Ergenlik öncesi beyinde viral vektörleri ifade edebilme yeteneği, beyin gelişimi için hücresel ve devre mekanizmalarını incelemek için temel bir unsurdur. Burada, doğum sonrası 11 veya 12. günlerde (P11-P12) bebek farede stereotaksik viral cerrahi yapılması için bir protokol tanımlıyoruz ve ameliyat sonrası bakım için rehberler sunuyoruz.
Yöntem makalesi
Bebek Farelerde Stereotaksik Cerrahi ve Ameliyat Sonrası Bakım
Bu makalede
Özet
Özet
Doğum sonrası dönem boyunca gelişimsel, hücresel ve devresel süreçlerin anlaşılması, beyin gelişiminin karmaşıklıklarını ve davranışsal ile sosyal olgunlaşma üzerindeki etkisini aydınlatmak için çok önemlidir. Bebeklikten yetişkinliğe geçiş, bilişsel yetenekler, duygusal düzenleme ve sosyal etkileşimler için temel olan sinaptik budama ve miyelinizasyon gibi önemli nörobiyolojik değişiklikleri içerir. Prepubertal farelerde beyin gelişiminin incelenmesi, araştırmacıların sağlıklı beyin büyümesini destekleyen kritik dönemleri belirlemelerini ve nörogelişimsel bozukluklar için zamanında müdahaleler kurmasını sağlar. Beyin fonksiyonunu kesin olarak disseksiye etmek için stereotaksik cerrahi, sinirbilim araştırmalarında önemli bir teknik olmuştur; ilgilenilen beyin bölgelerini hedeflemede ve viral ajanların iletilmesini sağlamada eşsiz hassasiyet sunmaktadır. Yetişkin farelerde stereotaksik cerrahiler nörobiyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak uygulansa da, prepubertal farelerde stereotaksik ameliyatlar için çok sınırlı yönergeler ve bebeğin anne ve yavrularına başarıyla yeniden tanıtılmasını sağlamak için kritik ameliyat sonrası bakım çok sınırlıdır. Burada, bebek (P11-P12) farelerinde stereotaksik cerrahi ve viral enjeksiyon protokolünü tanımlıyoruz; anestezi ve analjezi uygulamasını, ameliyat sonrası bakıma yönelik dikkate alınan noktaları ve yetişkinlerde stereotaksik cerrahiden farklılıkları vurguluyoruz. Bu protokol, istenen hedef koordinatları güncellenerek ilgilenilen herhangi bir beyin bölgesinde uygulanabilir ve doğum sonrası gelişimin ilerleyen aşamalarında, örneğin gençlik döneminde (P15-P30) beyin hedeflenmesi için değiştirilebilir. Genel olarak, bu protokol doğum sonrası beyin gelişimi ve fonksiyonunun incelenmesi için bir giriş noktası sağlar.
Giriş
Bebeklik ve ergenlik, beyin gelişimi için hayati doğum sonrası dönemlerdir ve miyelinleşme, sinaptogenez ve sinaptik budama ile karakterize edilir; bu da devre arıtmasınıkolaylaştırır 1,2. Çiftleşme, saldırganlık ve sosyal oyun gibi sosyal davranışların ortaya çıkışı, peripubertal dönemde (P28-40)3 ortaya çıkar ve dolaşımdaki steroidhormonları 4,5 ile sıkı bir şekilde düzenlenir. Yetişkinlerde sosyal davranışların hücresel temellerini incelemek için kullanılan araçlarda önemli ilerlemelere rağmen, doğum sonrası gelişim boyunca sosyal davranışların ortaya çıkışının altında yatan sinirsel mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Gelişen sosyal devrelerin anlaşılmamasının nedenleri arasında 1) bebek farelerde ameliyat yapma zorlukları, genç fareler için kurulmamış stereotaksik donanımlar dahil, 2) ameliyat sırasında analjezi ve anestezinin güvenliği ve etkinliğinin dengelenmesiyer alır 6) ve 3) ameliyat sonrası bebek tarafından bebek tarafından kabul edilmesi. Ayrıca, erken doğum sonrası zaman noktalarında genetik yapıların iletmek için kullanılan mevcut yöntemleri, örneğin rahimdeelektroporasyon 7, neonatal fare beyninde intracerebroventriküler viral enjeksiyon (P0-P10)8 veya rekombinaza sürücü ve -tepkili hat genetikçaprazlamaları 9, hassas hedeflemeden yoksun ve embriyonik veya P0 hedefleme odaklarına sahip değildir.
