Yöntem makalesi

Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

DOI:

10.3791/70283

⸱

30 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, membran proteini TWIK ile ilişkili asite duyarlı K+ kanal 2'nin (Görev 2) nanodisklere yeniden yapılandırılması prosedürünü özetlemektedir. Başarılı montaj, iyi tanımlanmış iki boyutlu sınıf ortalamaları elde eden tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi ile doğrulandı.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok zar proteini, deterjan bazlı ortamlarda çıkarıldığında zayıf kararlılık, aktivite kaybı ve örnek heterojenliği sergiler; bu da yüksek çözünürlüklü kriyoelektron mikroskopi analizi için önemli zorluklar oluşturur. Nanodisk teknolojisi, hedef proteinleri doğal bir lipid çift tabakasına dönüştürmek için membran iskelet proteinleri (MSP) ve fosfolipidler kullanarak bu sınırlamaları gider. Bu çalışmada, insan potasyum kanalı Task2, nanodisk montajından önce uygun deterjanların varlığında eksprese edildi, çözündü ve saflaştırıldı. Ortaya çıkan protokol, Task2 nanodisk yeniden yapılandırması için tekrarlanabilir bir iş akışı oluşturur; bu da temel doğrulama adımlarıyla gösterilir: parçacık büyütmesini doğrulayan boyut dışlama kromatografisi (SEC) profillerinde net bir değişim, SDS-PAGE'de Task2 ve MSP'nin birlikte göçü ve görünür ikincil yapı özellikleriyle iyi tanımlanmış 2D sınıf ortalamaları. İlk 3D yeniden yapılandırma, nanodiskle gömülü proteinin bütünlüğünü daha da doğrular. Örnek saflığını, homojenliğini ve parçacık kalitesini iyileştirerek, bu yaklaşım Görev 2'nin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için sağlam bir platform sağlar ve diğer membran proteinlerine uygulanabilir bir metodolojik çerçeve sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zar proteinleri, hücresel sinyal iletiminde, metabolit taşınmasında, hücre yapısal bütünlüğünü korumada ve bağışıklık yanıtlarında kritik bir rol oynar. Zar proteinlerinin düzensizliği çeşitli hastalıklarda rol oynar ve bu da onları ilaç geliştirme için önemli hedefleryapar 1. Kriyo-elektron mikroskopinin (kriyo-EM) ortaya çıkışı, büyük ve dinamik zar proteinlerinin yapısal çalışmalarınımümkün kılmıştır 2. Yüksek çözünürlüklü yapılar elde etmedeki temel zorluklardan biri, bu proteinleri doğal lipid çift katmanlarından çıkarırken onların doğal konformasyonlarını ve biyokimyasal işlevlerini korumaktır. Ayrıca, membran proteinlerinin son derece dinamik konformasyonu ve antikor taramasının karmaşıklığı, hedefli ilaç keşfine ek engelleroluşturur 3,4. Geleneksel membran protein ekstraksiyon yöntemleri, hidrofobik lipid çift tabakasının özelliklerini taklit etmek için genellikle deterjan kullanır. Ancak bu yaklaşım genellikle zar protein stabilitesini bozur ve bu da toplamaya veya kısmi açılmaya yolaçar 5. Ayrıca, deterjanlar, protein konformasyonunu stabilize etmek için kritik olan temel lipid moleküllerini uzaklaştırabilir; bu da protein konformasyonunu değiştirebilir veya hatta işlevi bozabilir; böylece antikor taraması ve diğer sonraki uygulamalarda uygulamalarınısınırlayabilir 6.

