Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hava sıvı arayüzünde farklılaşmış fare trakeal epitel hücre kültürlerinde nitrik oksit üretiminin ölçümü

129 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70311

⸱

3 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşan hava yolu epitel kültürlerinde nitrit üretimini triyodid bazlı kemimilüminesans testi kullanılarak apikal sekresiyalarda nitrit ölçümünü sağlayan bir yöntemi tanımlar.

Özet

Hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşan hava yolu epitel kültürleri, siliyasyonlu hücrelerde nitrik oksit (NO) sinyalini incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar. Burada, ALI ile farklılaşmış fare trakeal epitel hücrelerinden toplanan örneklerde NO'nun kararlı bir oksidasyon ürünü olan nitrit (NO₂⁻) ölçülerek NO üretimini nicelendirmek için bir protokolü tanımlıyoruz. Apikal yıkamalar, bazal ortamlar ve hücre lizatları, triyodid bazlı kemimilüminesans testi ve nitrik oksit analizörü (NOA) ile birleştirilerek toplanır ve analiz edilir. Reaksiyon kabına enjeksiyon yapıldığında, nitrit kimyasal olarak NO'ya indirgenir ve bu da ozon bazlı kemimilüminesans ile tespit edilir. Sinyal yoğunluğu, standart bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak nitritli pikomollere nicelleştirilir ve değerler toplam hücresel protein içeriğine normalize edilir. Test performansı, NO seviyelerinin farmakolojik modülasyonu kullanılarak doğrulanır. NO donörü Dietilenetriamin NONOat (DETA-NONOate) ve NO sitsetap inhibitörü N(ω)-Nitro-L-arginin metil esteri (L-NAME) ile yapılan tedavide, koşullar arasında nitrit seviyelerinde önemli farklılıklar gözlemledik. En sağlam ve tekrarlanabilir sinyal, hava yolu epitelinden salınan NO miktarına karşılık gelen apikal yıkamalarda gözlemlenir. Bu yöntem, ALI ile farklılaşmış hava yolu epitelisinden alınan örneklerde NO'yu güvenilir şekilde tespit eder; NO üretimini nicelendirmek ve anormal NO metabolizmasıyla ilişkili hastalıkları modellemek için doğru bir in vitro platform sağlar.

Giriş

Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (CF) ve primer siliyer diskinezi (PCD) gibi birçok hava yolu hastalığının ayırt edici özelliği olan nitrik oksit (NO) homeostazı, solun NO seviyelerindeki değişiklikler olarak ölçülebilir ve bu hastalıklarda büyük ölçüde değişebilir; KOAH ve astım 1,2'de yükselirken, CF vePCD 3'te ciddi şekilde azalır. 4. Bu hastalıklar genellikle mukosiliyer klirensin ana etkenleri olan hava yolu epitel hareketli kirpiklerindeanormallikler gösterir 5. NO ve onun aşağı akışındaki sinyal yolları siliyer hareketliliğin kritik düzenleyicileri olduğundan, bu bağlamlarda NO üretimi ve sinyalin nasıl değiştiğini anlamak, mukosilier disfonksiyon mekanizmalarını aydınlatmak için gereklidir. Buna göre, hava yolu epitelinde NO üretimi ve salınımının hassas tespitini sağlayan bir yöntem, bu sinyal molekülünün düzenlenmesi ve fizyolojik rolünü incelemek için değerli bir araç sağlar. Bu tür yaklaşımlar, NO'nun doğrudan ölçülmesinin kısa yarı ömrü ve hızlı tepkisi nedeniyle zor olduğu deneysel ortamlarda özellikle faydalıdır.

NO, silial hücre polaritesini ve hareketli silia 6,7,8'in koordineli atışını etkileyerek hava yolu silialarının biyogenezini ve işlevini düzenler. Ancak, hava yollarında HIÇ homeostaz sürmeyen mekanizmalar hâlâ tam olarak anlaşılmamaktadır. Hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşan hava yolu epitel kültürleri, bu mekanizmaların incelenmesi için değerli bir in vitro sistem sağlar. Şu anda, bu model çevresel hakaretlerin hava yoluepiteli 9,10,11 üzerindeki etkisini incelemek ve hava yolu hastalıklarının patofizyolojisini aydınlatmak için yaygın olarak kullanılmaktadır12. Geleneksel sualtıkültürlerle karşılaştırıldığında 13,14, ALI-farklılaşmış epiteller, epitel polarizasyonu, mukosiliyer farklılaşma ve gerçekçi gaz-sıvı değişimi gibi doğal hava yollarının mimarisi ve işlevini daha sadık şekilde yeniden üretir; bu da onları apikal NO salınımı, sinyal sinyal ve ilgili siliyer fonksiyonları incelemek için özellikle uygun kılar. Bu sistem, özellikle epitelyal farklılaşma veya farmakolojik manipülasyon koşullarında, hava yolu lümenine salınan NO kaynaklı metabolitleri nicelikten ölçemeye yönelik deneyler için oldukça uygundur.

