Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bebek Bağışıklığını Minimum Girdiyle Haritalama: Bütünleşik Tek Hücreli ve Multiomik Profilleme

495 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70279

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yenidoğan ve pediatrik hastalardan alınan kan örneklerinin toplanmasını ve korunmasını ve bu örneklerdeki bağışıklık hücre popülasyonlarını karakterize etmek için scRNA-seq, proteomik ve spektral akış sitometrisinin uygulanmasını açıklar.

Özet

Doğumda, yenidoğan bağışıklık sistemi aniden radikal farklı, mikrobiyal ve çevresel uyaranlar açısından zengin bir ortamla karşı karşıya kalır. Artan kanıtlar, erken yaşam bağışıklığının sadece olgunlaşmamış olmadığını, aynı zamanda bu gelişimsel pencerenin belirgin taleplerine benzersiz şekilde uyarlandığını göstermektedir. Bu dönemde, bağışıklık sistemi son derece dinamiktir ve değişen dış manzaraya uyum sağlamak için hızlı değişiklikler geçirir. Bu karmaşık ve evrimleşen bağışıklık ortamını anlamak, yenidoğan çocuklarda doğrudan çalışmayı gerektirir. Ancak, bu tür araştırmalarda büyük bir sınırlama, yenidoğanlarda düşük toplam kan hacmidir (~100 mL/kg), bu da özellikle çok düşük doğum ağırlığı (ELBW) veya çok erken doğuran bebeklerde araştırma için güvenli şekilde toplanabilecek miktarı sınırlar. Son çalışmalarımızda, yüksek boyutlu bağışıklık profillemenin çok küçük hacimlerde yenidoğan kanı kullanılarak nasıl yapılabileceğini göstererek bu sınırlamayı ele alıyoruz. Erken yaşamda boylamasına örnekleme için optimize edilmiş bir dizi protokol sunuyoruz ve minimum girdiden elde edilen bilgiyi en üst düzeye çıkarmak için akış sitometrisi, proteomik ve tek hücreli RNA dizileme gibi gelişmiş teknikler uygular. Bu yöntemler birlikte, yenidoğan bireylerde dolaşan bağışıklık hücrelerinin transkriptomik ve proteomik imzalarının kapsamlı bir görünümünü sağlar ve erken yaşam bağışıklığının benzersiz yörüngesine yeni bakış açısı sunar.

Giriş

Bu protokol, 100-250 μL kan örnekleri için optimize edilmiştir; alındıktan sonra 12 saat içinde işlenilir; ya kriyokonserve edilir ya da hemen kullanılır. Doğumda, yenidoğan bağışıklık sistemi, daha önce korunan rahim içiortamda olmayan mikrobiyal ve çevresel uyarıcılarla zenginleştirilmiş radikal farklılıklara yönlendirilir (1,2). Bu değişim, bağışıklık sisteminin çok sayıda yeni antijene uyum sağlamasını ve yanıt vermesini gerektirir; bu süreç hayatta kalmak için gereklidir ancak aynı zamanda önemli zorluklar da teşkileder 1,2. Artan kanıtlar, erken yaşam bağışıklığının sadece olgunlaşmamış ya da yetişkin bağışıklık sisteminin küçük bir versiyonu olmadığını gösteriyor. Bunun yerine, bu kritik gelişim döneminin özel ihtiyaçlarına özel şekildeuyarlanmıştır 3,4. Bu yenidoğan döneminde, bağışıklık sisteminin çeşitli T hücreleri, B hücreleri ve miyeloid hücreler gibi hücresel bileşenleri olgunlaşır ve erken yaşama özgü benzersiz özellikler ve işlevlergeliştirir 5,6,7,8. Önemine rağmen, yenidoğan bağışıklığı etik ve pratik kısıtlamalar nedeniyle doğrudan incelenmesi zordur. Büyük bir sınırlama, yenidoğan çocuklarda ortalama ~100 mL/kg 9,10 olan küçük kan hacmidir. Bu zorluk, gebeliğin 30 haftasından önce doğan çok erken bebeklerden ve sadece 40 mL dolaşımda olan kanla 400 g kadar hafif bir kilo alan ELBW bebeklerden kan topladığında daha da belirgin hale gelir. Bu durum, güvenli bir şekilde ne kadar kan toplanabileceğini sınırlarak, minimum örneklerden veri verimini en üst düzeye çıkaran yaklaşımlara olan ihtiyacı vurguluyor. Bu zorluğu ele almak için, çalışmalarımız, ELBW bebeklerinden elde edilen küçük kan hacimleri (100-250 μL) kullanılarak yüksek boyutlu bağışıklık profilleme için optimize edilmiş protokoller göstermektedir.

