Yöntem makalesi

Balina İzleme Gemileri için Çevresel DNA Örnekleme Örneği

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70334

⸱

10 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

Bu makalede

Özet

Bu protokol, balina gözlem gemilerinden deniz balığı çevresel DNA (eDNA) örnekleri toplamak için standartlaştırılmış bir iş akışını tanımlar. Araştırmacılar ve eğitimli vatandaş bilim insanları için fizibilite önceliklidirken, çevresel koşullar, filtrasyon süresi, bulanıklık ve gemi üzerindeki lojistik uygulamanın pratik sınırlarını belirler.

Özet

Çevresel DNA (eDNA), deniz balıklarını izlemek için invaziv olmayan bir yaklaşım sunar, ancak operasyonel platformlardan yaygın olarak uygulanması standart ve uygulanabilir örnekleme iş akışlarını gerektirir. Bu çalışma, balina gözlem gemilerinden deniz balığı eDNA'sı toplama protokolünü tanımlıyor; bu protokol, araştırmacılar ve eğitimli vatandaş bilim insanları tarafından tanımlanmış çevresel ve lojistik koşullar altında uygulanmak üzere tasarlanmıştır. Bu yaklaşım, flukeprint hedefli deniz suyu toplama, kendi kendini koruyan filtrelerle gemi içi filtrasyonu ve sonraki moleküler analizleri entegre ederek gerçek dünya koşullarında operasyonel olarak uygulanabilir veri üretimini destekler. Protokol, 2024 yılında Kuzey Atlantik ve Akdeniz'deki üç bölgede (İzlanda, Portekiz ve İtalya) birden fazla deniz baliği taksonunu kapsayan koordineli saha kampanyaları sırasında uygulandı. Yöntem performansı, humpback balinasının (Megaptera novaeangliae) mitokondriyal DNA'sını hedefleyen yeni geliştirilen tür-spesifik nicel PCR testi kullanılarak değerlendirildi ve değişken çevresel ve lojistik koşullarda tutarlı tespit oranları gösterildi. Saha uygulaması ve kirlilik kontrolü için pratik rehberlik sağlayarak, bu protokol tekrarlanabilir eDNA tabanlı cetacean izlemesini destekler ve deniz biyolojik çeşitliliği çalışmalarında bölgeler arası karşılaştırılabilirliği kolaylaştırır.

Giriş

Deniz megafaunası, deniz balıkları ve diğer geniş çeşitli türler dahil olmak üzere, biyolojik çeşitliliğin korunması için hayati öneme sahiptir. En iyi yırtıcılar ve ekosistem mühendisleri olarak, deniz balığı balıkları trofik düzenlemeye, besin döngüsüne ve okyanus havzalarında ekolojik dayanıklılığa katkıdabulunur 1. Ancak, bu yüksek hareketli türler için kapsamlı ekolojik bilgi üretmek hâlâ zordur ve genellikle kaynak yoğun izleme programlarınadayanmaktadır 2. Biyopsi örnekleme, fotoğraf tanımlama, pasif akustik izleme, uydu telemetrisi ve hava incelemeleri gibi geleneksel yaklaşımlar, cetaceanekolojisi 3,4,5,6,7 hakkında kritik bilgiler sağlamıştır; ancak bu yöntemler genellikle maliyetli, lojistik açıdan zorlu, mekânsal olarak kısıtlı veya müdahalecidir ve sıkı etik ve düzenleyicidenetime tabidir 8. Sonuç olarak, örnekleme sıklığı, coğrafi kapsama ve paydaş katılımı fırsatları genellikle sınırlıdır; özellikle geniş veya nadir türlerin incelenmesinde.

Çevresel DNA (eDNA, organizmaların çevrelerine döktüğü genetik materyal olarak tanımlanır) örneklemesi, su örneklerinden su türlerini tespit etmek için güçlü ve istilacı olmayan bir araçolarak ortaya çıkmıştır 9,10. Mitokondriyal DNA parçalarını hedefleyen türe özgü nicel PCR (qPCR) testleri, deniz taksonlarının, özellikle deniz balıkları 11,12,14 dahil olmak üzere, son derece hassas ve özgün tespit etmesini sağlar. Varlık/yokluk tespitinin ötesinde, göreli eDNA sinyal gücü ve hedef DNA dizileri, yakınlık, göreceli bolluk ve popülasyon düzeyindeki genetik kalıplarla ilgilideğerli bilgiler sağlar 15,16,17,18,19. Ayrıca, balinaların yakınında toplanan çevresel örnekler genellikle av türleri, simbiyontlar ve parazitler dahil olmak üzere aynı zamanda bulunan taksonlardan DNA içerir ve bu da daha geniş ekolojik çağrışımlarıdestekler 20,21,22. Bu ilerlemeler birlikte, eDNA tabanlı yaklaşımların geleneksel yöntemleri tamamlama ve deniz sistemleri genelinde cetacean araştırmalarının kapsamını genişletme potansiyelinigöstermektedir 23,24.

Bu avantajlara rağmen, deniz megafaunasının eDNA tabanlı izlenmesi, temsilli örnekleme, mekânsal kapsam ve metodolojik tekrarlanabilirlik gibi konularda sürekli zorluklarla karşı karşıyadır; özellikle DNA'nın hızla seyreltildiği ve hedef türlerin geniş menzile sahip olduğuve düşük yoğunluklarda bulunduğu açık deniz sistemlerinde. Bu kısıtlamaların ele alınması, geniş mekansal ve zamansal ölçeklerde uygulanabilecek ölçeklenebilir, operasyonel olarak uygulanabilir örnekleme çerçeveleri gerektirir. Vatandaş bilimi girişimleri, ekolojik veri toplamayı genişletirken deniz korumasına kamu katılımını teşvik etmede etkili olduğunu kanıtlamış ve böylece büyük ölçekli eDNA tabanlı izleme için umut vadeden bir yolhaline gelmiştir 27,28,29,30. Balina gözlem gemileri, eDNA örneği için az kullanılan ancak son derece uygun bir platformu temsil eder ve mevsimler ve bölgeler boyunca 31,32,33 deniz balığı habitatlarına düzenli erişim sağlar. Küresel balina gözlem endüstrisi, kapsamlı operasyonel ağlarıdestekliyor 34 ve önceki çalışmalar, ticari gemiler, feribotlar35 gibi diğer fırsatçı platformlardan ve fotoğraf tanıma ve davranışsal gözlemlerle entegre edilmiş hedefli örnekleme yoluyla deniz baliği eDNA'sının toplanmasının mümkün olduğunugöstermiştir 36,37. eDNA araştırmalarının hızlı yayılması, önemli metodolojik yeniliklere yol açtı, ancak deniz sistemlerindeki biyolojik değişkenlik ve teknolojik ilerlemelerin hızı, protokollerin uyumlandırılması ve çalışmalar arasında karşılaştırılabilirliği sağlama çabalarını zorlaştırıyor. Bu nedenle, standartlaştırılmış ancak uyarlanabilir saha metodolojileri özellikle büyük ölçekli çok uluslu izleme girişimleri için gereklidir38.

eDNA tespiti, filtrelenmiş su hacmi, filtreleme stratejisi, filtre malzemesi ve gözenek büyüklüğü tarafından etkilenir. Daha büyük hacimlerin filtrelenmesi genellikle omurgalı hedefler için eDNA verimlerini ve tespit olasılığını artırır; bunlar arasında deniz balığı(39,40,41,42) bulunur. Ancak verimli veya bulanık sularda, filtreleme verimliliği hızlı filtre tıkanmasıylasınırlanabilir ve bu da ulaşılabilir hacim ile operasyonel fizibilitearasında 45,46 arasında tavizler gerektirebilir. Flukeprintlerden — balina kuyruğunun darbesinden oluşan yüzey bozgunluğundan — örnekleme, yakın zamanda dökülen biyolojik materyalin yüzey yakınlarında yoğunlaştığı için cetase'lerin eDNA algılanabilirliğini sürekli artırdığı gösterilmiştir. Kapalı, kendini koruyan filtre sistemlerinin kullanımı, işlem adımlarını ve kirlenme risklerini azaltır, bu da onları vatandaş bilimi uygulamaları için oldukça uygunhale getirir 38,42. Ayrıca, biyolojik kopyaların ve rutin saha kontrollerinin dahil edilmesi tespit başarısızlığını en aza indirir ve veri güvenilirliğiniartırır 49,50,51.