Burada, bebek farelerde (P11-P12) stereotaksik cerrahi ve ameliyat sonrası bakım için basit bir protokol sunuyoruz; böylece anne ve yavru arkadaşlarıyla başarılı yeniden entegrasyonu destekleyeceğiz. Bu protokol, yetişkin fareler için mevcut stereotaksikprotokolü 10 kullanır ve stereotaksik kurulumda sadece küçük değişiklikler gerektirir. Ayrıca ameliyat sonrası bakım ve bebek farelerde başarılı anestezi ve analjezi konularında ayrıntılı rehberlik sunuyoruz. Ameliyat için P11-12 zaman noktasını seçtik çünkü viral ekspresyonun 2 haftalık kuluçka dönemi vardır, böylece fareler P24'ten itibaren in vivo test edilebilmektedir, peripubertal dönemden önce (P28-40)3. Ancak aynı protokol daha sonraki zaman noktalarında stereotaksik cerrahi için de kullanılabilir. Gelişen medial amigdala (MeA) üzerine odaklanıyoruz; bu, çeşitli sosyal davranışlarda rolüyle karakterize edilen bir amigdala alt bölümü11,12. Özellikle Foxp2 (MeAFoxp2)13'ü ifade eden MeA alt popülasyonunu inceledik; çünkü daha önce bu hücrelerin erkek farelerde erkek duyusal ipuçlarının in vivo işlemesi için benzersiz şekilde programlandığını ortaya koymuştuk; doğum sonrasıgelişim 14. Ayrıca, MeAFoxp2 alt popülasyonu, erkeklerde bölgesel saldırganlığı çift yönlü olarak modüle etmek içingereklidir 14. Genel olarak, mevcut protokol, sinirbilimcilerin beyin gelişiminin önemli doğum sonrası aşamalarında hedef beyin bölgelerine viral ajanları hassas bir şekilde iletmesini ve ergenlik ile yetişkinlik döneminde sosyal ve ilişkili davranışların hücresel ve devre temellerini incelemesini sağlıyor.
Protokol
Bu prosedür, NIEHS Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvanların kullanımı ve bakımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergelerine uygundu. Ameliyat boyunca ve hayvanların huzurunda eldiven, yüz maskesi, tek kullanımlık önlük, saç ağı ve ayakkabı kılıfları gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar kullanıldı.
1. Fare stereotaksik aparatının hazırlanması ve ayarlamaları (Şekil 1)
- Bebek fareler için stereotaksik aksesuarlarla stereotaksik cihaz hazırlayın; bunlar arasında rapture olmayan kulak barları, modifiye edilmiş gaz anestezi başlığı tutucu ve P12 bebekler için damak çubuğu da var.
- Tüm cerrahi aletleri cam boncuk sterilizatörüyle dezenfekte edin (250 °C, küçük aletler için 30 saniye, büyük aletler için 1 dakika). Sterilizasyondan sonra steril aletleri steril bir perde üzerine yerleştirin. Steril aletler ameliyat boyunca steril alanda kalmalıdır.
- Ameliyat boyunca bebeğin kontrollü sıcaklıkta kalması için stereotaksik donanıma ~37 oC sıcaklıkta bir ısıtma pedinin üzerine başka bir steril örtü yerleştirin. Ameliyat boyunca ısıtma pedinin sıcaklığını izleyin.
2. Fare cerrahi hazırlığı, stereotaksik yerleştirme, seviyeleme ve kraniotomi
- Vücut ağırlığını ölçün ve uygun dozda analjezi alın.
- Fareyi %3 izofluran dolu bir indüksiyon odasına yerleştirin ve oksijen akışı 0,9 L/dakika olarak belirlenir. Pedal çekilme refleksini test ettikten sonra farenin solumu hızının ~1 nefes/s'ye düştüğünü ve yanıt olmadığını kontrol edin. İzofluran/oksijen akışını stereotaksik çerçeveye geçirin ve izoflüran konsantrasyonunu %2'ye indirin.
NOT: Yeterli anestezi, cerrahi işlem süresince her 5 dakikada bir pedal çekilme refleksine yanıt vermemesiyle doğrulanmalıdır. Ameliyat boyunca farenin nefes alma düzenini dikkatlice gözlemleyin. Ameliyat boyunca izofluran konsantrasyonunu derin anesteziyi korumak ve aşırı dozdan kaçınmak için en düşük oranın kullanılmasını sağlayacak şekilde ayarlayın. - Fareyi bebek fareler için stereotaksik aksesuarlarla modifiye edilmiş stereotaksik cihazın üzerine monte edin. Deliksiz kulak çubuklarını farenin başının yanına yerleştirin ve kulak çubuğu cetveni, stereotaksik çerçeve cetveline göre her iki taraf için eşit mesafede hizalasın. P11 bebekler için stereotaksik cetveci 5 mm olarak ayarlayın.
NOT: P11 seviyesindeki bebeklerin gözleri genellikle henüz açık değildir, bu yüzden göz kayganlaştırıcısına gerek yoktur. P12'de bazı bebeklerin gözleri açılır. Bebeğin gözleri açıksa, ameliyat boyunca göz merhemi uygulanmalı ve tekrar uygulanmalıdır. - 5 mg/kg Meloksikamı, 1 mL enjekte ile 1 mL enjekte ile intraskapular yol ile intraderi (s.c.) yoluyla 27 G iğne ile enjekte edin.
- %0,5 bupivakain (5 mg/mL) tuzlu suyla 0,5 mg/mL (1:10) olarak seyreldin ve başın derisi altına s.c. enjekte edin (yani 5 g bebek için 0,05 mL).
NOT: 2.6'dan 3.15'e kadar olan adımlar steril eldivenlerle yapılmalıdır. - Başın orta hattı boyunca küçük makaslarla 1,5 cm'lik bir kesi yapın.
