Fructus xanthii Ekstrakt, kıkırdak bütünlüğünü koruyarak osteoartriti hafifleter

Özet

Bu çalışma protokolü, Fructus Xanthii ekstraktının osteoartritte potansiyel kondroprotektif etkilerini, entegre çoklu omik analizler ve in vivo deneyler yoluyla sistematik olarak incelemek için tasarlanmıştır.

Özet

Osteoartrit (OA), mevcut farmakolojik ve cerrahi müdahalelerin temel patolojik değişiklikleri tersine çevirmek yerine semptomları hafiflettiği ilerleyici bir dejeneratif eklem hastalığıdır ve bu da yeni tedavi etkenlerine acil ihtiyacı vurgular. Bu protokol, Fructus Xanthii ekstraktının OA'ya karşı potansiyel kondroprotektif etkilerini araştırmayı amaçladı. İlk olarak, ekstra kimyasalın bileşenlerini karakterize etmek için ultra-yüksek performanslı sıvı kromatografi ve yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi (UHPLC-HRMS/MS) kullanılarak hedefsiz metabolomik profilleme yapıldı. Daha sonra, ağ farmakolojisi ve transkriptomik madenciliği birleştiren entegre bir strateji, ekstraktın biyoaktif bileşenleri ve muhtemel hedefleri belirlemek için uygulandı, ardından OA ile ilişkili düzensiz genlerle çapraz analiz yapılarak çekirdek hedef genler elde edildi. Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri, ekstrakt tarafından modüle edilen ana biyolojik süreçleri ve sinyal yollarını notasyonlamak için gerçekleştirildi. In vivo doğrulama için, ekstraktın kondroprotektif etkilerini değerlendirmek için zebrafish kıkırdak yaralanma modelleri ve fare OA modelleri kullanıldı. Tedavi sonrası kondrositlerdeki transkriptomik değişiklikleri analiz etmek için RNA dizileme (RNA-dizi) daha sonra benimsendi; OA ile ilişkili yollar ve gen ifade profillerine odaklandı; Daha sonra ENZIM bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) yapıldı; böylece RNA dizisi ile taranan ana proteinlerin/reseptörlerin ifade seviyeleri doğrulandı ve böylece Fructus Xanthii ekstraktının çekirdek OA hedefleri üzerindeki düzenleyici etkileri daha da doğrulandı. Bu entegre çoklu omik ve deneysel protokol, Fructus Xanthii ekstraktının OA müdahalesi için umut vadeden bir botanik adayı olarak potansiyelini araştırmak için sistematik bir yaklaşım sunar.

Giriş

Osteoartrit (OA), eklem kıkırdaklarının ilerleyici bozulması, subkondral kemik sklerozu, sinovial iltihap ve osteofit oluşumu ile karakterize edilen dejeneratif bir eklem^{hastalığıdır 1}. Küresel Hastalık Yükü (GBD) çalışmasına göre, OA yaygınlığı 1990–2020 yılları arasında 204 ülke ve bölgede istikrarlı bir şekilde^{artmıştır 2} ve bu eğilimin küresel demografik yaşlanmayla birlikte hızlanması^{beklenmektedir 3}. Mevcut tahminler, dünya genelinde 250 milyondan fazla kişinin etkilendiğini ve bunun bireysel refah, sağlık sistemleri ve sosyoekonomik yapılar üzerinde önemli baskı^{oluşturduğunu gösteriyor 4}. Mevcut tedaviler ağırlıklı olarak semptomatik rahatlamayı hedeflemektedir; en yaygın müdahaleler ise steroid olmayan anti-inflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) ve hyaluronik asit (HA) ile intra-artiküler viskosupplementasyondur. Ancak, bu yaklaşımlar sınırlı klinik fayda sağlar ve önemli yan etkilerle ilişkilidir ^5,6. Bu, etkili hastalık modifiye edici osteoartrit ilaçlarına (DMOAD) olan kritik ihtiyacı vurgular.

Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), OA yönetiminde uzun süredir kullanılmaktadır ve "kemik bi" kavramına dayanır; bu kavram "bi sendromunun" bir alt türüdür^. Bu çerçevede, OA'nın patogenezi öncelikle karaciğer ve böbrek esansının eksikliği, qi ve kan yetersizliği ile ardından rüzgar, soğuk ve nemlilik nedeniyle istila^{ile ilişkilendirilmektedir 8}. Buna göre, terapötik stratejiler rüzgar nemini dağıtmaya, soğuğu dağıtmaya ve yan etkileri açmaya^odaklanır. 9. TCM tedavileri, çoklu hedefli etkileri, olumlu yan etki profilleri ve klinik açıdan anlamlı etkinliği ile^tanınır. Buqi Tongluo Kapsülü (BQTL) ve Fuzi Decoction (FZD) gibi dikkat çekici formülasyonlar klinik uygulamada net anti-OA etkileri göstermiştir; Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) ise yüzyıllar süren ampirik kullanımla desteklenen NLRP3 inflamatuar yolunu bastırarak OA semptomlarını hafifletmiştir. Benzer şekilde, Shenjinhuoxue Karışımı (SHM), IL-1β ve TNF-α gibi pro-inflamatuar aracıların aşağı regülasyonu yoluyla ağrı ve kıkırdak dejenerasyonunu azaltır 11,12,13. Monomer seviyesinde, tıbbi bitkilerden elde edilen ikariin (Siyanosid A, CyA) ve erianin gibi bileşikler, kondrosit çoğalmasını teşvik ettiği, inflamatuar sitokin salınımını engelleydiği ve eklem^{homeostazını 14,15} koruduğu bildirilmiştir. Topluca, TCM anti-inflamatuar, kondrotrotektif ve semptomları hafifletici özelliklere sahip kapsamlı bir tedavi yaklaşımı sunar. Ancak, mekanizmalarının karmaşıklığı ve standartlaştırmaya ilişkin sorunlar, sürekli ve titiz araştırmalar gerektirmektedir.

Fructus Xanthii (Compositae) kurutulmuş olgunlaşmış meyveleri, yaygın olarak "Cang-Er-Zi" olarak bilinen, antimikrobiyal, anti-inflamatuar, antioksidan, analjezik, antineoplastik ve immünomodülatör etkiler dahil olmak üzere çok çeşitli farmakolojik aktiviteler sergilediği^{belgelenmiştir 16}. Fructus Xanthii'den izole edilen fenolik asitler, romatoid artritte (RA)'da sinovial hiperplaziyi etkili bir şekilde ^azaltır17. Bunlar arasında, temsil eden bir kafeoylkin asit türevi olan klorojenik asit (CGA), osteoblast çoğalmasını ve farklılaşmasını uyarırken RANKL aracılı osteoklastogenezi inhibe ederek iskelet^{homeostazını 18} korur. Aynı ekstrakt içinde tanımlanan diğer fenolik asitler, örneğin neoklorojenik asit (5-CQA), kriptoklorojenik asit (CCA) ve protokateçuik asit de antimikrobiyal, anti-inflamatuar, antitümör ve antioksidan özellikler taşır 19,20,21. Fenolik asitlere ek olarak, Cang-Er-Zi'de bulunan çeşitli ikincil metabolitler bu biyoaktivitelere katkıda^bulunur 16,20,22,23,24,25. Ancak, Fructus Xanthii ekstraktının OA'daki kesin rolü ve altta yatan mekanizmaları büyük ölçüde keşfedilmemiştir.

Hedefsiz Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometrisi (LC-MS/MS) Metabolomik, hipotezsiz, yüksek verimliliğe sahip ve küresel kapsama yetenekleriyle karakterizedir. Binlerce metabolit özelliğinin eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar, metabolik ağların panoramik bir görünümünü sağlar ve önceden hedef ön spesifikasyonu olmadan yeni biyobelirteçler ve anormal metabolik yolların sistematik olarak^{keşfedilmesini sağlar 26,27}. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi teknolojisiyle birleştiğinde, bu yaklaşım çeşitli biyolojik örneklerin (örneğin serum, sinovial sıvı, idrar, kıkırdak dokusu vb.) kapsamlı analizi için uygundur ve osteoartrit (OA) araştırmalarında önemli avantajlar göstermiştir. Bir yandan, OA'nın patolojik ilerlemesiyle yakından ilişkili diferansiyel metabolitleri (örneğin, sinovial sıvı ve sinovial dokuda tanımlanan çeşitli metabolit sınıfları) kapsamlı bir şekilde taramak ve bunları enerji metabolizması, kıkırdak onarımı, osteogenez ve lipid metabolizması gibi temel yollara haritalayarak OA patogenezi anlayışını derinleştirebilir. Öte yandan, transkriptomik ve proteomik gibi çoklu omik verilerin entegre edilmesi, metabolik yeniden programlamanın kıkırdak dejenerasyonu, iltihap yanıtları ve eklem yapısı hasarındaki rolünü ortaya çıkarır; erken tanı biyobelirteçlerinin tanımlanması, hastalık ilerlemesini değerlendirmek ve hedefe yönelik metabolik müdahale stratejileri geliştirmek (örneğin, safra asidi, triptofan veya yağ asidi metabolizmasını düzenlemek) için kritik kanıtlar sunar; bu da translasyonel potansiyelini vurgular. OA hassas tipleme ve kişiselleştirilmiş tedavi üzerine araştırmalar.