Nanodisk teknolojisi ilk olarak Sligar vemeslektaşları tarafından tanıtıldı 7. Bu kendi kendine oluşan yapı genellikle apolipoprotein A1 (ApoA1) türevleri olan MSP'ler, sentetik veya doğal lipidlerle birlikte oluşur ve membranproteinleri 7,8,9 için kararlı bir ortam sağlar. MSP, lipid çift tabakasının hidrofobik kenarlarını çevreleyerek disk şeklinde bir yapı oluşturur. Bu yapı, asil lipid kuyruklarıyla etkileşime giren hidrofobik bir yüzeye sahiptir, zar proteinini stabilize eder ve dışa bakan hidrofilik bir yüzeye sahiptir; bu yüzey zar proteininin sulu çözeltilerdeçözünür kalmasını sağlar 10. Nanodiskler, membran protein çalışmaları için çok yönlü bir platform olarak hizmet verir. Saflaştırılmış zar proteinlerini neredeyse doğal bir lipid ortamında koruyarak, geleneksel deterjan bazlı yöntemlerin sınırlamalarını aşarak proteinlerin konformasyonunu ve biyolojik işlevini in vitro korurlar. Sonuç olarak, bu yöntem zar proteinlerinin yapısal çalışmaları için güçlü bir araç haline gelmiştir. Geleneksel deterjan ortamlarına kıyasla, nanodisklerdeki lipid çift tabakası zar proteinlerine yapısal destek sağlar ve onların doğal konformasyonunu stabilize eder—bu, G proteinine bağlı reseptörler ve iyonkanalları 11 gibi inaktivasyona yatkın proteinler için hayati öneme sahiptir. Ayrıca, nanodisk parçacıklarının montajdan sonra son derece uniform yapısı, yüksek kaliteli kriyo-EM verileri ve güvenilir yüzey plazmoni rezonansı/biyo-katman interferometrisi kinetik verileri elde etmek için daha güçlü desteksağlar 12.

Son on yılda, nanodisk teknolojisi doğal lipid ortamlarında membran proteinlerini incelemek için güçlü bir araç haline geldi. Örneğin, Vilela vemeslektaşları 13, yeniden yapılandırma koşullarını optimize ederek ve nihai bileşenlerin kalitesini doğrulayarak nanodisk montajı için sistematik bir çerçeve oluşturmuşlardır. Özellikle, boyut dışlama kromatografisini (SEC) niceliksel göstergelerle (montaj verimliliği ve zirve simetrisi dahil) birleştirerek örneklerin homojenliğini objektif olarakdeğerlendirmişlerdir 13. Şu anda nanodiskler çok yönlü bir platform haline gelmiştir. Nanodiskle yeniden oluşturulmuş proteinlerin tespit edilmesinde tek parçacıklı kriyo-EM kullanılarak zar proteinlerinin yüksek çözünürlüklü yapıları elde edilebilir ve uygulanabilirlikleri kesin olarak belirlenmiştir. MSP bandının çift halka yoğunluk özelliği,10,14,15'in başarılı bağlanmasının belirleyici yapısal kanıtıdır. Ayrıca, nanodiskler hem membran proteinlerinin lipid çift katmanlı ortamlarda fonksiyonel analizi hem de çözelti nükleer manyetik rezonans çalışmalarında uygulanması için değerli bir araçolarak hizmet vermektedir 16,17.

Bu protokol, insan Task2 zar proteininin nanodisklere birleştirilmesi için bir yöntem tanımlar. İnsan Görevi2, iki gözenekli alan K+ (K 2P) kanalailesi 18,19'un pH-kaplı bir üyesidir. Diğer K2P kanalları gibi, Görev 2 de alan değiştirilmiş bir homodimerdir; her protomer zincirinde dört transmembran kapsayan sarmal (TM1–TM4), iki yeniden giriş gözenek sarmalı (PH1 ve PH2), iki seçicilik filtresi (SF1 ve SF2) ve iki ekstrahücre kapanma sarmal (CH1 ve CH2) bulunur. Hedef protein, C-terminal 166 amino asitlerinden yoksun ve kısaltılmış bir Task2 formuydu—bu bölgenin büyük ölçüde yapılandırılmamış olduğu tahmin ediliyor—ve bu bölgenin protein ifadesini ve biyokimyasal stabiliteyi iyileştirdiği bulundu. Yeniden birleştirilmiş Görev2'nin moleküler ağırlığı yaklaşık 72 kDa'dır ve GFP etiketi vardır. Önceden bir deterjanla çözülüp arıtılmıştı. Lipidler ve MSP ile hassas hesaplanmış bir stoikiyometrik oranda birleştirildi. Bio-Beads kullanılarak deterjan çıkartılmasının ardından, örnek boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile daha da arıtıldı ve kriyo-EM için uygun bir hazırlık elde edildi. Daha sonra örnek bütünlüğünü doğrulamak için tek parçacıklı kriyo-EM verilerinden iki boyutlu (2D) sınıf ortalamaları oluşturuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lipid stokunun hazırlanması

