Vestibüler Schwannoma Fare Modelinde Tümör Kaynaklı Ataksiyanın Karakterizasyonu

Özet

Tümör kaynaklı ataksiyi incelemek ve vestibüler schwannoma fare modelinde nörolojik fonksiyonu koruyan tedavileri değerlendirmek için davranışsal testlerden oluşan bir panel geliştirdik.

Özet

NF2 ile ilişkili schwannomatoz (NF2-SWN), NF2 tümör baskılayıcı genindeki germline mutasyonlar nedeniyle oluşan otozomal dominant tümör yatkınlık sendromudur. Hastalık, giderek büyüyen ve işitme kaybı, dengesizlik ve hastaların yaşam kalitesini derinden etkileyen ataksi semptomlarına yol açan iki taraflı vestibüler şvannomların (VS) gelişimiyle karakterize edilir. Şu anda FDA onaylı farmakolojik tedavi mevcut değildir. Nörolojik eksiklikler arasında, ataksiya özellikle engelleyici ama az incelenen bir tezahür olarak kalır; bunun büyük nedeni olarak değerlendirmesi için sağlam preklinik modellerin eksikliği vardır. Bu çalışmada, VS ilişkili işitme kaybı ve ataksi ortotopik fare modelinde tümör kaynaklı ataksiyi sistematik olarak değerlendirmek için bir dizi davranışsal testler geliştirdik. Bu testler, tümör yükünden kaynaklanan denge ve motor koordinasyon eksikliklerinin nicel ölçülmesini sağlar. Bu deneysel platform, tümör kaynaklı serebellar disfonksiyonun mekanik çalışmalarını mümkün kılar ve terapötik stratejilerin klinik öncesi değerlendirmesi için değerli bir araç sağlar. Davranışsal değerlendirmeleri tümör biyolojisi ve işitme testleriyle entegre ederek, bu yaklaşım hem tümör baskılayıcı hem de nöroprotektif tedavi etkilerinin karakterizasyonunu kolaylaştırır. Sonuç olarak, bu testler ataksi ile karakterize edilen diğer nörolojik bozukluklara da uygulanabilecek çok yönlü bir çerçeve sunar ve NF2-SWN'nin ötesine kadar fayda sağlar.

Giriş

NF2 ile ilişkili schwannomatoz (NF2-SWN), sitoskelet proteini Merlin^1'i kodlayan NF2 tümör baskılayıcı genindeki mutasyonlar nedeniyle oluşan nadir, baskın olarak kalıtsal bir tümör yatkınlık sendromudur. Merlin fonksiyonunun kaybı, hücre çoğalması, yapışma ve hayatta kalma süreçlerini düzenleyen sinyal yollarını bozar ve etkilenen bireyleri sinir sisteminin birden fazla iyi huylu tümörünün gelişimine yatkın hale getirir. NF2-SWN'nin ayırt edici özelliği, vestibulocochlear sinirler boyunca ortaya çıkan iki taraflı vestibüler schwannomaların (VS) oluşumudur - malign olmayan Schwann hücresinden kaynaklanan tümörler. Bu tümörler giderek büyür, bitişik sinir yapılarını sıkıştırır ve sensösöreral işitme kaybı, kulak çınlaması ve yüz siniri disfonksiyonuna yol^{açar 2}.

İki taraflı VS'li hastalar sıklıkla vestibüler sinir ve iç kulak vestibüler apparatlarında ilerleyici hasar görür; bu da kronik dengesizlik, ataksi ve yürüyüş instabilitesi gibi ortaya çıkan zayıflatıcı vestibüler disfonksiyona yol açar; bu da hareketliliği ve yaşam kalitesini ciddi şekilde olumsuz^{etkiler 3}. Vestibüler disfonksiyon derecesi genellikle tümör yükü ve sinir etkileşimiyle ilişkilidir. Bu belirtiler genellikle tümör kontrolü veya işitme koruma çabalarından sonra bile devam eder ve mekanik sıkıştırmanın ötesinde karmaşık nörobiyolojik^{mekanizmalar olduğunu gösterir 4,5}. Baş dönmesi engelli envanterleri, yürüyüş analizi, vestibulo-okuler refleks (VOR) testi ve postürografi gibi klinik araçlar vestibüler bozuklukları nicelendirmek için kullanılsa da, tümör kaynaklı ataksiyanın altta yatan mekanizmaları hâlâ yeterince^{anlaşılmamaktadır 3}. Moleküler anlayıştaki ilerlemelere ve bevacizumab gibi hedefe yönelik tedavilerin tanıtılmasına rağmen, NF2-SWN hastalarında hem işitme hem de denge fonksiyonunu güvenilir şekilde koruyan FDA onaylı bir tedavi hâlâ bulunmamaktadır. Vestibüler semptomların yönetimi büyük ölçüde destekleyici olmaya devam ediyor ve bu da karşılanmamış büyük bir klinik ihtiyacı ortaya koymaktadır.