Zebrafish, birçok avantajı nedeniyle mükemmel bir model organizma olarak hizmet vermektedir: genomu insanlarınkiyle yüksek derecede korunmuştur ve insan protein kodlayan genlerin yaklaşık %70'iyle homolojiye^{sahiptir (28,29}). Hızlı gelişim, in vitro fertilizasyon, pratik in vivo görüntüleme sağlayan şeffaf embriyolar, yüksek verimlilik ve düşük bakım maliyetleri gibi temel özellikler^{sergilemektedir 30,31,32,33}. İskelet araştırmalarında, zebrabalıklar kemik oluşumun, mineralizasyon süreçlerinin ve yenilenme kapasitesinin net görselleştirilmesine olanak tanır ve osteoporoz ile kıkırdak hasarı gibi patolojik durumları simüle etmek için kullanılabilir. Ancak, eklem kıkırdak dejenerasyonu, sinovial iltihab ve subkondral kemik değişiklikleriyle karakterize edilen karmaşık bir tüm eklem hastalığı olan osteoartrit (OA) çalışmasında, zebrafish modelinin uygulanması nispeten sınırlı kalır.

Bu makale, UHPLC-HRMS/MS tabanlı hedeflenmemiş metabolomik, ağ farmakolojisi, transkriptomik madencilik ve in vivo deneysel doğrulamayı entegre eden bir protokol sunarak, Xanthium sibiricum ekstraktının OA müdahalesi için geçerli bir bitki adayı olarak potansiyelini araştırmaktadır. Amaç, OA ile ilgili biyoaktif bileşenleri, potansiyel hedefler ve temel düzenleyici yolları çoklu omik entegrasyon ve hesaplamalı analiz yoluyla belirlemekle kalmaz, aynı zamanda OA üzerindeki kondroprotektif etkisini in vivo modellerle doğrulamak ve kondrosit transkriptom üzerindeki düzenleyici mekanizmasını daha da netleştirmektir.

Protokol

Klinik örnekler ve farelerle ilgili tüm deneyler, Shandong İl Tıbbi Biyoteknoloji Araştırma Merkezi Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanan protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. İnsan eklemsel kondrositlerinin izolasyonu ve kültürü

İnsan eklem kıkırdağı örnekleri, Shandong Birinci Tıp Üniversitesi'nin Birinci Bağlı Hastanesi'nde artroskopik cerrahi veya tam eklem artroplastisi geçiren hastalardan alındı. Kıkırdak dilimleri, cerrahi eksizyondan sonra 30 dakika içinde buz üzerinde laboratuvara taşındı. Doku, buz gibi soğuk Dulbecco fosfatla tamponlu tuzlu sözü (DPBS; 3–5 yıkama) ile iyice yıkanmış, ardından steril cerrahi makasla yaklaşık 1 mm³ boyutunda parçalara ince kıymrulmuştur. Ardışık enzimatik sindirim yapıldı; önce %0,25 tripsin-EDTA kullanılarak 37 °C'de 30 dakika sürdü. Sindirim süreci, kıkırdak parçaları incelene, küçülmeye ve saydam hale gelene kadar izlendi; ardından kıkırdak parçaları oda sıcaklığında santrifüjle (200 × g, 5 dakika) toplandı. Bunu gece boyunca sindirim (8 saat, 37 °C) takip etti, sürekli hafif bir hareketlenme altında %0,2 tip II kollajenazla gerçekleşti. Sindirim süreci, makroskopik olarak görülebilen tüm kıkırdak parçaları tamamen çözülene kadar izlendi. Serbest bırakılan hücreler, oda sıcaklığında santrifüjle (200 × g, 5 dakika) toplanmış, %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiş tam DMEM ile yeniden süzülerek 75 cm² kültür termolarına tohumlanmıştır. Hücreler, %5_CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 °C sıcaklıkta tutuldu. Yapışkan kondrositler %0,25 tripsin-EDTA kullanılarak ayrıldı ve hücreler, yapışkan hücreler kültür şişesi yüzeyinin %80'lik birleşimine ulaştığında 1:3 oranında alt kültür yapıldı.