- Steril bir pamuk çubuğu kullanarak kafatasının yüzeyindeki yumuşak dokuyu dikkatlice betadinle çıkarın.
- Bir cam kapiler (~0,8 mm uzunluğunda) cam pipet tutucuya yerleştirin. Tutucuyu dikey stereotaksik kola monte edin.
NOT: 2.9'dan 3.10'a kadar olan adımlar diseksiyon mikroskopu altında yapılmalıdır. - Kafatası yüzeyinin ön-arka açısını düzleştirin:
- Kapilleri dorsal sinüslerin (RCS) rostral birleşim noktasına (Şekil 2) Chan ve ark.15'te belirtildiği gibi hareket ettirin.
- 2x büyütme ile mikroskop altında, kapiller RCS noktasında kafatasına hafifçe temas ettiğinde, stereotaksik cihazın dijital ekran konsolu kullanılarak X (medial-lateral), Y (Anterior-Posterior) ve Z (Dorsal-Ventral) koordinatlarını sıfırlar.
- Hürüseferi lambda'ya (Y = -7,30 mm) hareket ettirin ve kapiler hafifçe kafatasına değecek şekilde aşağı indirin (Şekil 2).
- Z koordinatlarının değerini kontrol edin ve stereotaksik sistemde ön-arka açıyı dengeleyerek başlığın eğim açısını değiştirin. 2.9.1'den 2.9.3'e kadar olan adımları tekrarlayın, RCS ile lambda arasındaki Z koordinatı değerindeki fark <0,02 mm olana kadar.
- Kafatası yüzeyinin medial-lateral açısını düzleştirin:
- Kapilleri RCS noktasına taşıyın.
- X (medial-lateral) ve Y (Ön-Posterior) koordinatları sıfırlanın; kapiller RCS noktasında hafifçe kafatasına değdiğinde.
- Postodorsal MeA (MeApd) koordinatlarıyla başı düzleştirmek için, kapiller hafifçe kafatasına değdiğinde kapiller X = +2.50 mm, Y = -4.20 mm ve sıfır Z (Dorsal-Ventral) konumuna taşınır.
- Kapilleri X = -2,50 mm, diğer yarımkürede Y = -4,20 mm olarak hareket ettirin ve kapilleri hafifçe aşağı indirerek kafatasına dokunun.
- Z değerini kontrol edin ve stereotaksik donanımda Medial-Lateral eksenini ayarlayarak başın eğim açısını değiştirin. 2.10.1'den 2.10.4'e kadar olan adımları tekrar et, sağ ve sol yarımküre arasındaki Z değerindeki fark <0.03 mm olana kadar.
- Kapiller tutucuyu çıkarın ve #75 matkap uclu mikro matkapı dikey stereotaksik koldaki bir matkap stereotaksik tutucuya monte edin.
- Matkap ucu ucunu RCS noktasının üstüne yerleştirin, X (Medial-Lateral) ve Y (Anterior-Posterior) koordinatlarını sıfırlayın. P11 bebeklerinin MeApd'sini hedeflemek için X = ±2,03 mm, Y = -4,20 mm konumuna geçin.
- Kafatasından 0,5 mm çapında kraniotomi delin.
- Kafatası yüzeyini steril salinle dikkatlice temizleyin, hassas iş mendilleri ve pamuklu çubuklarla kullanın.
NOT: Kafatası yüzeyini nemli tutmak için steril salin düzenli uygulayın.
3. Viral enjeksiyon
- Yeni bir kapilleri mikrofil esnek iğne kullanarak mineral yağla doldurun.
- Kapilleri nanolitre enjektöre bağlayın ve sıkın.
- Mikro matkapı çıkarın ve nanolitre enjektörü dikey stereotaksik kola monte edin.
- Ameliyat için gereken virüs miktarının en az iki katını (burada 400 nL) 10 nL/s oranında çekin.
NOT: İlgi duyduğunuz herhangi bir AAV virüsü, Kurum onayı sonrası viral enjeksiyon için kullanılabilir. Bu protokolde AAV2-DIO-mCherry (BSL-1, 2.5 E+13 vg/mL, 3 μl/tüp, -80 °C'de saklanan ve ardından ameliyat için buza aktarılmış) kullanıldı. - Kapilleri RCS noktasına taşıyın ve X ile Y koordinatlarını sıfırlayın.
- Kapilleri hedef beyin alanına taşıyor, burada MeApd (koordinatlar: X = ±2.03 mm, Y = -4.20 mm, Z= -5.08 mm RCS'den).
- Kapilleri kafatasının yüzeyine indirin, ardından Z koordinatını sıfırlayın.
- Kapiler kısmını istenen derinliğe indirip beyinden geri çekerek bir yol açın.
- Kapillerin tıkanmadığından emin olmak için ~8 nL virüs enjekte edin, sonra tekrar beyne yerleştirilir. Tıkanmışsa, görev sileceklerine steril salin ekleyin ve tıkanıklığı temizlemek için kapillerin yanlarını ve altını nazikçe silin.
- Kapilleri istenen derinliğe bir kez daha indirin ve istenen viral miktarı (bu durumda 150 nL virüs) 20 nL/dakika hızında enjekte edin.
