildi ve her alanda 100 hücre sayıldı. Her slayt için beş alandan ortalama pozitif hücrelerin yüzdesi kullanılır. Derecelendirme kriterleri şöyleydi: boyalı hücre yok (-), pozitif hücreler < %25 (+), pozitif hücreler %25–%50 (++) ve pozitif hücreler > %50 (+++), immünohistokimyasal analizlerde yaygın kullanılan yarı nicel yüzdelik puanlama yöntemine dayanmaktadır. Değerlendirme, iki nitelikli patolog tarafından bağımsız olarak, çift kör yöntemlegerçekleştirildi 15,16,17. Görüşleri farklıysa, tartışmalı ve sonucavarmalılar 18.
RT-PCR yöntemi
Temel Bilgiler
Astarlar, hedef gen dizilerine dayalı primer tasarım yazılımı kullanılarak tasarlandı; primer özgüllüğü, erime sıcaklığı uyumluluğu ve beklenen ürün boyutuna dikkat edildi. Detaylı primer dizileri, ürün boyutları ve tavlama sıcaklıkları Tablo 1'de özetlenmiştir. Primerler 2 OD konsantrasyonuna sentezlendi, iki tüplere ayrıldı ve -20 °C'de depolamak için DEPC ile arıtılmış suyla 10 pmol/μL olarak seyreltildi. Tavlama sıcaklığı şu formülle hesaplandı: Tm= 2(A + T) + 4(G + C)
Deneysel materyal ve ekipmanların RNase tedavisi:
Plastik Ürünler (örneğin, pipet uçları, EP tüpleri): Plastik ürünler sterilize edilmiş geniş ağızlı bir reaktif şişesine yerleştirilir, DEPC ile hazırlanmış su tamamen suya batırılana kadar eklenir ve malzemeler oda sıcaklığında (20–25 °C) bir buhar kaputu içinde gece boyunca kuluçka altına alınır. Daha sonra 120 dakika boyunca basınç altında sterilize edilip 65 °C'de kurutuldular.
Cam Ürünler: Cam eşyalar gece boyunca asitte bekletildi, iyice durulandı, kurutuldu, alüminyum folyoya sarıldı, 200 °C fırında 6 saat pişirildi ve gelecekte kullanılmak üzere temiz bir yerde saklandı.
Metal Eşyalar (örneğin makas, cımbız): Metal eşyalar temizlenir, 200 °C fırında 6 saat pişirilir ve gelecekte kullanılmak üzere temiz bir yerde saklanırdı.
Çözeltinin hazırlanması
%0,1 (v/v) DEPC Çözeltisi: 1000 mL damıtılmış suya 1 mL DEPC eklenerek %0,1 (v/v) nihai konsantrasyon elde edildi, iyice çallanmış, gece boyunca 4 °C'de kuluçka edilmiş, otoklavlama ile sterilize edilmiş ve 4 °C'de saklanmıştır.
%75 (v/v) Etanol Çözeltisi: 75 mL mutlak etanol, 25 mL DEPC ile arıtılmış su ile karıştırıldı ve nihai konsantrasyon %75 (v/v) elde edildi ve 4 °C'de saklandı.