Protokol geliştirme ve doğrulama
eWHALEprojesi 52 , Avrupa genelinde araştırmacıları, balina gözlemcilerini ve vatandaş bilim insanlarını bir araya getirerek eDNA kullanarak deniz megafaunasını izlemek üzere bir araya getiren ulusötesi bir girişimdir. Örnekleme çalışmaları, Kuzey Atlantik ve Akdeniz'deki birden fazla deniz balığı taksonunu hedeflemekte, yerel çevresel ve lojistik koşulları hesaba taşımak için bölgeye özgü adaptasyonlar içeren temel bir protokol kullanmıştır.

Burada, balina gözlem gemilerinden cetacean eDNA'sı toplamak için standartlaştırılmış, baştan sona bir protokol sunuyoruz; bu protokol, 2024'te Skjálfandi Körfezi (İzlanda), Azorlar (Portekiz) ve Ligurya Denizi (İtalya)'da koordineli saha kampanyaları sırasında toplanan 308 deniz suyu eDNA örneğinin analiziyle geliştirilmiştir; örnek başına iki kopya ve 21 saha kontrolü dahildir. Yöntem, flukeprint hedefli deniz suyu toplama, kendini koruyan eDNA filtreleriyle gemide filtrasyon ve sonraki moleküler analizleri entegre eder.

Bu protokol, eğitimli araştırmacılar ve vatandaş bilim insanları tarafından gerçek dünya balina gözlem koşullarında uygulanmak üzere tasarlanmıştır; burada gemide filtrasyon sakin ve ılıman deniz koşullarında balina gözlem faaliyetlerini bozmadan tamamlanabilir. Uygulanması, örnekleme stratejileri ve araştırma hedeflerinin tanımlanması için katılımcı kuruluşlarla (örneğin, balina gözlem operatörleri, kar amacı gütmeyen kuruluşlar, araştırma kurumları) koordinasyon gerektirir. Tekrarlanabilirlik ve çapraz karşılaştırılabilirlik için çekirdek parametrelerin sabit kalması gerekirken, yüksek bulanıklık, gemi hareketi veya zaman, mekan veya personel kısıtlamaları olan alanlarda protokolle uyumlu ayarlamalar gerekebilir. Bu tür adaptasyonlar arasında filtre tipi, ulaşılabilir filtrelenmiş su hacmi ve yardımcı ekipmanlar bulunur. Her örnekleme kampanyasında tutarlı şekilde uygulanmalı ve şeffaf şekilde raporlanmalıdır. Protokol adımları ve Tartışmalarında veri kalitesi, şeffaflık ve bölgesel karşılaştırılabilirliği desteklemek için ayrıntılı operasyonel rehberlik ve lojistik hususlar sağlanmaktadır.

qPCR test tasarımı
Protokol performansını değerlendirmek için, Skjálfandi Körfezi'nde (İzlanda)53 düzenli olarak karşılaşılan ve Azorlar'da mevsimsel olarak bulunan göçmen tür olan kamburbalinaların (Megaptera novaeangliae) eDNA'sı, sahada toplanan örneklerden amplifikasyon yapıldı. DNA lizisi, çıkarımı ve qPCR iş akışları, başlangıçta eWHALE projesine katılan dört laboratuvarın katıldığı laboratuvarlar arası halka testi ile optimize edildi ve böylece kurumlar arasında tutarlılık ve uygulanabilirliğiartırdı14.

Kambur balina eDNA'sının varlığını güvenilir şekilde tespit etmek için, mitokondriyal ND5 bölgesini hedefleyen türe özgü bir MGB (minik oluk bağlayıcı) qPCR testi belirlenmişyönergeler 55 (Tablo 1) doğrultusunda tasarlandı ve doğrulandı. Oligonukleotid primerleri ve bir prob, DNA dizisi hizalanması veanalizi için yazılım kullanılarak üretilmiştir 56; bu yöntem türlerin özelliğini ve amplifikasyon verimliliğini en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır (Ek Dosya 1-Ek Şekil S1). Hedef ve hedef dışı taksonlar (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens) kullanılarak in vitro analiz özgüllüğü değerlendirildi. QPCR standart eğrileri oluşturmak için kullanılan DNA konsantrasyonları, doku kaynaklı DNAstandardı 42,57,58,59,60'tan nicelendirilmiştir. Testi tespit sınırı (LOD), örnek kopyalananların %95'inde pozitif amplifikasyon veren en düşük konsantrasyon olarak tanımlandıve 11,61 olarak belirlendi. Kambur balina eDNA'sı tespitleri, saha örnekleri için pozitif reaksiyonların ve sinyal gücü oranının (yani Döngü Eşiği, CT değeri) tahmin edilerek değerlendirildi; böylece amplifikasyon değişkenliği hesaba katıldı ve tespitgüvenilirliği 57,60,62 artırıldı. Tür tespitleri daha sonra çift yönlü Sanger Dizileme ile doğrulandı ve ardından BLASTanalizi 63 ile doğrulandı.

qPCR verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Gruplar arasındaki istatistiksel anlamlılık, parametrik olmayan Mann-Whitney U testi ve Welch'in iki örneklemli t-testi kullanılarak değerlendirildi. Farklar p < 0.05'te anlamlı olarak değerlendirildi. Tüm analizler istatistiksel analizyazılımı 64 kullanılarak gerçekleştirildi.

Protokol

Etik ve düzenleyici uyum
Tüm deniz balığı gözlem çalışmaları ve ardından gelen su örnekleri ulusal ve bölgesel yaban hayatı düzenlemelerine uygun olarak yapılmalıdır. Örneklemeleri yalnızca geçerli balina izleme veya araştırma izinleri altında çalışan yetkili gemilerden almak. Yerel düzenlemelerle tanımlanan hedef türden minimum yaklaşma mesafelerini koruyun ve yalnızca örnekleme amaçlı yapılan manevralardan kaçının. Test doğrulama için kullanılan balina dokusu örnekleri, ilgili bölgesel izinler kapsamında toplandı ve ulusal ve kurumsal düzenlemelere uygun olarak eWHALE proje ortakları arasında paylaşıldı.

NOT: Herhangi bir örnekleme faaliyetinden önce aşağıdaki belgeleri inceleyin ve gerekli ekipmanları toplayın: Materyal Tablosu, eDNA Örnekleme Kiti (Ek Dosya 1-Ek Şekil S2), çevresel DNA örnekleri toplamak için kullanılan malzemeler (Şekil 1) ve örnekleme adımları ile gemi üzerindeki filtrasyon iş akışına genel bakış (Şekil 2).