NO konsantrasyonunun doğru ölçümü gereklidir, çünkü hem aşırı hem de eksik NO seviyeleri siliar fonksiyonu bozabilir. Şu anda, NO tespit etmek için mevcut olan floresan prob tabanlı yöntemler (örneğin, diaminofloresseinler, DAF'lar) sadece yarı nicel olup, pH hassasiyeti, oksijen bağımlılığı ve özgüllük eksikliği nedeniyle sınırlıdır; çünkü hücresel oksidanlar ve antioksidanlarla reaksiyona girebildikleri için yarı nicel ölçümlerelde edilir 15. Ayrıca, elektrokimyasal sensörler (örneğin, NO-duyarlı amperometrik elektrotlar) NO16'nın gerçek zamanlı tespitini sağlar ancak kısa yarı ömrü olmaması, elektrot yüzeyinin redoks-aktif türlerin parazitlenmesi ve stabil kalibrasyonun sürdürülmesinde zorluklar nedeniyle karmaşık biyolojik sistemlerde uygulanması zor olabilir17. Alternatif kemimilüminesans temelli yaklaşımlar da dahil olmak üzere doğrudan gaz fazı NO tespiti ve farklı azot oksit türlerini hedefleyen indirgenceli testler de tanımlanmıştır, ancak bunların hava yolu epitelyal kültürlerine uygulanması henüz keşfedilmemiştir. Bu sınırlamalar, küçük hacimli biyolojik örneklerde düşük NO türevli türleri güvenilir şekilde tespit edebilen duyarlı, nicel yöntemlere olan ihtiyacı ortaya koymaktadır. Bu sınırlamaları aşmak için, ALI-farklılaşmış hava yolu epitellerinden toplanan apikal salgılarda NO'yu Nitrik Oksit Analizörü (NOA) kullanarak niceliklendirmek için bir protokol oluşturduk. NOA, geleneksel olarak kimyasal örneklerde NO metabolitlerini ölçmek için kullanılan ve son zamanlarda kan, doku homojenleri ve hücre kültürü süpernatantları 7,18,19 dahil olmak üzere biyolojik örneklerin analizi için uyarlanmış son derece hassas bir kemimilüminesans tabanlı bir dedektördür. NO, normal oksijen seviyeleri koşullarında dokularda hızla nitrite oksitlenen yüksek reaktif bir sinyal molekülüdür ve son derece kısa yarı ömre sahiptir. Dolayısıyla, NO oksidasyonunun son ürünü olarak nitrit, biyolojik sistemlerde toplam NO üretiminin birgöstergesi olarak hizmet eder 20,21,22. Bu hassas ve tekrarlanabilir kemimilüminesans yöntemi, nitrit/NO'nun pikomolarseviyeleri 23,24'te tespit edilmesini sağlar ve MTEC ALI kültürlerinden elde edilen düşük hacimli biyolojik örneklerdeki küçük değişiklikleri ölçmek için ideal hale getirir. Ancak, bu yaklaşım, nitrit birikiminin yakın zamanda NO üretimini yansıttığı ve örnek taşıma, arka plan nitrit kontaminasyonu ve epitel farklılaşma durumu gibi faktörlerden etkilenebileceği koşullar için en uygundur. Bu nedenle, sonuçların doğru yorumlanmasını sağlamak için uygun kontroller ve dikkatli deneysel tasarım gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (Protokol # AUP–00004632) tarafından incelenip onaylanmıştır.

NOT: Protokol, fare trakeal epitel hücrelerinin (MTEC) izolasyonu için yaklaşık 2 gün, ardından genişleme için 7–10 gün, transwell insertlerinde proliferasyon için 5–6 gün, diferentasyon için 21 gün (yeterli çok-siliyel hücre elde etmek için gereken süre), 24 saat ilaç tedavisi ve örnek toplama, NOA kalibrasyonu için ek bir gün gerektirir, enjeksiyonlar ve veri toplama.

1. Medya ve çözümlerin hazırlanması

NOT: Medya içerikleriyle ilgili detaylar için Tablo 1'e bakınız.