Son zamanlarda kan toplama ve işleme alanındaki gelişmeler, numune almanın geleneksel olarak zor olduğu popülasyonlarda bağışıklık yanıtlarının incelenmesini mümkün kılmıştır. Tasso ve Dokunmatik Aktiflenmiş Flebotomi sistemleri gibi mikroiğne cihazları başlangıçta yetişkinlerde evde pratik kan toplamak için geliştirilmiştir. Daha sonra bebeklerde kullanılmak üzere uyarlanmış, birincil bakıcılar ve klinik ekipler minimum rahatsızlıkla numune toplayabilmiştir. Ayrıca, tekrar eden klinik ziyaretlerin stresi olmadan evde kullanılabilir, uyum ve erişilebilirliği kolaylaştırır. Cihazla birlikte bir etilenediamintetraasetik asit (EDTA) mikrotüp kullanılmalı ve uygun biyolojik tehlike protokollerine uyarak gece boyunca laboratuvara gönderilmelidir. Ertesi sabah örnekler geldiğinde, dolaşımdaki bağışıklık hücrelerini yakalamak için kırmızı kan hücresi (RBC) lizis yöntemleriyleişlenmeli 6. Dikkat çekici bir şekilde, EDTA tüpleri canlı hücre izolasyonunu sağlar, ancak zaman açısından önemlidir. Uyarımlı fonksiyonel testler için, örnekler 4 saatten kısa ve ideal olarak toplanmadan 2 saatten kısa sürede işlenmelidir. Aşağıda sunulan işlevsiz fenotipik testler için, hücrelerin canlılığı zamanla azaldığı için gece boyunca sevkiyat yapılmasına izin verilecek şekilde örnekler 12 saat içinde işlenmelidir. Ficoll ile yapılan geleneksel yoğunluk-gradyan ayrıma ile karşılaştırıldığında, lizin daha hızlı, daha az emek yoğunluğu gerektiren ve daha yüksek geri kazanımsağlar 13. Ancak, periferik kan mononükleer hücre izolasyonu lizis ile kontamine granülositleri geride bırakabilir ve saflığı düşürebilir, ancak bu hücre tipleriyle ilgilenen çalışmalar için avantajlıolabilir 14. Bu tavizler, nadir veya hassas klinik örnekler, örneğin yenidoğan çocuklardan alınanlar gibi incelenirken metodolojik uyarlamaların uygulanabilirlik ve doğruluk arasında dengesini vurgular. İzole hücrelerin aşağı akış işlenmesi de metodolojik iyileştirmelerden fayda sağlamıştır. Fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksit (DMSO) ile kriyokonserva, özellikle hücre canlılığı ve iyileşmesinin kritik olduğu fetal ve yenidoğan kanlarında bağışıklık hücreleri için sağlam bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Kan toplama sürecini optimize etmenin yanı sıra, küçük örnek hacimlerinden maksimum bilginin çıkarılmasını sağlayan aşağı akış tekniklerini de benimsedik. Erken yaşamda numune almayı kolaylaştıran optimize edilmiş bir dizi protokol sunuyoruz ve böylece bağışıklık dinamiklerinin zaman içinde ayrıntılı incelenmesini sağlıyoruz. Yaklaşımımız, spektral akış sitometrisi, proteomik ve tek hücreli RNA dizileme gibi gelişmiş teknikleri kullanır; bu teknikler, erken yaşamda dolaşan bağışıklık hücrelerinin proteomik ve transkripsiyonel imzalarına eşsiz bir bakış sunar. Ayrıca, spektral akış sitometrisi, minimal hücre girdisi ile fonksiyonel içgörü kazanma fırsatları sunar.

