Method Article

Kendi Kendini Oluşturan İnsan Kardioidlerinde Hipoksi-Reoksijenlenme Yaralanma Modeli

DOI:

10.3791/70310

⸱

March 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendi kendine oluşan insan kalp organoidleri (hCO'lar), insan kalp gelişimi ve hastalıklarını modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Burada, hipoksi-reoksijenlenme ile hCO'ların oluşturulması ve yaralanması için bir metodoloji ve yaralanma sonrası beklenen histolojik ve fonksiyonel sonuçların detayları sunulmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hızlı revaskülarizasiya olmadan, iskemik kalp hastalığı kardiyomiyositlerin geri dönüşü olmayan kaybı, yara oluşumu ve kalp fonksiyonunun azalmasına yol açar. Hipoksi-reoksijenlenme yaralanmalarını modelleme ve insan dokularında potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirme yeteneği karşılanmamış bir ihtiyaçtır. İnsan kalp organoidleri (hCO'lar) gelişmekte olan bir model sistemidir, ancak hCO'larla çalışmaya başlamak küçük boyutları, süspansiyon kültürü gereksinimleri ve farklılaşma verimliliğindeki değişkenlik nedeniyle zor olabilir. Bu protokol, insan iPSC'den türetilen kendi kendine kurulan hCO'ların üretimi ve sürdürülmesi için kullanıcı dostu bir rehber sunar; hCO'ları işleme ve histolojik analiz yöntemleri; ve insan iskemisi/reperfüzyonunda görülen fibroz ve apoptozu taklit eden hipoksi-reoksijenasyon ile hCO'ları yaralanmaya yönelik bir yaklaşım. Bu protokol, hCO'ların iskemi-reperfüzyon yaralanmasının hayvan modellerine tamamlayıcı olarak kullanılması için rehberlik sağlar ve insan miyokard iyileşmesini hızlandırabilecek faktörleri belirlemek ve test etmek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İskemik kalp hastalığı, dünya genelinde hastalık ve ölüm nedenlerinden biri olup, yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde en az 20,5 milyon kişiyietkiler (1,2,3). Yeterli perfuzyon olmadan, uzun süren hipoksi kardiyomiyosit (CM) ölümüne ve miyokardiyal disfonksiyona yol açar. Miyokardiyal iskemi öncelikle perkutan müdahale, trombolitik tedavi veya koroner arter bypass grefti yoluyla revaskülarizasasyonla tedavi edilir. Ancak, revaskülarizasiya iki ucu açılmış bir kılıçtır ve reaktif oksijentürlerinin salınımıyla ek hasara yol açabilir 4,5. Reperfüzyon stratejileri son derece başarılı olsa da, iskemik hakaretler sırasında veya reperfüzyon sonrası CM kaybını sınırlamak için yaklaşımlar daha zor bulunabiliyor. İnfarktlanmış dokuyu kurtarma girişimlerinin çoğu iskemi-reperfüzyon hayvan modellerinde etkili olsa da, aynı tedaviler insan denemelerinde büyük ölçüde önemli fayda sağlayamamış ve bu da insan modellerinin CM koruma veya yenileyici tedavileri değerlendirmesiihtiyacını artırmıştır 6,7,8,9,10,11,12.

Kalp hasarını modellemek için kullanılan insan platformları primer dokular ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) türevli sistemleriiçerir 13,14. Birincil dokular numune kullanılabilirliğiyle sınırlı olduğundan, hiPSC sistemleri genetik olarak yönetilebilir ve ölçeklenebilir olma avantajlarıyla kalp hastalığı modellemesi için baskın insan platformuolarak ortaya çıkmıştır 15,16,17,18,19. Geleneksel 2D hiPSC kaynaklı kardiyomiyosit (hiPSC-CM) kültürleri, ortaya çıkan CM'lerin olgunlaşmamış olgunluğu, karmaşık doku mimarisinin olmaması ve insan kalbinde bulunan tam hücresel çeşitliliği yeniden üretememesi nedeniylesınırlıdır 15,20. Bu eksiklikleri gidermek için, mühendislik ürünü 3D kalp dokuları (EHT'ler) giderek daha fazla benimsenmiştir 20,21,22,23,24,25,26. EHT yaklaşımları, önceden farklılaşmış kalp hücrelerininsferoidlere karışmasını veya farklılaşmış kalp hücrelerinin iskele veya kalıplaratohumlanmasını içerir 21,22,27. EHT'ler heterotipik hücresel etkileşimleri daha iyi modelleyebilse ve 2D kültürlere göre nispeten daha olgunluğa sahip olsalar da, EHT'leri oluşturmak ve sürdürmek için özel iskele veya biyoreaktör gereksinimleri şu anda ölçeklenebilirliklerinisınırlamaktadır 21,27,28.

Kendi kendine oluşan kardiyak organoidler (hCO'lar) veya kardioidler, yeni ve güçlü bir in vitro insan modelsistemidir 20,25,26,29. hCO'ların birkaç avantajı vardır. Birincisi, endotel hücreleri, fibroblastlar ve epikardiyal hücreler dahil birden fazla hücre tipini içerebilirler; bu protokoller birden fazla özel farklılaşma protokolüneihtiyaç duymaz. 26,29,30. İkincisi, farklılaşmalarının çoğu 3D süspansiyon kültüründe gerçekleşir ve bu da özel kalıplar veya dokumatriksi 25,26,29,30 gereksinimlerini ortadan kaldırır. Son olarak, hCO'lar merkezi bir boşluğa sahip stereotipik küresel bir morfolojiye sahiptir ve bu da morfolojik analizleri mümkün kılar. Bu nedenle, hCO'lar 2B kültür sistemlerine benzer ölçeklenebilirliğe sahiptir ve EHT'lerin doku karmaşıklığının bir kısmını korurlar. hCO'lar, ilaç toksisitesi testi, hasta spesifik hastalık modellemesi ve kalp gelişiminin yönlerini modellemek içinkullanılmıştır 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39 . Umut verici olsa da, hCO'ların EHT'lere kıyasla doğrudan kuvvet çıkışını ölçememesi gibi birkaç sınırlaması vardır. Ayrıca, tanımlanan hCO modellerinde doğal bağışıklık hücresi popülasyonu yoktur, ancak hCO'ları makrofajlarla doldurmak mümkündür. Buna rağmen, hCO'lar yükselen ve hızla gelişen bir insan modelsistemidir 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