  1. Ham'ın F–12 medyası
    1. Çözeltiyi steril laminar akış başlığı içinde hazırlayın. 500 mL Ham's F12 ortamına steril şişede 5 mL 100× Penisilin/Streptomisin antibiyotik ve 0,5 mL Amfoteresin B (Fungizone) ekleyin.
    2. Şişeyi nazikçe çevirerek 5–10 kez karıştırarak tam karıştırmayı garanti edin. Filtre ile çözeltiyi steril koşullarda 0,22 μm filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
      DIKKAT: Penisilin/streptomisin ve amfoterisin B, tahriş veya alerjik reaksiyonlara yol açabilen antimikrobiyal ajanlardır. Eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla kullanın.
  2. Pronaza çözeltisi
    1. 15 mg pronaz, steril bir tüpte 10 mL steril Ham's F12 ortamına ekleyin ve %0,15 pronaz çözeltisi elde edilir. Pronaza tamamen çözülene kadar nazikçe yukarı aşağı veya pipet yaparak karıştırın. Taze hazırlayın, hemen kullanmadan önce.
  3. DNase I çözümü
    1. Ham F12 ortamının 9 mL'sine 5 mg ham pankreas DNaz I ve steril bir tüpte 10 mg/mL sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ile 0,5 mg/mL DNaz I çözeltisi elde etmek için eklenin.
    2. DNase I tamamen çözünene kadar pipetle yukarı aşağı nazikçe karıştırın, böylece baloncuk oluşumunu önleyin. Tamamen çözündüğünde, çözeltiyi 1 mL steril mikrosantrifüj tüplerine aliquot yapın ve -20 °C'de saklayın.
  4. Ham'ın F12 medyası fetal sığır serumu (FBS)
    1. Çözeltiyi oda sıcaklığında steril laminar bir akış başlığı içinde hazırlayın. 40 mL fetal sığır serumu (FBS) ile antibiyotiklerle steril konik bir tüpte 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin; böylece F12 ortamında %20 FBS elde edilir.
    2. Tüpü 5–10 kez ters çevirerek çözelti homojen olana kadar nazikçe karıştırın. Filtre ile çözeltiyi steril koşullarda 0,22 μm filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  5. MTEC genişleme medyası
    1. MTEC genleşme ortamını, Tablo 1'de listelenen bileşenleri steril bir şişede birleştirerek oda sıcaklığında steril laminar akış başlığı içinde hazırlayın.
    2. Tüm bileşenler tamamen birleşene kadar kabı nazikçe dönerek veya ters çevirerek iyice karıştırın. Filtre filtresi, steril koşullarda 0.22 μm filtre ile sterilize edin.
    3. ROCK inhibitörü Y–27632'yi (5 mM stok çözeltisi) 10 μM nihai konsantrasyona ve Notch γ–sekretaz inhibitörü DAPT'yi (10 mM stok çözeltisi) kullanımdan hemen önce 5 μM nihai konsantrasyona ekleyin ve çevirme yoluyla nazikçe karıştırın.
  6. MTEC yayılma medyası
    1. MTEC proliferasyon ortamını, steril laminar akış başlığı içinde oda sıcaklığında Tablo 1'de listelenen bileşenleri birleştirerek hazırlayın.
    2. Tüm bileşenler tam olarak birleşene kadar hafifçe ters çevirerek veya dönerek iyice karıştırın. Ortamı steril koşullarda 0.22 μm filtre ile filtreleyin.
    3. Kullanımdan hemen önce, ROCK inhibitörü Y–27632'yi (5 mM stok çözeltisi) son konsantrasyona 10 μM'ye ve retinoik asit (5 μM stok çözeltisi) son konsantrasyona 0,05 μM ekleyin. Kullanımdan önce nazikçe ters çevirerek karıştırın.
  7. MTEC farklılaşma ortamı
    1. MTEC farklılaştırma ortamını, Tablo 1'de listelenen bileşenleri steril bir kapta birleştirerek oda sıcaklığında steril laminar akış başlığı içinde hazırlayın.
    2. Tüm bileşenler tam olarak birleşene kadar hafifçe ters çevirerek veya dönerek iyice karıştırın. Ortamı steril koşullarda 0.22 μm filtre ile filtreleyin.
    3. Kullanımdan hemen önce retinoik asit ekleyin ve son konsantrasyon olan 0,05 μM'ye ekleyin ve nazikçe ters çevirerek karıştırın.

2. Fare trakeal epitel hücrelerinin izolasyonu (MTEC)

  1. Kurumsal IACUC yönergelerine uygun olarak onaylı bir ötenazi odasında üç yetişkin fareyi (8–20 haftalık) karbondioksit (CO2) solumasıyla ötenazi yapın. Doku toplamadan önce ölümü doğrulayın.
  2. Hayvanı dorsal (göğsü yukarıya bakacak şekilde) aseptik bir yüzeye yerleştirin. Temiz forseps kullanarak, deriyi nazikçe kaldırın ve alt dudaktan karına kadar cerrahi makasla keserek trakeayı açığa çıkarın.
  3. Tükürük bezlerini kenara çekin ve bağ dokusu ile trakealis kasını çıkarın, kıkırdak halkalarını açığa çıkarın. Trakeanın tam uzunluğunu disseksiye edin ve steril Ham's F12 ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Üç trakeayı bir tabakta birleştirin.
  4. Tabağı laminar akış başlığına geçirin ve trakeyaları taze Ham's F12 orta malzemesiyle başka bir tabakaya yerleştirin. Ekstratrakeal dokuları çıkarın ve trakeayı lümenden boylamasına kesin.
  5. Tüm trakeyaları, steril 10 mL %0,15% pronaz çözeltisi içeren 50 mL vidalı kapalı konik tüpe aktarın. 4 °C'de 16–18 saat kuluçka yapın.

3. Hücre izolasyonu ve ilk genişleme

  1. Ertesi gün, dokuları içeren tüpü 10–15 kez ters çevirerek epitel hücrelerini yerinden çıkarır ve 45 dakika boyunca 4 °C'de kuluçka yapar. Pronaz reaksiyonunu %20 FBS içeren 10 mL Ham ortamı ekleyerek durdurun ve 10–15 kez ters çevirerek karıştırın.
  2. Üç adet 15 mL tüplere Ham'ın F12 orta ve FBS ile 10 mL ekleyin. Pasteur pipetiyle trakeal doku 50 mL tüpten birinci, ikinci ve üçüncü 15 mL tüplere sıralı olarak aktarılır ve her tüpte 10–15 kez ters çevirerek trakeal epitel hücrelerini çıkarır. Son transferden sonra dokuyu at.
  3. Üç 15 mL konik tüpten tüm ortamı 50 mL'lik tüpteki ortamla birleştirin. Santrifüj 360 × g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de yapıldı. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 0,5 mL 0,5 mg/mL DNase I çözeltisi ekleyin. 5 dakika buzda kuluçka yapın.
  4. Santrifüj 360 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun. Süpernatantı dikkatlice atın ve hücre pelletini 7–10 mL MTEC genleşme ortamında yeniden süspansiyona alın.