  1. Lipid Hazırlığı
    1. Üç fosfolipid kullanılarak lipid karışımları hazırlayın: 1,2-Dioleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 2-oleoyl-1-palmitoilglisero-3-fosfokolin (POPC) ve 1-palmitoil-2-oleoylfosfatidilserin (POPS).
    2. Bu lipidlerin önceden hazırlanmış stok çözeltilerini kloroformda kullanarak, her biri 25 mg/mL konsantrasyonda kullanın.
      NOT: Kloroform kullanılırken kişisel koruyucu ekipman gereklidir ve tüm işlemler bir duman davlumanında yapılmalıdır. Kloroformu özel bir kimyasal dolapta sakla.
    3. Kloroformun volevtikliği nedeniyle, mikro şırıngayla ölçülürken, lipid stok çözeltisinin hacminin her kullanımdan önce kaydedilen hacmle eşleştiği doğrulanacaktır. Buharlaşma olursa, çözeltiyi saf kloroformla orijinal hacme yenileyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Her ölçümden önce mikro şırıngayı kloroformla iki kez durulayın.
    4. 100 μL lipid karışımı hazırlayın; kütle oranı DOPE:POPC:POPS = 2:1:1. Bu orana dayanarak, 50 μL VDOPE, 25 μL VPOPC ve 25 μL VPOPS birleştirin. Hesaplanan sayıya göre ilgili hacmi ölçün. Cam test tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın.
    5. Cam test tüpünü kloroformun buharlaşmasını azaltmak ve ortam sıcaklığını sabit tutmak için su banyosuna yerleştirin.
  2. Lipid film hazırlığı
    1. Kloroformu, tüm sıvı tamamen uzaklaştırılana kadar hafif bir azot gazı akışı altında buharlaştırın ve test tüpünün dibinde şeffaf, homojen jel benzeri bir film oluşana kadar.
      NOT: Cam tüpün tabanında tekerer, kuru bir lipid filmi göründüğünden ve kalıntı sıvı damlaları olmadığından emin olun. Aşırı azot akışından kaçının, çünkü bu köpüklere neden olabilir ve kloroformun tamamen kurumasını engelleyebilir.)
    2. Yaklaşık 2 mL n-pentan damla olarak cam test tüpüne ekleyin. Daha sonra 1.2.1'de tanımlanan azot kurutma yöntemiyle çözücü buharlaştırılır ve kuru, şeffaf bir lipid filmi elde edilir. n-Pentan, kimyasal hareketsizliği ve organik çözücülerle uyumluluğu nedeniyle cam test tüpünde buharlaştırılır. Cam, birçok plastik laboratuvar malzemesi malzemesinde bulunan plastik sızma veya bozulma riskini önler, böylece film oluşumu sırasında lipid saflığını korur.
      NOT: n-Pentane özel bir reaktif dolabında saklanmalı ve kullanıldığında, uygun kişisel koruyucu ekipman takılırken duman kaputu içinde dikkatlice tutulmalıdır.
    3. Test tüpünün kapağını gevşetir ve vakum kurutucuya yerleştir. Kurutucuyu boşaltın ve kalan çözücüleri çıkarmak için vakum altında kalın. Nemi emmek için kuruducunun altına kendini gösteren silika jel yerleştirin.
      NOT: Buharlaştırma kapasası içinde kalıntı kloroform ve n-pentanı kuruyana kadar buharlaştırın.
  3. Lipid hidratasyonu ve stok çözelti hazırlama
    1. Vakum kurutucudan lipid filmi çıkarılır ve 250 μL deterjansız düşük tuzlu tampon (LSB) ekleyerek hidratlandırın (Ek Tablo 1). Bu, nihai lipid konsantrasyonu 10 mg/mL verir.
      NOT: Task2'nin potasyum iyon kanalı olması nedeniyle potasyum iyon bazlı bir tampon seçildi
    2. Lipid yeniden süzüldükten sonra, lipid dört cam tüpe eşit şekilde bölünür ve süspansiyonlar berrak ve şeffaf hale gelene kadar soniklenir; bu da başarılı lipozom oluşumunu gösterir (yaklaşık 1,5 saat). Sonikasyon %60 genlikte 4 saniye açık ve 6 saniye kapalı bir döngü ile gerçekleştirin.
    3. Temizleştirilmiş lipid çözeltisi ve aliquot 1,5 mL ayrı mikrosantrifüj tüplerine biriktirin. Her tüpün baş boşluğunu hemen azot gazıyla yıkayın ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