1. eDNA örneklemesinin hazırlanması

  1. Saha veri sayfaları ve lamine alan protokolü (Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) dahil olmak üzere saha dokümantasyon materyallerini hazırlamak.
  2. Yedek eldivenler, yedek filtreler (her örnek için bir filtre), su geçirmez işaretleyici ve özel bir atık konteyneri hazırlayın (Şekil 1A).
    NOT: Kullanım ve kirlenme risklerini en aza indirmek için kapalı kendini koruyan eDNA filtreleri (1.2 μm gözenek boyutu)kullanın 65,66.
  3. Gemi tipine ve gemi konfigürasyonuna uygun bir veya daha fazla sert kova hazırlayın (Ek Dosya 1-Ek Şekil S3).
    1. Kovaları 10 L ile kalıcı marker ile işaretleyin. 10 L kullanmak pratik değilse, birden fazla küçük kova hazırla.
    2. Denize ulaşma sınırlıysa, kovaya bir halatı sıkıca bağlayın.
      NOT: Damar hareketi aşırı olduğunda dökülmeyi en aza indirmek için kapaklı kovalar kullanın (Şekil 1B).
    3. Daha küçük hacimleri birleştirmek için ikincil bir eDNA kabı ve gerekirse kovaların konlekasyonsuz taşınmasını sağlamak için ek bir taşıma kutusu hazırlayın (Şekil 1C).
  4. Taşınabilir bir peristaltik veya vakum su pompası hazırlayın (Şekil 1D). Pompayı binmeden önce tam şarj edin ve hemen kullanmadan önce elektriği kesin.
  5. Yolculuktan önce örnekleme, filtreleme ve veri kaydetme rolleri atayın.
    DIKKAT: Tüm ekipman kullanımı sırasında eldiven takın ve görevler arasında eldiven değiştirin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Çevresel DNA örnekleri toplamak için kullanılan saha çalışması materyalleri. (A) Kendini koruyan eDNA filtreleri, atık konteyneri, seyreltilmiş ev çamaşır suyu içeren sıkma şişesi (1:10), eldivenler, saha veri sayfası ve su geçirmez kalem; (B) eDNA örnekleme için kova tiplerine örnekler; (C) büyük hacimlerin taşınması ve filtrelenmesi için ek eDNA konteyneri ve gemide kovaların taşınması için kullanılan konteyner örnekleri; (D) su filtrasyonu için taşınabilir pompa örnekleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2: Balina izleme teknelerinde çevresel DNA örneklemesi kavramsal diyagramı. Çizim, su örneği toplama ve gemi üzerinde filtrasyon gibi rehberli adımları açıklar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Ekipman temizliği

  1. Temizlikten önce tek kullanımlık eldivenler giyin.
  2. Ev çamaşır suyu (%5-6 sodyum hipoklorit) 1:10 oranında arıtılmış suyla (~50 mL) bir çamaşır suyu çözeltisi hazırlayın.
  3. Çözeltiyi tüm yüzeylere eşit şekilde seperek tüm kovalara, kapaklara, kaplara ve pompa tüplerine uygulayın. Tüm yüzeylerde minimum çamaşır suyu temas süresini 2-5 dakika olarak koruyun.
  4. Musluk suyla 3 kez iyice durulayın (Şekil 3).
  5. Malzemeleri güvenli bir yerde hava ile kurutun ve binişten önce güvenli ve temiz bir alanda saklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: Ekipman temizleme adımları. (A) (1:10) seyreltilmiş ev çamaşır suyu çözeltisi uygulanır; (B) DNA'sız eldivenlerle eşit şekilde yayılır; (C) musluk suyla üç kez iyice durulamak; ve (D) uygulanabilirse ek malzemeler (örneğin, eDNA kapları) için süreci tekrarlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Su örneği toplama

NOT: Her gemi veya platformda tüm güvenlik düzenlemelerine uyun; gerektiğinde can yeleği veya yüzme tulumu kullanımı dahil.

  1. Yolcular gelmeden önce tüm malzemeleri gemiye getirin ve belirlenmiş, temiz bir alanda saklayın.
  2. Geminin örnekleme zamanlaması ve konumlandırılmasını gemi mürettebatıyla koordine edin.
  3. Balina dalışlarını önceden tahmin etmek için yüzey yüzey desenlerini gözlemleyin (Şekil 4). Numune almadan önce yeni eldiven takın.
  4. Balina dalıştan sonra flukeprint'ten mümkün olan en kısa sürede (en fazla 10 dakikalık zaman geçişi olmadan) 20 L deniz suyu toplayın ve iki adet 10 L'lik örnek kopyası oluşturuldu.
  5. Toplanan suyu, dökülmeyi önlemek için kaplar veya ek sterilize edilmiş bir kap kullanarak gemide belirlenmiş bir filtrasyon istasyonuna taşıyabilirsiniz.
  6. Tür kimliği, GPS koordinatları, zamanı ve örnek kopyalama kimliğini veri sayfasında kaydedin.
  7. Rapor verdikten hemen sonra eldiven değiştir.

figure-protocol-4
Şekil 4: Kambur balina yüzey yüzümü dizisi. (A) Balina üflemesi; (B) sırtını yaylayıp dalıştan önce kuyruğunu kaldırmak; (C) balinanın dalışından sonra yüzeyde fluke print desenleri. Görsel atıfı: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. eDNA filtrasyonu

  1. Filtre poşetini açın ve filtreyi sadece prizden tutun (Ek Dosya 1-Ek Şekil S4).
  2. Girişi şnorkele takın ve pompa borusunu çıkışa bağlayın (Şekil 5A,B).
  3. Şnorkeli filtre yuvasını batırmadan su örneğine batırın (Şekil 5C).
  4. Pompayı (pompa tipleri için Malzeme Tablosu'na bakınız) hızlı ve sabit bir akış hızına ayarlayın.
  5. Akış stabilitesini izlerken sürekli olarak 10 L filtreleyin (hava kabarcıkları, yırtıklar, yırtıklar veya sızdırmazlık arızalarını kontrol edin).
    NOT: Filtreleme süresi maksimum 45 dakika ile sonlandırılır.
  6. Filtreyi ters çevirip kalan suyu çıkarmak için pompayı 30-60 saniye çalıştırın. Filtre muhafazonda görünür nem kalmadığını doğrulayın.
  7. Pompayı kapatın ve boru çıkarın.
  8. Şnorkeli atık konteynerine atın, filtreyi orijinal torbasına yerleştirin ve hemen etiketleyin.
  9. Filtreleri kapalı, sert bir kapta veya soğutma kutusunda (ortam sıcaklığı 20 °C >), doğrudan güneş ışığından ve yolcu alanlarından uzakta sakla.
  10. Eldivenleri değiştirin ve ikinci replikasyon için filtreyi tekrarlayın.

figure-protocol-5
Şekil 5: Gemi filtrasyon kurulumu için adımlar. (A) filtre girişini (beyaz parça) şnorkele (tüp) takmak; (B) pompa borusunu filtre çıkışına (sarı parça) bağlamak; ve (C) şnorkelin bir kısmını su örneğine daldırmak. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Alan negatif kontrolleri ve veri raporlaması

  1. Her beş flukeprint örneğinden sonra bir alan negatif kontrolünü filtreleyin.
  2. Hedef DNA'sız suyu hemen karaya döndükten sonra ve ekipman temizliğinden önce kullanın.
  3. Her geziden sonra tüm verileri dijital eDNA örnekleme tablosuna aktarın (Ek Dosya 4).

6. Filtre depolama ve gönderim

  1. Kendini koruyan eDNA filtrelerini, güvenli ve kuru bir kapta, gölgeli, ortam sıcaklığında bir odada—veya ortam sıcaklığı 20 °C'yi aşarsa buzdolabında—göndermeden önce 3 aydan fazla saklaman.
  2. Filtre poşetlerini gönderiden önce nem açısından görsel olarak kontrol edin.
  3. Filtreleri izole konteynerlerde buz paketleriyle etiketleyin ve belirlenen laboratuvara gönderin.

7. Laboratuvar analizi

NOT: Tüm laboratuvar prosedürlerini, yeterli havalandırma ve ayrı çalışma tezgahları olan özel UV sterilize odalarda, DNA'sız eldivenler ve koruyucu giysiler kullanarakgerçekleştirin 55,67,68.