4. MTEC'in genişlemesi ve farklılaşması

  1. 10 mL kolajen I (fare kuyruğu) kullanarak 50 μg/mL kolajen kaplı bir T75 hücre kültürü şişesi hazırlayın ve 37 °C'de 16–18 saat kuluçka yapın. T75 maşesinden kolajen solüsyesini aspire edin ve şişeyi PBS ile üç kez yıkayın (1×). Matayı tamamen kurutmaya bırakın.
  2. Hücreleri içeren 7–10 mL MTEC genleşme ortamından oluşan hücre süspansiyonunu kollajen kaplı şişeye tohumlayın. Matayı 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta bir kuluçka makinesine yerleştirin. Genişletme ortamını her 2-3 günde bir değiştirin ve hücre sayısını %70 birleşime kadar izleyin.
  3. %70 birleşimde, 1 mL Accutase çözeltisi eklenin ve hücre monotabakasını ayırmak için 37 °C'de 10–15 dakika kuluçka yapın. Hücreleri 10 mL MTEC proliferasyon ortamında yeniden süspansiyona alın. Oda sıcaklığında 1057 × g seviyesinde santrifüj yapın.
  4. Süpernatantı atın, hücreleri proliferasyon ortamında yeniden süzültü ve hücreleri sayın.
  5. Tohum 2 × 10,5 5 hücre, her transwell inserti için 0,5 mL hacimde, önceden kollajenle kaplanmış (12 mm membran çapı, 0,4 μm membran gözenek boyutu). Her insertin bazal odasına 1,5 mL ortam ekleyin ve transwell'i 37 °C'de kuluçka makinesine yerleştirin.
  6. 3. günde hem apikal hem de bazal odada ortam değiştirin ve hücrelerin genellikle 5 veya 6. gün boyunca %100 birleşime ulaşmasına izin verin. Kontrol olarak hücresiz bir ekleme ekleyin.
  7. Birleştiğinde, hücreleri apikal olarak 0,5 mL MTEC farklılaşma ortamı ile yıkayın. Sadece bazal odaya 0,75 mL farklılaşma ortamı ekleyerek hava-sıvı arayüzü (ALI) başlatın, böylece apikal odadaki hücreler havaya açık bırakılır.
  8. Her 2–3 günde bir, apikal yüzeydeki hücreleri farklılaşma ortamıyla yıkayın ve bazal ortamı değiştirin. Hücrelerin ALI'de 21 gün boyunca farklılaşmasına izin verin.

5. Siliated epitel hücrelerinin immünoetiketlenmesi ve görüntülemesi

  1. ALI'nin 7., 14. ve 21. günlerinde, hücreleri %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
  2. Hareketli siliyogenez25,26 için gerekli olan transkripsiyon faktörü FoxJ1'i tespit etmek için hücrelerin anti-FoxJ1 antikoku ve hareketli siliyaların yapısal belirtecisi olan asetillenmiş α–tubulin antikorunu tespit etmek için anti-asetillenmiş α–tubulin antikoru ile immünoetiketleme işlemi gerçekleştirilir; bu da yayımlananprotokollere göre hareketli siliyaların yapısal belirtecisidir.
    DIKKAT: PFA tehlikeli bir kimyasaldır, bu yüzden hücreleri sabitlerken uygun PPE (en az nitril eldiven ve laboratuvar önlüğü) giyin.
  3. İmmünoetiketlenmiş hücrelerin görüntülerini konfokal mikroskopiyle 40× veya 60× bir objektif kullanarak alın. Her adımı 0,5 μm olan 10 μm derinlikte Z–yığınları toplayın.
  4. Sinyal doygunluğunu önlemek ve örnekler arasında karşılaştırılabilir yakalama parametrelerini korumak için lazer gücü, dedektör kazancı ve pozlama ayarlarını ayarlayın.
  5. FIJI görüntüleme yazılımındaki hücre sayacı Eklentisi kullanılarak FoxJ1–pozitif veya asetillenmiş tubulin–pozitif hücreleri, ilgi alanına (ROI) göre toplam hücrelerin (DAPI–pozitif) yüzdesi olarak nicelikle ölçün.
  6. GraphPad'de Prism yazılımı (v. 10.0), Shapiro-Wilk testiyle veri dağılımını normallik açısından değerlendirdikten sonra iki kuyruklu Student's t-testi kullanarak grafikler oluşturulur ve istatistiksel analiz yapılır.