Bugüne kadar, kalp yaralanmalarını hCO'larla modellemek sınırlı olmuştur. Bir kriyoyaralanma modeli tanımlanmıştır, ancak yaralanmalar oldukça değişkendir ve hCO'ların bireysel olarak yaralanma ihtiyacıölçeklenebilirliği sınırlar 29. Bu el yazması, hipoksi-reoksijenasyon (H/R) yaralanması olan kendi kendini oluşturan hCO'ların oluşturulması ve yaralanması için kullanıcı dostu bir protokolü tanımlar. hCO'lar üretmek için diğer protokollerle karşılaştırıldığında, bu protokol basitleştirilmiş bir farklılaşma ortamı kullanır ve Hofbauer ve ark.29 tarafından tanımlanan 2D-3D mezoderm farklılaşma stratejisini içerir. H/R yaralanması protokolü, genellikle hCO'ların vurmaya başlamasından sonra herhangi bir zaman uygulanabilir; bu genellikle 8. (D8) ile D11 arasında farklılaşma günü civarında gerçekleşir. H/R süresi, istenen yaralanma seviyesine ulaşmak için 6 saat ile 24 saat arasında ayarlanabilir; minimum veya neredeyse tam CM kaybı arasında değişir. Ayrıca, hCO'lar H/R yaralanmasından sonra Vimentin+ hücreleriyle birlikte stereotipik olarak kollajen bir çekirdek geliştirir ve bu da H/R süresiyle şiddet olarak ölçeklenir. Bu yüksek verimlilikli, ölçeklenebilir hCO H/R yaralanma modeli, insan modellerinin yaralanma sonrası CM iyileşmesini veya yenilenmesini teşvik etmek için yeni terapötik yollar geliştirme ve test etme ihtiyacını potansiyel olarak karşılamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan hücre hatlarının işlenmesiyle ilgili tüm prosedürler yerel biyogüvenlik protokollerine uymalıdır. Tüm deneyler, Duke Üniversitesi'ndeki iPSC çekirdek tesisinde sağlıklı yeni doğan erkek fibroblastlarından türetilen iPSC hücre hattı DU11 kullanılarak gerçekleştirildi.

1. hCO'ların üretimi

NOT: Bu bölüm, iPSC'lerden hCO'lar üretmek için standart bir protokolü tanımlar (Şekil 1). Bu protokolde detaylandırılan tüm adımlar, sterilliği sağlamak için laminar bir akış başlığı içinde yapılmalıdır. Farklılaştırma ortamı tarifleri için Tablo 1'e bakınız.

GünStok yoğunluğuÇalışma KonsantrasyonuSulandırma FaktörüTemel Medya
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, %2 B27 eksi İnsülin
100 mg/mL Askorbin Asit50 μg/mL askorbin asit1:2000
10 mg/mL Activin A60 ng/mL Activin A1:167
D15 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, %2 B27 eksi İnsülin
100 mg/mL Askorbin Asit50 μg/mL askorbin asit1:2000
D25 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, %2 B27 eksi İnsülin
100 mg/mL Askorbin Asit50 μg/mL askorbin asit1:2000
10 mM Tiazovivin2 μM Thiazovivin1:5000
D35 mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, %2 B27 eksi İnsülin
100 mg/mL Askorbin Asit50 μg/mL askorbin asit1:2000
D45mM IWP25 μM IWP21:1000RPMI-1640, %2 B27 eksi İnsülin
D6+YokYokRPMI-1640, %2 B27 Plus İnsülin