Yıllar içinde, tam kan sayımları (CBC) gibi çeşitli teknikler kandan kaynaklanan bağışıklıkhücrelerini analiz etmek için kullanılmıştır 15, diğerleri ise DNA metilasyonu 16,17 kullanılarak yenidoğan tam kan örneklerindeki bağışıklık hücresi oranlarını analiz etmiştir. Bu teknikler bilinen bağışıklık hücrelerinin oranlarını öğrenmede faydalı olsa da, çoklu omik sistem olmadan hücreler hakkında derinlemesine bilgi edinme yeteneğimizde hâlâ sınırlamalar vardır. CBC'ler, ana kan hücresi tiplerinin yalnızca geniş ölçümlerini sağlar; bu da onları klinik ortamda genel bağışıklık durumunu belirlemek için faydalı kılar ancak alt tipleri veya fonksiyonel durumları çözme yeteneklerini sınırlar. Son zamanlarda, bu sınırlamayı ele almak için bebeklerde18 yaşının ilk haftasından itibaren plazma kaynaklı transkriptomik ve metabolomik değişiklikler kullanılmaya başlanmıştır. Kütle spektrometrisine dayalı proteomik, yenidoğan örneklerinde bağışıklık profillerini incelemek içinuyarlanmıştır 19. Bu yaklaşım, geniş bir protein yelpazesini tarafsız bir şekilde ölçmek ve potansiyel biyobelirteçleri belirlemek için güçlüdür. Ancak, temel sınırlamalar arasında göreceli olarak büyük protein girdisi gereksinimi ve hücre kimliği hakkında doğrudan bilginin olmaması yer alır; hem çözünür hem de çözünmeyen proteinleri yakalamaya devam eder. Hedefli çoklu proteomik testi (TMPA), düşük girdili örnekler için alternatifler sunar. Bu yöntemler, sınırlı malzeme içeren örnekler için yüksek hassasiyetli profilleme sağlayan hedefli antikor tabanlı tespiti kullanır. Bunlardan biri, özellikle erken yaşam bağışıklık gelişim yörüngelerini boylamasına20 takip etmek için kullanılmıştır.

Akış sitometrisi, floresan işaretli hücreleri odaklı lazer ışınından geçirerek ve ortaya çıkan ışık saçılması ile floresan sinyallerini ölçerek bağışıklık hücresi proteinlerinin tek hücre düzeyinde nicel analizini sağlar. Bu teknikte, floresan etiketli antikorlar belirli yüzey veya hücre içi proteinlere bağlanır. Bu, birden fazla bağışıklık hücresi alt tipinin ve floresans profillerine dayalı tanımlayıcı özelliklerinin eşzamanlı olarak tespit edilmesine ve nicelendirilmesine olanak tanır. Spektral akış sitometrisi, her florokromun tam emisyon spektrumunu yakalayarak bu yaklaşımı genişletir; böylece spektral karışıklığın tam olarak çözülmesini ve tek bir testte 35'ten fazla işaretçinin eşzamanlı olarak tespitedilmesini sağlar 21,22,23. Bu, geleneksel akış sitometri panellerinden çok daha fazla işaretleyicinin analizini sağlar; çünkü bunlar ~8-12 işaretleyiciyle sınırlıdır. Bu sitometrik teknikleri tamamlayan tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), minimal giriş materyalinden yüksek çözünürlüklü, tarafsız transkriptomik profilleme mümkün kılarak immünolojikçalışmaları dönüştürmüştür. Daha yüksek maliyetlere ve hücre yaşamına bağımlılığa rağmen, scRNA-seq toplu dizileme ile karşılaştırıldığında erken yaşamda bağışıklık heterojenliği konusunda eşsiz içgörüler sağlar. Bu ilerlemeler topluca, toplama, koruma ve analizdeki yeniliklerin fetal ve yenidoğan bağışıklığını incelemenin benzersiz zorluklarını aşmak için nasıl uyarlandığını gösteriyor.