- İş bittiğinde, kapilleri yavaşça çekmeden önce 5 dakika bekleyin.
- Gerekirse, virüsü kontralateral yarımküre enjekte etmek için 3.4-3.11 adımlarını tekrarlayın.
- Nanolitre enjektörden kapilleri çıkarın. Kullanılmış kapillyarları ve viral tüpleri %10 ağartıcı olan 50 mL'lik konik bir tüpte atın.
NOT: Bireysel laboratuvarlar, Kurumsal Biyolojik ve Biyogüvenlik Şubelerinin tüm atık işleme, dökülme yönetimi ve biyogüvenlik uyumluluk yönergelerine uymalıdır. - Deriyi emilmez 7-0 dikiş ile dikin. Dikiş yaparken tüyleri kaldırmayı deneyin, böylece dikişler gizli kalsın.
NOT: Genellikle, 3-4 dikiş yeterli olur. Elimizde, 7-0 dikiş, bebek ev kafesine geri getirildiğinde barajın dikişleri yırtmasını önlemek için en iyi şekilde işe yarar. - Dikiş alanını %3 hidrojen peroksit ile silin, ardından steril pamuk çubuklarıyla tuzlu su kullanın.
NOT: Ameliyat genellikle enjekte edilen virüs sayısına bağlı olarak 1 ila 2 saat arasında sürer. Virüslerin tam ifade için genellikle en az 2 hafta gereklidir.
4. Ameliyat sonrası bakım
- Bebeği stereotaksik çerçeveden çıkarın ve temiz bir kafese ısıtıcı pedin üstüne yerleştirin. Susuz kalmayı önlemek için steril tuzlu su enjeksiyonu önerilir.
- Bebeği hareket edip hareket edene kadar izleyin.
- Bebek kafeste hareket edebildiğinde, barajı ~2 dakika boyunca yeni, temiz bir kafese yerleştirin.
- Bebeği, yavrularının yanına orijinal ev kafesine yerleştirin. Tüm yavruları yuva ve yatak malzemesiyle dikkatlice silin, sonra yuvanın içine geri yerleştirin. Barajı tekrar kafese yerleştirmeye devam edin.
- Damcı ve bebekleri yakından takip edin. Dava yuvasına geri döndüğünü ve cerrahi bebeği tımar ettiğini ancak dikişleri çekmediğini doğrulayın.
- Eğer 1 saat sonra dam cerrahi bebeği kabul etmiyorsa, koruyucu bir dam kullanın. Bir anne zaten bebekleri kabul ettiğini gösterdiyse, sonraki yavrular için bu damjı kullanın (ilk yavruda bebekleri kabul ettikten sonra kabul oranı %100 olmuştur).
- Ameliyattan yirmi dört saat sonra kesi bölgesini kontrol edin ve Meloksikam (5 mg/kg, s.c.) verin.
- Başarılı ameliyat sonrası bakımdan sonra, cerrahi fareyi dam ve yabancılarla birlikte bırakın, P21'de sütten kesilene kadar. Ameliyattan sonraki 10-14 gün içinde görünür dikişleri çıkarın.
NOT: Cerrahi farelerde yiyecek alımı, vücut ağırlığı veya hareket davranışında littermate kontrolleriyle karşılaştırıldığında önemli bir fark beklenmemektedir.
Bebekler ameliyattan sonra en az 2 gün ve ardından haftada en az 2 gün boyunca günlük olarak izlenecek. İnsancıl Son Nokta Kriterleri: Bebek ameliyattan 2 saat sonra yürüyüş yapamıyorsa, bebek insancıl bir şekilde ötenazi edilir. Eğer bebekte ameliyat sonrası vücut ağırlığı ve/veya hareket göstermesi azalırsa, bebek insancıl bir şekilde ötenazi edilir.
Sonuçlar
Bebek ameliyatları için izofluran, bupivakain ve meloksikam kombinasyonunun güvenliği
Bebek farelerde anestezi ve analjezi kullanımının güvenliği hâlâ belirsiz6. Bu nedenle, bebek farelerde anestezi ve analjezi kombinasyonunun kullanımını test ederek hayatta kalma oranını belirledik. P11 seviyesindeki bebek fareler (vücut ağırlığı = 6,09 ± 0,90 g, en düşük vücut ağırlığı 3,9 g; n=13) 0,9 L/dakika oksijende %3 izofluran ile başlangıç anestezi için indüksiyon odasına yerleştirildi. Bebekler anestezi edilip pedal çekilme refleksine tepki vermedikten sonra, stereotaksik cihaza aktarıldılar ve izofluran anestezisi, ısıtıcı pedle (41,23 ± 2,28 °C) 0,9 L/dakika oksijende %1,5-2 isoflurane indirildi. Bebekler stereotaksik cihaza yerleştirildikten sonra, analjezi s.c. interscapular (5 mg/kg Meloksikam) ve başın derisi altına topikal anestezi (0,05 mg/mL Bupivakain) verildi. Otuz dakika sonra, bebekleri stereotaksik sistemden çıkardık ve temiz bir kafese koyduk. Analjezi doğumundan 30 dakika sonra %100 sağlıklama oranı (13/13) gözlemledik. Ayrıca, ameliyattan 24 saat ve 72 saat sonra ve yetişkinliğe kadar herhangi bir komplikasyon gözlemlemedik. Bu sonuçlar, lokal anestezi ile steroid olmayan bir anti-inflamatuar ilaçla birleştirmenin bebek fareler için güvenli olduğunu ve ağrı ile sıkıntıyı azalttığını göstermektedir.