Tablo 1: Farklılaştırma medya tablosu. Her farklılaşma faktörü için stok konsantrasyonları, çalışma konsantrasyonları ve seyreltme faktörü 0-6 diferensiya günleri. Tüm çalışan çözümleri beslenme anında taze hazırlayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: hCO farklılaştırma şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. iPSC bakımı
    1. 12 kuyuluğa sahip bir plakanın her kuyunun altını, 1:100 oranında taban membran matrisi ile tamamen kaplayın, soğuk DMEM/F12 ortamında seyreltilmiş. Polimerizasyona izin vermek için işlenmiş plakaları 37 °C'de 1 saat kuluçka yapın. Hemen kullanılmazsa, plakalar bir film ile mühürlenip 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir ve kullanımdan önce en az 60 dakika 37 °C'de inkübe edilebilir.
  2. Diferensiya günü -3 (D-3): sonraki farklılaşma için iPSC'lerin kaplaması
    1. Temel membran matris kaplamalı plakaları adım 1.1.1'de tarif edildiği şekilde hazırlayın.
    2. iPSC kültüründen aspirasyon bakım ortamı alın ve hücreleri tamamen kapatacak kadar hücre ayrılma çözeltisi ekleyin (12 kuyuluk plaka için ~500 μL veya 6 kuyuyla plaka için 1 mL). 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
    3. Her kuyuya eşit hacimde iPSC bakım ortamı ekleyin ve hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için plakaya hafifçe dokunun. Plakayı kendinize doğru eğin ve kuyunun dibini yukarı aşağı nazikçe pipetleyin, böylece yapışan hücreleri daha fazla 3 kez ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe haline taşımak için pipet kullanın.
    4. Pellet hücreleri, oda sıcaklığında 300 x g hassasiyetinde 3 dakika boyunca sallanan bir kovalı santrifüjde santrifüjle yapılır. Süpernatantı aspirasyon ve hücreleri 1 mL iPSC bakım ortamında nazikçe yeniden süspansiyona alın.
    5. Hücre askısının 10 μL'sini yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne taşıyor. 10 μL Trypan mavisi ve pipet ekleyin. Hemositometreye 10 μL iPSC/Trypan mavi karışımı ekleyin ve canlı hücreleri sayın.
    6. Hücre süspansiyonunu iPSC bakım ortamında ROCK inhibitörü (ROCKi) ile son konsantrasyona 100.000-200.000 hücre/mL kadar seyreltin. Taban membran matrisi ile kaplanmış 12 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
      NOT: Farklılaşmadan önceki kaplama yoğunluğu, belirli bir hücre hattının büyüme hızına bağlıdır. Her iPSC hattı için kaplama yoğunluğu ayarlanabilir. ROCKi konsantrasyonu marka/formüle bağlı olarak titre edilmesi gerekebilir.
  3. Ayırt D-2: ROCKi'yi çıkarmak için medya değişimi
    1. Medya değişimi için 1 mL taze iPSC bakım ortamı, ROCKi olmadan. Hücreler küçük koloniler oluşturmaya başlamalıdır. Koloniler düz görünmeli (Şekil 2A). Hücreler taş döşemesi gibi, ince veya uzamış görünüyorsa, bu kendiliğinden farklılaşmanın işaretidir ve farklılaşma verimliliği etkilenebilir.
  4. Farklılaşma D-1: Hücreleri tedavi olmadan kuluçkaya geçirmeye devam edin.
  5. Diferensiyon D0: Farklılaşma ve mezoderm indüksiyonunun başlangıcı;
    1. Mikroskop kullanarak, hücre yoğunluğunu kontrol ederek farklılaşma anında %70-%90 birleşimini (Şekil 2B) kontrol edin. Eğer sub-confluentse, hücreleri iPSC bakım ortamıyla besleyin ve 24 saat bekleyin. Hücreler çok birleşiyorsa, 1.2. adımdaki gibi hücreleri ayırın
    2. 12 kuyuyla D0 mezoderm indüksiyon ortamı için 12 mL hazırlayın (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL Askorbik Asit, 60 ng/mL Activin A RPMI-1640 içinde, %2 B27 Takviyesi İnsülin Çıkar (RB-)) ile birlikte).
    3. Mevcut ortamı çıkarın ve yerine 1 mL/well D0 mezoderm indüksiyon ortamı verin. Medya alışverişinin zamanına dikkat edin.
  6. Diferensiasyon D1: Kardiyak mezoderm spesifikasyonu
    1. D0 mezoderm indüksiyon ortamının eklenmesinden tam 24 saat sonra, D1 kardiyak mezoderm spesifikasyon ortamı (5 μM IWP2, 50 μg/mL Askorbik Asit RB) ile değiştirildi.
  7. Farklılaşma D2: hCO oluşumu
    1. Hücreleri kaplayacak kadar hücre dissosiyasyon reaktifi ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın (Şekil 2C). Her kuyuya eşit hacimde D2 kardiyak mezoderm ortamı ekleyin ve yapışkan hücreleri serbest bırakmak için yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın. Hücre süspansiyonunu 15 mL konik bir tüpe aktarın.
    2. Pellet hücreleri oda sıcaklığında 300 x g boyunca 3 dakika boyunca santrifüjle yapın. 1 mL D2 kardiyak mezoderm spesifikasyon ortamında (5 μM IWP2, RB-de 50 μg/mL askorbin asit) yeniden süzülür.
    3. Hücre süspansiyonundan 10 μL alın ve üzerine 10 μL Trypan mavisi ekleyin. Hücreleri istediğiniz herhangi bir yöntemle sayın. Hücreleri, 2 μM tiazovivin ile D2 kardiyak mezoderm spesifikasyon ortamında 100.000 hücre/mL konsantrasyona kadar seyreltir. 96 kuyu ultra düşük bağlantı plakası için 10 mL hücre süspansiyonu kullanın.
    4. Hücre süspansiyonunu uygun boyutta bir reaktif rezervuarına aktarın ve çok kanallı pipet kullanarak ultra düşük bir bağlantı 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 μL aktarın; böylece nihai konsantrasyon 10.000 hücre/kuyu olur.
    5. Süspansiyon kültüründe hCO oluşumunu sağlamak için, oda sıcaklığında 500 x g boyunca 500 x g santrifüj plakaları uygulanır. Santrifüjlemeden sonra büyük bir hücre peleti oluşur (Şekil 2D) - eğer bu pelet sınırlandırılmazsa, santrifüjleme tekrarlanır.
      NOT: Tüm hücreler hCO'ya dahil olmayacak; hCO, parlak alan mikroskopisinde bireysel hücreler görünür ve sınırlı bir hücre peleti olarak görünecektir. hCO'nun çevresindeki plakada bazı tek hücreli kalıntılar normaldir.
  8. Farklılaştırma D3: ROCKi'yi seyreltmek için ortam eklenmesi
    1. Her plaka için 10 mL D3 ortamı (5 μM IWP2, 50 μg/mL Askorbik Asit RB-de) hazırlanır. Çok kanallı pipet kullanarak, her kuyuya 100 μL D3 ortamı ekleyin, hiçbir medya çıkarılmadan.
      NOT: Bu aşamada, hCO'lar koyu ve iyi sınırlandırılmış bir küre dönüşmüş olacak. Bireysel hücreler görünmez (Şekil 2E).
  9. D4 Farklılaştırma: D4 medyaya geçiş
    1. 100 μL D3 ortamı çıkarın ve yerine 100 μL D4 ortamı (RB-'de 5 μM IWP2) koyun. Aspirasyon riskini azaltmak için, plakayı kendinize doğru yaklaşık 45° açıyla eğin ve çok kanallı pipeti plakanın yan duvarına göre yaklaşık 90° açıda tutun. Çok kanallı pipeti kuyunun yan duvarına sıkıca yerleştirin ve pipet uçlarında emiş hCO'ları ara ara kontrol ederek 100 μL ortamı yavaşça aspirasyon yapın.
      NOT: hCO'lar süspansiyon kültüründedir ve ortam çıkarımı sırasında hCO'ların aspirasyonu yaygındır. Aspirasyon riskini azaltmak için, plakayı kendinize doğru yaklaşık 45° açıya çevirin ve çok kanallı pipeti plakanın yan duvarına göre yaklaşık 90° açıda tutun. Çok kanallı pipeti kuyunun yan duvarına sıkıca yerleştirin ve yavaşça 100 μL ortamı aspire edin, pipet uçlarında emiş hCO'lar için aralıklı kontrol edin.
    2. Yerine 100 μL D4 medya verin.
  10. Farklılaştırma D6: hCO bakım ortamı
    1. D4 ortamından 100 μL çıkarın ve yerine 100 μL D6+ ortam (RPMI-1640, %2 B27 Takviyesi (RB+)) verin.
  11. Farklılaştırma D8
    1. Her 2 günde bir 100 μL çıkarıp yerine 100 μL yeni D6+ ortam ile değiştirerek ortam değişimine devam edin. hCO'lar daha büyük olmalı, düzgün kenarları korumalı ve başarılı şekilde farklılaşırsa D6-11 civarında çalışmaya başlamalıdır (Şekil 2F). hCO'lar hâlâ karanlık, iyi sınırlandırılmış sferoidler olarak görünecek ve bireysel hücreler görünmeyecek.

figure-protocol-2
Şekil 2: hCO Farklılaşma Zaman Çizelgesi. Organoid Farklılaşma Zaman Çizelgesi. (A) Farklılaşma başlatmadan (D-1) 1 gün önce iPSC kolonileri. Belirgin, düz görünümlü kolonilere dikkat edin. (B) Farklılaşma başlatma gününde (D0) ~%90 birleşimle. (C) 96 kuyruklu ultra düşük tutunma plakasında organoid oluşumundan hemen sonra D2 farklılaşmasında organoid. Ok, iğne şeklindeki IWP2 kristallerine örnek gösterir. (D) D3 diferensiyonunda organoidler. Hücre-hücre birleşim oluşumu nedeniyle belirgin organoid sıkıştırmaya dikkat edin; Bu aşamada bazı entegre edilmemiş hücre kalıntıları normaldir. (E) D10 diferensiyonunda organoidler. (F) Ok, uzun ve ince hücrelere sahip iPSC kolonisini gösterir; bu da potansiyel spontan farklılaşmaya işaret eder. Ölçek çubuğu = paneller A-E için 1000 μm, panel F için ölçek çubuğu = 400 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. İmmuntürüsasyon için hCO'ların toplanması ve sabitlenmesi