Bu protokol, seri RBC lizisi yoluyla izole edilen kriyokonserve periferik bağışıklık hücrelerinin analizi için optimize edilmiştir. Araştırmacılar, özellikle boylamasına analiz kritik olduğunda, küçük hacimli kanlardan (100-500 μL) yüksek çözünürlüklü bağışıklık profili gerektiriyorsa, bu protokolü değerlendirmelidir. Yöntem, hem term hem de erken doğulanlar için geniş çapta uygulanabilir olup geniş bir sonraki analiz yelpazesiyle uyumludur; bu da onu yenidoğan ve pediatrik immünolojide çeşitli araştırma soruları için uygun kılar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yale Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) uyarınca bilgilendirilmiş ebeveyn onayı ve ilgili ulusal etik düzenlemelere tam uyum sağlanmıştır. Onaylanmış IRB protokolünde belirtildiği gibi, bebeğin doğumundan sonraki ilk hafta içinde ebeveynlerle iletişime geçilerek kayıt öncesi onay alındı. Belgelenmiş etik onaydan önce insan kaynaklı materyallerle ilgili hiçbir çalışma prosedürü başlatılmamıştır.

1. Örnek toplama, işleme ve depolama (Şekil 1)

  1. Yatarak kan alımı
    1. Bebek örneklerini aldıktan sonra toplayın ve işleyin, 4 °C'de saklanın ve toplandıktan sonra 12 saat içinde işleyin.
    2. ~250 μL tam kan toplayın ve antikoagülan EDTA kan toplama tüpünde depolayın. Kan toplama tüpünü 8 kez ters çevirerek antikoagülanı karıştırın.
    3. Tüm kanı Bölüm 1.3'te (tam kan örneği işleme) açıklandığı şekilde kırmızı kan lizisi yoluyla işlemeye devam edin.
    4. Kuru kan lekelerini toplamak için, steril lancet ile temizlenmiş parmak/topuk üzerinde delik açın.
      1. Alternatif olarak, EDTA tüpünden ~25-30 μL kan filtre kağıdına pipetleyin. Kan damlasına filtre kağıdını hafifçe dokundur.
    5. En az bir çemberi serbest akan kanla doldurun, her daireye bir damla. Kan lekesinin kurumasına izin verin. Kan lekeleri iyice kuruyana kadar filtre kağıdını açık tutun.
    6. Toplama zamanı, işleme tarihi, zaman noktası ve örnek Tanımlama ile uygun şekilde etiketleyin.
    7. Şeffaf plastik fermuarlı bir saklama torbasına koyun. Kan leke kartlarını proteomik analize hazır olana kadar uzun süreli stabilite için −20 °C veya −80 °C'de saklayın.
  2. Ayakta tedavi kan alımı
    NOT: Yale Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayıyla, ayaktan tedavi katılımcılarının ebeveynlerine, evde mikroiğne kendi kendine toplama cihazı kullanarak kan örnekleri alma seçeneği sunuldu. Bu cihaz, cilde uygulanan lanset aracılığıyla kapiller kanı elde eder. Bu yöntemi seçen ebeveynler, klinik içi eğitim alarak gösteri kitleri kullandı ve ardından ayrıntılı yazılı talimatlar ile evde kullanım için toplama kitleri verildi.
    1. Kullanmadan önce ellerinizi yıkayın ve eldiven takın. Sadece bir ebeveyn kan toplama işlemi yapıyorsa bir ayna da dahil olmak üzere tüm gerekli eşyaları toplayın.
    2. Cihazı alet setinden çıkarın ve uyumlu bir tüpten kapağını dolayın.
    3. Tüpü cihazın içine sıkı bastırın, dolgu hatları dışa bakacak şekilde sıkı hale getirilsin.
    4. Bebeğin bezini çıkarın ve bebeği dik tutun.
    5. Isı paketinin talimatlarını takip ederek etkinleştirin.
      NOT: Eğer bir paket yoksa, başka bir ısıtma yöntemi kullanın, örneğin bir el kullanın.
    6. Isı paketini bölgede (kalçada) 2-4 dakika boyunca tutarak kan akışını ısıtın ve artırın.
    7. Bölgeyi alkol pediyle temizleyin ve kurumasına izin verin.
    8. Kırmızı düğmeden şeffaf kapağı çıkarın. Cihazın kabını çıkarın ve bebeğin kalçasının en dolgun kısmına sıkıca yapışarak dik tutun.
      NOT: Düzgün kan toplamak için tüpü tamamen dikey tutmak için duruşlarını gerekli şekilde ayarlayın.
    9. Düğmeye bir kez tamamen basıp bırak. Zamanlayıcıyı 5 dakika olarak ayarlayın. Tüpün dolmasını aynayla izleyin.
    10. İlk 1-2 dakika boyunca kan görünmeyebilir. Cihazı en fazla toplam 5 dakikadan sonra veya kan en üst gösterge çizgisine 5 dakikadan önce doluyorsa daha erken çıkarın.
    11. Tüpü cihazdan hafifçe döndürerek çıkarın ve aşağı çekin. Kapağı hızla tüpün içine tamamen takın. Tüpü en az 10 kez ters çevirin, her ters dönmede kanın kapağa temas ettiğinden emin olun ki pıhtılaşma önlenir.
    12. Numuneleri toplandıktan sonra gece gönderin.
  3. Tam kan örneği işleme
    1. Biyolojik bir güvenlik kabininde kan örneklerini işleyin.
    2. 250 μL kanı dikkatlice 10 mL 1x RBC lizis tamponu içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kan toplama tüpünü 10 mL RBC lizis tamponu ile boşalana kadar durulayın. Hücrelerin oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca lizleşmesine izin verin.
    3. Liz tamamlandıktan sonra, RT'de ~30 mL PBS ekleyip 430 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de spin yapın. Süpernatantı vakumla aspire edin, pelleti rahatsız etmeden.
    4. Hücre pelleti görünür kırmızı kan hücrelerinden arınmış görünene kadar 1.3.2 adımında belirtildiği gibi numuneyi aktarmaya ve durulamaya devam edin. 430 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın, ardından süpernatantı dikkatlice peleti rahatsız etmeden çıkarın.
    5. Toplanan her 250 μL kan için, ortaya çıkan hücre pelletini 2 mL dondurma ortamında (FBS'de %10 DMSO) yeniden askıya alın ve koruma için iki kriyovial'e bölünün.
    6. Hücre canlılığını kontrol etmek için hemositometre ile hemositometre ile feezing ortamında yeniden süspan yapılmasını kontrol edin.
    7. 1.3.5 aşamasından her kriyoviale 1 mL aktarın. Toplama zamanı, işleme tarihi, zaman noktası ve örnek Tanımlama ile uygun şekilde etiketleyin.
    8. Kriyovial(lar)ı arada -80 °C sıcaklıkta, izopropanol içeren dondurucu bir kapta sakla. 24 saat sonra, kriyovial(ler)i analiz için hazır olana kadar sıvı azota aktarın.