2. Fructus Xanthii özünün hazırlanması

Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) adlı kurutulmuş olgun meyveler, Kuzey Çin'deki doğal popülasyonlardan toplanarak kıdemli bir farmakognosist tarafından doğrulandı. Örnek, Shandong Birinci Tıp Üniversitesi herbaryumuna yerleştirildi. 20 g ince tozlu Fructus Xanthii ekstraksiyon yumruğuna yerleştirildi ve yedi ila sekiz sifon döngüsü tamamlanana kadar %95 etanol (yaklaşık 250 mL) kullanılarak kapsamlı Soxhlet ekstraksiyonu yapıldı. Etanolik ekstrakt filtrelendi ve filtre, döner evaporatör kullanılarak 45 °C basınçta azaltılmış basınçta kuruyana kadar konsantre hale getirildi. Ortaya çıkan kalıntı, 60 mL çift damıtılmış suya yeniden süspansiyon yapıldı ve 60 mL etil asetat ile ardışık olarak ayrılan bir hunide bölündü. Karışım şiddetle çalkaladı ve 4 °C'de 24 saat faz ayrımı geçirilmesine izin verildi. Sulu tabaka daha sonra toplanmış, liyofilize edilmiş ve −80 °C'de depolanarak daha fazla kullanıma sunulmuştur.

3. Hedefsiz LC-MS/MS metabolomikleri için standartlaştırılmış iş akışı

1. UHPLC-HRMS/MS tabanlı Hedefsiz metabolomik analizi
   Hedefsiz metabolomik profilleme, ultra yüksek performanslı sıvı kromatografi-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi (UHPLC-HRMS/MS) platformunda gerçekleştirildi. Metabolitler, soğutulmuş metanol-su sistemi kullanılarak hızla söndürülür ve çıkarılırdı. Kromatografik ayrım, 40 °C'de tutulan C18/T3 kromatografik kolonuyla (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) donatılmış bir UHPLC sisteminde sağlanmıştır. Suda (A) %0,1 formik asit ve asetonitril (B)'de %0,1 formik asitten oluşan ikili gradyan (0–28 dakika) 0,3 mL/dakika akış hızıyla uygulanmıştır. Kütle spektrometrik algılama, tam polarite anahtarlamalı tam MS/veri bağımlı MS2 (Tam MS/dd-MS2) modunda çalışan hibrit bir dörtlü Orbitrap cihazında gerçekleştirildi; tam tarama aralığı m/z 70–1.050 ve çözünürlük 120.000 (m/z 200 çözünürlükte FWHM). Daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) parçalanması 20, 40 ve 60 eV'de gerçekleştirildi; dinamik dışlama 10 saniyeye ayarlandı.
2. Ham veriler ProteoWizard kullanılarak mzXML formatına dönüştürüldü. Zirve seçme, tutma süresi hizalanması ve izotopun giderilmesi XCMS Online üzerinden HRMS optimize edilmiş parametrelerle (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6) gerçekleştirildi. Örneklerde %50'den fazla eksik değer içeren özellikler hariç tutuldu ve kalan zirve alanları toplam iyon akımı (TIC) olarak normalize edildi. Metabolitler, doğru kütle, MS2 spektrumları ve tutma süresi, ≤ 5 ppm kütle hata toleransı ve ≥80 nokta-ürün puan eşiği kullanılarak şirket içi referans kütüphanesi ile eşleştirilerek notlandı.
   NOT: İş akışı boyunca sıkı standart işletim prosedürleri uygulandı. Örnekler toplandıktan hemen sonra sıvı azotta (−80 °C) donduruldu, kuru buz zinciriyle taşındı ve rastgele ekstraksiyon, enjeksiyon ve partileme prosedürleriyle işlendi. Her 10 çalışma örnekinden sonra enstrümantal kaymayı izlemek için havuzlu kalite kontrol (QC) örnekleri eklendi.