  1. Ucu kesilmiş 1000 μL pipet kullanarak, hCO'ları 1.7 mL bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüm hCO'lar aktarıldığında, hCO'ların tüpün dibine batmasını bekleyin ve fazla ortamı nazikçe çıkarın. hCO'ları PBS ile 1 kez yıkayın, birkaç saniye boyunca hCO'ların tüpün dibine inmesini bekleyin ve fazla PBS'yi nazikçe çıkarın.
  2. Oda sıcaklığında %4 PFA ile hCO'ları 30 dakika sabitleyin.
    NOT: Bazı antikorlar optimal performans için aseton veya metanol fiksasyonuna ihtiyaç duyabilir. Üretici yönergelerine bakın.

3. Tam montajlı immünboyama

  1. İstenilen sayıda sabit hCO'yu 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Fiksatif çözeltiyi çıkarın ve %0,1 Tween-20 (PBS-T) içeren PBS ile yıkayın.
    1. hCO'ları yıkamak için, fazla fiksantörü mümkün olduğunca çok çıkarın. Tüpün altındaki hCO'ları rahatsız etmemeye dikkat edin. ~1 mL PBS-T ekleyin ve hCO'ların tüpün dibine batmasını birkaç saniye bekleyin, sonra bir sonraki adıma geçin.
  2. Birincil antikoru istenen konsantrasyona boyama çözeltisinde seyreldin (%10 yenidoğan baldır serumu, %0,1 PBS-T'de %1 DMSO). Her mikrosantrifüj tüpü için 50-100 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin (veya her tüpteki tüm hCO'ları kaplayacak kadar hacm).
  3. 24 saat boyunca 4 °C'de bir sallayıcı/sallayıcı ile kuluçka yapın. Fazla birincil antikoru çıkarın ve ardından oda sıcaklığında PBS-T'de üç saat 1 saat yıkama yapın. Aşırı antikorların giderildiğinden emin olmak için 4 °C sıcaklıkta PBS-T'de gece boyunca son yıkama yapın.
  4. İkincil antikoru boyama çözeltisinde istenen konsantrasyona seyreldin ve mikrosantrifüj tüpü başına 50-100 μL antikor çözeltisi ekleyin (veya her tüpteki tüm hCO'ları kaplayacak kadar hacim).
  5. HCO'ları ikincil antikorla 24 saat boyunca 4 °C'de bir sallama platformunda kuluçka edin. Fazla ikincil antikoru çıkarın ve ardından oda sıcaklığında PBS-T'de üç 1 saat yıkama işlemi yapın. Aşırı antikorların tamamen temizlendiğinden emin olmak için PBS-T'de 4 °C'de gece boyunca son yıkama yapın.
  6. Tüm montaj görüntüleme için, hCO'ları ucu kesilen 1000 μL pipet kullanarak pozitif yüklü cam sürgüye aktarın. Fazla PBS-T'yi çıkarın ve hCO'ları kapatmak için birkaç damla montaj ortamı ekleyin. HCO'ları düzleştirmek için dikkatlice bir kapak kuşağı yerleştirin.
    NOT: hCO'nun 3D mimarisini korumak için, kaydırağın kenarlarında kauçuk conta veya çift taraflı bant kullanarak kapak kayağının yüksekliğini yükseltin. Temizleme montaj ortamı kullanmak, özellikle hCO'lar düzleştirilmemişse, hCO aracılığıyla görüntülemeyi iyileştirmek için faydalı olabilir.

4. Kesimlendirme ve gömme

  1. Fiksasyondan sonra, kriyokoruma için gece boyunca 4 °C'de %30 sukroz ile hCO'ları kaplayın. Ucu kesilen 1000 μL pipet kullanarak, istenen hCOs sayısını 12 mm x 12 mm boyutlarında plastik bir kalıba aktarın. Fazla sakaroz çözeltisi dikkatlice çıkarın, hCO'ları aspire etmemeye dikkat edin.
    NOT: Pipet ucunda %30 sukroz pipetlemek faydalıdır, böylece huco'lar uca yapışmasını önlemek için kullanılır.
  2. HCO'ları kapatacak kadar küçük bir damla OCT ekleyin. Bir çift ince cımbız veya pipet ucu kullanarak, hCO'ları OCT'de nazikçe yeniden konumlandırın; böylece hCO'lar bir arada toplayılmamış ve kalıbın kenarlarına yakın hiçbir hCO'nun olmaması sağlanır. Tüm hCO'ların kalıbın altına mümkün olduğunca yakın olmasını sağlamak ve tek bir kriyoseksiyonda bulunan hCO'ların sayısını maksimize etmek amacıyla dikkat edin.
  3. Bu ilk OCT tabakasını bir strafor soğutucuya koyarak dondurun, altına kuru buz tabakası yerleştirilir. OCT'nin sertleşmesini birkaç dakika bekleyin, sonra kalıpı kuru buzdan tezgaha taşıyın. Kalıp dolana kadar ek OCT ekleyin. OCT'nin ilk tabakasının tamamen erimesini bekleyin, sonra tekrar kuru buza geçin.
  4. Dondurulmuş, gömülü hCO'ları -80 °C'de kriyobölüme hazır olana kadar saklayın.
  5. Kesitleme hazır olunca, hCO bloğunu mümkün olduğunca hizalayın ve bloğu kesmeye başlayın. Periyodik olarak bir bölüm yüklü bir kaydıra yerleştirin ve her bölümü hCO'lar açısından görsel olarak inceleyin. hCO'lar görselleştirildiğinde, 6 μm kesitlere geçin.
    NOT: hCO'ların gömüleme ve kesitleme sırasında attrisiyon oranı en az %10'dur. Buna göre plan yapın.