VS ile ilişkili ataksiyanın klinik yönetimini iyileştirmedeki önemli engellerden biri, hastalarda gözlemlenen vestibüler ve motor koordinasyon eksikliklerini sadık şekilde yeniden üreten preklinik modellerin eksikliğidir. Mevcut VS hayvan modellerinin çoğu, tümör büyümesi veya işitme kaybına odaklanır, karakteristik denge ve koordinasyon bozukluklarını tekrar eder. Ayrıca, preklinik ortamlarda ataksi ve vestibüler disfonksiyonu objektif olarak değerlendirmek için standartlaştırılmış davranışsal testler iyi kurulmamıştır. Bu boşluk, mekanik araştırmayı engeller ve vestibüler fonksiyonu korumaya yönelik aday tedavilerin değerlendirilmesini sınırlar.

Burada, ölçülebilir ataksi fenotipleri gösteren bir VS fare modelinin geliştirilmesini ve tümör kaynaklı ataksiyi nicelendirmek için özel olarak tasarlanmış davranışsal testler panelini raporluyoruz. Bu model, VS ile ilişkili vestibüler disfonksiyonun altında yatan mekanizmaların araştırılması ve NF2-SWN hastalarında denge, koordinasyon ve genel nörolojik fonksiyonu yeniden sağlamaya yönelik terapötik müdahalelerin etkinliğini değerlendirmek için çok ihtiyaç duyulan bir platform sağlar.

Protokol

Hayvan deneyleri, Massachusetts General Brigham (MGB) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokole uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Hayvan modeli

1. Nf2^-/- hücrelerini (Gaussia luciferase raporlayıcı geni, Gluc) eksprese eden Nf2-/- Schwann hücrelerini immünokompetent C57/FVB farelerine aşılayın. Stereotaktik enjeksiyon cihazı kullanılarak (Şekil 1A), her fareye 2.500 tümör hücresinden 1 μL enjekte ederek sağ^{yarımküre 4,6'nın} CPA bölgesine enjekte edilsin.
2. Yeterli istatistiksel gücü sağlamak ve olası cinsiyetle ilgili farkları incelemek için hem erkek hem de dişi fareleri (1:1 oranı) 8-12 haftalık olarak kullanmaktır. Kafeste 4 kişilik gruplar halinde 12 saatlik ışık/karanlık döngü altında ev fareleri yapılır, ayrıca yiyecek ve su da adeta mevcuttur.
   NOT: Hastaların vestibüler sinirlerinde schwannomalar geliştiği göz önüne alındığında, serebellepopontin açı (CPA) modelini kullandık. CPA modeli, VS'lerin intrakraniyal mikro ortamını özetler.
3. Sahte grup: Hayvan cerrahisi ve tümör hücresi implantasyonunun ataksiye etkilerini değerlendirmek için, farelerin sahte ameliyat geçirdiği ve CPA bölgesine salin enjeksiyonu yaptığı bir Sham cerrahi grubunu dahil edin.
4. Kontrol olarak tümör taşımayan bir fare grubunu dahil edin.
5. Tümör ilerlemesini izlemek için, Gaussia luciferase raporlayıcı genini (Gluc) ifade eden Nf2^-/- hücreleri kullanın ve implantasyondan sonra her 3 günde bir plazma Gluc ölçün.
6. Kısaca, pıhtılaşmanı önlemek için EDTA tüplerine 13 μL kan toplayın. Kan örneğini 96 kuyuyla bir plakaya aktarın ve daha önce tarif edildiği gibi Gluk ^{aktivitesini ölçün} 6,7,8,9.

