Method Article

İnsan Asparagine Sentezi Kullanarak Kriyo-EM Haritalarından Protein Konformasyon Dinamiklerini Görselleştirmek İçin Bir İş Akışı

DOI:

10.3791/70312

⸱

March 20th, 2026

1Department of Biochemistry, Molecular Biology and Pharmacology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, CryoSPARC'ta 3D değişkenlik analizi (3DVA) ve Phenix'te değişkenlik iyileştirme yöntemlerini kullanarak kriyo-EM verilerindeki konformasyonel heterojenliği analiz etmeyi açıklar. İnsan asparagin sentezini örnek olarak kullanarak, değişkenlik haritalarının nasıl oluşturulacağını, ana bileşenlerin nasıl görselleştirileceğini ve ilgili atomik modellerin nasıl geliştirileceğini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, CryoSPARC'ta 3D değişkenlik analizi (3DVA) ve Phenix'te değişkenlik iyileştirme kullanılarak tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi (kriyo-EM) verilerinde konformasyonel heterojenliği analiz etmek için kapsamlı bir iş akışı sunmaktadır. Protokol, parçacık görüntülerinden türetilen ana bileşenler boyunca değişkenlik haritalarının nasıl hesaplanacağını, yapısal varyasyonun ana modlarını görselleştireceğini ve karşılık gelen atomik model topluluklarını bireysel değişkenlik çerçevelerine göre nasıl inceletileceğini açıklar. Ortaya çıkan çıktılar arasında bir dizi 3B değişkenlik haritası, ayrık konformasyonel durumları temsil eden çok modelli atomik yapılar ve karşılaştırmalı yapısal analiz ile film üretimi için uygun görselleştirme dosyaları yer almaktadır. Bu iş akışı, konformasyonel heterojenliğin omurga ve yan zincir seviyelerinde anlamlı şekilde yorumlanabildiği çözünürlük aralığındaki (genellikle ~2.0-6.0 Å) kriyo-EM rekonstrüksiyonlarına geniş çapta uygulanabilir. Özellikle sürekli alan hareketlerini, menteşe bükme hareketlerini ve yalnızca ayrık sınıflandırmayla kolayca çözülemeyen koordineli yerel yeniden düzenlemeleri yakalamak için uygundur. Değişkenlik haritalarının ve geliştirilmiş model topluluklarının birleşik kullanımı, konformasyonel uçların doğrudan yapısal karşılaştırılmasını sağlar, kök ortalaması kare dalgalanma (RMSF) hesaplamaları gibi nicel analizleri destekler ve dinamik yapısal özellikleri biyokimyasal veya fonksiyonel hipotezlerle bağlamak için bir çerçeve sağlar. İnsan asparagin sentezi (ASNS), iş akışının pratik uygulamasını göstermek için örnek olarak kullanılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makromoleküler yapılarda konformasyonel heterojenliğin karakterizasyonu, tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopisi (kriyo-EM) analizinde giderek daha önemli bir unsur haline gelmektedir. Bu protokolün amacı, CryoSPARC1'de üç boyutlu değişkenlik analizi (3DVA) ile Phenix2'de değişkenlik iyileştirme kullanılarak doğrudan kriyo-EM veri setlerinden baskın yapısal değişkenlik modlarını çıkarmak, görselleştirmek ve iyileştirmek için pratik bir iş akışı sağlamaktır. Bu makale, okuyucuların bu hesaplamalı yaklaşımın veriler için uygun olup olmadığını belirlemesinde ve iş akışı tarafından üretilen çıktı türlerini anlamalarında rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Geleneksel deneysel teknikler (örneğin, hidrojen-deüteryum değişimi, NMR spektroskopisi, kütle spektrometrisi) proteinhareketleri 3,4,5 hakkında değerli bilgiler sağlar ancak genellikle moleküler boyut, örnek gereksinimleri veya deneysel karmaşıklık nedeniyle sınırlıdır. Kriyo-EM'deki gelişmeler, büyük ve heterojen sistemler için yüksek çözünürlüklü yapı belirlemesini mümkün kılmıştır ve parçacık popülasyonlarındaki konformasyon değişkenliğinin analizini mümkün kılmıştır. CryoSPARC1'de uygulanan 3D değişkenlik analizi (3DVA), kriyo-EM parçacık veri setlerini baskın, sürekli yapısal varyasyon modlarını tanımlayan ana bileşenlere ayırır. Phenix2'deki değişkenlik iyileştirme ile birleştiğinde, bu yaklaşım her ana bileşen boyunca ayrık konumlara karşılık gelen atomik modeller üretir ve deneysel verilerden elde edilen alternatif konformasyonların görselleştirilmesini ve karşılaştırılmasını mümkün kılar.