2. MSP'nin aşırı ifade edilmesi ve arındırılması

  1. MSP'nin prokaryotik ekspresyonu
    1. Plazmid dönüşümü: 7×His etiketi taşıyan MSP1D1 plazmidini kullanarak E. coli BL21 (DE3) yetkili hücreleri dönüştürülür. Dönüşüm karışımını kanamisin (50 μg/mL) içeren Luria-Bertani (LB) agar plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka geçirerek tek koloni elde edin.
    2. Kültür amplifikasyonu: Tek bir klon seçip kanamisin içeren 5 mL LB ortamına aşılayın ve gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak kuluçka yapın. Gece kültürünü sıvı LB ortamına 1:100 oranında aşılayın, ardından 37 °C'de sallanarak 600 nm (OD600) optik yoğunluğu 2.0–3.0 seviyelerine ulaşana kadar büyütür.
    3. Protein ekspresyonu indüksiyonu: MSP ekspresyonunu izopropil β-d-1-tiogalaktopiranozid (IPTG) ile nihai konsantrasyona 0,5–1 mM olarak indükleyin. Hücreleri 16 °C'de 16–20 saat boyunca çalkalayarak kültüre devam edin.
  2. Hücre bozulması
    1. Pellet Toplama: Bakteriyel kültürü 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlenin. Süpernatantı atın ve hücre pelletini kalın.
    2. Bakteri lizisi: 1 L kültürden elde edilen peleti 100–150 mL Lysis tamponu içinde yeniden askıya alın (Ek Tablo 1). Görünür bir küme olmadan eşit bir süspansiyon elde edilene kadar iyice homojenize edin. Proteazları engellemek ve köpüklenmesi azaltmak için süspansiyona PMSF ekleyin.
    3. Sonikasyon: Bakterileri kırmak için soğutmalı ultrasonik hücre bozucu kullanın. Gücü %35'e ayarlayın ve 3 saniyelik darbe ve ardından 6 saniyelik duraklamalar döngüleri uygulayın. Aşırı ısınmayı önlemek için, her 15 dakikalık kümülatif sonikasyon süresinden sonra 2 dakikalık bir dinlenme aralığı bırakın. Lizat berrak ve açık kahverengi olana kadar devam edin.
    4. Açıklama: Lizat 30.000 g'de 45 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin ve sonraki adımlar için süpernatantı toplayın.
  3. MSP arıtma
    1. Ni-NTA Reçine Hazırlanması: 3–5 mL Ni-NTA reçine alın ve yerçekimi kolonuna (boyut: 26,4×134,8 mm) paketleyin. Reçineyi 3 sütun hacmi (CV) damıtılmış su ile yıkayın ve 3 CV Wash Buffer 1 ile dengeleyin (Ek Tablo 1).
    2. MSP'nin Reçine'ye bağlanması: Hücre lizatının santrifüjlenmesiyle üst örtü dengelenmiş Ni-NTA reçinesi ile karıştırılır. 5 mM nihai konsantrasyona imidazol ekleyin ve karışımı 4 °C'de 2 saat boyunca hafif bir döndürerek inkübe yapın.
    3. Safsızlıkları gidermek için yıkama: Her tampondan en az 50 mL kullanarak Yıkama Tamponu 1, Yıkama Tamponu 2 (Ek Tablo 1) ve Yıkama Tamponu 3 (Ek Tablo 1) gradyanlarıyla sıralı yıkayın. Akışın 280 nm (A280) UV soğurgunluğunu izleyin ve A280 değeri 0.01'in altına düşene kadar yıkamaya devam edin.
    4. Elution: Hedef proteini Elution Buffer (Ek Tablo 1) ile elüasyon yapın ve elüat fraksiyonlarını toplayın. Elyutisyon sürecine devam edin, eluatın A₂₈₀ değeri 0.01'in altına düşene kadar kesirleri toplayın.
    5. Süreç İzleme ve Analizi: Üst aşama, çökeltme, akış, yıkama fraksiyonları ve elusiyon fraksiyonları dahil olmak üzere temel arıtma aşamalarından örnekler toplayın. Bunları SDS-PAGE ile analiz ederek arıtma verimliliğini değerlendirin (Ek Şekil 1).
    6. Tampon Değişimi için Diyaliz: Biriktirilen elyatı diyaliz tüplerine aktarın ve 4 °C'de Diyaliz Tamponuna (Ek Tablo 1) karşı gece boyunca hafif karıştırarak diyaliz yapın.
    7. Ultrafiltrasyon ve konsantrasyon: Diyalizlenmiş çözeltiyi ultrafiltrasyon cihazı kullanarak nihai MSP konsantrasyonu 2–5 mg/mL olarak konsantre edin. Arındırılmış ve konsantre MSP artık membran protein nanodisk montajında kullanıma hazırdır.