  1. DNA Lizisi
    1. Her filtre için 2 mL reaksiyon tüpünü etiketleyin.
    2. Filtreyi 200 mL'lik Erlenmeyer şişesine yerleştirin ve kauçuk üstünü atın (Şekil 6A).
    3. DNA-içermeyen forseps kullanarak, zarı (Ek Dosya 1-Ek Şekil S5) bir üçgen şeklinde katlayın ve ucunu aşağıya doğru yönlendirerek 2 mL reaksiyon tüpüne aktarın (Şekil 6B-D).
    4. Her reaksiyon tüpüne 380 μL TES tamponu ve 20 μL Proteinaz K (bkz. Malzeme Tablosu) eklenerek 400 μL lizis tamponu elde edilir (Şekil 6E).
    5. Girdap kısa süreliğine 56 °C'de ≥3 saat boyunca kışkırtma ile kuluçka geçirin (Şekil 6F).
    6. Santrifüj tüpleri 18.626 × g sıcaklıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kullanılır.
      NOT: Berrak veya hafif renkli lizat, başarılı sindirim olduğunu gösterir.
      NOT: Lizatlar -20 °C'de saklanırsa protokol bu aşamada geçici olarak durdurulabilir.
  2. DNA çıkarımı
    1. Ekstraksiyondan önce 56 °C'de 10 dakika boyunca kuluçka lizat yapın.
    2. Yıkama plakalarında ve elusyon plakalarında pipet ekstraksiyon reaktifleri, negatif kontroller ve pipetleme hatalarınıhesaba katan 69 ( bkz. Ek Dosya 1-Ek Tablo S1).
    3. TES tamponu kullanarak her plaka için bir ekstraksiyon boşluğu ekleyin.
    4. Bind plakasındaki her bir kuyuya 300 μL lizat aktarın. Her kuyuya 300 μL Buffer AL ve 300 μL İzopropil alkol ekleyin. Toplam lizatat hacmi 300 μL'yi aşıyorsa birden fazla Bağlanma plakası kullanın. Girdap kullanın ve ilk Bind plakasına (Materyaller Tablosu) her kuyu başına nükleik asit bağlanması için 30 μL manyetik parçacık ekleyin.
    5. Bind plakasını bir çubuk kapağıyla örtün.
    6. İki bağlanma plakası için ön DNA alım programını (toplam 400 μL lizat; Malzeme Tablosu ve Şekil 7'ye bakınız) ve manyetik boncuk tabanlı bir laboratuvar robotunda otomatik çıkarma protokolünü çalıştırın.
    7. Çıkarma kimyasallarını belirlenmiş atık konteynerlerine at.
    8. Elütlenmiş DNA'yı etiketlenmiş 1,5 mL reaksiyon tüplerine aktarın ve −20 °C'de depolayın.
      NOT: Protokol bu aşamada geçici olarak durdurulabilir. Bu noktada ek olarak inhibitör çıkarma adımları yapılabilir.
  3. qPCR
    1. Üreticinin talimatlarına (Materyal Tablosu) göre doku ekstraktları ve floresan tabanlı yüksek duyarlılıklı dsDNA testi kullanarak hedef tür DNA standartlarını hazırlayın ve niceliklerini belirleyin. 10 ng/μL11,55 ile seri seyreltme ile sekiz noktalı standart eğri oluşturulur. Donma-erime döngülerini en aza indirmek için qPCR öncesi Aliquot standartları.
      NOT: Protokol bu aşamada geçici olarak durdurulabilir.
    2. Tüm qPCR reaksiyonlarını 96 delikli plakalarla üçlü olarak hazırlayın.
    3. Her qPCR plakası için bir şablonsuz kontrol (moleküler kalitede su) ve bir ekstraksiyon boşluğu ekleyin.
    4. Ana karışımı Ek Dosya 1-Ek Tablo S2 ve Şekil 8A'ya göre hazırlayın.
    5. DNA yükleme başlığında, önceden hazırlanmış DNA standartları ve ana karışımı içeren her kuyuya 3 μL DNA ekstraktı ekleyin (Şekil 8B).
    6. Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile mühürleyin (Şekil 8C).
    7. Santrifüj 3.500 × g'de 10 saniye boyunca ve gerçek zamanlı nicel PCR termosikline yükleyin (Şekil 8D,E).
    8. Testi, Tablo 2'de belirtilen optimize edilmiş döngü koşullarında çalıştırın ve verileri üreticinin yazılımı (Materyal Tablosu) kullanarak kaydedin.

figure-protocol-6
Şekil 6: DNA lizisi için iş akışı. (A) Kendini koruyan eDNA filtresinden kauçuk kapağı çıkarıp Erlenmeyer şişesine yerleştirin; (B) iki çift pensi üç kez alevlenerek sterilize eder; (C) filtre membranını katlamak; (D) 2 mL'lik bir tüpe yerleştirir; (E) liz tamponu ve Proteinaz K ekleyin, (F) örnekleri 56 °C'de 3 saat boyunca kuluçka edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-7
Şekil 7: DNA çıkarımı için kullanılan malzemeler ve ekipmanlar. (A) Ekstraksiyon hazırlığı için bağlanma, yıkama ve elusiyon plakalarını, tüketim malzemelerini ve reaktifleri; ve (B) örnek işleme için kullanılan manyetik boncuk tabanlı laboratuvar robotu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-8
Şekil 8: qPCR için iş akışı. (A) Master karışımı önceden UV sterilize edilmiş bir odada (ana karışımların hazırlanması için ayrılmış bir çalışma davudadı altında) hazırlamak; (B) gösterilen deseni takip ederek bir DNA yükleme istasyonunda DNA standartlarını, ekstraktlarını ve kontrollerini yüklemek; (C) mühür plakası; (D) santrifüj; (E) gerçek zamanlı nicel PCR termosiklene yüklenir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Bu optimize edilmiş protokolle 2024 yılında toplam 154 flukeprint örneği (308 eDNA filtresi) toplandı; bunlar arasında Mart-Kasım ayları arasında elde edilen Skálfandi Körfezi'nde (İzlanda); 9 saha kontrolü ve 76 kambur balina kopyası) bulundu; Temmuz ayında Azorlar'da (Portekiz; 12 saha kontrolü ve 15 kambur balina replikası) 151 filtre ve Mayıs-Ekim ayları arasında elde edilen Ligurya Denizi'nde (İtalya; 4 saha kontrolü) 61 filtre bulundu. Tüm örnekler, kendini koruyan eDNA filtreleriyle 10 litreye kadar deniz suyu (flukeprint örneği başına iki kopya) toplanmasını içeriyordu (Tablo 3). Saha çalışmaları sırasında iki tür negatif kontrol toplandı: ekipmanın ağartıcı temizliğinden sonra filtrelenen arıtılmış su ve liman(lar)a yeniden girildiğinde toplanan deniz suyu42. Sonuncusu, çamaşır suyu temizlemeden önce kasıtlı olarak filtrelenerek numune alma sırasında cetacean eDNA ile olası çapraz kontaminasyonu değerlendirildi. Her örnekleme alanından örnekler, laboratuvar işlemleri için Avusturya'nın Innsbruck Üniversitesi Zooloji Bölümü Uygulamalı Hayvan Ekolojisi Araştırma Birimi'ne iki parti halinde gönderildi.

Analiz ve kontrol performansı
44 filtreden oluşan bir alt küme (İzlanda'daki Skjálfandi Körfezi'nden 2 saha kontrolü ve Portekiz'in Azorlar adası Faial ve Pico çevresindeki sulardan 1 saha kontrolü dahil olmak üzere 14 saha kontrolü dahil olmak üzere 30 kopya) humpback balina eDNA'sı için analiz edildi (Şekil 9). Sinyal, üçlü qPCR reaksiyonlarıyla ölçüldü. Bir örnek (yani eDNA filtresi), eğer qPCR'nin üçte biri replikasyon yaparsa pozitif kabul edilirdi. Bu çalışmada testin tespit sınırı (LOD) 0.0001 ng/μL olarak hesaplandı (LOD ortalama CT = 35.8). Analiz edilen 41 filtre arasında 20'si (%49) amplifikasyon verirken, 24'ü (%58) amplifikasyon göstermedi. Tespit edilmemeler (CT değeri yok) muhtemelen hedef DNA'nın yokluğunu veya çok düşük konsantrasyonlarını yansıtır. Tespit edilmemeler ise Azor Adaları'ndan gelen 13 filtreden 5'i (%38) ve İzlanda'dan 28 filtrenin 19'unu (%68) oluşturdu. Ekstraksiyon boşlukları, MarVer3 testi70 kullanılarak deniz omurgalı DNA'sı açısından tarandı ve tespit edilebilir bir amplifikasyon göstermedi; bu da DNA çıkarımı sırasında çapraz kontaminasyon olmadığını gösteriyor. Saha kontrolleri (NC) ve qPCR kontrolleri (NT) herhangi bir amplifikasyon vermedi, bu da saha çalışması ve qPCR taraması sırasında kirlenme olmadığını doğruladı (Tablo 4).

