Yöntem makalesi

Bebek Bağışıklığını Minimum Girdiyle Haritalama: Bütünleşik Tek Hücreli ve Multiomik Profilleme

DOI:

10.3791/70279

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yenidoğan ve pediatrik hastalardan alınan kan örneklerinin toplanmasını ve korunmasını ve bu örneklerdeki bağışıklık hücre popülasyonlarını karakterize etmek için scRNA-seq, proteomik ve spektral akış sitometrisinin uygulanmasını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğumda, yenidoğan bağışıklık sistemi aniden radikal farklı, mikrobiyal ve çevresel uyaranlar açısından zengin bir ortamla karşı karşıya kalır. Artan kanıtlar, erken yaşam bağışıklığının sadece olgunlaşmamış olmadığını, aynı zamanda bu gelişimsel pencerenin belirgin taleplerine benzersiz şekilde uyarlandığını göstermektedir. Bu dönemde, bağışıklık sistemi son derece dinamiktir ve değişen dış manzaraya uyum sağlamak için hızlı değişiklikler geçirir. Bu karmaşık ve evrimleşen bağışıklık ortamını anlamak, yenidoğan çocuklarda doğrudan çalışmayı gerektirir. Ancak, bu tür araştırmalarda büyük bir sınırlama, yenidoğanlarda düşük toplam kan hacmidir (~100 mL/kg), bu da özellikle çok düşük doğum ağırlığı (ELBW) veya çok erken doğuran bebeklerde araştırma için güvenli şekilde toplanabilecek miktarı sınırlar. Son çalışmalarımızda, yüksek boyutlu bağışıklık profillemenin çok küçük hacimlerde yenidoğan kanı kullanılarak nasıl yapılabileceğini göstererek bu sınırlamayı ele alıyoruz. Erken yaşamda boylamasına örnekleme için optimize edilmiş bir dizi protokol sunuyoruz ve minimum girdiden elde edilen bilgiyi en üst düzeye çıkarmak için akış sitometrisi, proteomik ve tek hücreli RNA dizileme gibi gelişmiş teknikler uygular. Bu yöntemler birlikte, yenidoğan bireylerde dolaşan bağışıklık hücrelerinin transkriptomik ve proteomik imzalarının kapsamlı bir görünümünü sağlar ve erken yaşam bağışıklığının benzersiz yörüngesine yeni bakış açısı sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, 100-250 μL kan örnekleri için optimize edilmiştir; alındıktan sonra 12 saat içinde işlenilir; ya kriyokonserve edilir ya da hemen kullanılır. Doğumda, yenidoğan bağışıklık sistemi, daha önce korunan rahim içiortamda olmayan mikrobiyal ve çevresel uyarıcılarla zenginleştirilmiş radikal farklılıklara yönlendirilir (1,2). Bu değişim, bağışıklık sisteminin çok sayıda yeni antijene uyum sağlamasını ve yanıt vermesini gerektirir; bu süreç hayatta kalmak için gereklidir ancak aynı zamanda önemli zorluklar da teşkileder 1,2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yale Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) uyarınca bilgilendirilmiş ebeveyn onayı ve ilgili ulusal etik düzenlemelere tam uyum sağlanmıştır. Onaylanmış IRB protokolünde belirtildiği gibi, bebeğin doğumundan sonraki ilk hafta içinde ebeveynlerle iletişime geçilerek kayıt öncesi onay alındı. Belgelenmiş etik onaydan önce insan kaynaklı materyallerle ilgili hiçbir çalışma prosedürü başlatılmamıştır.

1. Örnek toplama, işleme ve depolama (Şekil 1)