6. Farklılaşmış hava yolu epitellerinin ilaç tedavisi

  1. ALI'nin 21. gününde, oda sıcaklığında steril bir tüpte üç insertli hücreler için 3 mL farklılaşma ortamı hazırlanır.
  2. 100 mM stok çözeltisinden (10 mM NaOH'da hazırlanmış) 7,5 μL Dietilen triamin–NONOat veya DETA/NO ekleyerek 3 mL'de 250 μM nihai konsantrasyonu elde edilir. Nazikçe ters çevirerek karıştırın ve hemen kullanın.
  3. Son çözeltinin 750 μL'sini farklılaşmış hücrelerin üç bazal odasına ekleyin ve 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
  4. 100 mM L-NAME stok çözeltisinden (DMSO'da hazırlanmış) MTEC farklılaştırma ortamına 30 μL ekleyerek toplam hacim 3 mL Nω-Nitro-L-Arginin Metil Esteri (L–NAME) hazırlayın.
  5. Son çözeltiden 750 μL her üç bazal odaya eklenin ve 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
  6. 3 mL bazal ortama (%1 v/v) sadece 30 μL dimetil sülfoksit (DMSO) (işlenmemiş grup) ekleyin.
  7. Son çözeltinin 750 μL'sini üç eklemeden oluşan bazal odaya (işlenmemiş) ekleyin.

7. Örnek koleksiyonu

NOT: NOA analizi için üç insertten medya, apikal yıkama ve hücre lizatı örnekleri bir kenara toplanmalıdır.

  1. ALI 22. günde, deneysel grup başına üç insertin her birinden 750 μL bazal ortam ile başlayan farklılaşan hava yolu epitelinden örnekler alın.
  2. Hücresiz insertlerde kuluçka edilen bazal ortamları toplayarak potansiyel dış nitrit kontaminasyonunu hesaba katmak için boş kontrol görevi görür.
  3. Bazal ortamı üç insertten toplayıp NOA'ya enjeksiyon yapılana kadar -20 °C'de hemen saklayın.
  4. Epitelin apikal mukusundaki nitrit/NO'yu toplamak için, her insertteki hücrelerin üzerine önceden ısıtılmış PBS (1×) tamponu (steril, alsitasyonlu ve dondurulmuş) 50 μL eklenin ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
    NOT: PBS ile hücrelerin apikal yıkama toplamak için 30 dakikalık kuluçka aşamasında, hücrelerin her iki tarafında hidrasyonu korumak için bazal odaya da PBS eklenebilir.
  5. Epitelin üzerindeki mukusu içeren PBS'yi toplayın.
  6. PBS yıkamalarını üç insertten birleştirerek her deneysel durumdan yaklaşık 150 μL apikal mukus/PBS elde edin, bu da iki NOA enjeksiyonu için yeterli olacaktır.
  7. Apikal yıkama örneklerini -20 °C'de saklayıp daha fazla kullanıma kadar sakla.
  8. Ayrıca NOA enjeksiyonları sırasında boş kontrol olarak kullanmak üzere PBS yıkama tamponunu da saklayın.
  9. Hücrelerin apikal ve bazal taraflarını üç insertte 500 μL önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın.
  10. Apikal olarak 500 μL Accutase çözeltisi ekleyin ve hücreler tamamen membranlardan ayrılana kadar 15–20 dakika kuluçka yapın.
  11. Tamamen ayrıldıktan sonra, hücrelere serumsuz RPMI-1640 medyası ekleyin (3:1 medya/Accutase oranında).
  12. Üç insertten ayrılmış hücreleri tek bir tüpte biriktirin.
  13. Hücreleri 3000 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürün.
  14. Hücre pelletini 50 μL lizis çözeltisine (RIPA tamponu + Halt 1× proteaz inhibitörü kokteyli) yeniden askıya alın ve 45 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
  15. Lizatı 14.800 × g ile 20 dakika boyunca 4 °C'de döndürün ve süpernatantı toplayın.
  16. Protein konsantrasyonunu Bicinchoninic Acid (BCA) testiyle belirlemek için 3 μL tüm hücre lizatı kullanın.
  17. Kalan lizat çözeltisini RIPA tamponunda 1:1 oranında seyreltirin, böylece iki 50 μL NOA enjeksiyonu için yeterli hacim elde edilir.
  18. Lizatları -80 °C'de saklayıp -20 °C'de NOA'ya enjekte edilene kadar.
  19. Hücre pelletini yeniden süspansiyonda kullanmak için kullanılan RIPA tamponunu -20 °C'de depolayarak lizat örnekleri için boş ve kontaminasyon kontrolü olarak kullanılır.