20 pozitif filtre arasında, dokuzu (%22) testin tespit sınırının (LOD; 0.0001 ng/μL) altında en az bir Ct değeri vermiş ve bu nedenle güvenilir tespit olarak sınıflandırılmıştır. Bunlar arasında Azorlar'dan 8 filtreden 4'ü (%50) ve İzlanda'dan 12 filtreden 5'i (%42) bulunuyordu. Ek olarak 11 filtre (%27) LOD'un üzerinde bir veya daha fazla Ct değeri üretmiştir; bunlar Azorlar'dan 4 filtre (%50) ve 7 filtre İzlanda'dan (%58) oluşuyor ve bu da makul tespitleri göstermektedir (Şekil 10). Karşılaştırmalı analiz, Azor Adaları filtreleri için ortalama döngü eşiği (Ct) değerinin marjinal olarak daha düşük olduğunu ortaya koydu (34.7 ± 3.60; n = 8) ile karşılaştırıldığında İzlanda filtreleri (36.9 ± 3.60; n = 10). Mann-Whitney U testi, bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını gösterdi (U = 199.0, p = 0.204). Ct değeri ile DNA sinyalinin gücü arasındaki ters ilişki göz önüne alındığında, sonuçlar Azor Dağları filtrelerinde hedef kambur balina eDNA'sının biraz daha yüksek konsantrasyonlarını göstermektedir (Şekil 11).

Fizibilite kısıtlamaları
Her yolculuk için flukeprint örneklerinin sayısı, seyahat süresi ve hava koşullarına göre değişiyordu. Azorlar'da 3 saatlik turlarda yaklaşık iki ila üç örnek (altı eDNA filtresine kadar elde edilen), İtalya'da ~8 saat içinde iki ila dört örnek (sekiz filtreye kadar verici) ve İzlanda'da 3,2 saatlik turlarda bir ila iki örnek (4 filtreye kadar elde edilen) toplandı. Azorlar ve İtalya'da filtreleme performansı genel olarak yüksekti. Azor Adaları'nda 10 L deniz suyu 10-15 dakika içinde tutarlı olarak filtrelenirken, İtalya'da aynı hacim yaklaşık 10 dakikada filtrelendi. İzlanda'da filtrelenmiş hacimler 4,5 ila 10 L (ortalama = 8,5 L) arasında değişiyordu ve sık filtre tıkanması nedeniyle ortalama filtrasyon süresi ~40 dakika idi; bu durum muhtemelen çalışma alanındaki sudaki partikül maddelerden kaynaklanıyordu. Özellikle, 98 filtrenin 46'sı (%47) için 10 L başarılı şekilde filtrelenmiş, 31 filtre için 7 L ile 10 L arasında hacimler (%32) ve 21 filtre için 4 L ile 7 L arasında hacimler (%21) elde edilmiştir (Ek Dosya 1-Ek Tablo S3).

Protokol, her beş flukeprint örneğinden sonra bir alan-negatif kontrolün filtrelenmesini önerir. Ancak, operasyonel balina izleme koşullarında, sınırlı filtre bulunabilirliği, zaman kısıtlamaları ve nakliye gecikmeleri gibi lojistik kısıtlamalar nedeniyle bu tamamen sağlanamadı. Bu, elde edilebilir kontrol-örnek oranlarını İzlanda'da 1:10.7'ye (9/96), Azor Adaları'nda 1:12.6'ya (12/151) ve İtalya'da 1:15.3'e (4/61) düşürdü. Bu sapmalara rağmen, hiçbir alan veya laboratuvar negatif kontrolü amplifikasyon göstermedi.

figure-results-1
Şekil 9: Örnek konumların genel bakışı. Haritadaki siyah noktalar, İzlanda'daki Skjálfandi Körfezi ve Azorlar'da kambur balina fluke izinden örneklerin alındığı yerleri temsil eder. eDNA filtresinin adı, ilgili örnekleme bölgesinin yakınında belirtilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 10: Azorlar ve İzlanda'dan eDNA filtrelerinin bir alt kümesinden yapılan tespitler.qPCR, Azor Adaları ve İzlanda pozitif tespitlerinde (en az bir pozitif PCR kopyalanıyor), SD ve LOD ile birlikte ortalama Ct değerleri ve DNA sinyal gücü anlamına gelir. Çubuklar, LOD'a göre sinyal gücüne göre renklendirilir: koyu mavi = güçlü sinyal (Ct ≤ 35.8) güvenilir tespitleri gösterir, açık mavi = zayıf sinyal (Ct > 35.8) olası tespitleri gösterir. SD hata çubukları, PCR kopyaları arasındaki değişkenliği temsil eder. Kırmızı kesik çizgi LOD'u (Ct = 35.8) gösterir. Ortalama Ct değerleri her çubuğun üstünde gösterilmiştir. Kısaltmalar: Ct = döngü eşiği; SD = standart sapma; LOD = tespit sınırı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 11: Azorlar ve İzlanda'dan humpback balina DNA'sı tespitleri için ortalama döngü eşik değerleri. Kutu grafiklerindeki siyah çizgiler medianı gösterirken, kırmızı kareler ortalama Ct değerlerini (SD) gösterirken, bıyıklar Azor Adaları ve İzlanda'nın minimum ve maksimum değerlerini temsil eder. Mann-Whitney U testi, bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını gösterdi (U = 199.0, p = 0.204). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: ND5 hedefli qPCR testi için primer ve prob dizileri. Bu diziler ileri ve geri primerler, MGB prob dizileri (5′-3′), optimal tavlama sıcaklığı ve analiz tespit sınırı (LOD) içerir. (*) LOD, hedef türün DNA'sının en düşük DNA konsantrasyonu (ng/μL) olarak tanımlanır ve PCR çoğaltmalarının %95'inin pozitif amplifikasyon verdiği en ≥düşük DNA konsantrasyonu (ng/μL) olarak tanımlanır. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Kambur balina eDNA qPCR testi için optimize edilmiş döngü koşulları. Bu optimize edilmiş qPCR ayarları: 10 dakika 95°C (enzim aktivasyonu), ardından 95°C'de 40 döngü (15 saniye denatürasyon) ve 60°C (90 saniye (tavlama/uzatma) şeklindedir. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Alan örnekleme konfigürasyonuna genel bakalım. Azorlar, İzlanda ve İtalya'daki örnekleme bölgeleri, saha ortakları, gemi tipleri, hedef türler, örnekleme dönemleri ve örnek kopyalarının genel büzülü. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Çevresel örnekler ve kontroller için qPCR tespit özeti. Pozitif tespitler (sarı ile vurgulanmış), qPCR Ct değerlerini tekrarlar ve tespit sonuçları gösterilir; Örnekler, qPCR replikasyonlarından en az biri amplifikasyon gösterdiğinde pozitif olarak sınıflandırıldı. "No Ct" amplifikasyon olmadığını gösterir, negatif kontroller amplifikasyon göstermez ve analiz performansını tanımlamak için kullanılan M. novaeangliae standart seyreltme serisi ve LOD tablonun en altında yer alır. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Protokol uygulaması hakkında ek bilgiler içeren Ek Şekiller ve Tablolar içerir; primer tasarımı eDNA örnekleme kiti, balina izleme kap tipleri, kendini koruyan eDNA filtre özellikleri, DNA çıkarımı ve qPCR reaksiyonları için reaktif hacimleri ile örnekleme bölgelerindeki filtreleme oranlarındaki farklılıklar dahildir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Cetacean eDNA örneklemesi sırasında kullanılan saha veri sayfası. Seyir meta verileri, deniz balığı gözlemleri ve örnek ile filtre bilgisi kaydetmek için standartlaştırılmış form. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Balina gözlem gemilerinde deniz balığı eDNA örneklemesi için adım adım saha protokolü; ekipman temizliği, deniz suyu toplama ve gemide filtrasyon, örnek raporlama ve depolama dahil. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Cetacean eDNA örnekleme elektronik tablosu şablonu. Örnek toplama ve gemi üzerinde filtreleme sonrası örnekleme bilgisinin kaydedilmesi için standart form. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Operasyonel fizibilite ve saha uygulaması
Burada sunulan protokol, algılama hassasiyetini gerçek dünya kısıtlamalarıyla dengeleyen standartlaştırılmış eDNA iş akışına katkıda bulunur. Büyük hacimli, flukeprint hedefli örnekleme, kendini koruyan kapalı filtrelerle gemi içi filtrasyon ve standart kirlenme kontrol önlemleri entegre edilerek, protokol bölgeler ve örnekleme kampanyaları arasında uygulanabilecek tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar. Bu yaklaşım, eDNA'nın geleneksel deniz izleme tekniklerine maliyet etkin ve ölçeklenebilir bir tamamlayıcı olarak artan tanınmasıylauyum sağlamaktadır 9,10,22.