3. Biyo-Boncukların Aktivasyonu

  1. Tartma
    1. Yaklaşık 250 mg Bio-Beads'i analitik bir tartı kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne tartın.
  2. Metanol yıkamaları
    1. Tüpe 25–30 mL metanol ekleyin. Karışımı karanlıkta iyice döndürün veya vortex yapın, ardından 20 dakika kuluçka yapın. Kuluçkadan sonra süpernatantı dikkatlice atın.
    2. Bu metanol yıkama adımını toplamda üç kez tekrarlayın.
      NOT: Metanolun değişkenliği nedeniyle, bu işlem uygun kişisel koruyucu ekipmanla birlikte bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Kullanılmış metanol toplayın ve bunu biyolojik atık sıvı olarak ele alın.
  3. Sulu yıkamalar
    1. Boncuklara 25–30 mL ddH2O ekleyin. Tüpü karıştırmak ve inkübe yapmak için 20 dakika sallayıp döndürün.
    2. Üst yüzeyi at. Bu sulu yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
  4. LSB ile denge
    1. Boncuklara 25–30 ml deterjan içermeyen LSB ekleyin. Tüpü döner bir masada sallayın veya döndürerek 20 dakika karıştırın ve kuluçka yapın.
    2. Üst yüzeyi at. Bu LSB dengeleme adımını üç kez tekrarlayarak boncukları tam olarak koşullandırın.
  5. Aliquote ve depolama
    1. Aktive edilen Biyo-Boncukları üç adet 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne eşit olarak bölünür. Boncukların az miktarda LSB ile nemli kaldığından emin olun.
    2. Tüpleri ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın ve hemen kullanılmak üzere buzda saklayın.