2. Kurumuş kan lekelerinden (DBS) kaynaklanan TMPA (Şekil 2)

  1. İşlem günü, filtre kağıdını RT'ye getirin. 3 mm metal delici kullanarak, kanın geçtiği filtre kağıdına mümkün olduğunca ortada kan noktasında 2-3 daire delik açın.
  2. Her 3 mm deliği cımbızla alın ve 96 kuyuluğa sahip bir plaka veya 20 μL elusiyon tamponu içeren düşük bağlanma PCR tüpünün bir kuyusuna ekleyin (1x PBS, 1x Proteaz İnhibörü, %0,05 Tween 20). Punch'ın elution buffer ile kaplı olduğundan emin olun.
  3. Tüpleri kapatın veya plakayı plastik bir etekle örtün ve 600 rpm'de RT hızında 60 dakika boyunca dönen Dijital Vortex'e yerleştirin.
  4. Kuluçka sonunda, eluatı dikkatlice yeni bir düşük bağlanma tüpüne veya 96 kuyruklu bir plakaya aktarın. Filtre deliklerinin olduğu tüpleri veya plakayı atın.
  5. Protein içeriğini BCA testiyle nicelikten ölçin.
    1. Her örnekten veya BSA standardından 2 μL alınarak 1:10 ve 1:100 suda seri seyreltmeler yapılabilir. Örnekleri ve standartları ikili olarak hazırlayın; 200 μL 1x çalışma çözeltisine 15 μL seyreltilmiş numune veya standart ekleyin. Örnekleri 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
    2. Sinyali plaka okuyucudan 562 nm'de oku. BSA standart eğim ve elusiyon tampon arka planına dayalı nihai protein konsantrasyonunu hesaplayın.
  6. Düşük bağlanma eğilimli 1,5 mL vida kapaklı mikro tüplerde 0,5-1 mg/mL örnekler için 30 μL alikotlar yapın. Örnekleri daha sonra TMPA servisi ile işlenmek üzere -80 °C'de dondurun.