MeA'ya hassas ve doğru viral teslimat
Bebekte yapılan stereotaksik ameliyatlar sırasında viral teslimatın doğruluğunu ve hassasiyetini doğrulamak için, AAV2-hSyn-DIO-mCherry'yi P11'deki Foxp2cre+/- erkek farelerin MeApd'sine iki taraflı olarak aktardık (Şekil 3A). Fareler daha sonra P21'de sütten kesildi. P45 seviyesinde, fare beyinleri daha önce grup14 ve diğerleri16 tarafından tanımlandığı immünohistokimya ve görüntü analizi için toplanmıştır (Şekil 3B,C). Fareler anestezi edilip 30 mL 1× PBS ile perfüze edildi, ardından 10 mL/dakika ile %4 PFA 30 mL alındı. Beyinler gece boyunca %4 PFA'da 4 °C'de sabitlenmiş, %30 sukrozda kriyokorumalı hale getirilmiş, O.C.T.'ye gömülü ve 50 μm hassasiyette kriostat ile kesitlenmiştir. Her üçüncü bölüm daha önce tanımlandığı gibi immünohistokimya içinişlendi. 14. Serbest yüzen bölümler %10 normal eşek serumunda bloklandı, birincil antikor ile gece boyunca kuluçka altına alındı, ikincil antikorla 4 saat kuluçka edildi, tekrar yıkandı ve DAPI içeren ortamla örtülü bir ortamla örtüldü. Beyin bölümleri Foxp2 antikoru ve Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) ile boyandı.
Hedef verimliliğini doğrulamak için, MeA'da mCherry+ ve Foxp2+ hücrelerinin birlikte ekspresyonunu belirledik ve popülasyonlar arasında %90,2 ± 2,1 örtüşme gözlemledik; bu da mCherry ekspresyonunun Foxp2+ hücreleriyle kre-bağımlı bir şekilde sınırlı olduğunu gösteriyor (Şekil 3D). Bu sonuç, bu protokol kullanılarak yapılan viral enjeksiyonun yüksek verimliliğini vurgulamaktadır. Ayrıca, MeApd'deki mCherry+ hücrelerinin yüzdesini tüm bölgelerdeki toplam mCherry yüzdesine göre analiz ederek viral enjeksiyonların doğruluğunu araştırdık. MCherry+ hücrelerinin %93,7 ± 1,4'ünün MeApd içinde yer aldığını gözlemledik; bu da virüsün mekânsal ifadesinin ilgi alanımızla sınırlı olduğunu gösteriyor (Şekil 3E).
Şekil 1: Bebek stereotaksik cerrahisi için hazırlık. (A) Stereotaksik donanım. (B) Yırtılmaz kulak barları. (C) P12 bebekleri için gazlı anestezi başlığı tutucusu ve damak çubuğu. (D) Boncuk sterilizatör. (E) Isıtma pedi kontrolcüsü. (F) Stereotaksik kol. (G) Nanolitre enjektör. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: P11 fare kafatasındaki önemli simgeler. (A) Bebeğin kafatasındaki önemli simgelerin şematik çizimi. (B) Bebeğin kafası, kırılmayan kulak çubukları, modifiye edilmiş gaz başlığı tutucu ve P12 fareleri için bir pelet çubuğu gibi özel stereotaksik aksesuarlarla sabitlenir. Kısaltma: RCS = Sinüslerin rostral birleşimi, SSS = Üst sagital sinüs, RRV = Rostral-rhinal venler, SOS = Superior koku sinüsü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bebek stereotaksik cerrahisi sonrası MeApd'de hedefli çift taraflı viral ekspresyone. (A) MeApd'nin şematik illüstrasyonu (koronal görünüm). (B) Foxp2cre+/- yetişkin erkek farelerde Foxp2 antikorunun (yeşil) ve mCherry+ hücrelerinin (mCherry+ hücreleri) çift taraflı ekspresyonunun temsil eden histoloji görüntüsü. (C) MeA'nın hem birleşmiş hem de bireysel kanallardan genişletilmiş görünümü. Beyaz oklar, ortak etiketlenmiş Foxp2 antikoru ve mCherry+ hücrelerini gösterir. (D) Enjeksiyon verimliliği. (E) Enjeksiyon doğruluğu. (D,E) n=3 fare, sol ve sağ yarımküre/fare. Kısaltmalar: MeApd = posterodorsal medial amigdala; MeApv = posteroventral medial amigdala. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Yöntemler | Artıları | Eksiler | Referans |
| Rahim içi elektroporasyon | Daha büyük plazmid transfeksiyonu | Hassas hedefleme eksikliği, toksisite, yüksek becerili olma | Wang ve ark., Yöntemler Mol Biol. (2013). |
| İntracerebroventriküler viral enjeksiyon | Hızlı, kolay, ekonomik | Hassas hedefleme eksikliği, bebek öldürme riski | Kim ve ark., J Vis Exp. (2014). |
| P0'da Stereotaktik Mikroenjeksiyon | Hassas hedefleme, anne tarafından reddedilme riski daha düşük | Virüs nedeniyle hücre toksisitesi, ergenlik sonrası zaman noktalarını incelemek için ideal değil | Chen ve ark., J Vis Exp. (2018). |
| Rekombinaz çizgisi genetik çaprazlama | İnvaziv olmayan | Hassas hedefleme eksikliği, pahalı. | Robertson ve ark., Nat Neurosci. (2013). |
Tablo 1: Kemirgenlerde hücresel ve devresel embriyonik ve doğum sonrası gelişimi incelemek için kullanılan önceki yöntemlerin özeti.