2. Ataxia testleri

1. Hayvanlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için dört davranışsal testi sabit bir sırada gerçekleştirin. Testler şu sırayla yapılmalıdır: (1) arka uzuv kavrama testi, (2) çıkıntı testi, (3) yürüyüş değerlendirmesi ve (4) kifoz değerlendirmesi. Fareyi ev kafesine geri getirerek testler arasında minimum 2-5 dakikalık dinlenme aralığı tanı. Hayvanı dinlenme süresince izleyin ve ancak normal keşif davranışı yeniden başladığında bir sonraki teste geçin. Aşırı stres veya yorgunluk belirtileri gözlemlenirse testleri durdurun. 10 farelik bir kohort için dört ataxia testinin tam setini, testler arasındaki dinlenme aralıkları da dahil olmak üzere, yaklaşık 45-60 dakika içinde tamamlayın.
2. Arka uzuv kavrama testi
   NOT: Arka uzuv kavrama testi, farelerde nöromüsküler koordinasyonu, motor tonus ve duruş kontrolünü değerlendirir. Ataksili fareler, motor koordinasyonun bozulduğunu ve kas tonusunun düzenlenmesini yansıtan arka uzuv geri çekilme veya karın bölgesine^{kavuşma gösterir 5}.
   1. Fareyi kuyruğun tabanından nazikçe tutun, rahatsızlık için güvenli ama hafif bir tutuş sağlayın. Hayvanı kısa bir süre kafes kapağında veya elinde destekleyerek ürkme tepkisini azaltarak kaldırın.
   2. Fareyi yavaşça kaldırın, böylece gövdesi tamamen uzanmış ve herhangi bir engelsiz havada asılı kalsın. Fareyi kafesin veya test yüzeyinin en az 10 cm üzerinde tutun.
   3. Yaklaşık 10 saniye boyunca asılı pozisyonu koruyun ve hayvanı döndürmeden veya sallamadan arka ayakların ve kuyruğun pozisyonunu gözlemleyin.
   4. Aşağıda açıklandığı şekilde arka uzuv duruşunu değerlendirin.
      1. Her iki arka uzuv da karın dışına doğru ve karından uzaklaştığında normal duruşu belirleyin.
      2. Bir veya her iki uzuvun karın bölgesine doğru çekildiğinde veya birbirinin üzerinden geçtiğinde anormal duruşu tespit edin; bu, ataksi veya nörolojik bozuklukla ilişkili arka uzuv tutunmasını gösterir.
   5. Davranışı önceden tanımlanmış bir puanlama sistemi kullanarak kaydedin veya kör bir post hoc analiz için kısa bir video çekin.
      NOT: Her testi stresi en aza indirmek için ≤10 saniye ile sınırlayın.
3. Kenar testi
   NOT: Çıkıntı testi, farelerde denge, koordinasyon ve ince motor kontrolünü değerlendirir. Hayvanın dar bir çıkıntı boyunca yürüyüp dengesini kaybetmeden güvenli şekilde ev kafesine inme yeteneğini ölçür. Serebellar disfonksiyon veya vestibüler ataksili fareler genellikle bu görev sırasında kayma, düşme veya dengesiz duruş^{gösterir 5}.
   1. Kafesi, tezgah yüksekliğinde (~1 m) sabit ve düz bir yüzeye yerleştirin.
   2. Test kafesinin bir ucunu (Şekil 1C) gövde kutusuna (Şekil 1D) bağlayın; böylece kafesler arasında dikey boşluk veya engel olmamasını sağlayarak farenin sıçrama veya düşme olmadan doğal ve pürüzsüz şekilde ev kafesine inmesini sağlar (Şekil 1B).
   3. Video kamerayı, bir üçayda kenara bakan bir üçada 30°-45° açıda konumlandırarak hem yanal hareket hem de inişi yakalayın.
   4. Aydınlatmayı parlamayı en aza indirecek şekilde ayarlayın ve farenin uzuvları ile kuyruğu net görünürlüğünü sağlasın.