Önceki deniz balığı eDNA çalışmaları, büyük araştırma gemilerinden alınan transekt tabanlı deniz suyu örneklerine veya deniz balığı gözlemlerine yakın fırsatçı küçük hacimli örneklere dayanıyordu. Transekt tabanlı yaklaşımlar geniş bir mekansal kapsama sağlar ancak genellikle seyreltilmiş ve zamansal olarak ayrılmış DNA sinyallerini yakalar; bu da nadir veya geçicitürlerin tespitini sınırlar ve örnekleme yüzeye yakın olsa bile, genellikle özel kaplar ve altyapıgerektirir 25,37,72. Buna karşılık, yüzeye çıkan balinaların yakınında küçük hacimli numune alma karşılaşma özgüllüğünü artırır ancak sınırlı su hacmleri ve tutarsız filtrasyon uygulamaları nedeniyle yanlış negatiflere yatkınkalır 72,73. Flukeprintleri açıkça hedefleyerek ve gemide büyük hacimleri filtreleyerek, burada sunulan iş akışı, düşük konsantrasyonlu deniz balığı eDNA'sını yakalama olasılığını artırırken, balina gözlemleme operasyonlarının tipik zaman ve alan kısıtlamaları altında uygulanabilir kalır. Kapalı, kendini koruyan filtrelerin kullanımı, kullanım ve kirlenme risklerini daha da en aza indirir, sahada uygulanan koruma tamponları ihtiyacını ortadan kaldırır ve kısıtlı gemi koşullarında lojistiğibasitleştirir 42,66.

Çapraz karşılaştırılabilirliği sağlamak için, örnekleme kampanyasında aşağıdaki parametrelerin sabit kalması gerekir: deniz suyunun doğrudan görünür deniz balığı izlerinden toplanması; flukeprint başına iki adet 10 L biyolojik replika; kendini koruyan eDNA filtrelerinin kullanımı, standart kirlenme kontrol önlemleri sırasında yerleşik filtreleme sürecini zorunlu kılar; bu önlemler belirli minimum frekansta düzenli alan negatif kontrolleri içerir; ve türe özgü qPCR taraması uygun kontrollerle üç kez gerçekleştirilir. Diğer parametreler, tutarlı ve şeffaf şekilde raporlanmış şekilde uygulandıkları koşuluyla metodolojik çerçeveden ödün vermeden değişebilir; bunlar arasında su toplama ekipmanı ve işleme, filtre gözenek boyutu, pompa tipi ve boru konfigürasyonu, filtrasyon süresi ve tıkanma koşullarında elde edilebilecek filtrelenmiş hacim, gemi içi örnek lojistiği ve sevkiyat öncesi kısa süreli depolama koşulları yer alır. eDNA çalışmalarındaki birçok işleme adımı değişken kalınca, tüm örnekleme ve analitik adımların titiz raporlanması şiddetle tavsiye edilir.

Bu protokolün uygulanabilirliği, sakin ve orta dereceli deniz koşullarında (Beaufort 3 ≤ en yüksek seviyede, gemi içi zaman ve alanda her flukeprint için iki eDNA filtresi ve her filtre için 10 L filtrelenmiş su hacmi işlenildiğinde, düşük ila orta bulanıklık seviyelerinde en yüksek seviyededir. Pratikte, eğitimli bilim insanları Beaufort 3'e kadar örnek alabilir, ancak vatandaş bilim insanları sadece sakin koşullarda çalışmalıdır (Beaufort 1-2), çünkü gemi hareketi ve türbülans, bazen Beaufort 3'te balina izleme turları yapılmasına rağmen. DNA bozulmasını en aza indirmek için su toplandıktan sonra filtreleme mümkün olan en kısa sürede başlamalıdır47,74. Geminin rüzgar tarafı ve alt taraflarından numune almak gibi, pervane kaynaklı yüzey eDNA'sının seyrelmesini en aza indiren örnekleme stratejileri, hedefleme doğruluğunu ve güvenilir tespitleri daha da destekler47. Ters manevralardan kaçınmak ve kovalara bağlı iplerin deniz suyu örneklerine temas etmesini önlemek, sucul eDNA en iyi uygulamalarıyla uyumlu olarak kirlenme riskini daha da azaltır38. Gemi konfigürasyonu ve lojistiğinden (örneğin, kap yüksekliği, hareket ve mevcut gemi alanı) bağlı olarak, tutarlı şekilde uygulanırsa iki örnekleme stratejisi desteklenir: (i) iki ayrı kova kullanılarak iki 10 L'lik replikanın bağımsız toplanması ve filtrelenmesi veya (ii) tek bir 20 L'lik su örneğinin güvenli taşınma için kapalı steril bir konteynere aktarılması ve ardından filtreleme için iki 10 L'lik replikaya bölünmesi. Filtre başına 10 L filtreleme hacmi, balina gözlem koşullarında tespit olasılığı ile filtrasyon çabası arasında pratik bir uzlaşma sağlar.

Daha büyük hacimler, nadir veya düşük konsantrasyonlu eDNA'yı yakalama olasılığını artırır ve deniz balığı çalışmalarında yaygın olan yanlışnegatifleri azaltır (39,40,75), ancak kendini koruyan filtreler ve büyük gözenek büyüklükleriyle birleştiğinde operasyonel olarak uygulanabilirkalır. Artan partikül yükleri, gemi hareketi, sınırlı güverte alanı veya zaman kısıtlamaları, filtreleme verimliliğini ve ulaşılabilir hacimleri azaltarak protokolün uygulanabilirliğini sınırlayabilir. Bu tür durumlarda, su hacmlerinin azalması veya alternatif filtre gözenek boyutları gibi protokole uygun uyarlamalar gerekebilir ve veri karşılaştırılabilirliğini korumak için örnekleme kampanyalarında tutarlı şekilde uygulanmalıdır. Seyahat süresi, balina karşılaşmalarının zamanlaması ve filtrasyon kapasitesi, elde edilebilecek örnek sayılarını belirler. Standart 3 saat balina gözlem turlarında, genellikle operasyonları veya vatandaş bilimi deneyimini kesintiye uğratmadan bir veya iki flukeprint örneği (bazen üç tane) tamamlanabilir. Daha uzun keşif gezilerinde, örnekleme kapasitesi günlük balina gözlem çabasıyla ölçeklenir (örneğin, İtalya vaka çalışmamızda ~8 saat). Pratikte, eDNA örneklemesi turizmin yoğun olduğu dönemde üç noktada da uygulanabilir.

eDNA amplifikasyonu başarısı ve kontaminasyon kontrolü
Özellikle besin açısından zengin sularda toplanan çevresel örnekler, amplifikasyonu bastırabilen ve yanlış negatif üretebilen PCRinhibitörleri içerebilir 76. Aynı projede İzlanda örneklerinden yapılan önceki analizlerde herhangi bir inhibitisyontespit edilmemiş olsa da, inhibitör kaldırma adımının dahil edilmesi tutarlı amplifikasyon başarısını sağladı (bkz. Materyal Tablosu) ve sucul eDNA iş akışları için en iyi uygulamaönerileriyle örtüştü 14,55.