3. RBC lizlenmiş kanın spektral akış sitometrisi (Şekil 3)

  1. Deney günü, RBC lizlenmiş hücrelerden oluşan bir şişe, 37 °C su banyosu, küçük bir buz damlası kalana kadar hızlıca eritilir.
  2. Hücre süspansiyonunu, 10 mL önceden ısıtılmış (37 °C) tam RPMI içeren 15 mL konik bir tüpe ekleyin (500 mL RPMI 1640, 50 mL FBS, 5,6 mL Penisillin-Streptomisin ve 5,6 mL glutamin takviyesi kullanılarak hazırlanmıştır). Oda sıcaklığında 400 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
  3. Pelleti 3 mL tam RPMI'da nazikçe tekrar süskü ve uygun bir yöntemle hücre sayısını belirleyin.
  4. Yeniden askılanan hücreleri oda sıcaklığında 400 × g boyunca 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı aspire edin ve atın.
  5. Hücre konsantrasyonunu tam RPMI'da 1 ×10 6 hücre/mL olarak ayarlayın. Her kuyu başına 100 μL (0.1 × 10⁶ hücre) 96 kuyruklu V-taban plakasına dağıtın. 764 × g sıcaklığında 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
  6. Tüm örneklere 1:2.000 seyreltme ile 1:2.000 seyreltme ile Fc bloğu ve monosit bloğu (1:100 seyreltme) ile 100 μL Live/Dead boya stoku ekleyin, lekelenmemiş kontrol hariç. 4 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
  7. 100 μL PBS ile yıkayın ve 764 × g sıcaklığında 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice at.
    NOT: Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için Fc blok ve monosit blok kullanmak şarttır.
  8. Tüm örneklere 100 μL yüzey kokteyli FACS tamponunda (1:200 seyreltme) eklenir (500 mL PBS, 2,5 g sığır serum albümini (BSA), 2 mM EDTA, pH 8,5) tüm örneklere (lekesiz kontrol hariç). 4 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  9. 100 μL FACS tamponu ile yıkayın ve 764 × g sıcaklığında 4 °C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice at.
  10. Her numuneye %4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. Karanlıkta RT'de 15 dakika kuluçka yapın.
  11. 100 μL FACS tamponu ile yıkayın, 764 × g'de 4°C'de 2 dakika santrifüj yapın ve 200 μL FACS tamponuyla yeniden süzülün.
  12. Ultra-comp boncukları tek renkli kontroller olarak hazırlayın. Tek renkli kontrol boncuklarını, örneklerle aynı protokolü kullanarak boyandırın; örnekler sabitlenmişse fiksasyon dahil.
  13. Numuneler için uygulanan aynı prosedürle floresan Minus One (FMO) kontrollerini hazırlayın.
    NOT: Tek renkli kontrolleri ve FMO'ları örneklerle aynı şekilde ele almak önemlidir. Örneğin, boyama sonrası örnekler sabitlenirse, FMO'lar ve tek renk kontrolleri de sabitlenmelidir.
  14. Örnekleri, tek renkli kontrolleri, lekesiz kontrolleri ve FMO kontrollerini konvansiyonel/spektral akış sitometresinde çalıştırın. Verileri yazılım kullanarak analiz edin.
  15. Kapıları uygun izotip ve FMO kontrollerine göre ayarlayın. İlk olarak, hücreler, ileri saçılma (FSC) ile yan saçılma (SSC) grafikini kullanarak lökosit popülasyonunu seçmek için kapı hücreleri; bu da enkaz dışlanmasına ve hücreleri boyut ile granülarlığa göre seçmeye yardımcı olur.
  16. Lökosit seçiminin ardından, kapı hücreleri ileri saçma alanı (FSC-A) ile ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) grafiki kullanılarak çiftleri dışlar.
    NOT: Bu, tek hücrelerin (singlet) seçimini sağlar; çapraz boyunca uzanan hücreler singlet olarak kabul edilirken, çift hücreler ve kümeler hariç tutulur.
  17. Hücreleri canlılık için kapatarak ölü hücreleri dışlamak için bir canlılık boyası kullanılır ve sonraki analizin sadece canlı hücreleri içermesini sağlar.
  18. Bu ilk kapı adımlarından sonra, farklı bağışıklık hücre popülasyonlarını alt kategorize etmek için belirli soy belirteçleri için canlı tek hücreleri daha fazla kapaj edin. Canlı tek hücreleri CD33 ekspresyonuna göre CD33+ miyeloid hücrelere ve CD33-lenfositlere ayırın.
  19. CD33+ popülasyonunda, CD14+ monositlerini ayırt edin ve CD11c+ dendritik hücreleri (DC'leri) CD11c'yi ifade eden ancak CD14 olmayan hücreler olarak tanımlayın.
  20. CD33-lenfosit popülasyonu içinde, CD3+ T hücreleri ve alt kapı CD4+ ve CD8+ T hücre alt kümelerini belirlemek için alt kapı kullanır.
  21. Ayrıca, CD56+ doğal katil (NK) hücrelerini CD56 ekspresyonuna göre, CD19+ B hücrelerini ise CD19 ekspresyonuna göre tespit edin.