   5. Faresi nazikçe kuyruğun tabanından kaldırın ve diğer elinizle vücudunu destekleyin. Fareyi çıkıntının ortasına yerleştirin, böylece dört pati de yüzeyde olsun. Kuyruğu sadece fare dengeli ve tetikte göründüğünde bırakın.
   6. Farenin dışarıdan bir uyarı olmadan kenar boyunca özgürce yürümesine izin verin. Fareyi en az 10 saniye veya kafese inene kadar kaydedin.
   7. Kaymadan kenarda denge kurma yeteneğini ve çıkıntı boyunca kafese veya platforma doğru yürüme yeteneğini gözlemleyin.
   8. Her fare için üç bağımsız deneme yapın, denemeler arasında ~2 dakikalık bir dinlenme aralığı var. Hayvanlar arasındaki çıkıntı yüzeyini %70 etanol kullanarak koku izlerini çıkararak temizleyin.
   9. Tüm testleri sessiz bir ortamda, tutarlı aydınlatma ve minimum arka plan gürültüsü veya titreşimi ile yapın. Testi aynı gün aşırı tekrarlamaktan kaçının, çünkü yorgunluk ve öğrenme etkileri performansı etkileyebilir.
4. Yürüyüş değerlendirmesi
   NOT: Yürüyüş değerlendirme testi, serbest hareket eden farelerde lokomotor koordinasyonu, adım desenini ve duruş stabilitesini değerlendirir. Ataksili farelerde genellikle kısaltılmış adım, dengesiz hareketler ve düzensiz pati yerleşimi gösterir; bu da koordinasyon ve denge kontrolünde eksiklikleri^{gösterir 5}.
   1. Düz, düz bir pisti beyaz kopya kağıdıyla (8.5 × 11 inç) hata yapın. Ev kafesini kağıdın sonuna yerleştirin, böylece farenin kağıdın üzerinde yürümesini teşvik edin.
   2. Ön ve arka patileri iki zıt renkle hafifçe kaplayın (örneğin, ön patiler için mavi, arka patiler için kırmızı) toksik olmayan bir mürekkep pediyle (Şekil 1E).
   3. Fareyi pistin başlangıç ucuna yerleştirin ve dışarıdan sıkışmadan kağıt üzerinde serbestçe yürümesine izin verin.
   4. Aşağıdaki parametreleri gözlemleyin ve ölçün:
      Adım uzunluğu: aynı patinin ardışık pozisyonları arasındaki mesafe.
      Temel genişlik: sol ve sağ arka ayak izleri arasındaki yan mesafe.
   5. Her fare için iki ila üç koşu yapın, testler arasında dinlenme sağlanın.
      NOT: Toksik olmayan, hızlı kuruyan mürekkep kullanın ve sadece pati pedlerinin kaplandığından emin olun. Her denemeden sonra kağıdı değiştirin ki bulanmasın. Ayak izlerinin bulanıklaşmasını önlemek için mürekkebi az uygulayın; çünkü aşırı mürekkep adım ölçümlerinin doğruluğunu azaltır.
5. Kifosis değerlendirmesi
   NOT: Kifoz değerlendirmesi, doğal hareket sırasında omurga hizalanması ve duruş anormalliklerini değerlendirir. Nörolojik veya kas işlev bozukluğu olan farelerde genellikle kalıcı sırt eğriliği veya omurgada kamburluk^{görülür 5}.
   1. Fareyi bir yüzeye koyun ve birkaç saniye boyunca özgürce yürümesine veya keşfetmesine izin verin. Hayvanı korkutmaktan kaçının, çünkü ani hareketler geçici olarak duruşu değiştirebilir.
   2. Gövde eğriliğini belgelemek için yan görünümden kısa bir video kaydedin.
   3. Farenin yürürken duruşunu gözlemleyin, aşağıda açıklandığı gibi omurga hizalanması ve gövde eğriliğine odaklanın.
      1. Fare düz veya hafifçe kavisli bir sırt ve düzgün vücut hareketleriyle normal duruşu belirleyin.
      2. Fareye kifoz gösterdiğinde anormal duruş tespit edin; bu, anormal şekilde kambur veya kıvrımlı omurga, sert gövde ve yürüyüş sırasında azalmış esneklikle karakterize edilir.