Dokudan toplam RNA ekstraksiyonu
RNA çıkarımından sonra, ters transkripsiyon ve sonraki analizden önce RNA bütünlüğü değerlendirildi. 80 mg doku elektronik bir teraziyle tartıldı, küçük parçalara bölündü ve önceden işlenmiş cam homojenizatora kondu. 4 °C'de 1 mL önceden soğutulan RNA ekstraksiyon reaktifi eklendi ve örnek, görünür doku parçaları olmayan uniform bir lizat elde edilene kadar tekrar tekrar öğütülerek buz üzerinde homojenleştirildi; böylece baloncuk oluşumu önlendi. Homojenleştirilmiş karışım, 1,5 mL RNase-serbest EP tüpüne aktarıldı ve 5 dakika boyunca buzda kuluçka halinde tutuldu. Her tüpte 400 μL kloroform eklendi, tam faz karışması için 10–15 saniye şiddetle girdablandırıldı, ardından 5 dakika buz üzerinde kuluçka yapıldı. Tüpler 4 °C, 12.000 x g sıcaklıkta 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Santrifüjlemeden sonra, üst sulu faz, interphase tabakasını yeni bir tüpe sokmadan RNazsız bir pipet kullanılarak dikkatlice aspire edildi. Eşit hacimde izopropanol eklendi, tüpü 8-10 kez nazikçe ters çevirerek katmanlar yok olana kadar karıştırıldı ve en az 10 dakika boyunca -20 °C'de kuluçka edildi. Karışım 4 °C, 12.000 x g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatant tabakası atıldı, RNA peletini askıya almak için %75 buz soğukluğu etanol 400 μL eklendi. Karışım tekrar 4 °C, 12.000 x g sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüjlendi. Üst tabaka atıldı ve RNA peleti hafifçe kurutuldu. RNA peleti RNase içermeyen suda çözünür ve gelecekte kullanılmak üzere -80 °C sıcaklıkta depolanır.
RNA bütünlüğü tespiti
RNA bütünlüğü tespiti için 5 μL RNA örneği 5 μL bromofenol mavi yükleme tamponu ile karıştırıldı ve %2 agaroz jel üzerinde elektroforez yapıldı. RNA bütünlüğü, belirgin bir lekelenme olmadan net 28S, 18S ve 5S bantları görünürken kabul edilebilir sayıldı.
cDNA sentezi için ters transkripsiyon (RT)
6 μL RNA 70 °C'de 10 dakika önceden ısıtıldı, ardından 25 mM MgCl2 (4.0 μL), dNTP (2.0 μL), AMV (0.7 μL), 10× AMV Buffer (2.0 μL), oligo(dT) (1.0 μL), RNasin (0.5 μL) ve deionize su ardışık olarak buz üzerinde eklenerek 20 μL nihai reaksiyon hacmi elde edildi, ardından nazik karıştırma ve kısa santrifüjleme yapıldı. Reaksiyon koşulları 1 dakika 25 °C, 60 dakika 42 °C, 5 dakika 98 °C ve ardından süresiz olarak 4 °C'de saklanıyordu. Reaksiyon 4 °C'ye ulaştığında, ürün PCR makinesinden çıkarılır, bir sonraki PCR reaksiyonu için cDNA şablonu olarak kullanılır ve daha sonra kullanılmak üzere -20 °C'de saklanırdı.
PCR amplifikasyonu
Her PCR reaksiyonu için, karışım cDNA şablonu (1 μL), HMGA1, HAND1 veya GAPDH için özel ön primer (1 μL), hedef gen veya GAPDH için spesifik ters primer (1 μL), PCR master karışımı (10 μL) ve DEPC ile işlenmiş su (7 μL) içeriyordu; toplam hacim 20 μL'dir. Her hedef gen için ayrı reaksiyonlar hazırlandı (HMGA1, HAND1) ve iç kontrol genini (GAPDH) içerir; her reaksiyon ilgili gene özgü ön ve ters primer çiftini içerir.
Toplam reaksiyon hacmi 20 μL idi. Reaksiyon bileşenleri nazikçe karıştırıldıktan ve düşük hızda 5–10 saniye kısa bir santrifüj yaptıktan sonra, tüp önceden ısıtılmış bir PCR makinesine yerleştirildi ve Tablo 2'deki reaksiyon koşullarına göre güçlendirildi.