8. NOA kalibrasyonu ve örnek enjeksiyonları

  1. Triiodid reaktifi, 28 mL buzul asetik asit ve 8 mL ultrasaf suda 400 mg potasyum iyodid ve 250 mg iyot çözünerek hazırlayın.
  2. Triiodid reaktif preslerini, uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) kimyasal bir duman kapasosunda gerçekleştirin.
    DIKKAT: İyot ve buzul asetik asit tehlikelidir ve cilt ile gözlerde tahriş ve korozyona yol açabilir.
  3. Oda sıcaklığında saklayın ve hazırlıktan sonraki 2 hafta içinde kullanın.
  4. Nitritsiz suda 1 mM sodyum nitrit stok çözeltisi hazırlayın.
  5. Stok çözeltiyi kullanana kadar -20 °C'de sakla.
  6. Enjeksiyondan hemen önce PBS'de yeni çalışma standartları (0.125–4.0 μM) hazırlanır.
    NOT: NOA kalibrasyonu için, nitrit kontaminasyonunu en aza indirmek için steril, sıkı kapalı PBS kullanın.
  7. Azot (N 2) taşıyıcı gazı açın ve sistemde gaz akışını başlatın.
  8. Cam temizleme kabını birleştirin ve 20 μL köpük karşıtı 1:10 seyreltilmiş ile birlikte 4 mL triyodid reaktüsü kapa ekleyin.
  9. Hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için vida kapağıyla sabit bir septumla güvenli bir şekilde kapatın.
  10. NaOH tuzağına 10 mL sodyum hidroksit (NaOH) dök.
  11. NOA cihazının (nCLD 88) ekran ekranında Ölçüm, Gaz ve Menzil seçeneklerini seçin.
  12. Cihazı, 0 ile 50 bölek NO arasında ölçüm aralığına karşılık gelen MR2:50.00 olarak ayarlayın ve filtre ayarı için Hızlı seçin.
  13. Azot gazı basıncını, reaktör basıncı 27–29 psi (186–200 kPa) arasında stabil olana kadar ayarlayın.
  14. NOA'ya bağlı bilgisayardaki eDAQ chart yazılımını açın.
  15. Alım aralığını 10/s, voltajı ise 10 V'a ayarlayın.
  16. Kurulum > Kanal Ayarları'na gidin, Kanal 1'i seçin.
  17. NOA yazılımında ekran ölçeğini 2:1 olarak ayarlayın.
  18. NOA cihazında ve yazılımda veri toplamaya başlayın.
  19. Temel çizgiyi stabilize olana kadar izleyin.
  20. Başlangıç stabilitesini doğrulamak için Hamilton şırıngası kullanarak septumdan 10 μL PBS enjekte edin.
  21. Her enjeksiyon için kimyalüminesan sinyalini kaydedin.
  22. Temizleme kabına 0.125 μM nitrit standardından 10 μL enjekte edin.
  23. Her nitrit standardı için iki kez tekrarlayın, böylece daha sonra ortalaması alınacak tekrarlayıcı ölçümler elde edilir.
  24. Her enjeksiyonu Yorum sekmesinde not yapın (örneğin, 10 μL 0,5 μM nitrit).
  25. Şırıngayı tüy içermeyen bir mendille silin ve fazla triyodidi çıkarmak için steril, nitritsiz suyla 3–4 kez durulayın.
  26. Her enjeksiyondan sonra bu temizlik adımını tekrarlayın.
  27. Sinyalin enjeksiyonlar arasında (20–30 saniye) bazına dönmesine izin verin.
  28. Akış Analizi penceresini açın.
  29. Analiz tablosunda her enjeksiyon için zirve yükseklik ve zaman değerlerini inceleyin.
  30. Her zirveyi vurgulayın ve eğriyi (AUC) hesaplamak için seçimi ayarlayın.
  31. Kalibrasyon modunu etkinleştirmek için ekranı S'den C'ye değiştirin.
  32. Her standart için bilinen nitrit miktarlarını Miktar sütununa girin.
  33. Standart eğriyi oluşturmak için Kalibrasyon eğrisi düğmesine tıklayın.
  34. Kalibrasyon eğrisinin kabul kriterlerini (R 2 ≥ 0.99) karşıladığını doğrulayın.
  35. Daha önce buz üzerinde ALI kültürlerinden toplanan biyolojik örnekleri eritin.
  36. 50 μL boş hücresiz ortamı temizleme kabına enjekte edin.
  37. Her bazal ortam örneğinden 50 μL arındırma kabına enjekte edin.
  38. Her enjeksiyon için kemilyünüminesans sinyalini kaydedin.
  39. Her örnek için çift enjeksiyonlar (her biri 50 μL) uygulanır.
    NOT: 50 μL enjeksiyonlar sık sık baloncuk oluşumuna yol açar. Bu sorunu sınırlamak için, triiyodid reaktifini düzenli olarak temizlik kabında anti-köpük ile değiştirin.
  40. Her örneği enjeksiyondan önce Yorum sekmesine not edin.
  41. 50 μL hücresiz PBS (apikal boşluk) temizleme kabına enjekte edilir.
  42. Apikal yıkama örnekleri enjekte edin (her örnek başına iki adet 50 μL enjeksiyon) ve ilgili sinyal tepelerini kaydedin.
  43. RIPA tamponunu iki kez enjekte edin, ardından lizat örnekleri (örnek başına iki adet 50 μL enjeksiyon) ve ilgili sinyal tepelerini kaydeder.
    NOT: Kemilyünesan izin her zaman temel çizgiye ulaşmasına ve stabilize olmasına izin verin. 20–30 saniye bekleyin, ardından bir sonraki örneği enjekte edin.
  44. Örnek enjeksiyonlarının sonunda, Akış Analizi penceresini açın.
  45. Her örnek zirvesini vurgulayarak eğriyi (AUC) hesaplayın.
  46. Standart çözeltilerden oluşturulan kalibrasyon eğrisi kullanılarak her örnek için nitrit konsantrasyonlarını belirleyin.