4. Nanodiskin montajı

  1. Lipid ve MSP Hazırlanması
    1. Lipid Stok Açıklaması: Önceden hazırlanmış lipid stokundan bir aliquot alın ve çözülür. Tüpü hemen 7.000 x g hassasiyetinde 5 saniye boyunca 4 °C'de santrifüjle ederek içeriği alt kısımdan toplayın.
    2. Ultrasonik su banyosunda ultrason yapın ve aşırı ısınmayı önlemek için her 5–10 dakikada bir berraklık ve sıcaklığı izleyin. %60 genlikte sonikasyon yapın. Lipid stokunu ultrasonla ultrasonla inceleyin, ta ki lipid stoku berrak ve şeffaf hale gelene kadar.
    3. MSP eritmesi: Hazırlanmış MSP çözeltisinin 1 aliquotunu buzlu su banyosunda erit.
  2. Tamponu stoikiyometrik orana göre hazırlayın.
    1. Membran Proteinini Nicel Olarak Ölçin: Boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile %0,025 DDM/%0,005 CHS içinde çözünürülmüş saflaştırılmış zar proteinini (Görev 2) izole edin. Superose 6 Artış kolonuna (Cytiva) 0,5 mL/dakika akış hızıyla 500 μL örnek hacmi enjekte edin. 14,8 mL'deki zirve elütasyonunu toplayın ve konsantre edin (Şekil 1). NanoDrop kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
    2. Protein Molar Miktarını Hesaplayın: Hedef zar proteininin azı miktarını (n) şu formülle hesaplayın: n = C × V, burada C moler konsantrasyonu, V ise hacmdir.
    3. MSP ve Lipid Hacimlerini Belirleyin: Hedef proteinin molyar stoikiyometrik oranına göre gerekli MSP ve lipid stok çözelti hacimlerini hesaplayın: MSP : lipid = 1 : 5 : 250.
    4. Ana Karışımı Hazırlayın: Hesaplama sonuçlarına dayanarak, ilgili lipid ve MSP hacimlerini birleştirerek 300 μL'lik bir ana karışım hazırlanır.
      NOT: Bu karışıma deterjan dahil edildiğinden emin olun, böylece protein çözeltisindeki konsantrasyonla tutarlı bir konsantrasyon sağlanır ve böylece erken agregasyonu önler.
  3. Deterjan çıkarımı ve nanodisk montajı
    1. Yeniden Yapılandırma Karışımı ile İlk Kuluçka: Hazırlanmış karışım tamponunu (Ek Tablo 1) buz üzerinde 10 dakika kuluçka yapın. Sonra, karışımı yavaşça 50 μL konsantre protein çözeltisine ekleyin ve homojenliği sağlamak için pipetle nazikçe karıştırın.
    2. Protein-Lipid Karışımının Dengelenmesi: Kombine karışımı 1 saat buzun üzerine koyun. Tüpü her 15 dakikada bir nazikçe ters çevirerek iyice karıştırın.
    3. Bio-Beads ile İlk Kuluçkalama: Karışımı 7.000 x g ile 5 saniye boyunca 4 °C'de kısa bir süreliğine santrifüjle ederek tüpün dibindeki protein çözeltisini toplayın. Önceden aktive edilmiş Biyo-Boncuklardan bir aliquot alın, kalan LSB'yi aspire edin, protein çözeltisini boncuklara ekleyin ve hedef proteinin ışıkla indüklenen bozulmasını önlemek için karanlıkta 1 saat döndürerek inkübe yapın.
    4. Bio-Beads ile İkinci Kuluçkalama: Karışımı 7.000 x g sıcaklığında 4 °C'de 5 saniye boyunca santrifüjlenin ve süpernatantı dikkatlice ikinci bir Bio-Beads aliquotuna (LSB de buradan aspirasyon almıştır) aktarın ve karanlıkta nazik inversiyonla 4–8 saat veya gece boyunca iyi karıştırın.
    5. Bio-Beads ile Son Kuluçka: Gece kuluçkasından sonra protein çözeltisini alın, kısa bir süreliğine santrifüj edin ve süpernatantı önceden aktive edilmiş Bio-Beads'in üçüncü ve son kısmına aktarın. Karanlıkta 4 °C sıcaklıkta 1 saat boyunca dönerek kuluçka yapın.
    6. Kısa bir santrifüjlemenin ardından, süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve agregaları çıkarmak için 17.000 x g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Kullanılmış Biyo-Boncukları biyolojik atık olarak bertaraf edin.
    7. Nanodisklerin Arıtılması: Nanodisk-Task2 komplekslerini boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile arındırın: Superose 6 Increase kolonuna 0,5 mL/dakika akış hızında 500 μL örnek hacmi enjekte edin ve 15 mL'de elütlenen zirve toplayın (Şekil 2).
    8. Son Ürünün Konsantrasyonu: SEC elülyasyonundan çıkan zirve fraksiyonları bir topa alın ve kriyo-EM örnek hazırlığı için uygun olan 1,2–1,5 mg/mL nihai nanodisk-Task2 konsantrasyonuna konsantre olun.