4. RBC lizlenmiş kanın scRNA-seq'i (Şekil 4)

  1. 37 °C su banyosunda bir şişe kriyokonserve edilmiş RBC lizlenmiş hücreleri eritin. Örneği 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mL T-hücre ortamına ekleyin. Santrifüj 430 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun. Üst yüzeyi at.
  2. Numuneye 10 mL daha 1x PBS ekleyin. Santrifüj 430 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun. Üst yüzeyi at.
  3. Hücreleri sayın ve trypan blue ile canlılığı değerlendirin. Eğer yaşamlılık %70'in altındaysa, ölü hücre çıkarma kiti ile devam edin.
    1. Ölü hücre çıkarımı
      1. 20x Bağlama Tampon Stokunu steril, çift damıtılmış suyla seyreltirerek 1x çalışma çözeltisi elde edin.
      2. Hücre pelletini, 1 × 10-7 hücre başına 100 μL ölü hücre çıkarma Mikroboncuklarında askıya alın. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçka yapın.
      3. Manyetik ayırma kolonunu uygun manyetik standa yerleştirin. Kullanmadan önce kolonu 500 μL 1x Bağlama Tamponu ile durulayın, böylece denge sağlanır.
      4. Hücre hacmini 1x bağlama tamponu ile 500 μL'ye getirin. Hücre süspansiyonunu kolona uygulayın ve akışı yeni bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
      5. 2 kez 500 μL bağlama tamponu ile yıkayın. Akışı aynı mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
      6. Eluatı 300 × g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst yüzeyi at.
    2. Hücreleri sayın ve trypan blue ile canlılıklarını değerlendirin.
    3. Yeni 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünde %0,04 BSA ile 40 μL PBS içinde 20.000 canlı hücreyi yeniden askıya alın.
    4. Buz üzerindeki hücreleri hemen kütüphane üretimi ve dizilemesi için genomik çekirdek tesisine gönderin. Cell Ranger çıktıları formatında sıralama sonuçlarını toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