PCR amplifikasyonlu ürünlerin doğrulanması ve analizi
Jel hazırlama
2 g agarose tartıldı ve üçgen bir şişeye kondu. 2 mL 50× TAE elektroforez tamponu ve 100 mL damıtılmış su (%2 agaroz jeli hazırlayın) eklendi, ardından mikrodalga fırında aralıklı girdablarla (15–20 saniye aralıklarla) ısıtıldı ve agaroz tamamen çözünene kadar alındı. Yaklaşık 55 °C'ye kadar soğuduktan sonra, 10 μL EB çözeltisi eklenip iyice karıştırıldı. Jel daha sonra oda sıcaklığında (20–25 °C) temiz bir jel tepsisine dökülür, damıtılmış suyla yıkanır ve örnek kuyuları oluşturmak için bir tarak yerleştirilir. Jel kalınlığı 0,4 cm'ydi. Tepsi, oda sıcaklığında (20–25 °C) düz bir yüzeye 30 dakika boyunca konur, jel tamamen katılaşana kadar. Tarak dikkatlice çıkarıldı.
Yükleme örnekleri
Her DNA örneğinden 4 μL jelin yuvalarına eklendi ve en sol kuyuya DNA Marker eklendi.
Elektroforez
Yüklü jel tepsisi, TAE elektroforez tamponu ile doldurulmuş bir elektroforez tankına yerleştirilerek tampon seviyesinin jel yüzeyinin yaklaşık 1 mm üzerinde kalmasını sağladı. Kuyunun bir ucu katotta (DNA'nın anoda doğru göç etmesini sağlamak için) bulunuyordu. Elektroforez sistemi bir güç kaynağına bağlandı ve yaklaşık 45 dakika boyunca 120 V ve 60 mA'da çalıştı, ta ki yük tamponu jelin orta hattının ötesine geçene kadar, ardından güç kapatıldı.
Sonuç gözlemi ve görüntüleme
Elektroforezden sonra jel dikkatlice çıkarıldı ve sonuçlar UV dönüştürücü altında gözlemlenerek DNA Marker ile karşılaştırıldı; böylece amplifikasyonlu parçaların moleküler ağırlığının beklenen pozisyonlarda olup olmadığı belirlendi. Jel görüntüleme sistemi, görüntüleri yakalamak ve sonuçları bilgisayarda kaydetmek için kullanıldı.
Kontrol kurulumu
Negatif kontrol olarak cDNA yerine distile su kullanıldı.
Yarı-nicel analiz
Agararoz jel elektroforezi sonuçları analiz edilip jel görüntüleme sistemi kullanılarak yakalanmıştır. Bantların parlaklığını analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanıldı. Hedef gen amplifikasyon bandının mutlak entegre OD değerleri ve ilgili dahili kontrol gen amplifikasyon bandı ölçüldü. Sonuçlar, hedef bandın mutlak entegre OD değerinin ilgili iç kontrol bandının mutlak entegre OD değerine oranı olarak ifade edildi.
Yani, göreli ifade = hedef gen OD değeri / iç kontrol geninin OD değeri.
İstatistiksel analiz
Tüm veriler Excel kullanılarak organize edilmiş ve istatistiksel yazılımlarla analiz edilmiştir. Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi ve bağımsız örneklemli t-testi kullanılarak iki grup arasında karşılaştırıldı. İmmünohistokimyasal pozitif ifade oranları dahil olmak üzere nominal kategorik değişkenler χ2 testi kullanılarak analiz edildi. Patolojik derecesi ve klinik evresi dahil olmak üzere sırasal kategorik değişkenler, sıra-toplam testi kullanılarak analiz edildi (uygun olduğunda iki grup karşılaştırması için Mann-Whitney U testi). HMGA1 ile HAND1 ekspresyonları arasındaki korelasyon, doğrusal korelasyon analiziyle değerlendirildi. Tüm testler iki kuyrukluydu; P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi ve P. < 0.01 oldukça anlamlı olarak kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