4. Ağ farmakolojisi analizi

1. Aktif bileşiklerin ağ farmakolojisine dayalı taraması ve hedef tahmini
   Fructus Xanthii'nin aktif bileşenleri TCMID veritabanından (https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php) ve HERB veritabanından (http://herb.ac.cn/) alındı. Alınan bileşikler, önerilen ADME ağız biyoyararlanıllığı eşiklerine ≥%30 ve ilaç benzerliği ≥0.18'e göre filtrelendi. Nitelikli bileşiklerin tahmin edilen insan hedefleri iki veritabanından elde edildi. Tarama sonuçları toplandı ve derlendi, Fructus Xanthii ile ilişkili 15 aktif bileşik ve 151 benzersiz protein hedefi tespit edildi.
2. Transkriptomik verilerin entegrasyonu ve OA ile ilişkili çekirdek hedeflerin tanımlanması
   Normal ve osteoartrit (OA) örnekleri arasında kıkırdak dokularında farklı ekspresyon genler (DEG), GEO2R web aracı (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r) kullanılarak GSE51588 (n = 5 normal, 6 OA) ve GSE169077 (n = 10 normal, 40 OA) veri setlerinden çıkarıldı. OA ile regülasyona giren genler, log2 katlama değişimi >0.5 ve ayarlanmış p-değeri <0.05 kriterleri kullanılarak tanımlandı. OA ile yukarı regülasyona sahip genler ile 151 Fructus Xanthii ile ilişkili protein hedefi arasındaki kesişim, R paketi ggvenn kullanılarak görselleştirildi. Kesişim hedeflerinin protein–protein etkileşim (PPI) ağları STRING veritabanı kullanılarak oluşturuldu (https://string-db.org/). PPI ağ verileri Cytoscape'e aktarıldı ve en üst 10 hub geni, MCC algoritmalı CytoHubba eklentisi kullanılarak sonraki fonksiyonel zenginleştirme analizi için tarandı.

5. Zebrabalıklarda Maksimum Tolere Konsantrasyonun (MTC) Belirlenmesi

Transgenik zebrafish larvaları (Tg col2a1a:EGFP) döllenmeden 2 gün sonra (2 dpf) rastgele olarak 6 kuyu taneli plakalara dağıtıldı ve her kuyuda 30 larva yoğunluğu sağlandı. Her kuyu, seri olarak seyreltilmiş Fructus Xanthii ekstraktı içeren 3 mL maruz kalma ortamı ile desteklendi. Ölen veya ölmüş larvalar günlük olarak çıkarıldı. Larvalar 72 saat boyunca sürekli olarak 28 °C'de maruz kaldılar; bundan sonra larva ölümünün %10'u aşmadığı en yüksek tolere edilen konsantrasyon (MTC) belirlendi.

6. Zebrafish kemik yaralanması modelinin kurulması

Tg col2a1a:EGFP zebrafish larvaları döllenme sonrası 2 gün (2 dpf) dört gruba ayrıldı: kontrol, model, kondroitin sülfat (CS) pozitif kontrol ve Fructus Xanthii ekstraktı tedavisi. Kontrol grubu hariç tüm gruplar, kemik hasarını indüklemek için 24 saat boyunca Staphylococcus aureus (OD600 = 0.8, 1 ×^{10 8} CFU/mL) ile maruz kalmıştır. Başarılı model oluşturulması, epifloresan mikroskobu altında kraniofasialiel bölgede kraniofasiyal bölgede en az %50 azalma doğrulanarak doğrulandı.

7. Zebrafish larvalarında kıkırdak-spesifik floresansının nicel değerlendirmesi

Larvalar, 72 saat boyunca 28 °C'de Fructus Xanthii özünün veya 1.000 μg/mL sodyum kondroitin sülfat A (pozitif kontrol) dereceli konsantrasyonlarına sürekli maruz bırakıldı. Daha sonra, her 6 kuyulu replikasyondan 10 larva rastgele seçildi (grup başına n = 30). Seçilen larvalar %0,016 trikain kullanılarak anestezi edildi ve %1 düşük eriyen agaroz pedlerine yanlı olarak yerleştirildi. Floresans görüntüleri, floresans kameralı stereomikroskop kullanılarak 2× büyütme (uyarılma 488 nm, emisyon 525/50 nm) elde edildi. Seratohyal ve Meckel kıkırdak dahil olmak üzere kraniofasiyal bölgedeki kıkırdak spesifik EGFP yoğunluğu, görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicele alındı. Entegre yoğunluk değerleri üzerinde arka plan düzeltmesi yapıldı ve düzeltilen değerler kontrol grubuna normalize edilip, kondroprotektif etkinliğin istatistiksel analizi yapıldı.