Tartışma
Doğum sonrası gelişim boyunca sosyal davranışların altında yatan sinirsel mekanizmaları incelemek, sadece ortaya çıkışlarını değil, aynı zamanda bu mekanizmaların çevresel faktörler veya nörogelişimsel bozukluklar tarafından nasıl bozulabileceğini anlamak için de gereklidir. Çalışmamız, virüsü P11-12 bebek farelerinin beyinlerine hassas ve verimli şekilde iletmek için stereotaksik cerrahi için ayrıntılı bir protokolü tanımlar. Bu nedenle, bu protokol, ergenlik öncesi ve sonrası moleküler olarak tanımlanmış nöronal alt popülasyonların manipülasyonu, kaydı ve devre çalışmalarına olanak tanır; bu yöntem viral bir strateji kullanılarak gerçekleştirilir. Ameliyat öncesi ve sonrası modifikasyonları ve bakımı vurguluyoruz; ayrıca bebek fareler tarafından iyi tolere edilen anestezi ve analjezi ajanlarının güvenli bir kombinasyonunu öne çıkarıyoruz.
Bebek stereotaksik cerrahisinin önemli ve zorlu bir bileşeni, bebeği annesi ve yavru arkadaşlarıyla birlikte ev kafesine başarıyla yeniden yerleştirmektir. Kafese yeniden yerleştirildiğinde uygun bebek bakımı sağlanması için, dava bebeği (aşırı tımar yapmadan) alıp temizlemelidir ve olası ihmal belirtileri yakından izlenmelidir. Bebeğin kesisi ve dikişleri nedeniyle, dam baş bölgesini aşırı bakıma geçirebilir, bu da dikişlerin yırtılması ve çıkarılmasına yol açabilir. Bu zararlı olurdu ve bu nedenle ameliyat sonrası barajın bebeğe karşı davranışını izlemek hayatta kalmak için kritik öneme sahiptir. Ameliyat sonrası bebeğin baraj kabulünü artırmak için, dikiş atmadan sonra hidrojen peroksit ve tuzlu su kullanılmasını ve yetişkinlerde kullanılanlardan daha ince dikişler (7-0) kullanılmasını öneriyoruz. Bu iki strateji, annenin ameliyat sonrası bebek farelerini kabul etmesini sağladı.
Ayrıca, çalışmamız bebek ameliyatlarında anestezi ve analjezilerin güvenli kullanımı konusunda rehberlik sağlar. Bu kritiktir çünkü yenidoğanlar ve bebek fareler yetişkinler kadar iyi analjezi ve anestezi dozlarına dayanamaz; bu da zararlı solunum ve kalp yan etkilerine yol açabilir6. İzofluran olan ağız anestezi ve meloksikam ile bupivakain analjezi kombinasyonunun deri altına (sırasıyla intraküspular ve baş derisi altında) uygulanmasının bebekler tarafından iyi tolere edildiğini ve uzun vadeli hayatta kalma sağladığını gözlemledik. Ayrıca, daha önce bebek farelerde stereotaksik cerrahi işlemin, ameliyattan 2 hafta sonra genç farelerde benzer tür bireylere yönelik benzer inceleme sürelerine yol açtığını, ameliyat yapılmayan yaş uyumlu kontrol kontrollerine kıyaslagöstermiştik. Bu nedenle, bu sonuçlar bebek farelerde ameliyat sonrası yeterli iyileşme ve belirgin motor eksiklikler olmadığını göstermektedir. Dikkat çekici olarak, ameliyat boyunca kan oksijenasyonunu ölçmedik. Kan oksijen seviyeleri, hipoksi17'yi önlemek için bir nabız oksimetre ile takip edilmelidir.
Bu protokolün bir diğer kritik bileşeni, lambda ve RCS tabanlı stereotaksik koordinat sisteminin sagittalorta hat 15'te kullanılmasıdır. RCS, üst sagital sinus ile üst koklu sinüs birleşiminin sagital orta hat boyunca birleştiği noktayla tanımlanan bir simge yapıdır. Bu simge, başın küresel hizalanmasından sonra diğer dorsal işaretlere kıyasla tutarlı olarak daha düşük pozisyon değişkenliği sergilemiştir. Bu durum, RCS/lambda arasındaki mesafenin bregma/lambda ile karşılaştırıldığında artması, hayvanlar arası yatay angulasyonun stabilitesini vetekrarlanabilirliğini artırdığı için geçerlidir 15.