10 son derece erken bebekten DBS kartları üç zaman noktasında topladık: 1 hafta (n = 12), 1 ay (n = 7) ve 2 ay (n = 3) için TMPA proteomikanalizi 6 (Şekil 2A). Bu örnekler, tam dönem bebek kordon kanı (TCB; n = 4) ve sağlıklı yetişkin kanı (AB; n = 5) ile birlikte analiz edildi. 92 bağışıklık ilişkili proteinin normalize protein ekspresyonu (NPX) TMPA platformu kullanılarak nicele edilmiş (Şekil 2B). İsta...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yenidoğan ve bebek kanından minimum hacimlerden yüksek kaliteli immünolojik veriler elde etmek, birden fazla aşamada metodolojik uyumlar gerektirir. Bu protokolde dört tamamlayıcı strateji tanımlıyoruz: (i) kan toplama ve kriyokonserasyonun optimize edilmesi, böylece sonraki akım kullanımı için canlı hücreleri korumak, (ii) çok parametrik immünofenotipleme için spektral akış sitometrisinin uygulanması, (iii) yüksek çözünürlükte bağışıklık heterojenliğini çözmek için scRNA-seq ve (iv) TMP...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, çıkar çatışmaları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Yale'deki aşağıdaki çekirdek tesislere teşekkür ederiz: Yale Akış Sitometri çekirdeği; Yale Genom Analizi Merkezi. Yale Klinik Araştırma Merkezi, Yale Hekim-Bilim İnsanı ve Bilim İnsanı Gelişim Ofisi ile Pediatrik Kritik Bakım ve Travma Bilim İnsanı Geliştirme Programı/NICHD'ye teşekkür ederiz. Respirometri çalışmaları Yale Üniversitesi'ndeki Kimyasal Metabolizma Merkezi tarafından gerçekleştirildi. Bu çalışma, şu hibelerle finanse edilmiştir: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Kistik Fibroz Vakfı (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), Hartwell ödülü (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Yale Tıp Fakültesi, Pediatri Bölümü (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini mutlaka yansıtmaz. Şekil 1 BioRender'da oluşturulmuştur. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 3177165 
BCA Protein Test Kiti  Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific 22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1&°; C Dondurma Kontrolörü Millipore Sigma 41122800 
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Parlak Ultra Violet 496 Anti-Human CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Parlak Ultra Violet 661 Anti-İnsan CD11c BD BioScience 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Human CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, EDTA-sız Proteaz İnhibitörü KokteyliMillipore Sigma 11836170001 
Ölü Hücre Temizleme Kiti & nbsp;Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimetil Sülfoksit (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Dulbecco' s Fosfat tamponlu tuzlu (DPBS), kalsiyum içermeden, magnezyum ve nbsp içermez;Thermo Fisher Scientific 14190144 
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A5256801 
Fisherbrand Dijital Girdap Mikseri Thermo Fisher Scientific 02215418 
Fiksasyon Tamponu BioLegend 420801 
GlutaMAX TakviyesiGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
MS sütunları Miltenyi Biotec 130-042-201 
İsimŞirketKatalog Numarası
OctoMACS Ayrıcısı Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pacific Blue Anti-Human CD4 BioLegend 344619 
Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Anti-İnsan CD33 BD Biosciences 755606 
Rierdge 3mm Metal Delici Rierdge SDD231031PC-01 
RPMI 1640 OrtaGibco 11875-093 
Spark UV 387 Anti-Human CD19 BioLegend 302289 
Tasso Koleksiyon KitleriTasso Yok
Thermo Scientific Vida Kapağılı Mikro TüplerThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
Zombie NIR Düzeltilebilir Kullanılabilirlik Kiti BioLegend 423105 
yazılım ve paketler
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prizması9.4.0
İsimVersiyon
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
Ticari testler
Krom Tek Hücreli 5' Forma10X GenomiklerPN-1000263
Olink  Aşkar Et veya Hedef 96 İltihap PaneliOlinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Kaynaklar

  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Hücreli ProfillemeNeonatal İmmün SistemAkış SitometrisiBoylamsal İmmün ProfillemeProteomik İmzalarTek Hücreli RNA Dizilemeİmmün Hücre KümeleriMinimum Kan Hacmi
Bebek Bağışıklığını Minimum Girdiyle Haritalama: Bütünleşik Tek Hücreli ve Multiomik Profilleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.