8. C57BL/6J farelerinde OA'nın indüksiyonu

Erkek C57BL/6J fareleri (6–8 haftalık, 20–22 g) belirli patojensiz (SPF) koşullarda, 22 °C ± 2 °C sıcaklıkta, 12 saatlik ışık/karanlık döngüyle barındırıldı. Farelerin bir hafta boyunca uyum sağlamalarına izin verildi ve ardından rastgele sayı tablosu kullanılarak üç gruba (n = 8) ayrıldılar: (1) sahte kontrol, (2) ACLT ile indüklenen OA (ACLT) ve (3) ACLT artı Fructus Xanthii ekstraktı müdahalesi (ACLT + Fructus Xanthii ekstraktı). Tüm cerrahi işlemler steril koşullarda önceden doğrulanmış bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Fareler, kurumsal onaylı protokollere uygun olarak intraperitoneal sodyum pentobarbital (50 mg/kg) ile anestezi edildi ve sağ diz eklemi kapsülünü açığa çıkarmak için medial parapatellar kesi yapıldı. Ön çapraz bağ, eklem dengesizliği oluşturmak için ameliyat mikroskopu altında kesildi; ardından eklem kapsülü ve deri 6-0 emilebilir dikişlerle katmanlar halinde kapatıldı. Sahte ameliyat edilen fareler, bağ kesimi olmadan aynı artrotomi prosedürlerinden geçti. Eklem stabilitesi değerlendirildi ve başarılı model kurulumu, çekmece testi veya model grup farelerinden histolojik kesitlerde eklem yaralanmasının derecesi değerlendirilerek doğrulandı.

Ameliyat sonrası buprenorfin (0,1 mg/kg, deri altı enjeksiyon) ile üç gün üst üste uygulandı. Tedavi maddeleri günde bir kez gavaj yoluyla uygulandı. ACLT + Fructus Xanthii ekstraktı grubu, normal tuzlu suyla seyreltilmiş 100 μL 1.000 μg/mL Fructus Xanthii ekstraktı alırken, diğer iki grup araç kontrolü olarak 100 μL normal tuzlu sözü aldı. Ameliyattan 8. hafta sonra, fareler CO₂ boğulması ve ardından servikal dislokasyon ile ötenazi edildi ve diz eklemleri histolojik analizler için alındı.

9. Histopatolojik boyama

1. Diz eklemi dokusu histolojik hazırlığı ve boyama
   Ameliyat edilen diz eklemleri, ameliyat sonrası 8. haftada blok olarak çıkarıldı ve 4 °C'de %4 paraformaldehit (PFA) ile 48 saat boyunca sabitlendi. Sabit eklemler 14 gün boyunca %10 etilen diamintetraasetik asit (EDTA; pH 7.4) içinde kalsifiye edilmiş, derecelendirilmiş etanol serisi ile kurutulmuş ve parafine gömülmüştür. Gömülü eklemlerden seri sagital kesitler (5 μm) hazırlanmış ve aşağıdaki histolojik boyama prosedürleri uygulanmıştır.
   1. Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyama
      Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama işlemleri, genel doku mimarısı, kıkırdak bütünlüğü ve sinovial hiperplaziyi değerlendirmek için gerçekleştirildi.
   2. Safranin-O/Hızlı Yeşil boyama
      Safranin-O/Fast Green boyama işlemi kıkırdak dokusunda proteoglikanları tespit etmek için gerçekleştirildi. Lekeli bölümler, dijital kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak incelendi ve 10× ile 20× büyütmelerle görüntüler alındı.
2. OARSI tabanlı yarı nicel kıkırdak dejenerasyonu puanlaması
   Kıkırdak dejenerasyonunun yarı nicel değerlendirmesi için, boyalı kesitler geriye dönük olarak yeniden değerlendirilmiş ve Osteoartrit Araştırma Derneği Uluslararası osteoartrit kıkırdak histopatoloji değerlendirme sistemine göre puanlanmıştır; bu sistem, kırdaj hasarının şiddetini artim kırdak dejenerasyonunun derecesine (0–6; kıkırdak kaybının derecesi) ve aşaması (0–4; hasarın mekansal dağılımı) göre değerlendirmektedir.
   Tüm değerlendirmeler için sonradan bir kör etme stratejisi benimsendi. Tüm bölümler orijinal grup etiketleri kaldırılarak kimliği silindi ve anonim seri numaralarıyla yeniden kodlandı. İki deneyimli patolog, grup dağılımı bilgisi olmadan bölümleri bağımsız olarak değerlendirdi. İki puanlama sonucu seti arasında çapraz doğrulama yapıldı. Puan farkı ≥1 olduğunda, farklı kesimler iki patolog tarafından ortak olarak yeniden değerlendirilerek bir uzlaşma puanı belirlendi. Nihai konsensus puanları, histopatolojik sonuçların nesnelliği, sağlamlığı ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için sonraki istatistiksel analizler için kullanıldı.