Nöronal gelişimi incelemek için önceki yöntemler, embriyonik ve P0 zaman noktalarında viral stratejilere veya ilgi gören kader haritalama hücreleri için genetik çaprazlamalara odaklanmıştır (Tablo 1). Rahim elektroporasyonu ve intracerebroventriküler viral enjeksiyonlar gibi teknikler hassas hedeflemeden yoksundur. P018'de hedefli viral enjeksiyonlar yapılması, ilgi alanına tam olarak viral bir yapı enjekte ederek bu sorunu aşıyor. Ancak, viral yapılar birkaç hafta sonra sitotoksik hale gelebilir ve bu da hücre ölümüne yol açabilir. Bu nedenle, yenidoğanın beynine yetişkinliğe kadar devam edebilecek uzunlamasına ergenlik çalışmaları için viral bir yapı enjekte etmek ideal olmayabilir. Bu nedenle, viral enjeksiyonun doğumdan bir buçuk hafta sonra gerçekleştiği yaklaşımımız, ergenlik sırasında hücre toksisitesi riskini azaltıyor.
Yaklaşımımızın avantajlarına rağmen, birkaç hususun hâlâ devam etmesi gerekiyor. İlk olarak, bebek farelerde kullanılan beyin koordinatlarının yetişkinlerde kullanılanlardan değiştirilmesi gerekir. Örneğin, P11 bebek farelerinde MeApd'yi hedeflemek için aşağıdaki koordinatları kullanırız: X= +2,03 mm, Y= -4,20 mm, Z= -5,08 mm; yetişkinlerde kullanılan koordinatlar ise X= +2,15 mm, Y= -5,00 mm, Z= -5,10 mm'dir. Ne yazık ki, prepubertalfareler için 19 için beyin atlası referansları yetişkin farelere göre daha az (Allen Mouse Brain Atlas, mouse.brain-map.org ve atlas.brain-map.org)20,21. Bu nedenle, MeA'nın ötesinde diğer beyin bölgelerinde doğru viral hedeflemeyi başarıyla sağlamak için araştırmacıların koordinatların bilinçli bir tahminini elde etmesi ve koordinat testleri yapmaları gerekecek. İkinci olarak, AAV'lerin kuluçka süresi dikkate alınmalıdır. AAV ekspresyonunun in vivo için optimal kuluçka süresi en az 2-3 haftadır. Protokolümüzde stereotaksik cerrahi bebek farelerde P11 seviyesinde yapıldığı göz önüne alındığında, araştırmacılar sadece optimal AAV kuluçka döneminden sonra P25'te fare testlerine başlayabilecekler.
Genel olarak, bu protokol araştırmacılara viral vektörler kullanarak bebek farelerde ilgilenen beyin bölgelerini yüksek hassasiyetle hedeflemeleri için ayrıntılı rehberler sunar. Bu yaklaşım son derece avantajlıdır çünkü son derece esnektir: herhangi bir ticari veya özel yapımı AAV yapısı enjekte edilebilir. Bu nedenle, ilgi çekici moleküler olarak tanımlanmış hücre alt popülasyonlarını, anatomik devrelerini, nöronal dinamiklerini ve ergenlik öncesi ve sonrası hücresel rollerini, sosyal davranışların ortaya çıkışıyla uyumlu kritik bir zaman aralığında incelenmesine olanak tanır. Ayrıca, bu yaklaşım sadece burada gösterildiği gibi amigdalayı değil, hipotalamus ve kortikal bölgeler gibi diğer subkortikal yapıları da hedeflemek için başarılıdır.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS/NIH) Karşılaştırmalı Tıp Şubesi'nden Dr. Andrew Gorman, Dr. Donna Webb ve David Goulding'e kemirgen ameliyatlarında anestezi ve analjezi konusunda en iyi uygulamalar üzerine değerli tartışmalar için teşekkür ediyoruz. Ayrıca, hayvan deneklerine gösterdikleri en üst düzeyde özen gösterdikleri için NIEHS'deki tüm CMB üyelerine ve Nörodavranışsal Devreler Grubu'nun tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nün Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIEHS/NIH) (ZIA ES103403) (J.E.L.) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. NIH yazarlarının katkıları, Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin Eserleri olarak kabul edilir. Bu makalede sunulan bulgular ve sonuçlar yazarlara aittir ve NIH veya ABD Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı'nın görüşlerini mutlaka yansıtmaz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| #75 matkap ucu | Matkap Uçluğu Şehri | 10WS75-850FL | |
| 27 G iğne | Covetrus | 60757 | |
| %3 hidrojen peroksit | Kuğu | NDC 0809-0871-43 | |
| %32 paraformaldehit | Elektron Mikroskopi Bilimleri | 15714 | |
| AAV2-hSyn-DIO-mCherry | Addgene | 50459-AAV2 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey (1:1000) Anti-Tavşan IgG (H+L) | Jackson Immuno Araştırmaları | 711-545-152 | |
| Analitik Denge | Sartorius | 1102--15 | |
| Betadine | Avrio Eczanesi | NDC 67618-155-15 | |
| Bupivakain | Hospira | NDC 0409-1163-18 | |
| Kriyostat | Leica | CM1950 | |
| Diseksiyon Mikroskobu | Zeiss | 2149-629 | |
| Göz merhemi | Dechra Veterinerliği | Puralube | |
| DAPI ile Fluoromount Montaj Medya | Thermo Fisher Scientific | 00-4959-52 | |
| Foxp2 Antikor (1:1000) | Atlas Antikor/Kozmo Biyografisi | HPA000382 | |