3. Ataxia test analizi

NOT: Gözlemci yanlılığını en aza indirmek için deneysel grup atamasına kör bir gözlemci tarafından tüm davranışsal puanlamaları yapın.

1. Çıkıntı testi puanlaması
   1. Fare kenarda pürüzsüz yürürse, dengesini korursa ve kaymadan kafese inerse 3 puan ver.
   2. Fare hafif bir sakınlık (tereddüt veya hafif bir pati kayması) gösterirse ama toparlanır ve güvenli bir şekilde inerse 2 puan verin.
   3. Fare sık sık kayma, çömelmiş duruş, denge için aşırı kuyruk kullanımı veya gecikmeli iniş gibi orta derecede bir engel gösteriyorsa 1 puan verin.
   4. Fare ciddi bir sakat gösterirse, dengede duramazsa, kenardan düşerse veya hareket etmeyi reddederse 0 puan verin.
2. Arka uzuv kavrama testi puanlama
   1. Fare sürekli dışa doğru açılmış arka ayakları ve tutunma belirtisi olmadan 3 puan verin.
   2. Farede hafif bir bozukluk, örneğin bir arka uzuvunun aralıklı geri çekilmesi gibi bir bozukluk varsa, 2 puan verin.
   3. Fare, orta derecede bir bozukluk gösteriyorsa ve her iki arka uzuvun kısmi geri çekilmesiyle karakterize edilen bir bozukluk gösteriyorsa 1 puan verin.
   4. Eğer fare ciddi bir bozukluk gösteriyorsa, her iki arka uzuv gözlem süresinin çoğunda karın bölgesine sıkıca kenetlenmiş olursa, 0 puan verin.
3. Yürüyüş puanı
   1. Fare düzenli ve koordineli bir yürüyüşle yürüyüp düz çizgilerde hareket ederse 3 puan verin.
   2. Farede hafif bir dengesizlik veya yan sapma ile yavaş yürümek, bir yana topallayarak gitmek veya geniş, dairesel yollar yürümek gibi hafif bir bozukluk varsa 2 puan verin.
   3. Farede orta düzeyde bir bozukluk varsa, bu da açık yürüyüş bozukluğu, sadece iki veya üç pati ile yürüme, vücudunun bir kısmını sürükleme veya dar daireler çizerek hareket etme gibi orta düzeyde bir engel gösteriyorsa, 1 puan verin.
   4. Fare ciddi bir sakinlik gösteriyorsa, etkili şekilde hareket edemiyorsa, hareketsiz kalıyorsa veya kontrolsüz yan hareketler gösteriyorsa 0 puan verin.
4. Kifosis puanlama
   1. Fare hem dinlenirken hem de yürürken düz ve düz kalırsa 3 puan verin.
   2. Fare hafif bir bozukluk ve hareket sırasında sırt hafifçe eğrilik gösterirse 2 puan verin.
   3. Farede orta düzeyde bir engel varsa ve yürürken kıvrımlı kalan orta derecede kambur sırt varsa, 1 puan verin.
   4. Eğer fare ciddi bir engel ve gözlem süresi boyunca ciddi şekilde kambur bir sırt hareketi gösteriyorsa 0 puan verin.

4. Derecelendiriciler arası güvenilirlik değerlendirmesi

1. Gözlemcileri, puanlama kriterlerinin yorumlanmasını standartlaştırmak için resmi puanlamadan önce temsil eden örnek videolar kullanarak eğitin.
2. Gözlemci yanlılığını en aza indirmek için, tüm davranış testlerini tedavi grubuna ve deneysel zaman noktasına kör olan iki eğitimli gözlemci tarafından bağımsız olarak puanlayın.
3. Cohen'in kappa katsayısı kullanılarak her davranışsal test için derecelendirici arası güvenilirliği nicelikle ölçemek. Kappa değerlerini şu şekilde yorumlayın: <0.40, kötü uyum; 0.40-0.60, ılımlı anlaşma; 0.60-0.80, önemli bir anlaşma; ve >0.80, neredeyse mükemmel bir uyum.
4. Kayıtlı videoların ortak gözden geçirilmesiyle puan tutarsızlıklarını çözün ve 5 puan üzerinde bir uzlaşma puanına^ulaşın.

Sonuçlar

CPA tümör büyümesi, VS fare modelinde ataksiye neden olur

Tümör kaynaklı ataksiyi değerlendirmek için iki deneysel kohort oluşturduk. İlk olarak, hayvan cerrahisi ve tümör hücresi implantasyonunun ataxi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için farelere sahte ameliyat ve CPA bölgesine salin enjeksiyonu yapıldı. Sahte grup farelerindeki ataxi semptomları, ameliyat edilmeyen kontrol farelerindeki semptomlarla karşılaştırıldı. İkinci kohortta, Nf2^-/- tümörleri...

Tartışma

Burada açıklanan davranışsal testler, VS ve ilgili vestibüler bozuklukların fare modellerinde ataxi ve motor koordinasyon eksikliklerini değerlendirmek için sağlam ve nicel bir çerçeve sağlar. Huntington hastalığı ve spinoserebellar ataksi¹⁰ gibi nörodejeneratif hastalık modelleri için yerleşik protokollerden uyarlanan bu testler, NF2-SWN'de tümör kaynaklı vestibüler disfonksiyonu karakterize etmek için oldukça uygundur. B...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fetal sığır serumu	ThermoFisher	A5670701
GloMax 96 Mikroplaka Luminometre	Promega	GM3000
McKesson mavi prosedürü alt alt paneli	McKesson	75402
Schwann hücre büyüme takviyesi	ScienCell	1752