Bu protokol, neredeyse atomik veya ara çözünürlükte (genellikle ~2-6 Å) yeniden oluşturulan kriyo-EM veri setleri için en uygundur. Daha yüksek çözünürlüklerde, iş akışı omurga yeniden düzenlemelerini ve sınırlı yan zincirdeğişkenliğini 6 yakalayabilirken, daha düşük çözünürlüklerde alan düzeyinde veya ikincil yapıhareketlerini tanımlamak için daha uygundur 2,7. Bu yöntem, veri setinde geniş çapta bulunan menteşe hareketleri, alan snefesi veya alanlar veya alt birimler arasında koordineli yeniden düzenlemeler gibi baskın, sürekli hareket modlarını yakalamak için uygundur. Yeterli parçacık sayısı ve açısal kapsama gereklidir ve yan zincir pozisyonlarının belirsiz kaldığı esnek veya zayıf çözülen bölgelerde yorumlama sınırlı olabilir. Odaklısınıflandırma 8 veya kapsamlı alt sınıflandırma stratejileriyle karşılaştırıldığında, 3B değişkenlik iyileştirme iş akışı konformasyonel heterojenliği ayrık sınıflar yerine sürekli yörüngeler olarak temsil eder. Bu durum, yöntemi özellikle enzimler, moleküler makineler ve çoklu konformasyon örneklemeleri beklenen çok alanlı komplekslerin keşif analizi için kullanışlı kılar.

İnsan asparagin sentezi (ASNS), protokolün uygulanmasını göstermek için örnek olarak kullanılır. ASNS, iki fonksiyonel domainden oluşan glutamin bağımlı bir amidotransferazdır ve moleküler içi amonyaktüneli 9,10 ile birbirine bağlıdır. Önceki çalışmalar, Arg-142 gibi kalıntıları içeren konformasyon değişikliklerinin butünelin modülasyonuna katkıda bulunduğunu göstermiştir6. Bu makalede, ASNS yalnızca 3DVA ve değişkenlik iyileştirmesinin değişkenlik haritaları, geliştirilmiş atom model toplulukları ve görselleştirmeler nasıl oluşturduğunu gösteren temsili bir sistem olarak hizmet vermektedir. Detaylı mekanik yorumlar Sonuçlar ve Tartışma bölümlerine bırakılır. Moleküler dinamik (MD) simülasyonları, konformasyon manzaralarını incelemek için genellikle tamamlayıcı bir yaklaşımolarak kullanılsa da, bu protokol için MD gerekli değildir. MD simülasyonlarıyla karşılaştırmalar isteğe bağlı bir sonraki analiz olarak yapılabilir, ancak burada açıklanan iş akışı (Şekil 1) yalnızca kriyo-EM verilerinden konformasyonel heterojenliği çıkarmak ve görselleştirmeye odaklanır.

Şekil 1
Şekil 1. İş akışına genel bakış. Tek parçacık verilerinden konsensus kriyo-EM haritası yeniden oluşturulur ve ana bileşenler boyunca değişkenlik haritaları oluşturmak için üç boyutlu değişkenlik analizine (3DVA) tabi tutulur. Değişkenlik iyileştirmesi (Phenix.varref), görselleştirme ve karşılaştırma için karşılık gelen atomik modeller oluşturmak amacıyla konsensus atomik modeli kullanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Veri hazırlığı