5. TUNEL ve bağışıklık boyayan doku kesitleri

  1. Boyaması gereken doku bölümlerinin etrafına hidrofobik bir kenar çizmek için pap kalemi kullanın. Slaytları bir kez PBS 0.1% Tween (PBS-T) içinde yıkarak OCT'yi çözebiliriz.
  2. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklayıcı tampon (%10 yeni doğulan baldır serumu, %1 DMSO, PBS-T) ekleyin.
  3. Birincil antikor çözeltisi hazırlayın. İmmünofluoresans için üretici tarafından önerilen konsantrasyonla başlayın, ancak konsantrasyonun ampirik olarak titremesi gerekebilir.
    NOT: Alternatif olarak, üreticinin protokolüne uygun olarak bu aşamada TUNEL boyama yapılabilir.
  4. Bloklayıcı tamponu sürgüden çıkarın. HCO kesitlerini kapsayacak kadar birincil antikor çözeltisi ekleyin. Birincil antikoru gece boyunca 4 °C'de veya 3 saat içinde 37 °C'de inkubasyon edin. Slaytları oda sıcaklığında PBS-T ile dolu bir Coplin Kavanozunda 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  5. DAPI veya başka bir pan-nükleer işaretleyici dahil olmak üzere bloklama tamponu içinde ikincil antikor boyama çözeltisi hazırlayın. HCO kesitlerini kapatacak kadar ikincil antikor boyama çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat ışıktan korunan kuluçka için.
  6. Slaytları oda sıcaklığında PBS-T dolu bir Coplin Kavanozunda 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. İstenilen montaj ortamıyla bir coverslip ile montaj yapın.

6. CardioCount ile nükleer kolokalizasyonun nicelendirilmesi

NOT: CardioCount, mikroskopikgörüntülerden CM çekirdeklerini puanlamak için derin öğrenme tabanlı bir yöntemdir 40. Başlangıçta CM döngüsünü değerlendirmek için geliştirilen CardioCount, TUNEL40 dahil olmak üzere birden fazla nükleer boyada iyi performans gösterir.

  1. CardioCount kullanmak için GitHub'dan CardioCount paketini indirin veya Google Colab'a (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3) aktarın. CardioCount Sürüm 1, Python 3 ortamında çalışır.
  2. Görüntüleri, kırmızı, mavi ve yeşil kanalların birleştirildiği bireysel 512 x 512 piksel .tif dosyaları olarak nicel olarak dışa aktarın; burada kırmızı kanal bir CM nükleer işaretçi, mavi genel bir nükleer işaretleyici, yeşil ise döngüsel bir nükleer işaretleyici (yani Ki67) veya apoptotik işaretleyici (yani TUNEL) olarak kullanılır. Bu deney için Google Drive'da bir ana klasör oluşturun ve birleştirilmiş tiff'leri alt klasör olarak yükleyin.
    NOT: CardioCount, çekirdeği dolduran nükleer lekeler üzerinde eğitilmiştir. Aurora B veya PH3 gibi daha noktalı bisiklet belirteçleri CardioCount ile uyumlu olmayabilir.
  3. Google CoLab'da CardioCount Notebook'u açın. Grafik işlemci birimi (GPU) erişimini kontrol etmek için Cell 1.1'i çalıştırın. CoLab Notebook'u Google Drive'a bağlamak için Cell 1.2 çalıştırın.
  4. Google Colab'da CardioCount ve Dependencies'i yüklemek için Cell 1.3'ü çalıştırın. İndirildiğinde PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries klasörün kaydedildiği yerin yol adını okumak için kfile'ı düzenleyin.
  5. Cell 2.0'da, analiz edilecek alt klasörü içeren ana klasöre yol adını okumak base_folder düzenleyin. Bu klasörü CoLab'a bağlamak için Cell 2.0'ı çalıştırın.
  6. Cell 2.1.1'de, analiz için görüntüleri içeren klasörün adıyla eşleşecek şekilde orig_image_folder düzenleyin. Yeşil okumak için channel_to_remove düzenleyin ve new_image_folder alt klasörü alt klasörü isimlendirmek için base_folder altında düzenleyin; burada yeşil kanal çıkarılan tüm görüntüler (kırmızı/mavi) kaydedilecek. Kırmızı kanalı kaldırmak için bu adımı tekrarlayın, kırmızı kanal (yeşil/mavi) çıkarılmış görselleri içeren alt klasörü ayırt etmek için new_image_folder düzenlemeye dikkat edin.
  7. Cell 2.1.2'de, kırmızı/mavi görüntüler için görüntüleri 512 x 512 boyutunda kırpın. uncropped_image_folder adımın 6.6'da oluşturulan new_image_folder isimle eşleştiğinden emin olun. kırmızı/mavi görüntüler için. Kırpılmış, kırmızı/mavi görsellerin kaydedileceği alt klasörü belirlemek için destination_image_folder isimini verin. Yeşil/mavi görüntüleri kırpmak için bu adımı tekrarlayın. Son olarak, base_folder'de bulunan orijinal 3 kanallı, birleşik tiffleri kırpmak için bu adımı tekrarlayın.
  8. Olasılık haritaları oluşturmak için Cell 2.2'yi çalıştırın. Hücre 2.1.2'den destination_image_folder oluşturulan kırmızı/mavi ve yeşil/mavi görüntülerin adı data_specific_folder. model_dir için, segmentasyon modellerini içeren bir klasöre dosya yolunu girin. Kırmızı çekirdekleri segmentlemek için model erg_rb_opt kullanın ve epoch için 200 girin. Kırmızı/mavi olasılık haritalarının kaydedileceği klasörü belirlemek için probmap_directory_name yeniden adlandırın. Yeşil/mavi görüntüler için bu adımı tekrarlayın. Yeşil çekirdekleri segmentlere ayırmak için model edu_mouse_bg_opt kullanın ve epoch için 100 girdi.
  9. Cell 2.3.1'de, nesne haritaları, 6.8. adımda oluşturulan olasılık haritalarına göre oluşturulacaktır. input_folder, Hücre 2.1.2'de üretilen kırmızı/mavi olasılık haritası görüntülerini içeren Hücre 2.1.2'deki destination_image_folder'in adını taşıyacaktır. Kırmızı/mavi eşikli görüntülerin saklanacağı output_folder adını verin. Nükleer segmentasyon için güven seviyesi eşiği belirleyin (0.0-1.0 aralığı). Hücre 2.3.1'i çalıştır. Yeşil/mavi görüntüler için bu adımı tekrarlayın.
    NOT: Çekirdekler hakkındaki güven seviyesi için eşikler veri setine bağlı olacaktır. 0.9 eşik ile başlayın ve olasılık haritalarının rastgele incelenmesine dayanarak çok yumuşaksanız daha yüksek, çok katı ise daha düşük ayarlayın.
  10. Cell 2.3.2'de, 6.10. adımda oluşturulan nesne haritalarındaki hücre sayısı sayılır ve .csv dosyasına aktarılır. count_folder, eşikli kırmızı/mavi görüntülerin kaydedildiği Cell 2.3.1'deki output_folder adını alacaktır. Bir görselin sınırına temas eden nesneleri dışlamak için ignore_border_cells Doğru olduğunu okuduğundan emin olun. csv_path tüm alt klasörlerin saklandığı base_folder yol adı olarak yeniden adlandırın. Kırmızı/mavi nesnelerin sayılarını yansıtacak şekilde csv adını düzenleyin. Mavi/yeşil görüntüler için bu adımı tekrarlayın.
  11. Hücre 2.4'te yeşil/kırmızı çift pozitif çekirdekler sayılır. img_folder adımda oluşturulan ve kırpılmış, 3 kanallı görüntüleri içeren alt klasörün adı olarak yeniden adlandırın. childcell_folder 2.3.1 Hücresinden output_folder olarak yeniden adlandırılın; burada eşikli kırmızı/mavi görüntüler kaydedilir. parentcell_folder Cell 2.3.1'den output_folder olarak yeniden adlandırın; burada eşikli yeşil/mavi görüntüler kaydedilir. dest_folder adını değiştirerek çift pozitif nesne haritalarının kaydedileceği klasörü belirleyin. csv_path yol adını ve dosya adını tüm alt klasörlerin saklandığı base_folder olarak belirlemek ve csv adını çift pozitif nesnelerin sayılarını yansıtacak şekilde düzenlemek için yeniden adlandırmak.
  12. Doğru segmentasyonu, her görüntü için üretilen kırmızı, yeşil ve çift pozitif sayıları ham görüntüyle karşılaştırarak doğrulayın.
    1. CardioCount, bir görseldeki çekirdek sayısını, kör bir incelemecinin sayacağı miktara göre tutarlı şekilde fazla tahmin ediyorsa, 6.9. adımı daha yüksek bir güven eşiğiyle tekrarlayın ve 6.10-6.11 adımlarını tekrarlayın. CardioCount, bir görüntüdeki çekirdek sayısını, kör bir incelemecinin sayacağı miktara göre hafife alıyorsa, 6.9. adımı daha düşük bir güven eşiğiyle tekrarlayın ve 6.10-6.11 adımlarını tekrarlayın.
  13. Her hCO için kırmızı çekirdekler, yeşil çekirdekler ve çift pozitif çekirdekler için tüm sayımları topla. Her organoid için %100 çevrim çekirdekleri (çift pozitif çekirdekler / toplam kırmızı CM çekirdekleri) olarak hesaplayın.