9. Veri toplama, normalizasyon ve analiz

  1. Verileri eDAQ yazılımındaki Flow Analysis fonksiyonundan eDAQ yazılımındaki Flow Analysis fonksiyonundan zirve yükseklik (V), eğri altındaki alan (V.s) ve eğri altındaki ortalama alan dahil olmak üzere bir Excel dosyasına aktarın. Dışa aktarılan dosya, tüm NOA deneyi boyunca sinyal izlerinin yüksekliğini (V) ve zamana (s) göre tablolayacaktır.
  2. NOA'ya enjekte edilen nitrit pikomollerini (pmol) nitrit konsantrasyonunu (μM) enjeksiyon hacmi (μL) ile çarparak belirleyin.
  3. Kontrollerde ölçülen nitritin pikomollerini (pmol) ortalamayın (hücresiz ortam, PBS yıkama tamponu veya RIPA tampon).
  4. Her 50 μL örnek enjeksiyonunda ölçülen pmol'den ilgili kontrol değerleri çıkarılır.
  5. Her örnekteki toplam nitrit pikomollerini (pmol) enjekte edilen parçada ölçülen pmol'un toplanan tam toplam örnek hacmiyle çarpmasıyla belirleyin. Medya için 750 μL, apikal yıkama için 150 μL ve lizat için yaklaşık 90–100 μL kullanın.
  6. Ayrıca, sadece lizatlar için, toplam nitrit pmol'u 2 ile çarparak seyreltme faktörünü hesaba katlar.
  7. Her örnek için elde edilen nitrit pmol'unu, bu değerleri, BCA testiyle elde edilen ilgili örnekteki lizat içindeki toplam protein miktarına (μg) bölerek normalize edin.
  8. Her örnek için tekrarlanan enjeksiyonlardan alınan nitrit seviyelerini (pmol/μg) ortalamayın.
  9. Her örnek için normalize nitrit seviyelerini (toplam proteinin pmol/μg) GraphPad Prism yazılımı ile çizin.
  10. Shapiro-Wilk testi kullanarak normallik için veri dağılımını değerlendirin.
  11. İki kuyruklu Öğrenci T-testi kullanarak istatistiksel analiz yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu prosedürün genel amacı, hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşan fare trakeal epitel hücre (MTEC) kültürlerinde nitrik oksit (NO) seviyelerini nicelikle ölçmektir. Birincil hücreler, belirlenmişprotokollere göre izole edilir ve farklılaştırılır 27,28. ALI'de 21 gün boyunca hücreler, sililihücreler içeren 27,28 içeren psödostratifikasyona sahip bir hava yolu epiteline far...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hava yolu epitelindeki çoklu siliyasyonlu hücreler, NO sentezi ve sinyalizasyonu için kritiktir; bu da siliyer ribit, mukosiliar klirens ve hava yolu homeostazı 6,7,8 düzenlemesinde hayati öneme sahiptir. NO, oldukça reaktif bir moleküldür ve NO seviyelerindeki küçük değişiklikler bile hava yoluhastalıkları 1,2,3,4 ile ilişkilidir.<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanı ve Profesörü Dr. Mark T. Gladwin'e çalışma tasarımı konusunda rehberlik için teşekkür ederiz. Ayrıca Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin Konfokal Mikroskopi Çekirdeği (Baltimore, MD) programına konfokal mikroskopi kaynaklarına erişimi için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından Dr. Paola Corti'ye verilen 5R01HL168775 bursu ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248immünoboyama için 1:2000 seyreltilmiş
50 mL Santrifüj tüpü filtresi (0.22 µm)CellTreat229710Steril solüsyonların hazırlanması için
500 mL Filtre birimleriThermoFisher Scientific566-0020Steril medya hazırlığı için
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovin Hipofiz EkstraksiyonuThermoFisher Scientific13028014
Bovin Serum AlbuminiSigmaA7906
Kolera toksiniSigmaC8052
Kolagen IThermoFisher ScientificA1048301
Konfokal MikroskopNikonHamamatsu sCMOS kameralı W1 Döner diskli Ti2 ters mikroskop
Corning Transwell eklemelerSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 medyaThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetal Bovin SerumSigmaF4135
Halt 1X Proteas inhibitör kokteyliThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 Besin karışımıThermoFisher Scientific11765054
İnsülin çözeltisiSigmaI0516
Izoproterenol hidroklorürSigmaI6504
Keratinosit Serum-süzülmemiş medyaThermoFisher Scientific17005042
Murin Epidermal büyüme faktörüSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginin metil ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penisilin-StreptomisinSigmaP4333
Fosfat tamponlu salin (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronazSigma10165921001
Retinoik asitSigmaR2625
Rho kinaz inhibitörü (Y-27632 hidroklorür)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA tamponuSigmaR0278
RPMI-1640 medyaThermoFisher Scientific11875093
Sodyum nitrit SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Asetile edilmiş tübülin antikoru (fare)SigmaT6793immünoboyama için 1:200 seyreltilmiş
α-FoxJ1 antikoru (fare)ThermoFisher Scientific14-9965-80immünoboyama için 1:200 seyreltilmiş
α-mouseCy3 ikincil antikoruThermoFisher ScientificA10521immünoboyama için 1:1000 seyreltilmiş
γ-sekretaz inhibitörü IX (DAPT)SigmaD5942