10. RNA dizileme (RNA-dizi)

Birincil insan eklem kondrositleri (pasajlar 2–3) 6 delikli plakalara tohumlanmış, her kuyu başına 5 ×^10-5 hücre yoğunluğunda. Hücreler 24 saat boyunca serum açlığı tutuldu ve ardından iki gruba ayrıldı (n = 3 her grup): (1) Kontrol grubu: hücreler sadece araç ile tedavi edildi (%0,1 DMSO); (2) Fructus Xanthii ekstraktı grubu: hücreler DMSO'da çözünmüş 1.000 μg/mL Fructus Xanthii ekstraktıyla işlendi.
Hücreler 24 saat boyunca işlendi, ardından üretici protokolüne göre TRIzol Reaktifi kullanılarak toplam RNA çıkarıldı. RNA bütünlüğü (RIN ≥7.0) ve konsantrasyonu bir RNA analizörü kullanılarak değerlendirildi. Zincire özgü cDNA kütüphaneleri, RNA dizileme kütüphanesi hazırlık kiti kullanılarak hazırlanmış ve yüksek verimli bir sonraki nesil dizileme (NGS) platformunda, eşleştirilmiş uçlu 150 bp (PE150) modunda dizilmiştir. Ham FASTQ dosyalarının kalite kontrolü FastQC kullanılarak gerçekleştirildi, ardından adaptör ve kalite kırpma işlemi Trimmomatic ile yapıldı ve ardından sonraki analizler yapıldı.

11. RNA-dili veri işleme

Fructus Xanthii ekstraktı tarafından aşağıya düzenlenen farklı ekspresyon genler (kontrol grubuna karşı; p < 0.05 ve logFC < −0.5) RNA-seq veri setinden çıkarıldı ve en üst 10 hub hedefiyle kesişti. Fructus Xanthii ekstraktı ve osteoartrit ile ilişkili temel hedefler, ggvenn paketi kullanılarak görselleştirildi.

12. ELISA

2–3 geçitlerdeki birincil insan eklem kondrositleri, kuyu başına 5 ×^10-5 hücre yoğunluğunda 6 kuyu tabakalarına tohumlanmıştır. Hücreler, sessizlik için serumsuz ortamda 24 saat kuluçka altına alındı. Hücreler daha sonra aşağıdaki üç gruba bölündü (n = her grup başına 3):
(1) Boş kontrol: hücreler sadece araç (%0,1 DMSO) ile tedavi edildi; (2) Pozitif kontrol: hücresel iltihap IL-1β ile indüklendi, ardından araç (%0,1 DMSO) ile tedavi yapıldı; (3) Fructus Xanthii ekstraktı grubu: hücresel iltihap IL-1β ile indüklenmiş, ardından %0,1 DMSO'da çözünmüş 1000 μg/mL Fructus Xanthii ekstraktı ile tedavi edilmiştir. Hücre kültürü süpernatantları, 24 saatlik kuluçkadan sonra toplandı ve kullanılana kadar −80 °C sıcaklıkta saklandı. Kültür süpernatantlarındaki MMP1 ve PGR seviyeleri, insan MMP1 ve PGR için özel ticari olarak mevcut enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitleri kullanılarak belirlendi. Testler üreticilerin talimatlarına göre yapıldı.

13. İstatistiksel analiz

Tüm istatistiksel analizler istatistiksel analiz ve grafik yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi ve veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. Veri normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi ve homoskedastisite Levene testi kullanılarak değerlendirildi. Gruplar arası karşılaştırmalar, uygun olduğunda tek veya iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak yapıldı, ardından Tukey veya Šidák sonrası testleri yapıldı. İkili karşılaştırmalar iki kuyruklu Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı. Parametrik olmayan veriler Mann–Whitney U testi kullanılarak analiz edildi. İki taraflı bir P-değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Hedefsiz LC-MS/MS verilerinin kalite değerlendirmesi ve metabolik ortamı

QC örnekleri, hem pozitif hem de negatif iyon modlarında yüksek örtüşen TIC kromatografileriyle mükemmel tekrarlanabilirlik gösterdi ve tüm analitik parti boyunca tutma süresi kayması 0,05 dakikanın altında kaldı. Ham veriler, zirve tespit edilme, entegrasyon ve tutma süresi hizasını içeren XCMS tabanlı ön işlemeden geçti. Varsayılan metabolitler, doğru kütle (≤5 ppm), izotopik desenler ve yüksek kaliteli...