Bölgeler arasında tutarlı qPCR tespit performansı, protokolün çeşitli çevresel koşullarda cetacean eDNA'sını güvenilir şekilde yakaladığını gösterir. Küçük KT varyasyonları muhtemelen eDNA salınımı, bozulma ve dağılımı etkileyen sıcaklık, bulanıklık ve verimlilik konularındaki bölgeselfarklılıkları yansıtır 75,76. Testin tespit sınırı (0.0001 ng/μL), eWHALEprojesi 14,11,42 kapsamında geliştirilen diğer doğrulanmış cetacean testleri için bildirilen hassasiyet aralığı içindedir. Tespit oranları, daha önce yayımlanmış flukeprint tabanlı araştırmalarla tutarlıydı ve tür davranışlarının ve yüzey çıkma sıklığının tespit başarısı üzerindeki etkisinivurguladı 41,42,47. QPCR nicelendirmesi için doku kaynaklı DNA standartları kullanıldı ve bu, deniz eDNA araştırmalarında yaygın bir uygulamayıyansıtıyor 57,72,77,78,79. Bu yaklaşım, özellikle düşük konsantrasyonlu ve heterojen çevresel örnekler içinmutlak niceliklendirmede varyans getirebilir 11,61,80,81,81,82,83 için, ancak gerçek dünya örnek karmaşıklığını yansıtır 55,86. Sentetik standartların kullanımı, nicel olarak tekrarlanabilirliği ve çalışmalar arası karşılaştırılabilirliği artırabilir ve gelecekteki uygulamalar içinönerilmektedir 11,87.

Potansiyel kontaminasyon kaynakları arasında çapraz örnek transferi ve işlem aşamalarında insan veya hedef olmayan çevresel DNA'nın dahil edilmesi yer alır; bu da yanlış pozitif tespitlere yol açabilir88. Saha ve laboratuvar işlemlerinde, özellikle vatandaş bilimi operasyonlarının tipik kısıtlı koşullarında, sıkı kirlilik kontrolü gereklidir. Rutin eldiven değişimi, DNA-içermeyen ekipmanların kullanımı, kapalı filtrasyon sistemleri, standartlaştırılmış eğitim, saha ve laboratuvar kontrollerinin rutin dahil edilmesi, potansiyel kontaminasyon olaylarının belgelenmesi ve yerleşik çerçevelere uygun olarak analiz doğrulaması, veri güvenilirliği ve tür tespitini sağlamak için kritiköneme sahiptir 11,31,49,51,55,89 . Plastik kullanımı, sahada moleküler örnekleme için kaçınılmaz bir sınırlama olsa da, tüketim mümkün olduğunca en aza indirilmiş ve kısmen biyolojik bozunabilir filtrasyon malzemelerikullanılmıştır66.

Sınırlamalar, ölçeklenebilirlik ve gelecekteki sonuçlar
Filtre tıkanması, İzlanda'daki Skjálfandi Körfezi gibi bulanık veya üretken ortamlarda önemli bir kısıtlama olmaya devam etmektedir; burada askıya alınmış organik madde ve plankton yoğunluğu muhtemelen filtreleme verimliliğini43,90 azaltmıştır. Filtreleme süresinin kaydedilmesi, azalan akış, filtredeki görünür hava kabarcıkları veya pompa gerilmesi gibi filtre tıkanma göstergeleri ve bir kopya başına yaklaşık 45 dakika filtreleme süresiyle sınırlamak, sonraki yorumlama ve karşılaştırmayı destekler. Filtreyi askıya almak için sterilize edilmiş bir yüzer cihaz veya yerçekimiyle beslenen filtrasyon torbaları kullanmak, filtreleme sırasında kullanım süresini potansiyel olarak azaltabilir; ancak sonuncusu, kendini koruyan eDNA filtreleri ve büyük hacimler (≥1 L)91 ile uyumsuz olabilir. Daha büyük gözenek boyutu filtreler (≥ 5 μm) filtreleme oranlarını daha da artırabilir, ancak taksona özgü tespit verimliliği deniz memuru eDNA45,92 için pilot örnekleme sırasında değerlendirilmelidir.

Tam ölçekli örnekleme öncesi önemli hususlar şunlardır: gemide filtrasyonun gecikmeli işlemeye göre önceliklendirilmesi, tutarlı su hacmi ve filtre konfigürasyonunun korunması, yerel koşullarda filtreyi optimize etmek için pilot örnekleme yapılması ve örnekleme çalışmasının geminin kapasitesi ve seyahat süresiyle uyumlu hale gelmesi. Vatandaş bilim insanları tarafından yapılandırılmış, sahada kaydı mümkün kılan dijital veri giriş araçları gelecekteki uygulamalar için önerilir93.

Bu baştan sona iş akışının başarılı uygulanması, operasyonel kısıtlamalar altında dayanıklılığı gösterirken, vatandaş bilimi bağlamlarına özgü uzay, zaman, hava ve kirlenme riskleriyle ilgili sınırlamaları vurgular. 10,94. Bu kısıtlamalara rağmen, balina izleme gemileri standart eğitim ve denetim sağlandığında eDNA deniz balığı izleme için güçlü ve az kullanılan bir platformoluşturur 31,32,42,95. Bu iş akışını, foto-tanımlama, pasif akustik ve biyopsi örnekleme gibi yerleşik deniz baliği izleme araçlarıyla entegre etmek, genetik tespitleri davranışsal ve demografik verilerle ilişkilendirebilir. Bu çalışma türe özgü qPCR tabanlı tespite odaklansa da, gelecekteki uygulamalar DNA metabarkodlaması veya popülasyon genetik analizlerini entegre ederek cetacean eDNA izlemesinin ekolojik ve koruma değerini daha da artırabilir.

eDNA tabanlı yaklaşımlar gelişmeye devam ederken, bu iş akışı genetik izlemenin özellikle deniz yakısı sıcak noktaları ve hassas ekosistemlerde mevcut deniz gözlem ve koruma programlarına entegre edilmesi için ölçeklenebilir bir temel sağlar.

Açıklamalar

Belén García Ovide, okyanus korumasına odaklanan ve Kuzeydoğu İzlanda'nın Húsavík şehrinde bulunan kar amacı gütmeyen bir kuruluş olan Ocean Missions'un kurucusu ve yürütme direktörüdür. Ocean Missions, İzlanda'daki balina gözlem gemilerinden ve Arktik keşif gemilerinden örnekleri koordine etmektedir. Ayrıca Húsavík'teki balina izleme şirketi North Sailing'in temsilcisi olarak eWHALE projesi kapsamında görev yapmaktadır. Bu bağlantılar, çalışmanın tasarımını, veri toplamasını, analizini veya sonuçların yorumlanmasını etkilemedi.

Teşekkürler

Saha çalışması ve laboratuvar çalışmalarında yer alan tüm kişileri teşekkür etmek isteriz, yani:

i) İzlanda'nın Skjálfandi Körfezi'nde toplanan örneklerde yer alan Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot ve Isabell Österle; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet Azor Adaları'nda (Portekiz); iii) Avusturya'da Sandra Schallhart, Jana Robertson; ve iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri, Pelagos Koruma Alanı'nda (İtalya) veri toplama için görev aldı.