  1. Konsensus EM haritasının oluşturulması
    1. Makromoleküler kompleksin uzlaşma 3D yapısını belirlemek için tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) kullanın.
    2. Kriyo-ızgaralarda örnekler vitrifiye edilir ve doğrudan elektron dedektörlü yüksek voltajlı iletim elektron mikroskobu kullanılarak görüntü verilir.
    3. Toplanan filmleri işleyerek ışın kaynaklı hareketi düzeltin, görüntüleme parametrelerini tahmin edin ve parçacık görüntülerini seçin.
    4. Parçacıkların yinelemeli sınıflandırması ve iyileştirmesi yaparak uzlaşma EM haritası oluşturulur.
    5. CryoSPARC (v4 veya üzeri)13 kullanılarak veri işleme işlemi yapılacak, çünkü 3D değişkenlik analizi (3DVA) uygulanacaktır.
  2. Bir uzlaşma modeli oluşturun
    1. Bir atom modeli oluştur ve onu konsensus haritasına göre geliştir. Geliştirilmiş model kalitesini standart kriterlerle doğrulamak
      NOT: ASNS için yapı, şablon tabanlı parçacık seçme stratejisiyle belirlenmiştir. DON modifiye insan ASNS (PDB 6GQ3)9'unX-ışını yapısından türetilen şablon, CryoSPARC13'te yüksek kaliteli parçacıkları verimli bir şekilde seçmek için kullanıldı. Bu parçacıklar, 2B sınıflandırma, Ab initio rekonstrüksiyonu ve C2 simetrisi uygulanarak heterojen ve düzensiz iyileştirme turlarından geçti ve 3.5 şkonsensus haritası elde edildi. Atomik model, EM haritasına kristalyapı 9 kullanılarak oluşturulmuş, ardından Phenix 14,15'te gerçek alan iyileştirmesi ve Coot 16'da manuel ayarlama yapılmış, böylece nihai uzlaşma ASNS yapısı tarifedildiği gibi oluşturulmuştur 6.

2. 3D değişkenlik analizi (3DVA) yapmak

  1. Son bir iyileştirme için parçacık yığını ve maskesini kullanın (nihai rafine harita değil)
    NOT: Genellikle 3DVA için uniform olmayan bir iyileştirme çalışmasının sonuçları kullanılır.
  2. CryoSPARC'ta 3D Değişkenlik işi oluşturun. Parçacık yığını ve maskesini uniform olmayan iyileştirme işinden girin.
  3. Çözülecek mod sayısını belirleyin: Ana bileşen (PC) sayısını 5'e ayarlayın.
    NOT: Makromoleküler yapılar üç boyutlu uzayda bulunduğundan, genellikle en az üç PC ana mekansal hareket modlarını tanımlamak zorundadır. Ek olarak, potansiyel olarak daha küçük ama işlevsel olarak ilgili konformasyon varyasyonlarının gözden kaçırılmaması için iki PC daha eklendi.
  4. Filtre çözünürlüğünü 4.0 Å, Highpass çözünürlüğünü 20 olarak ayarlayın. Diğer tüm parametreleri varsayılan olarak bırakın. İşe başla.
    NOT: 4.0 ş"Filtre çözünürlüğü", veri setinin genel kalitesine uygun olacak şekilde ayarlanmıştı ve yüksek frekanslı gürültüye aşırı uyum sağlanmamasını engelledi. Son uzlaşma haritası 3.5 şçözünürlükte belirlendiğinden, biraz daha düşük bir filtre çözünürlüğü (4.0 Å) uygulanması, değişkenlik analizinin çözünürlük sınırına yakın gürültü yerine gerçek yapısal hareketlere odaklanmasını sağladı.
  5. Çıktı olarak bir dizi değişkenlik hacmi elde edin (Şekil 2A)

3. 3D değişkenlik göstergesinin gerçekleştirilmesi

  1. 3DVA tarafından tanımlanan sürekli konformasyon değişikliklerini görselleştirmek için CryoSPARC'ta bir 3D Değişkenlik Göstergesi işi oluşturun.
  2. 3DVA işinden oluşan parçacık yığını ve değişkenlik hacimlerini girin.
  3. Çıkış modu olarak Simple'ı seçin (aşağıya bakınız).
  4. Filtre çözünürlüğünü 4.0'a ayarlayın ve Yüksek geçirecek çözünürlüğü 20'ye ayarlayın. Diğer tüm parametreleri varsayılan değerlerinde bırakın. İşe başla.
  5. 0'dan 4'e kadar olan 5 Ana bileşene (PC) karşılık gelen 20 değişkenlik haritasını elde edin (0 ile 19 arasındaki çerçeve) (Şekil 2B)
    NOT: 3D Değişkenlik Göstergesi programındaki "basit mod", her ana bileşen boyunca konformasyon değişikliklerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bu mod, 3DVA tarafından tanımlanan uç durumlar arasında doğrusal yörüngeler oluşturur ve parçacık popülasyonundaki hareketlerin net ve doğrudan yorumlanmasını sağlar.