İmmünohistokimyasal tespit sonuçları
Farklı derecelerde farklılaşma derecelerinde (iyi, orta ve zayıf) olan bitişik normal laringeal mukoza ve LSCC'nin histolojik morfolojisini gösteren temsil hematosilin–eozin (HE) boyama görüntüleri gösterilmiştir. Özellikle, Şekil 1A bitişik normal laringeal mukozanı, Şekil 1B iyi farklılaşmış LSCC'yi, Şekil 1C orta de...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Baş ve boynun en yaygın tümörlerinden biri olan laringeal kanser, son yıllarda çevresel ve yaşam tarzıyla ilgili faktörlerle ilişkili olarak artan bir sıklık göstermiştir. Diğer kötü hutlu tümörler gibi, onun da tekrarlanması ve metastazı ölüm nedenlerinden başlıca olarak kalmaya devam etmektedir. Moleküler biyolojiydeki gelişmelerle birlikte, larenks kanserinin gelişimiyle ilişkili birçok faktör tanımlanmış, ancak başlangıç ve metastaz mekanizmaları hâlâ tam olarak anlaşılmamıştır. HMGA...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, kurumlarının ve bu çalışmaya katkıda bulunan tüm bireylerin desteğini takdir etmek ister.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Otomatik Doku Gömüleme Makinesi | Sakura Finetek, Tokyo, Japonya | Tissue-Tek TEC 5 | Parafin gömü |
| Mikrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Almanya | RM2135 | Bölümleme (4 μ m) |
| Kaydıraklı Kurutucusu | Xiaogan Hongye Tıbbi Aletler A., Ltd., Çin | CS-VI | Kaydırma kurutma |
| Isıtma Kuluçka Makinesi | Shanghai Yangguang Deneysel Enstrümanlar Co., Ltd., Çin | 303-4A | Sıcaklık kontrollü kuluçka |
| Optik Mikroskop | Olympus Corporation, Tokyo, Japonya | BX41 | Histolojik gözlem |
| Görüntü Yakalama Sistemi | QImaging, Kanada | QCapture Pro 7 | Mikroskopi görüntüleme |
| Temiz Sıra | Pekin Xicheng Yarı İletken Ekipman Fabrikası, Çin | SW-CJ-1FD | Steril çalışma alanı |
| Soğutmalı Santrifüj | Pekin Tıbbi Aletler Onarım Fabrikası, Çin | LXJ-64-01 | RNA ayrımı |
| Masaüstü Santrifüj | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., Çin | PQ-1600A | RNA/DNA işleme |
| Manyetik Karıştırıcı | Jiangsu Jintan Tıbbi Aletler Fabrikası, Çin | HJ-3 | Çözelti hazırlığı |
| Mini Mikser | Şanghay Peng' s Industrial Co., Ltd., Çin | H-1 | Örnek miksajı |
| Elektronik Denge | METTLER Toledo, İsviçre | PB3002-S | Numune tartımı |
| PCR Amplifikatörü | Eppendorf AG, Almanya | Mastercycler 5333 | PCR amplifikasyonu |
| Elektroforez Güç Kaynağı | Pekin Liuyi Enstrüman Fabrikası, Çin | DYY-6C | Voltaj kontrolü |
| Elektroforez Tankı | Pekin Liuyi Enstrüman Fabrikası, Çin | DYCZ-24DN | Jel elektroforezi |
| Mikrodalga fırın | Şanghay Zhongda Tıbbi Uygulama Araştırma Enstitüsü, Çin | WD800SL23 | Agaroz hazırlığı |
| UV Transilluminatör | Pekin Liuyi Enstrüman Fabrikası, Çin | WD-9403B | DNA görselleştirme |
| Jel görüntüleme sistemi | Anlai Co., Ltd., Çin | AlphaImager HP | Jel dokümantasyonu |
| Buzdolabı (4 derece ve derece; C) | Haier Biomedical, Çin | BC-165D | Örnek depolama |
| Ultra Düşük Sıcaklık Dondurucu | Haier Biomedical, Çin | DW-86L388 | Depolama (-80 ve derece; C) |
| Buz Kutusu | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., Çin | FZ-IB-20L | Örnek taşıma |