Bu araştırma, Avrupa Biyolojik Biyoçeşitlilik Ortaklığı olan Biodiversa+ tarafından, 2021-2022 BiodivProtect ortak araştırma teklifi çağrısı kapsamında, Avrupa Komisyonu (GA No. 101052342) ve şu fon kuruluşlarıyla ortak finanse edilen kuruluşlarla finanse edilmiştir: 1) İzlanda Araştırma Merkezi (RANNÍS), (Hibe No. 229030), 2) Üniversiteler ve Araştırma Bakanlığı (MUR), Avrupa ortaklığı Biodiversa+ Çağrısı 2021 ile ilgili FIRST ve IGRUE özel hesabından - eWHALE projesi, 3) Avusturya Bilim Fonu (FWF) [doi: 10.55776/I6389] ve Innsbruck Üniversitesi'nin yayın fonu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alternatif eDNA filtreleri: SterivexTM /WaterraMerck Millipore/Waterra Pompaları LimitedSVHVL10RC/NA0.45 & mikro; Gözenek boyutu. eDNA koruma tamponları  gerektiriyor;
AW1, AW2, AE tamponlarıQiagen   19081, 19072, 19077Ekstraksiyon sırasında DNA arıtması için kullanılan tampon çözeltiler
Çamaşır suyu çözeltisi (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerÖzelleştirilmişYüzey dekontaminasyonu. Tüm laboratuvar süreçlerindeki adımlar
KovalarTekne dükkanları, balıkçılık ekipmanları, AmazonKatı. Kauçuk veya sert plastik (≥ 10 L). Örnekleme kurulumu ve gemi lojisiğine bağlı olarak bir veya daha fazla
Temizlik Reagenti, Express PCR ExoSAP-IT75001.1.EASanger dizilemesi için PCR ürünlerinin hazırlanması
Soğutma kutusuKonutYalıtımlı sert kap veya soğutma torbası
Tek kullanımlık eldivenler, Büyük (L) ve Orta (M) bedenler,
Pudrasız		Kimberly-Clark43431, 55090Tek kullanımlık nitril veya lateks eldivenler, 100 adet kutu. Gereken miktar: 10 - 15 yolculuk başına 1 kutu
DNA standartları (3 μ L) NAÖzelleştirilmişDNA dokusundan türetilen seri seyreltme (8 puan, 10 ng/&mikro; L) kambur balinadan. qPCR'de kalibrasyon
DNA güvenli laboratuvar kıyafetleriFalano, PP-Genel Puan081-2900Bunların hepsi laboratuvar süreçlerindeki adımlar.
eDNA konteyneriKonut veya hırdavatçılarNAKapaklı, dayanıklı, şeffaf (≥ 10 L). 
Elution plakası, Çubuk kapağı, Yıkama plakaları, Bağlanma plakasıQiagen19581, 997004, 1031656, 302570DNA çıkarımı için kullanılan plastikler 
Etanol (8:10)Endure , ACS ISO RangÇeşitliTezgah kısırlaştırması. Tüm laboratuvar aşamaları
Saha veri sayfaları
Floresans tabanlı yüksek hassasiyet testiThermo Fisher ScientificQ32851Kubit dsDNA Yüksek Duyarlılık testi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ABD)
Yüksek hızlı santrifüj (24.000 rpm)Hettich Zentrifugen DNA içeren süpernatantı enkaz parçalarından ayırır. DNA lizisi
Buz paketleriKonut mağazalarıKonteyner içindeki örneklerin soğutulması
IPC ileri ve geri primerlerEntegre DNA TeknolojileriNAHedef tür DNA'sının amplifikasyonu için kullanılan özel ürün
IPC PrimeTime qPCR ProbesEntegre DNA TeknolojileriNAHedef tür DNA'sının amplifikasyonu için kullanılan özel ürün
Laminar akış başlıkı Kendro Laboratuvar ÜrünleriVFS1206qPCR hazırlığında reaktif preparatları için steril ortam
Lamine resimli alan protokolü Özelleştirilmiş
Liz tamponuQiagen79216DNeasy lizis tamponu AL. TES Tamponu + Proteinaz K'ya Alternatif
Manyetik boncuk– Temelli DNA robotuKingFisher Apex 96 PCR başlığı5400910Yazılım: BindIx PC 
Nükleik asit bağlanması için manyetik parçacıklar (30 µ L)Qiagen67563MagAttract parçacıkları. DNA çıkarımında manyetik boncuklara DNA bağlanmasını kolaylaştırır
Master mix (5 μ L)EMM, Yaşam Teknolojileri4396838TaqMan Çevre Master Karışımı (2.0)
Mini Plaka Döner Santrifüjü LabnetC1000PCR ve mikroplakalardan sıvı damlacıkları ve yoğuşmayı spin down
OneStep-96 PCR İnhibitör Çıkarma KitiZYMO AraştırmasıD6035eDNA ekstraktlarındaki kirleticilerin arındırılması ve uzaklaştırılması;
PCR PlakalarıBio-RadHSP9601Sert Kabuklu 96-Well
Pipetler + steril filtrelenmiş uçlarPipetler: BIOHIT, Filtre ipuçları: Biozym Safe  Mühür İpuçları  profesyonelÇeşitliManuel veya elektronik pipetler çeşitli maksimum hacimlerde kullanılabilir
Plaka Döner Santrifüjü NANAqPCR  öncesinde baloncukları çıkarır;
Proteinaz KAvantor VWRA4392.0010Liz sırasında DNA salgınmasına yardımcı olmak için proteinleri sindirir
Arındırılmış suMilliQNARNase içermeyen su, negatif kontroller ve temizlik çözeltisi için kullanılır 
Reaksiyon tüpleri (2 mL)Eppendorf30120094DNA lizisi
Gerçek zamanlı nicel PCR termosikletiAnalytikjenaNAQTower 3G platformu. DNA'yı gerçek zamanlı olarak artırır ve niceliklendirir
İplerTekne gezintisi, hırdavatçılar, balıkçılık limanlarıNASağlam malzeme (örneğin, polietilen veya örgü ip). Uzunluğu geminin yüksekliğinin en az iki katı
Sızdırmazlık filmi, yapıştırıcı, optikBio-RadMSB1001Mikromühür 'B'. PCR'den önce PRC plakasını mühürleyin
Kendini koruyan eDNA filtreleriSmith-Root 11579-251.2 & mikro; Gözenek boyutu. Örnekleme kampanyası başına miktar: gerektiği gibi
Nakliye konteyneriLaboratuvarlar, eczaneler, AmazonÇeşitliStrafor yalıtımlı
Biyolojik dizi hizalama ve analiz için yazılımBiyografi DüzenlemesiSürüm 7Windows 95/98/NT için Kullanıcı Dostu Biyolojik Dizis Hizalama Editörü ve Analiz Programı
Sıkıştırma şişesiLaboratuvarlar, eczanelerÇeşitliEv çamaşır suyu ile dolu (1:10)
İstatistiksel analiz yazılımıR Studio Ekibi. (2023)Sürüm 4.2.1
Sterilize edilmiş DNA'sız eldivenlerSempercare  Baskı79712Tüm aşamalar laboratuvar süreçlerinde. 
TES tamponuDNeasy lizin tamponuna eşdeğer özel ürün.
Zehirli atık konteyneriTehlikeli atıkların güvenli bertarafı. Tüm adımlar
UV lamba SterilAIRQPCR hazırlığı için kapüşon sterilizasyonu
Vortex-genie 2 vortex mikseri Thermo Fisher Scientific50728002Reaktifleri homojenleştirir ve karıştırır. DNA lizisi, ekstraksiyon
Atık konteyneriKonut mağazalarıKüçük sert kap
Su pompası (peristaltik/vakum)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Taşınabilir pompalar
Su geçirmez markerÇeşitli

Kaynaklar

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

eDNA rneklemesiFlukeprint ToplamaG verte st FiltrasyonMolek ler AnalizlerKantitatif PCRMitokondriyal DNADeniz Biyo e itlili i

İlgili makaleler