Kaynaklar

  1. Alcázar–Navarrete, B., Ruiz Rodríguez, O., Conde Baena, P, Romero Palacios, P. J., Agusti, A. Persistently elevated exhaled nitric oxide fraction is associated with increased risk of exacerbation in COPD. Eur Respir J. 2018;51(1):1701457.
  2. Krantz, C., Janson, C., Alving, K., Malinovschi, A. Nasal nitric oxide in relation to asthma characteristics in a longitudinal asthma cohort study. Nitric Oxide 2021;106:1–8.
  3. Thomas, S. R., Kharitonov, S. A., Scott, S. F., Hodson, M. E., Barnes, P. J. Nasal and exhaled nitric oxide is reduced in adult patients with cystic fibrosis and does not correlate with cystic fibrosis genotype. Chest 2000;117(4):1085–9.
  4. Shapiro, A. J. et al. Nasal nitric oxide measurement in primary ciliary dyskinesia. A technical paper on standardized testing protocols. Ann Am Thorac Soc. 2020;17(2):e1–e12 .
  5. Legendre, M., Zaragosi, L. E., Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin Cell Dev Biol. 2021;110:19–33.
  6. Li, D., Shirakami, G., Zhan, X., Johns, R. A. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(2):175–81.
  7. Rochon, E. R. et al. Cytoglobin regulates NO-dependent cilia motility and organ laterality during development. Nat Commun. 2023;14(1): 8333.
  8. Mikhailik, A. et al. nNOS regulates ciliated cell polarity, ciliary beat frequency, and directional flow in mouse trachea. Life Sci Alliance 2021;4(5):e202000981.
  9. Schamberger, A. C., Staab–Weijnitz, C. A., Mise–Racek, N., Eickelberg, O. Cigarette smoke alters primary human bronchial epithelial cell differentiation at the air–liquid interface. Sci Rep. 2015;5:8163.
  10. Gindele, J. A. et al. Intermittent exposure to whole cigarette smoke alters the differentiation of primary small airway epithelial cells in the air–liquid interface culture. Sci Rep. 2020;10(1):6257.
  11. Ghosh, B. et al. Effect of sub-chronic exposure to cigarette smoke, electronic cigarette and waterpipe on human lung epithelial barrier function. BMC Pulm Med. 2020;20(1):216.
  12. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. Air-liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: promises, challenges and future directions. Adv Nanobiomed Res. 2021;1(6):2000111.
  13. Bessa, M. J. et al. In vitro toxicity of industrially relevant engineered nanoparticles in human alveolar epithelial cells: Air-liquid interface versus submerged cultures. Nanomaterials (Basel) 2021;11(12):3225.
  14. Allouche, Y. et al. Comparison of submerged and air liquid interface exposure: limitations and differences in the toxicological effects evaluated in bronchial epithelial cells. Environ Res. 2025;279(Pt 2):121856.
  15. Li, J., LoBue, A., Heuser, S. K., Leo, F., Cortese-Krott, M. M. Using diaminofluoresceins (DAFs) in nitric oxide research. Nitric Oxide. 2021;115:44–54.
  16. Jiang S. et al. Real–time electrical detection of nitric oxide in biological systems with sub–nanomolar sensitivity. Nat Commun. 2013;4:2225. 
  17. Brown M. D, Schoenfisch M. H. Electrochemical nitric oxide sensors: Principles of design and characterization. Chem Rev. 2019;119(22):11551–75.
  18. Corti, P. et al. Globin X is a six-coordinate globin that reduces nitrite to nitric oxide in fish red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2016;113(30):8538–43.
  19. Zhao, X. J. et al. Mechanisms for cellular NO oxidation and nitrite formation in lung epithelial cells. Free Radic Biol Med. 2013;61:428–37.
  20. Lundberg, J. O. Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2008;7(2):156–67.
  21. Rochon, E. R., Corti, P. Globins and nitric oxide homeostasis in fish embryonic development. Mar Genomics 2020;49:100721.
  22. Giordano, D., Verde, C., Corti, P. Nitric oxide production and regulation in the teleost cardiovascular system. Antioxidants (Basel) 2022;11(5):957.
  23. MacArthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S–nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;851(1–2):93–105.
  24. Basu, S., Ricart, K., Gladwin, M. T., Patel, R. P, Kim-Shapiro, D. B. Tri-iodide and vanadium chloride based chemiluminescent methods for quantification of nitrogen oxides. Nitric Oxide 2022;121: 11–19.
  25. Brody, S. L., Yan, X. H., Wuerffel, M. K., Song, S. K., Shapiro, S. D. Ciliogenesis and left-right axis defects in forkhead factor HFH-4-null mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;23(1): 45–51.
  26. Jain, R. et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010;43(6): 731–9.
  27. Eenjes, E. et al. A novel method for expansion and differentiation of mouse tracheal epithelial cells in culture. Sci Rep. 2018;8(1): 7349.
  28. You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;283(6): L1315–21.
  29. Pfeiffer, S., Leopold, E., Schmidt, K., Brunner, F., Mayer, B. Inhibition of nitric oxide synthesis by NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME): requirement for bioactivation to the free acid, NG-nitro-L-arginine. Br J Pharmacol 1996;118(6):1433–40. 
  30. Rochon, E. R., Corti, P., Gladwin, M. T. Hemoglobin α in Pulmonary Endothelium: Ironing Out Nitric Oxide Signaling. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;57(6):639–41.
  31. van Faassen, E. E. et al. Nitrite as regulator of hypoxic signaling in mammalian physiology. Med Res Rev. 2009;29(5):683–741. 

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T pSay 233Say 233HepsiSayBo De erSay
Hava sıvı arayüzünde farklılaşmış fare trakeal epitel hücre kültürlerinde nitrik oksit üretiminin ölçümü
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.