| Kriyojenik Depolama Torbaları | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., Çin | YL-ULT-50 | Örnek koruma |
| Araştırma Pipetleri | Eppendorf AG, Almanya | Research Plus | Sıvı taşıma |
| RNA Ekstraksiyon Reaktifi (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), ABD | 15596026 | RNA çıkarımı |
| Ters Transkripsiyon Kiti | Takara Bio Inc., Japonya | RR037A | cDNA sentezi |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japonya | RR820A | PCR amplifikasyonu |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Japonya | 4030 (tipik) | PCR bileşeni |
| RNaz İnhibörü (RNasin) | Promega, ABD | N2111 | RNA koruması |
| Oligo(dT) Astar | Takara Bio Inc., Japonya | 3806 (tipik) | cDNA sentez primeri |
| Agarose | Sigma-Aldrich, ABD | A9539 | Jel hazırlama |
| TAE Buffer (50& kez;) | Sigma-Aldrich, ABD | TAE50X-1L (tipik) | Elektroforez tamponu |
| DNA Marker (Merdiven) | Takara Bio Inc., Japonya | DL2000 (3421A) | Boyut referansı |
| Etidyum bromid (EtBr) | Bio-Rad, ABD | 1610433 | DNA görselleştirme |
| PBS Buffer | Gibco (Thermo Fisher Scientific), ABD | 10010023 | Yıkama tamponu |
| DEPC ile arındırılmış su | Invitrogen, ABD | AM9916 | RNA koruması |
| Kloroform | Sigma-Aldrich, ABD | C2432 | RNA çıkarımı |
| İzopropanol | Merck, Almanya | 109634 | RNA çökelmesi |
| Etanol (mutlak) | Merck, Almanya | 100983 | Susuz kalma |
| Metanol | Merck, Almanya | 106009 | Peroksidaz blokajı |
| Hidrojen Peroksit (H2O2) | Sigma-Aldrich, ABD | H1009 | Endojen peroksidaz blokajı |
| Ksilen | Sigma-Aldrich, ABD | 534056 | Deparafinizasyon |
| Sitrat Antijen Geri Alma Tamponu | Abcam, Birleşik Krallık | ab93678 | Antijen toplama |
| Antikor Sulandırıcı | Dako, Danimarka | S3022 | Antikor seyreltmesi |
| HMGA1 birincil antikor | Abcam, Birleşik Krallık | AB129153 | Sulandırma 1:150 |
| HAND1 birincil antikor | Abcam, Birleşik Krallık | ab200040 | Sulandırma 1:100 |
| İkincil antikor (HRP ile konjuge) | Dako, Danimarka | K5007 | Tespit sistemi |
| DAB Substrat Kiti | Dako, Danimarka | K3468 | Kromojenik tespit |
| Hematoksilin Boyama | Sigma-Aldrich, ABD | H9627 | Nükleer boyama |
| Eosin Lekesi | Sigma-Aldrich, ABD | E4009 | Sitoplazmik boyama |
| Nötr Balsam Montaj Aracı | Sinopharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Çin | 10004160 | Sürgü montajı |
| HMGA1 Primerleri | Özel sentezlenmiş (örneğin, IDT/Sangon) | Yok | Gen amplifikasyonu |
| HAND1 Astarları | Özel sentezlenmiş (örneğin, IDT/Sangon) | Yok | Gen amplifikasyonu |
| GAPDH Primers (iç kontrol) | Özel sentezlenmiş | Yok | Ev Hizmetleri geni |
| APES (Aminopropiltrietoksisilan) | Sigma-Aldrich | Yok | Sürgü kaplama |
| RNase-free mikrosantrifüj tüpleri | Eppendorf | Yok | RNA kullanımı |
| RNase-free Pipet Uçları | Eppendorf | Yok | Sıvı taşıma |
| Agarose Jel Dökme Tepsisi ve Tarak | Genel | Yok | Jel hazırlama |
| Primer Tasarım Yazılımı | Entegre DNA Teknolojileri, ABD | PrimerQuest Aracı | Astar tasarımı |
| Görüntü Analiz Yazılımı | Media Sibernetik, ABD | Image-Pro Plus 6.0 | Bant niceliklendirmesi |
| İstatistiksel Analiz Yazılımı | IBM Corp., ABD | SPSS Sürüm 13.0 | İstatistiksel analiz |