4. Filmler ve Phenix 3D değişken iyileştirmesi için veri hazırlama

  1. 3DVA değişkenlik haritalarını indirin: CryoSPARC'tan 0-4 PC'ler için (toplam beş zip) değişkenlik haritalarını içeren zip dosyalarını indirin.
  2. Dizinleri düzenleyin: Bir ana klasör oluşturun (örneğin, 3DVA/). İçeride, her ana bileşen için bir alt klasör oluşturun (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
  3. Her zip'i ilgili klasöre taşıyın ve içindekileri açın.
  4. Her klasörün 20 değişkenlik haritası (0-19 kareleri) içerdiğini doğrulayın ve comp1-comp4 için tekrarlayın.
    NOT: PC'ler arasında çerçevelerin karışmasını önlemek için her ana bileşen için ayrı klasörler bulundurun.

5. UCSF'de hızlı filmler hazırla Chimera (Isteğe Bağlı) 17

  1. Volume Series aracını açın: Chimera'yı başlatın, ardından Tools → Volume Data → Volume Series sayfasına gidin. Yeni bir Volume Series penceresi açılacak.
  2. Haritaları yükleyin: Aç tuşuna tıklayın ve bir ana bileşene (örneğin, comp0) karşılık gelen 20 haritayı seçin.
  3. Görselleştirme parametrelerini ayarlayın: Volume Viewer'ı açın, uygun yoğunluk eşiğini belirleyin ve haritaya bir renk atayın.
    NOT: Bu örnekte gökyüzü mavisi kullanılmıştır (Şekil 3).
  4. Önizleme hareketi: Volume Series penceresinde Play yönünü Oscillate olarak ayarlayın, ardından Play tuşuna tıklayın ve 0 → 19 → 0 arasında sürekli bir geçiş görüntülenir.
  5. Ek bileşenler için tekrarlayın: Diğer ana bileşenler için 5.2-5.4 adımlarını gerektiğinde tekrarlayın.
  6. Komut satırı girisiyle film dosyası oluşturun: Chimera komut satırını açıp Ek Kodlama Dosyası 1'i çalıştırarak bir filmi dışa aktarın.
    NOT: Bileşen başlı, 20 karelik mrc serisi (örneğin, compX_frame000-019.mrc) Phenix 3D değişken iyileştirmesi için girdilerdir. PC'ler arasında çerçeve karıştırmamak için bileşen klasörlerini ayrı tutun (comp0-comp4).

6. Phenix'te değişkenlik iyileştirme ile model üretimi

NOT: Phenix.varref, giriş haritalarına ve modele giden tüm yollar belirtildiği sürece herhangi bir dizinden çalıştırılabilir. Ancak, organizasyon netliği için, iyileştirmenin her PC için özel bir alt dizinde yapılması önerilir.

  1. Son geliştirilmiş uzlaşma model dosyasını her PC'ye karşılık gelen alt dizine kopyalayın.
  2. Her alt dizinden, komut satırından aşağıdaki sözdizimi kullanılarak Phenix.varref çalıştırın:
    phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
  3. Çözünürlüğü 4.0 şolarak ayarlayın ve 3DVA haritalarının etkin çözünürlüğüyle eşleşin
  4. nproc'u mevcut işlemci sayısına ayarlayın (bu örnekte 20, ancak bu mevcut hesaplama kaynaklarına göre değişebilir)
  5. models_per_map 50 modele ayarlayın (varsayılan).
    NOT: Her harita için, 3DVA verilerinin çözünürlüğüne göre ayarlanmış kısıtlamalarla 50 model oluşturulur. Her harita için en uygun model otomatik olarak korunur. Ortaya çıkan çıktı dosyası, 20 değişkenlik haritasına karşılık gelen 20 geliştirilmiş model içerir. Çıktı, 20 geliştirilmiş model ve bireysel harita dosyalarını içeren bir PDB paketinden oluşur.
  6. Değişkenlik iyileştirme sırasında ek harita keskinleştirme uygulamayın. CryoSPARC tarafından oluşturulan değişkenlik haritalarını (4.0 Å'da filtrelenmiş) doğrudan phenix.varref'e giriş olarak kullanın.