7. Hipoksi-reoksijenasyon yaralanması

  1. Hipoksiya ortamı hazırlanır (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 1.3 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 0.9 mM CaCl2, 20 mM sodyum laktat ve 5 mM HEPES, pH = 6.4)5.
  2. Bir hücre kültür şişesine, 96 delikli hCO plakası başına 5 mL hipoksi ortamı aktarın. Hücre kültür termosunu hipoksi odasına yerleştirin ve 3 dakika boyunca anoksik gazla (%5 CO2, %95N2) duruzun. Hipoksi başlatmadan önce en az 1 saat 37 °C'de kuluçka yapın.
  3. hCO'lardan tüm medyayı kaldırın. Tüm kuyulardan çok kanallı pipetle ~150 μL çıkararak başlayın. Sonra, hCO'ları rahatsız etmeden kalan medyayı dikkatlice tek kuyulardan çıkarmak için 200 μL pipet kullanın.
    NOT: Tüm maddelerin tüm kuyulardan çıkarılması, tekrarlanabilir hasar elde etmek için kritik öneme sahiptir.
  4. Her kuyuya 50 μL hipoksi ortamı ekleyin. hCO plakasını hipoksi odasına yerleştirin ve 3 dakika boyunca anoksik gazla (%5 CO2, %95N2) durulaştırın. Hipoksi odasını inkubatöre 37 °C'ye 6 saat boyunca yerleştirin.
  5. Reoksijenasyonu başlatmak için, hipoksi odasından hCO'ları çıkarın ve 150 μL önceden ısıtılmış RB+ ortamı ile besleyin. Aşağı akış testleri yapmadan önce 37 °C'de en az 3 saat reoksijenlenme bırakın.

8. Laktat dehidrojenaz salınım testi

  1. Reperfüzyon başlatıldıktan sonra yaralı ve yaralanmamış hCO'ların kuyulardan istenen zamanda 20 μL madde toplayın. 180 μL LDH depolama tamponunda 1:10 oranında seyreldin (200 mM Tris-HCl (pH 7.3), %10 Gliserol, %1 BSA). Testi yapmaya hazır olana kadar -20 °C'de saklayın. Toplamadan önce malzemeyi karıştırmak için pipet birkaç kez yukarı aşağı
  2. Dondurulmuş medyayı erit. Her analiz edilecek ortam örneği için siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 96 kuyu plakanın bir kuyusuna 45 μL LDH depolama tamponu ekleyin. Her kuyuyuga 5 μL 1:10 seyreltilmiş ortam ekleyin, böylece nihai seyrelme 1:100 olur. Her örnek için 50 μL LDH Algılama Enzim Karışımı ve 0,25 μL Reductaz Substratı karıştırarak LDH Algılama Reaktifi'ni hazırlayın.
  3. Her 1:100 seyreltilmiş ortam içeren her kuyuya 50 μL LDH Algılama Reaktifi ekleyin. Oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 60 dakika kuluçka yapın. Uyumlu bir plaka okuyucuda biyolüminesans sinyal testi.

9. Kalsiyum görüntüleme

  1. Kalsiyum boya boyama çözeltisi fenol kırmızısız RPMI-1640, %0,04 pluronik ve 5 μM Cal520-ile hazırlayın. Örnekleri ışıktan koruyun.
  2. Kalsiyum görüntüleme için iyi amaçlanan her maddeden 100 μL madde alın. 100 μL kalsiyum boya boyama çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de, ışıktan korunarak 30 dakika kuluçka yapın.
  3. Her kuyidan kalsiyum boyalı 100 μL ortamı çıkarın ve yerine 100 μL fenol kırmızısız RPMI-1640 verin. Boyanın yıkılmasını önlemek için 37 °C'de 30 dakika - 1 saat kuluçka yapın.
  4. Sürekli görüntüleme/akış özelliklerine sahip bir mikroskop kullanarak, 96 kuyuluğa sahip ultra düşük bağlantı plakasını çalışma pozisyonuna yerleştirin. 10x bir hedefle, bir hCO'nun tabanını belirleyin ve Cal520 geçici varlıklarını izleyin.
  5. Oda sıcaklığında kalsiyum geçişlerinin 30 saniyelik kayıtlarını yakalayın. Konfokal mikroskop kullanılırsa, tüm hCO'dan görüntü almak mümkün olmayacak. hCO'nun tabanına yakın bir odak düzlemi seçin; hücre hatları kalsiyum geçişleri sırasında görünür olur.