5. Nanodisk montajının başarılı olduğunu doğrulayın

  1. SDS-PAGE Analizi: SEC ile saflaştırılmış fraksiyonlardan Aliquot örnekleri.
    1. Örnekleri %12 SDS-PAGE kullanarak analiz ederek anahtar bileşenlerin (örneğin, MSP ve hedef membran proteini) varlığını doğrulayın; bu da başarılı nanodisk montajını gösterir (Şekil 3).
  2. Kriyo-EM Örnek Hazırlığı ve Analizi.
    1. Başarılı şekilde monte edilen örneği kriyo-EM numune hazırlamak için 1,2–1,5 mg/mL nihai konsantrasyona konsantrasyonla konsantre edin.
    2. Örneği 17.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle yaparak başlayın. 3 μL damlayı, taze parlayan Quantifoil R1.2/1.3 altın ızgaralarına (300 ağ, delikli karbon) bırakın.
    3. 4 °C'de, %100 nemde 5 saniye kuluçka yapın. Bir Vitrobot Mark IV ile ızgarayı 4 saniye boyunca lekeleyip sıvı azot sıcaklığında tutulan sıvı etanda daldırma-dondurma yapın.
    4. 300 kV'da çalışan ve Falcon G4i doğrudan elektron dedektörüyle donatılmış bir Titan Krios G4 kriyo-EM üzerinde EPU yazılımı kullanarak süper çözünürlüklü film yığınları toplayın.
    5. Pozlama süresini 2.78 saniyeye ayarlayın; bu da 0,73 ş(165k ×) piksel boyutuna ve EER film yığını başına yaklaşık 50 e⁻/ş2 toplam birikmiş doza karşılık gelir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipid stokunun başarılı bir şekilde hazırlanması, sonikasyondan sonra berrak ve şeffaf bir çözeltinin oluşmasıyla gösterilmiştir. MSP için, nikel affinitesi kromatografisi yaklaşık 3 mg/mL ile yüksek saflıkta bir ürün verdi. Nanodisklerin montajı, SEC ile doğrulandı ve bu özellik karakteristik bir elusiyon profili gösterdi (Şekil 2). Nanodisk montajından önce elde edilen Task2 SEC profiliyle (Şekil 1) karşılaştırıldığında, protein zirvesi montajdan sonra dah...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, deterjanla çözünürülmüş zar proteinlerinin deterjan çıkarımı yoluyla nanodisklere yeniden oluşturulması ve böylece daha doğal bir lipid çift tabakalı ortam sağlanması için sunulmaktadır. Bu montaj sürecinin başarısı birkaç önemli faktöre bağlıdır. Bunların en önemlisi, membran proteini, MSP ve lipidler arasındaki hassas stoikiyometrik orandır. Yanlış stoikiyometrik oranlar protein toplamasına veya başarısız bir montaja yol açabilir. Örneğin, nanodiskleri 1:2:50 oranında birleş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Henan Üniversitesi kriyo-EM Merkezi personeline ve Profesör Wei Wang'a uzman destekleri için teşekkür ediyor. Fonlama Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından sağlandı (B.L.'ye 32371261 ve R.Z.'ye 32301011 hibeler).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Biyo-boncuklarBio-rad1523920
Kolesteril hemisüksinatAnatraceCH210
KloroformSinoreagentBuharlı bir davlumbazda kullanım
HARIKAAvanti850725P
MetanolSinoreagent
n-Dodesil-beta-D-maltozidAnatraceD310
n-pentanAdamasBuharlı bir davlumbazda kullanım
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radDoğru kullanım için üretici protokolünü takip edin
SnakeSkin Diyaliz TüpüTermo68011
Superose  6 Artış10/300 GLCytiva29091596
Ultrafiltrasyon Spin Kolonları Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Nanodisk TeknolojisiMembran skele ProteinleriLipid ift TabakasTask2 Potasyum KanalProtein Rekonstit syonuBoyuta Ba l D lama KromatografisiSDS PAGEKriyo Elektron MikroskopisiProtein Safla t rma

İlgili makaleler