7. Görselleştirme

  1. ChimeraX18'deki PDB paketini açın ve tüm 20 geliştirilmiş modeli aynı anda yükleyin.
  2. Modeller panelini karşılaştırma ve analiz için bireysel çerçeveleri veya ilgi çekici belirli modelleri seçici olarak göstermek üzere kullanın (Şekil 4). Alternatif olarak, her geliştirilmiş model ayrıca ChimeraX veya Chimera'da da açılabilir.

8. Analiz için veri hazırlığı

NOT: Yukarıdaki sözdizimi çalıştırıldığında, 20 değişken modeli ve her bir bireysel harita içeren bir PDB paketi oluşturulur. Çoğu analiz için, seçilen ana bileşen (PC) boyunca iki aşırı konformasyon durumunu temsil eden yalnızca iki model - çerçeve 0 ve 19 çerçevesine karşılık gelen iki model gereklidir.

  1. ChimeraX'te PDB paketini açın, model 1.1 (kare 0) ve model 1.20'yi (kare 19) seçin ve her modeli ayrı bir PDB dosyası olarak kaydedin (Şekil 4).
  2. Ortaya çıkan PDB dosyalarını düzenleyerek ilgi çekici kalıntıları izole edin. Bu manuel olarak veya Phenix.pdb.tools kullanılarak yapılabilir.
  3. Omurga veya yan zincirlerdeki konformasyonel değişiklikleri belirlemek için iki değiştirilmiş PDB dosyasını karşılaştırın.
  4. İki PDB modelini karşılaştırmak için, Chimera'daki MatchMaker fonksiyonunu kullanarak değiştirilmiş yapıları üst üste koyabilirsiniz.
    NOT: Güvenilir hizalama için MatchMaker genellikle en az 10-15 üst üste binen kalıntı gerektirir. Bizim durumumuzda sadece 6 kalıntı analiz edildi; ancak başarılı bir süperpozisyon, ASNS'nin homodimerik doğasından faydalanarak sağlanmıştır—zincir A'da sadece 6 kalıntı kalmışken, zincir B sağlam kalmış ve hizalama için referans olarak hizmet vermiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölüm, 3D değişkenlik analizi (3DVA) ve değişkenlik iyileştirme iş akışı tarafından oluşturulan temsilli çıktıları sunar ve yorumları konusunda rehberlik sağlar. İnsan asparagin sentetazı (ASNS), protokol tarafından mümkün olan başarılı sonuçlar, yaygın eserler ve karşılaştırmalı analizleri göstermek için örnekleyici bir veri seti olarak kullanılır. 3DVA kaynaklı değişkenlik haritalarının tamamı ve ASNS veri setlerinden oluşturulan ilgili rafine modeller Zenodo kamu deposuna depolanmıştır. Detaylı erişim bilgileri