| Foxp2cre+/- fareler | Jackson Laboratuvarı | 30541 | |
| P12 Yavru Köpekleri İçin Gaz Anestezi Başlığı Tutucu ve Damak Çubuğu | David Kopf Enstrümanları | 1934-C | |
| Cam Boncuk Sterilyeci | Fisher Scientific | 10-000-632 | |
| Cam Kapiller | Dünya Hassas Aletleri | 504949 | |
| Cam Pipet Tutucu | David Kopf Enstrümanları | 1975-1.2-A | |
| Isı pederi | Kent Scientific Şirket | RT-0520 | |
| İzofluran | Piramal Kritik Bakım | NDC 66794-017-10 | |
| Meloksikam | Pivetal Veterinerlik Tedariki | NDC 46066-937-13 | |
| Mikro Matkap | David Kopf Enstrümanları | Model 1911 matkap | |
| Microfil Esnek İğne | Dünya Hassas Aletleri | MF28G67-5 | |
| Mikroskop Slaytları | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Mineral Yağ | Sigma-Aldrich | M5904-500ML | |
| Nanolitre Enjektör | Dünya Hassas Aletleri | NANOLITER2020 | |
| Emilmez Dikiş | AD Cerrahi | S-N718SP13 | |
| Rapture Olmayan Kulak Külçeleri | David Kopf Enstrümanları | 1921-A | |
| Normal Eşek Serumu | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| O.C.T. Yerleşkesi | Sakura | 4583 | |
| Stereotaksik Donanım | David Kopf Enstrümanları | 1900 | |
| Steril Pamuk Çubuk | ULINE | S-21102 | |
| Steril Perde | Busse Hastanesi Tek Kullanımlık Malzemeler | 696 | |
| Steril Salin | Hospira | NDC 0409-1966-02 | |
| Steril Su | Hospira | NDC 0409-4887-24 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
| Şırın | Fisher Scientific | 50-252-2568 |
Kaynaklar
- Andersen, S. L. Trajectories of brain development: Point of vulnerability or window of opportunity. Neurosci Biobehav Rev. 27 (1-2), 3-18 (2003).
- Zeiss, C. J. Comparative milestones in rodent and human postnatal central nervous system development. Toxicol Pathol. 49 (8), 1368-1373 (2021).
- Bell, M. R. Comparing postnatal development of gonadal hormones and associated social behaviors in rats, mice, and humans. Endocrinology. 159 (7), 2596-2613 (2018).
- Auger, A. P., Olesen, K. M. Brain sex differences and the organisation of juvenile social play behaviour. J Neuroendocrinol. 21 (6), 519-525 (2009).
- Barkley, M. S., Goldman, B. D. A quantitative study of serum testosterone, sex accessory organ growth, and the development of intermale aggression in the mouse. Horm Behav. 8 (2), 208-218 (1977).
- National Research Council (US) Committee on Guidelines for the Use of Animals in Neuroscience and Behavioral Research. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. , The National Academies Press. (2003).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods Mol Biol. 1018, 151-163 (2013).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. (91), e51863(2014).
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., De Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nat Neurosci. 16 (8), 1016-1023 (2013).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
- Prakash, N., Abu Irqeba, A., Corbin, J. G. Development and function of the medial amygdala. Trends Neurosci. 48 (1), 22-32 (2025).
- Raam, T., Hong, W. Organization of neural circuits underlying social behavior: A consideration of the medial amygdala. Curr Opin Neurobiol. 68, 124-136 (2021).
- Lischinsky, J. E., et al. Embryonic transcription factor expression in mice predicts medial amygdala neuronal identity and sex-specific responses to innate behavioral cues. Elife. 6, e21012(2017).
- Lischinsky, J. E., et al. Transcriptionally defined amygdala subpopulations play distinct roles in innate social behaviors. Nat Neurosci. 26 (12), 2131-2146 (2023).
- Chan, E., Kovacević, N., Ho, S. K., Henkelman, R. M., Henderson, J. T. Development of a high resolution three-dimensional surgical atlas of the murine head for strains 129s1/svimj and c57bl/6j using magnetic resonance imaging and micro-computed tomography. Neuroscience. 144 (2), 604-615 (2007).
- Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Methods Mol Biol. 176, 1-12 (2021).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO during surgical anesthesia in mice. J Neurosci Methods. 159 (2), 261-267 (2007).
- Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. J Vis Exp. (137), e57270(2018).
- Kronman, F. N., et al. Developmental mouse brain common coordinate framework. Nat Commun. 15 (1), 9072(2024).
- Dong, H. W. The Allen reference atlas: A digital color brain atlas of the C57BL/6J male mouse. , John Wiley & Sons. (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2004).
Yeniden basım ve izinler
Bu makale yayımlandı
Video yakında