  1. Yatarak kan alımı
    1. Bebek örneklerini aldıktan sonra toplayın ve işleyin, 4 °C'de saklanın ve toplandıktan son....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10 son derece erken bebekten DBS kartları üç zaman noktasında topladık: 1 hafta (n = 12), 1 ay (n = 7) ve 2 ay (n = 3) için TMPA proteomikanalizi 6 (Şekil 2A). Bu örnekler, tam dönem bebek kordon kanı (TCB; n = 4) ve sağlıklı yetişkin kanı (AB; n = 5) ile birlikte analiz edildi. 92 bağışıklık ilişkili proteinin normalize protein ekspresyonu (NPX) TMPA platformu kullanılarak nicele edilmiş (Şekil 2B). İsta.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yenidoğan ve bebek kanından minimum hacimlerden yüksek kaliteli immünolojik veriler elde etmek, birden fazla aşamada metodolojik uyumlar gerektirir. Bu protokolde dört tamamlayıcı strateji tanımlıyoruz: (i) kan toplama ve kriyokonserasyonun optimize edilmesi, böylece sonraki akım kullanımı için canlı hücreleri korumak, (ii) çok parametrik immünofenotipleme için spektral akış sitometrisinin uygulanması, (iii) yüksek çözünürlükte bağışıklık heterojenliğini çözmek için scRNA-seq ve (iv) TMP.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, çıkar çatışmaları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yale'deki aşağıdaki çekirdek tesislere teşekkür ederiz: Yale Akış Sitometri çekirdeği; Yale Genom Analizi Merkezi. Yale Klinik Araştırma Merkezi, Yale Hekim-Bilim İnsanı ve Bilim İnsanı Gelişim Ofisi ile Pediatrik Kritik Bakım ve Travma Bilim İnsanı Geliştirme Programı/NICHD'ye teşekkür ederiz. Respirometri çalışmaları Yale Üniversitesi'ndeki Kimyasal Metabolizma Merkezi tarafından gerçekleştirildi. Bu çalışma, şu hibelerle finanse edilmiştir: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Kistik Fibroz Vakfı (L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), Hartwell ödülü (N.N.B.); K08DK133687 (O.O.), Yale Tıp Fakültes....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific 15575-038 
1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 3177165 
BCA Protein Test Kiti  Abcam ab287853 
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific 22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1&°; C Dondurma Kontrolörü Millipore Sigma 41122800 
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-Aldrich A9647-100G 
Parlak Ultra Violet 496 Anti-Human CD3 Thermo Fisher Scientific 364-0038-42 
Parlak Ultra Violet 661 Anti-İnsan CD11c BD BioScience 612968 
Brilliant Vil750 Anti-Human CD14 BioLegend 367135 
Brilliant Violet 570 Anti-Human CD8a BioLegend 301038 
Brilliant Violet 711 Anti-Human CD56 BioLegend 318336 
cOmplete, Mini, EDTA-sız Proteaz İnhibitörü KokteyliMillipore Sigma 11836170001 
Ölü Hücre Temizleme Kiti & nbsp;Miltenyi Biotec 130-090-101 
Dimetil Sülfoksit (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 
Dulbecco' s Fosfat tamponlu tuzlu (DPBS), kalsiyum içermeden, magnezyum ve nbsp içermez;Thermo Fisher Scientific 14190144 
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco A5256801 
Fisherbrand Dijital Girdap Mikseri Thermo Fisher Scientific 02215418 
Fiksasyon Tamponu BioLegend 420801 
GlutaMAX TakviyesiGibco 35050061 
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 
MS sütunları Miltenyi Biotec 130-042-201 
İsimŞirketKatalog Numarası
OctoMACS Ayrıcısı Miltenyi Biotec 130-042-109 
Pacific Blue Anti-Human CD4 BioLegend 344619 
Penisillin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific 15140-122 
RB780 Anti-İnsan CD33 BD Biosciences 755606 
Rierdge 3mm Metal Delici Rierdge SDD231031PC-01 
RPMI 1640 OrtaGibco 11875-093 
Spark UV 387 Anti-Human CD19 BioLegend 302289 
Tasso Koleksiyon KitleriTasso Yok
Thermo Scientific Vida Kapağılı Mikro TüplerThermo Fisher Scientific 14-755-287 
Whatman 309 ProteinsaverCytiva 41111700 
Zombie NIR Düzeltilebilir Kullanılabilirlik Kiti BioLegend 423105 
yazılım ve paketler
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prizması9.4.0
İsimVersiyon
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
Ticari testler
Krom Tek Hücreli 5' Forma10X GenomiklerPN-1000263
Olink  Aşkar Et veya Hedef 96 İltihap PaneliOlinkhttps://olink.com/products/olink-target-96

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life edu....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H creli ProfillemeNeonatal mm n SistemAk SitometrisiBoylamsal mm n ProfillemeProteomik mzalarTek H creli RNA Dizilememm n H cre K meleriMinimum Kan Hacmi

İlgili makaleler