Tartışma

OA, yaygın bir dejeneratif eklem rahatsızlığıdır ve dünya çapında engelliliğin önde gelen^{nedenlerinden biridir 36}. Patogenezi karmaşık ve çok faktörlüdür; eklem dokularında biyokimyasal, hücresel ve moleküler değişiklikleri içerir. Bir zamanlar basit bir eklem kıkırdak "aşınma ve yıpranma" fenomeni olarak kabul edilen OA, şimdi kıkırdak bozulması, sinovial iltihab, osteofit oluşumu ve subkondral kemik yeniden şekillendirmesiyle karakterize edilen kronik, tüm eklem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4% PFA	Biosharp, Çin	BL539A	pH 7.4, steril
C57BL/6 Fareler	Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, Çin	N/A	Erkek, 8-10 haftalık, 20-25g
Kondroitin sülfat	MCE, Amerika	HY-B2162	Saflığı ≥98%
ClusterProfiler (R Paketi)	Bioconductor	Ücretsiz erişim	R v4.2.2'de entegre
Kollagenaz, Tip II, toz	Gibco, Amerika	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Ücretsiz erişim (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (CytoHubba ile)
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Ücretsiz erişim	Sürüm 3.9.1
DESeq2 (R Paketi)	Bioconductor	Ücretsiz erişim	R v4.2.2'de entegre
DMEM, yüksek glikoz	Gibco, Amerika	11965092	Steril ortam
Etanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, Çin	10009218	Analitik dereceli, %95
Etil asetat	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, Çin	10009418	Analitik dereceli
Fetal boğa serumu (FBS)	Cellmax, Çin	SA102.02	Isı ile inaktive edilmiş
Floresan Mikroskop	Nikon, Japonya	Eclipse Ti2-U	GFP filtresi (488nm eksitasyon) ve dijital kamera ile donatılmış
GEO Veritabanı	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	GEO2R analiz aracı
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, Amerika	Ticari	Sürüm 9.5.1
Hematoksilen-Eozin(HE) Boyama Kiti	Solarbio, Çin	G1120	Kullanıma hazır kit
HERB Veritabanı	Çin Bilimler Akademisi	http://herb.ac.cn/	V2.0
İnsan MMP-1 ELISA Kiti	Yamei Biotechnology, Çin	HJ088	İnsan için, 96 kuyuluk plaka
İnsan Progesteron Reseptörü (PR) ELISA Kiti	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., Çin	ml05997	İnsan için, 96 kuyuluk plaka
ImageJ	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)	Ücretsiz erişim	Sürüm 1.53t
Işık Mikroskobu	Olympus, Japonya	BX53	10×/20× objektifler ve dijital kamera
Liyofilizatör	Christ, Almanya	Alpha 1-4 LDplus	Dondurma kurutma sistemi
Modifiye Safran-O Ve Hızlı Yeşil Boyama Kiti	Solarbio, Çin	G1371	Kemiğe/kıkırdakla boyama için
Nötr Balzam	Solarbio, Çin	G8590	Montaj ortamı
Penisilin-Streptomisin	Gibco, Amerika	15070063	100×, steril
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Sparkjade, Çin	CR0013-500ML	pH 7.2-7.4, steril
R yazılımı	R Foundation for Statistical Computing	Ücretsiz erişim (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (ggvenn ile)
Serum içermeyen Hücre Dondurma Ortamı	Biosharp, Çin	BL203B	Sterili
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Standart suş
STRING Veritabanı	STRING Consortium	https://string-db.org/	Protein etkileşimi analizi
TCMID Veritabanı	Shaanxi Qinling Qiyao İşbirliği İnovasyon Merkezi	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Tg(col2a1a:EGFP) Zebrabalığı	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Larvae (2 dpf), AB suşu
TRIzol Reaktifi	Thermo Fisher, Amerika	15596018CN	Toplam RNA ekstraksiyonu için
Tripsin-EDTA (%0.25), fenol kırmızısı	Gibco, Amerika	25200056	Steril çözelti
Ultra-yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (UHPLC)	Thermo Fisher, Amerika	Q Exactive Focus	HRMS/MS ile birleştirilmiş
XCMS-online	Scripps Araştırma Enstitüsü	Ücretsiz erişim	Web tabanlı platform