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritik protokol adımları ve karar noktaları
Bu protokolün etkili kullanımı, iş akışındaki birkaç önemli adıma bağlıdır. Son kriyo-EM iyileştirme için kullanılan parçacık yığınının ve maskenin kalitesi kritik öneme sahiptir; çünkü 3D değişkenlik analizi (3DVA), sonradan işlenmiş bir harita yerine doğrudan bu girdiler üzerinde çalışır. Ana bileşen sayısının (PC) seçimi, veri seti büyüklüğünü ve beklenen karmaşıklığı yansıtmalıdır; Çok az bileşen değişkenliği az temsil e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarın ilan edecek bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Takagi, Zhu, Vos, Chaptal, Alcaro ve Richards laboratuvarlarının üyelerine, bu makalenin dayandığı yayına katkıları için teşekkür ediyorum. Yazar, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Elektron Mikroskopi Tesisi ve NIH/NIGMS (S10 OD028723) bu çalışmayı destekledikleri için minnettarlıkla teşekkür eder. Ek fon Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi (Y.T.), kısmen NIGMS (R01GM111695-Y.T.) ve Amerikan Kanser Derneği (DBG-23-1038947-01-IBCD'den Y.T.'ye) tarafından sağlandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CryoSPARC v4.4+Structura Biyoteknolojisihttps://cryosparc.comKriyo-EM işleme için yazılım
Phenix v1.24+Phenix Konsorsiyumuhttps://phenix-online.orgDeğişkenlik iyileştirmesi için yazılım
UCSF ChimeraBiyobilgisayar, Görselleştirme ve Bilişim Kaynağı, UCSFhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/Moleküler Görselleştirme Yazılımı
UCSF ChimeraXBiyobilgisayar, Görselleştirme ve Bilişim Kaynağı, UCSFhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Moleküler Görselleştirme Yazılımı
CPPTRAJAMBER moleküler dinamik yazılım paketihttps://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/RMSF hesaplaması için Python araçları
Linux İş İstasyonu (kurum içi montajlı GPU tabanlı sistem)
İş Istasyonu KutusuSupermicrohttps://www.supermicro.comİş istasyonu kutusu: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassis 
CPUIntel https://www.intel.comCPU: XEON E5-2690V3 x2
Ana KartSupermicrohttps://www.supermicro.comAna Kart: Supermicro Genişletilmiş ATX DDR4 LGA 2011 Anakart X10DAI-O
HafızaKritikhttps://www.crucial.comBellek: Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC Kayıtlı. 288 Pin Server Belleği CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Sabit diskWestern Digitalhttps://www.westerndigital.comHDD: WD RE 4TB Kurumsal Sabit Disk
ARAÇ KONTROLÖRÜLSI Mantığıhttps://www.broadcom.comRAID KONTROLCÜSÜ: LSI Logic MegaRAID SAS 9271-8i Kiti
GPUNVIDIA https://www.nvidia.com24 GB GDDR5 belleğe sahip Quadro M6000 ekran kartı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  2. Afonine, P. V., et al. Conformational space exploration of cryo-EM structures by variability refinement. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1865 (4), 184133(2023).
  3. Schwartz, S. D. Protein Dynamics and Enzymatic Catalysis. J Phys Chem B. 127 (12), 2649-2660 (2023).
  4. Xu, D., Meisburger, S. P., Ando, N. Correlated Motions in Structural Biology. Biochemistry. 60 (30), 2331-2340 (2021).
  5. Gao, S., Klinman, J. P. Functional roles of enzyme dynamics in accelerating active site chemistry: Emerging techniques and changing concepts. Curr Opin Struct Biol. 75, 102434(2022).
  6. Coricello, A., et al. 3D variability analysis reveals a hidden conformational change controlling ammonia transport in human asparagine synthetase. Nat Commun. 15 (1), 10538(2024).
  7. Gobet, A., et al. Rhodamine6G and Hoechst33342 narrow BmrA conformational spectrum for a more efficient use of ATP. Nat Commun. 16 (1), 1745(2025).
  8. Barchet, C., et al. Focused classifications and refinements in high-resolution single particle cryo-EM analysis. J Struct Biol. 215 (4), 108015(2023).
  9. Zhu, W., et al. High-resolution crystal structure of human asparagine synthetase enables analysis of inhibitor binding and selectivity. Commun Biol. 2, 345(2019).
  10. Richards, N. G., Schuster, S. M. Mechanistic issues in asparagine synthetase catalysis. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 72, 145-198 (1998).
  11. Matsumoto, S., Ishida, S., Terayama, K., Okuno, Y. Quantitative analysis of protein dynamics using a deep learning technique combined with experimental cryo-EM density data and MD simulations. Biophys Physicobiol. 20 (2), e200022(2023).
  12. Vant, J. W., et al. Exploring cryo-electron microscopy with molecular dynamics. Biochem Soc Trans. 50 (1), 569-581 (2022).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Adams, P., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  15. Afonine, P. V., et al. New tools for the analysis and validation of cryo-EM maps and atomic models. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (Pt 9), 814-840 (2018).
  16. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (Pt 12 Pt 1), 2126-2132 (2004).
  17. Pettersen, E., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  18. Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
  19. Roe, D. R., Cheatham, T. E. 3rd PTRAJ and CPPTRAJ: Software for Processing and Analysis of Molecular Dynamics Trajectory Data. J Chem Theory Comput. 9 (7), 3084-3095 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Conformational DynamicsCryo EM Maps3D Variability AnalysisCryoSPARC WorkflowVariability RefinementPhenix SoftwareConformational HeterogeneityAtomic Model EnsemblesStructural ComparisonHuman Asparagine Synthetase
Video Coming Soon

Related Articles