10. Kalsiyum geçici analizi (Şekil 3)

  1. Kalsiyum geçici analizi, çeşitli zirve analiz yazılımları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Aşağıda Spiky ImageJeklentisi 41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/) kullanılarak analiz için talimatlar yer almaktadır.
  2. Her hCO'daki görünür hücreler boyunca ROI Yöneticisi'ne beş adet 2 x 2 piksel ilgi çekici bölge (ROI) ekleyin. Yatırım getirisi miktarlarını hücre çekirdekleri veya hücre sınırlarıyla örtüşmemeye dikkat edin, çünkü hCO'nun hareketi geçici analizi etkileyebilir.
  3. Analiz > Set Ölçümleri bölümünde, Ortalama Gri Yoğunluğu seçin. ROI yöneticisinde, tüm ROI'larda ve kaydın tüm karelerinde Ortalama Gri Yoğunluğunu yakalamak için Multi-Measure seçeneğini seçin.
  4. Tüm ROI'lar için Ortalama Gri Yoğunluğunu içeren .csv bir dosya kaydedin. Her görüntü için tüm yatırım getirisi pozisyonlarını daha sonra referans için kaydedin.
  5. Yeni bir tabloda, Zaman(lar) için bir sütun ekleyin. Her karedeki zamanı, 30 saniyeyi toplam kare sayısına bölerek ve ardından kare sayısıyla çarparak hesaplayın. Bunu düzenlenmiş bir .csv olarak kaydedin.
  6. Fiji'de düzenlenmiş .csv dosyasını açın ve Spiky Eklentisini açın. Analiz Seçenekleri altında, istenen analiz parametrelerini seçin.
  7. X ekseninde Çizim Zaman(lar) ve Y ekseninde ROI #1 için Ortalama Gri Yoğunluğu. Analyze Peaks'i seçin ve taban, zirve başlangıç/sonu ve zirve genliğinin doğru açıklamasını onaylayın. Yanlış sayıda zirve tespit edilirse, Analiz Seçenekleri'nde temel seviyeden minimum zirve genliği dahil parametreleri değiştirin ve zirve eşiğini başlatın, ta ki zirve tanımlaması başarılı olana kadar.
  8. Tüm ara dosyaları kaydet. Dakikada vuruş (bpm), her ROI için 60'ı Zirveden Zirveye Aralığının ortalamasına bölünerek hesaplanabilir.
  9. Yukarıdaki analizi hCO başına tüm ROI için tekrarlayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Kalsiyum geçici analizi. (A) Kırmızı kutu, analiz parametrelerini seçmek için açılır menü düğmesini gösterir. (B) Kırmızı kutu, temsil eden yaralanmamış bir hCO içindeki bir yatırım getirisinden Zaman (s) ile Ortalama Gri Yoğunluğu arasındaki çizim düğmesini gösterir. (C) Kırmızı kutu, zirve analizini seçme butonunu gösterir. (D) Yaralanmamış bir hCO'dan temsil eden kalsiyum geçici iz ve tepe analizi. Kırmızı üçgenler zirve maksimumu gösterir, pembe kareler zirve yukarı ve aşağı çizgi için maksimum eğimi, yeşil kutu zirvenin başlangıcını, mavi kutu ise temel çizgiyi gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokole uyulmak, 7-12 farklılaşma günleri (D7-12) arasında hızla ilerlemeye başlayan iyi şekillenmiş hCO'lar elde etmelidir. hCO'lar 25. günü geçtikçe olgunlaştıkça, spontan kasılmaların elektriksel tempo olmadan artık görünür olmaya ihtiyacı mümkündür. H/R yaralanması, hCO'lar vurmaya başladıktan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir - genellikle yaralanmayı 15 günlük (D15) hCO'larda veya daha sonrasında gerçekleştiririz.

Yaralanmanın On...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, H/R ile kendiliğinden oluşan hCO'ların oluşturulması ve yaralanması için adım adım bir protokol sunulmaktadır. İskemik kalp hastalıkları, kardiyosit ölümü, fibrotik yeniden yapılanma, elektriksel işlevsel bozukluk ve fonksiyonel gerileme gibi patofizyolojik yeniden yapılandırma ile karakterizedir. Bu bozulmalar, hCO model sisteminde gözlemlenir; artan TUNEL+ CM'leri, LDH salınımında artış, Vimentin+ doku alanının artışı ve kalsiyum işlemede fonksiyonel senkr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiçbiri yok

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP) ve Duke Üniversitesi Tıp Bilimcisi Eğitim Programı T32 5T32GM145449-03 (LP) tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase çözeltisiSigma-AldrichA6964-500ML
Anti-Kardiyak Troponin T antikoruAbcamEPR20266
B-27 Takviyesi (50X), serumsuzGibco17504044
B-27 Takviyesi, insülin hariçGibcoA1895602
BioTek Synergy Neo2 Plaka OkuyucuBioTek
Cal-520,AAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LaboratuvarıPMID: 38984052
Hücre hattı (Homo sapiens, erkek) - DU11 iPSC HattıDuke Üniversitesi Kök Hücre Çekirdeği
Şarjlı Mikroskop Slaytları, Beyaz CamVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRSTEMCELL Teknolojileri5888
Corning 96-Hole Şeffaf Ultra Düşük Bağlantı MikroplakalarıFisher7007
Tek Kullanımlık Pipetleme RezervuarlarıVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
EVOS Floresan MikroskopEVOS
Geltrex Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal-Membran Matrisi, LDEV içermemiş, kök hücre nitelikliGibcoA1413302
İnsan Aktivin Bir Rekombinant ProteinPEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2STEMCELL Teknolojileri72124
L-Askorbin Asit (Kristal/Sertifikalı ACS)Fisher ScientificA61-100
Fare anti-VimentinDSHBAMF-17b
mTeSR PlusSTEMCELL Teknolojileri100-0276
Multiwell Hücre Kültür Plakaları – 12 iyiVWR10062-894
Plüronik F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRSTEMCELL Teknolojileri100-0483
RPMI 1640 OrtaGibco11875119
RPMI 1640 Orta, fenol kırmızısı yokGibco11835-030
ThiazovivinSTEMCELL Teknolojileri72254
Tissue-Tek O.C.T. BileşimiSAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Zeiss Dönen Disk Konfokal MikroskobuZeiss

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bozkurt, B., et al. Heart failure epidemiology and outcomes statistics: A report of the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 29 (10), 1412-1451 (2023).
  2. Groenewegen, A., Rutten, F. H., Mosterd, A., Hoes, A. W. Epidemiology of heart failure. Eur J Heart Fail. 22 (8), 1342-1356 (2020).
  3. Ss, M., et al. 2025 heart disease and stroke statistics: A report of us and global data from the american heart association. Circulation. 151 (8), e41-e660 (2025).
  4. Sebastião, M. J., et al. Bioreactor-based 3d human myocardial ischemia/reperfusion in vitro model: A novel tool to unveil key paracrine factors upon acute myocardial infarction. Transl Res. 215, 57-74 (2020).
  5. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. Human tissue-engineered model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Tissue Eng Part A. 25 (9-10), 711-724 (2019).
  6. Frangogiannis, N. G. Why animal model studies are lost in translation. J Cardiovasc Aging. 2 (2), 22(2022).
  7. Forrest, M. J., et al. Torcetrapib-induced blood pressure elevation is independent of cetp inhibition and is accompanied by increased circulating levels of aldosterone. Br J Pharmacol. 154 (7), 1465-1473 (2008).
  8. Barter, P. J., et al. Effects of torcetrapib in patients at high risk for coronary events. New Engl J Med. 357 (21), 2109-2122 (2007).
  9. Wilensky, R. L., et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase a2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development. Nat Med. 14 (10), 1059-1066 (2008).
  10. Investigators, T. S. Darapladib for preventing ischemic events in stable coronary heart disease. New Engl J Med. 370 (18), 1702-1711 (2014).
  11. Debenedittis, P., et al. Coupled myovascular expansion directs cardiac growth and regeneration. Development. 149 (18), dev200654(2022).
  12. Hojo, Y., et al. Expression of vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. J Am College Cardiol. 35 (4), 968-973 (2000).
  13. Lodrini, A. M., et al. Modeling cardiac injury using human cardiac slices to test therapeutic approaches for cardiac regeneration and repair. Eur Heart J. 44 (Supplement_2), ehad655.730(2023).
  14. Arstall, M. A., et al. Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia. J Mol Cell Cardiol. 30 (5), 1019-1025 (1998).
  15. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: At the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev. Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  16. Narsinh, N., Narsinh, K. H., Wu, J. C. Derivation of human induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling. Circ Res. 108 (9), 1146-1156 (2011).
  17. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  18. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  19. Lyra-Leite, D. M., et al. A review of protocols for human ipsc culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 3 (3), 101560(2022).
  20. Hofbauer, P., Jahnel, S. M., Mendjan, S. In vitro models of the human heart. Development. 148 (16), dev199672(2021).
  21. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nat Commun. 8 (1), 1825(2017).
  22. Baar, K., et al. Self-organization of rat cardiac cells into contractile 3-d cardiac tissue. Faseb J. 19 (2), 275-277 (2005).
  23. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  24. Kahn-Krell, A., et al. A three-dimensional culture system for generating cardiac spheroids composed of cardiomyocytes, endothelial cells, smooth-muscle cells, and cardiac fibroblasts derived from human induced-pluripotent stem cells. Front Bioeng Biotechnol. 10, 908848(2022).
  25. Lewis-Israeli, Y. R., Volmert, B. D., Gabalski, M. A., Huang, A. R., Aguirre, A. Generating self-assembling human heart organoids derived from pluripotent stem cells. J Vis Exp. (175), e63097(2021).
  26. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 12 (1), 5142(2021).
  27. Jackman, C. P., et al. Engineered cardiac tissue patch maintains structural and electrical properties after epicardial implantation. Biomaterials. 159, 48-58 (2018).
  28. Deluca, S., et al. Engineered cardiac tissues as a platform for crispr-based mitogen discovery. Adv Healthc Mater. 14 (1), e2402201(2025).
  29. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317.e22 (2021).
  30. Schmidt, C., et al. Multi-chamber cardioids unravel human heart development and cardiac defects. Biorxiv. , (2022).
  31. Hoang, P., et al. Engineering spatial-organized cardiac organoids for developmental toxicity testing. Stem Cell Rep. 16 (5), 1228-1244 (2021).
  32. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nat Biomed Eng. 4 (4), 446-462 (2020).
  33. Abdallah, H., Toomey, K., O'riordan, A. C., Davidson, A., Marks, L. A. Familial occurrence of discrete subaortic membrane. Pediatr Cardiol. 15 (4), 198-200 (1994).
  34. Lin, H., McBride, K. L., Garg, V., Zhao, M. T. Decoding genetics of congenital heart disease using patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs). Front Cell Dev Biol. 9, 630069(2021).
  35. Keung, W., et al. Human cardiac ventricular-like organoid chambers and tissue strips from pluripotent stem cells as a two-tiered assay for inotropic responses. Clin Pharmacol Ther. 106 (2), 402-414 (2019).
  36. Kupfer, M. E., et al. In situ expansion, differentiation, and electromechanical coupling of human cardiac muscle in a 3d bioprinted, chambered organoid. Circ Res. 127 (2), 207-224 (2020).
  37. Marini, V., et al. Long-term culture of patient-derived cardiac organoids recapitulated duchenne muscular dystrophy cardiomyopathy and disease progression. Front Cell Dev Biol. 10, 878311(2022).
  38. Mills, R. J., et al. Drug screening in human psc-cardiac organoids identifies pro-proliferative compounds acting via the mevalonate pathway. Cell Stem Cell. 24 (6), 895-907.e6 (2019).
  39. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), E8372-E8381 (2017).
  40. Karpurapu, A., et al. Deep learning resolves myocardial dynamics in the failing human heart. JACC Basic Transl Sci. 9 (5), 674-686 (2024).
  41. Pasqualin, C., et al. Spiky: An imagej plugin for data analysis of functional cardiac and cardiomyocyte studies. J Imaging. 8 (4), 95(2022).
  42. Kuppe, C., et al. Spatial multi-omic map of human myocardial infarction. Nature. 608, 7924(2022).
  43. Karra, R., et al. Vegfaa instructs cardiac muscle hyperplasia in adult zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (35), 8805-8810 (2018).
  44. Ab, A., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. J CliniInvest. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  45. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. Elife. 6, e25605(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxia ReoxygenationCardiac OrganoidsHuman CardioidsIschemia ReperfusioniPSC Derived OrganoidsSuspension CultureCryosectioningFluorescence MicroscopyScar FormationCardiomyocyte Apoptosis

Related Articles